CN1159833A - 产生海藻糖的转基因植物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及产生海藻糖的转基因植物及增加植物海藻糖含量的方法。根据本发明，有用的植物是用编码海藻糖-6-磷酸合成酶基因的序列转化的，所说的序列与非组成性植物启动子相融合，从而使基因按时序的、按局部分布的或环境压力诱导的控制方式得以表达。本发明可用于生产抗干旱、高盐碱或极端温度变化的基本农作物，并用于改善绿色食品原料、采摘的果实及观赏植物等在内的收获植物的储存性质。

Description

产生海藻糖的转基因植物

                  发明的领域

本发明涉及在植物内导入海藻糖合成能力的基因工程。具体地说，本发明涉及增加了海藻糖含量的植物及生产这些植物的方法。本发明还涉及提高植物对冷和干燥等环境压力之方法，以及由植物生产海藻糖的方法。

                  发明的背景

海藻糖(α-吡喃葡糖基-α-D-吡喃葡糖)是通过其还原基团连接的葡萄糖分子的二聚体。由于与其他糖相比，其具有缺少还原基团、水解慢及能够形成不易潮解的玻璃体等不寻常的性质，所以它是一种蛋白质、细胞膜和其他生物学化合物的最有效的已知体外防腐剂、另外，含有大量海藻糖的活生物体常常是以暴露于渗透压、脱水及热应激状态下为特征，例如昆虫、某些浅海动物及包括酵母和细菌在内的许多微生物。有间接证据(见Wiemken[1990]Antonie van Leeuwenhoek 58，209-217的综述)表明海藻糖在面包酵母中的主要作用是提供对抗这些环境压力的抗性。但也有人提示(Nwaka et al(1994)FEBS Letters 344，225-228；Van Dijk et al(1995)Applied Environ.Microbiol.61，109-115)，海藻糖在面包酵母中的积聚本身并不足以提供对环境压力的耐受性。

在所谓更苏植物如蕨类植物(Selaginella lepidophylla)中存在有高水平的海藻糖，使之可在干燥和热环境下长期存活(参见Avigad(1982)在Encyclopedia of Plant Research(new series)13A，pp 217-347中所作的评述)。然而，大多数维管植物并不能合成海藻糖。这些植物往往通过降低细胞内水分的利用性来对干燥等环境压力作出反应，常常积聚其他一些“相容的”溶质，例如甘氨酸三甲内铵盐、脯氨酸及各种多元醇(参见McCue and Hanson(1990)Trends in Biotechnology 8，358-362)。

有关被子植物中海藻糖的报导十分有限，并且报导中所述的小量海藻糖可能反映存在有微生物的污染(例如参见Kandler&Senser(1965)Z.Pflanzenphysiol.53，157-161；Qesch&Meier(1967)Phytochemistry 6，1147-1148)。已有人提示海藻糖对许多植物组织是有毒性的(Veluthambi et al.，(1981)Plant Physiol.68，1369-1374)，特别是对那些只有很小或没有海藻糖酶活性的植物(海藻糖酶是一种将海藻糖转化成葡萄糖的酶)。但至少有一种被子植物即Myrothamnus flakellifolia。(另一种“更苏”植物)积聚有较大量的海藻糖(Bianchi et al.(1993)Physiologia Plantarun 87，223-226)表明海藻糖和被子植物间没有绝对的相容性屏障。

大多数被子植物中没有海藻糖，并且还报导其在某些植物中是有毒性的，此表明在这些植物内导入海藻糖合成途径有时可能对植物带来不利影响。另一方面，在植物中成功地产生海藻糖将会具有明显的好处。例如在糖甜菜、马铃薯、洋葱等的储藏器官中积聚的海藻糖经商业生产后，可得到在某些应用中有与蔗糖价值相媲美的海藻糖。这些应用包括制造干燥食品(奶和蛋粉、汤料及果泥等)，因为海藻糖可通过在商业上有吸引力的干燥工艺来保持许多食品原料的风味和组织特征，并且在这方面比蔗糖要优越得多(例如参见Roser(1991)Trends in Food Science&Technology，July issue，pp.166-169；Roser&Colaco(1993)NewScientist，May issue，pp.25-28)。因为海藻糖不产生发现可能对健康不利的果糖，所以在许多情况下(如制作汤料、蛋粉)海藻糖比蔗糖有更多的优点。但海藻糖的高价格又使之在干燥食品工业中的应用成本太高以致难以承受。其次，在某些植物的可食用部分中产生海藻糖可延长产品例如番茄的货架期。第三，海藻糖在敏感组织中的积聚可增加植物对霜冻、干燥、高盐及相似压力的耐受性。

                    发明的概要

基于上述事实，本发明的一个目的是提供具有新的合成海藻糖能力的植物。具体地说，本发明的一个目的是提供海藻糖在作为海藻糖之商业来源的植物组织中的可控制性积聚，或提供环境压力耐受性或两者，同时最大限度地减小海藻糖对植物生长的不利影响。

本发明是基于用处于适当的植物启动子控制下的负责海藻糖合成的结构基因转化适当的植物，以产生增加了海藻糖含量的转基因植物这一概念。具体地说，即按照本发明于特异性的植物启动子的控制下，在植物中表达编码能产生海藻糖-6-磷酸或海藻糖本身的酶的多肽一个或多个基因的编码序列。

因此，至少用与植物启动子适当融合的海藻糖-6-磷酸合成酶(Tre6P合成酶)基因的编码序列转化的有用的植物，只有在植物成熟时或当其遭遇到特殊的环境条件时才能实现基因的表达。因此，启动子最好是非组成性的，且选择能在基因表达过程中得以时序性(如按昼夜进行的)控制、按局部分布(如组织特异性的)的控制或压力激活性(或“压力诱导性”)控制。也可以用一个或多个编码海藻糖-6-磷酸酶(Tre6Pase)或与Tre6P合成酶或与Tre6Pase相互作用的调节性多肽或这两者的基因来转化植物。

可用本领域已知的任何一种方法转化植物，这些方法包括用被转化的根瘤农杆菌(Agrobacter tumefaciens)进行感染，或经微量注射、电穿孔或颗粒轰击，以及DNA直接摄入来直接导入外来DNA。结构基因最好选自分别编码56 KDa Tre6P合成酶、酵母海藻糖合成酶的102 KDaTre6Pase和123KDa调节亚基的酵母基因TPS1、TPS2及TSL1。

本发明的另一个目的是提供生产增加了海藻糖含量之转基因植物的方法，该方法包括用海藻糖合成的结构基因，特别是如上所述的Tre6P合成酶的基因转化有用的植物，并在适当的启动子控制下表达这些基因，以允许在基因表达过程中进行时序性、按局部分布性、或压力诱导性控制。

本发明的第三个目的是提供生产海藻糖的方法，该方法包括：

—用至少一个Tre6P合成酶的结构基因转化植物，以产生转基因植物，

—于可诱导海藻糖合成酶基因在该植物中表达的条件下培养该转基因植物，以及

—从植物的组织中提取海藻糖。

本发明的第四个目的是提供使植物免受干旱、高盐碱、极端温度及其他压力等不良条件影响的方法，该方法包括用至少一个与植物启动子适当融合的海藻糖-6-磷酸合成酶基因的编码序列转化植物，只有当植物遭遇到不利条件时才实现基因的充分表达。也可用一个或多个编码海藻糖-6-磷酸酶和与海藻糖-6-磷酸合成酶或海藻糖-6-磷酸酶相互作用的调节蛋白或两者的基因可操作地共转染。例如，本发明提供一种防止带浆果或其他果实植物在开花期免于霜冻损害的方法，该方法包括用与植物启动子适当融合的海藻糖-6-磷酸酶的基因转化植物，只有在植物遭遇到低温时才实现基因的充分表达。

本发明的第五个目的是提供一种生产被转化的，不需要象未被转化的植物那样进行细致地和专门地照料的观赏植物的方法，该方法包括用与植物启动子适当融合的编码海藻糖-6-磷酸合成酶的基因转化植物，从而使植物的某些组织中含有海藻糖。

附图的简要说明

图1图解显示含有融合了A.thaliana 1，5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚基启动子(pats1A)的与编码Tre6P合成酶亚单位的TPS1酶母基因及根瘤农杆菌之胭脂碱合成酶基因(nos)的转录终止信号的嵌合基因构建体的结构。其中只显示出带嵌合基因之质粒pKOH51的一部分。显示了用于嵌合基因构建的独特的限制性酶切位点。

图2给出对转基因烟草植物所作Western印迹分析的结果，其中以箭头指示56KDa TPS1产物。从含有图1所示构建体(泳道1，3，4，5，6，8，10，12，15，16和19)，或(GUS)另一个带有在同样载体中与β-葡糖苷酸酶基因(UIDA)融合之花椰菜花叶病毒35S启动子的嵌合基因的烟草转化植株中，或从未被转化的烟草植株(SR1)中提取蛋白质。各泳道加入等量的蛋白质。所使用的抗血清是抗酵母之56KDa Tre6P合成酶亚单位的抗血清。

图3显示对海藻糖的层析鉴定结果。按照一般“材料和方法”所述的以HPLC法分析烟草叶的水提取物样品(20μl)。提取物A和B含有192mg/ml鲜重温室生长的转化体19ml^-1，(A)为用海藻糖酶处理前的，(B)为用海藻糖酶处理后的。提取物C和D含有149mg/ml(C)转化株4或(D)用缺少TPS1基因的质粒pDE1001转化的对照植株的叶片，两者均生长于无菌条件下。T指示海藻糖峰值。在大约25分钟洗脱时间出现的两个大峰是葡萄糖和蔗糖。

图4显示对ats1-TPS1转化系4中TPS1亚基之组织定位的蛋白质免疫印迹分析结果。用野生型烟草(SR1)的叶作为阴性对照，并使用0.1μg从酵母(TPS1)中纯化的Tre6P合成酶亚单位作为阳性对照。在免疫印迹上方以mg/g干重表示同样组织中的海藻糖含量。nt代表未检测到。使用了下列缩写符号：FB代表花蕾，UL代表上部叶，ML代表中部叶，LL代表下部叶，US代表上茎，R代表根，EC代表酶对照物。

图5显示产海藻糖植物提高了的对干燥的耐受性。将试管内繁殖的6至8周令植物处于同一发育阶段的离体叶片暴露于空气干燥的环境(25％RH)。(A)在所述的时间将叶片称重，并将结果作为在各时间点上叶子的相对鲜重示于图中。将叶子于+60℃干燥48小时后得到各叶片的干重。SR1指示野生型对照烟草，产海藻糖转基因系1、4和8，分别由它们的系号指示。(B)显示在环境压力处理期间的选定的时间点上得自转基因系4和对照植物的离体叶片之外观。

图6显示对照组和产海藻糖组烟草植物的干旱存活性。(A)显示6至8周令试管内繁殖的全植株在空气干燥(D)条件下暴露的时间。环境压力处理17小时后，将未被转化的对照植株(SR1)和系4与8的产海藻糖转基因植物放在水中重新水化(R)。(B)将3周令转基因系8及未被转化的(SR1)和载体转化的(C)对照植株的籽苗在空气干燥(D)条件下暴露指定的时间。环境压力处理7小时后，将籽苗放在水中使之重新水化(R)。

图7显示对含有第一次肝素-Sepharose柱上洗脱的M.SmegmatisTre6P合成酶的组分所作SDS-PAGE分析的结果。泳道1至4分别含有H33(7.0mU)、H35(20mU)、H36(21mU)和H37(12mU)的样品(表3)。在8％丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE后，用考马斯亮兰染色。泳道5中以KDa数示出分子量标准品的分子量大小。用箭头指示55KDa Tre6P合成酶多肽的位置。

图8显示对从第二次肝素-Sepharose柱上洗脱的M.SmegmatisTre6P合成酶之组分峰的SDS-PAGE分析的结果。在Centricon 10试管中浓缩组分T21(表3)，然后与半量体积之3倍浓缩的SDS-PAGE样品缓冲液混合。总体积浓缩6倍。在8％丙烯酰胺凝胶上对含有(泳道1)2.9mU和(泳道3)8.7mU Tre6P合成酶的样品进行SDS-PAGE，并用考马斯亮兰染色。泳道2中所示的分子量标准从顶部到底部分别为109、84、47、33、24和16KDa。

图9显示对从M.Smegmatis中纯化的Tre6P合成酶所作Western印迹分析的结果。将预染色的分子标志(泳道1：200、117、80和47KDa；泳道10：只可看到84KDa的分子量标志)、从组分T21(表3)得到的纯Tre6P合成酶(泳道7和8：2.9mU；泳道3、4和9：8.7mU)以及得自G100 Sephadex层析柱(表3)的合并的活性部分(泳道6：7.8μg总蛋白质；泳道2和5：23μg总蛋白质)。电泳并转印迹到硝酸纤维素膜上之后，在泳道3和4之间及泳道7和8之间切开硝酸纤维素膜。用考马斯亮兰染泳道1至3，用抗纯化的酵母56KDa Tre6P合成酶亚基的抗57血清探查泳道4至7，并用预免疫血清探查泳道8至10。按照制造商提供的使用说明用购自Promega的羊抗兔LgG-碱性磷酸酶偶联物显现免疫活性带，在两者情况下显色时间均为2.8分钟。跨越泳道4至7的斜线是由于在转移到硝酸纤维素膜上时膜意外形成的皱褶所致。

图10显示对Arabidopsis thaliana的8个转基因系进行的Western印迹分析结果。提取从初始转化体的种子生长成的植物，并基本上按图2所示用抗酵母56KDa Tre6P合成酶亚基的抗血清分析之。使用从酵母中纯化的Tre6P合成酶亚基(0.1μg)作为阳性对照。未被转化的A.thaliana呈阴性反映。

                  发明的详细描述

在下文描述中，术语“组成性植物启动子”是指造成它们的相关编码序列的连续性和普遍性表达，从而在这些植物株的所有细胞中及生长的各个阶段中均可发现这些序列的表达产物。相反，非组成性启动子则是通过特异的内部或外部过程激活的，例如随着植物发育和成熟细胞分化形成不同的组织，或者植株的环境发生改变等。已知许多种环境改变都激活特定启动子是的。其例子包括光诱导的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶之小亚基启动子(Krebbers et al.(1988)Plant Mol.Biol.11，745-759)，例如实施例1-3中使用的ats1A启动子，以及可由各种环境压力诱导的启动子例如LTI78(Nordin et al.(1993)Plant Mol.Biol.21，641-653)和RAB18(Lang&PalVa(1992)Plant Mol.Biol.20，951-962)。但本发明不只限于这些举例的非组成性启动子。相反，本发明的一个重要的和新颖的部分是基于这样一个概念，即由植物组成性合成海藻糖总是不经济并且有时是有害的，从而最好通过使用非组成性启动子体现本申请中公开的海藻糖生产方法的好处。借助这些非组成性启动子，可以对转基因植物中海藻糖的生物合成进行时序控制(即其只发生在某些时间)、局部分布控制(即其只限于植物的某些部位)或同时进行这两方面的控制。

本说明书中使用的植物器官的名称都是普通蔬菜水果店和其客户通常使用的。例如，“果实”包括苹果或草莓植物的可食用实体部分，但这些含有种子的储存组织并不是严格的植物学意义上的果实本身。

已经提到几乎所有的维管植物似乎都缺乏合成海藻糖的能力，所以对术语“产海藻糖”植物并不需要进行定量定义。然而，似乎还没有研究某些常规植物(而不是所谓的更苏植物)在经受环境压力期间产生海藻糖的可能性。本发明涉及外源导入海藻糖合成能力(本文中也称为“新的”海藻糖合成能力)的植物遗传工程。与在相同条件下生长的未被转化的植物相比，所期望的海藻糖含量的增加在于其可引起对环境压力耐受性的有益改善，或者可以有利地从植物中提取之，以用于商业目的。

许多微生物都有产生海藻糖-6-磷酸(Tre6P)并进而将其水解成海藻糖的酶系统。例如，啤酒酵母即具有包括56、102和123KDa亚基的海藻糖合成酶复合物(Londesborough&Vuorio(1993)Eur.J.Biochem.216，814-848)，该酶复合物首先将尿苷二磷酸葡糖(UDPG)和葡萄糖-6-磷酸(Glc6P)缩合成Tre6P(Tre6P合成酶反应)，然后再水解成游离海藻糖(Tre6Pase反应)。Tre6P合成酶和Tre6Pase活性分别存在于56和102KDa亚基中，123KDa亚基则使复合物具有调节特性并起到稳定作用。其他微生物系统包括产朊假丝酵母(Soler at al.(1989)FEMS Microbiol Letters 61，273-278)、大肠杆菌(Glaever et al.(1988)J.Bacteriol.170，2841-2849)、盘状网柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)(Killick(1979)Arch.Biochem.Biophys.196，121-133)和包皮垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatis)(Lapp et al.(1971)J.Biol.Chem.246，4567-4579)的酶系统，后两个系统可使用腺苷二磷酸葡糖(ADPG)代替UDPG。有关后者提到的这些微生物酶系统之亚基结构的资料很少。也可以推想包括线虫、昆虫和更苏植物在内的产生海藻糖的多细胞生物体含有聚Tre6P合成酶和Tre6Pase活性的酶。

原则上，将这些Tre6P合成酶中的任何一种转移到植物内，均可得到有新的合成Tre6P能力的植物。已揭示某些植物，例如烟草，具有将Tre6P转化成海藻糖的固有能力，从而令人惊奇地发现，单独用编码Tre6P合成酶的基因转化例如烟草即可有效地产生海藻糖。但如果Tre6P向海藻糖的内源性转化很慢或缺乏这样的能力，则也可以转移得自任何适当来源的Tre6Pase。例如在使用其中Tre6P合成酶和Tre6Pase均为海藻糖合成酶之亚基的酵母酶系统时，用得自同一来源的Tre6P合成酶和Tre6Pase基因进行共转化可能是有利的，因为这样便可形成天然酶复合物。不管酶的来源如何，均可提取转基因植物中生成的海藻糖，或者可赋予植物以对某些环境压力的更高的耐受性。已经描述过在以这种方式用某些酵母基因转化的植物中生产海藻糖的方法(PCT/FI93/00049)。

虽然可期望海藻糖在某些时间(例如在植物接触到环境压力期间或在成熟的植物中)或某些组织中(例如在储存器官中，或在适当时间于霜冻敏感性组织中)的积聚对植物有益，或者至少对植物无害，但也存在相反的可能性，即在其他时间和其他组织中海藻糖的积聚可能是对植物有害的(Veluthambi et al.(1971)，文献同上)。因此，使用在植物成熟或遇到干旱和低温等环境压力之前不能导致海藻糖之基因充分表达的植物启动子(其作为促成编码序列转录之基因的一部分)将是有利的，在这种情况下海藻糖对植物的好处超过其可能对植物带来的不利。这类非组成性植物启动子的一些实例是本领域技术人员已知的，其中包括驱动RUBISCO小亚基之光诱导表达的小亚基核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)启动子(Krebbers et al.(1988)Plant Mol.Biol.11，745-759)。

公开了用正确融合到Rubisco小亚基基因启动子上之酵母TPS1基因的编码序列(开放阅读框架，ORF)转化的烟草和拟南芥属植物。TPS1编码酵母海藻糖合成酶的56KDa亚基。被转化的植物是健康和可育的，并且在其叶子含有海藻糖。未被转化的烟草和用缺少TPS1基因的相似载体转化的烟草则不含海藻糖。已公开的转基因植物是使用根瘤农杆菌介导转化而得到的，但也可以使用本领域已知的任何方法进行转化，其中包括经微量注射、电穿孔或颗粒轰击以直接导入DNA(Gasser&Fralev(1989)Science 244，1293)。

这些被转化的烟草植物中有一株(转化体4)显示出含有Tre6P合成酶活性。已经知道，游离的56KDa亚基从酵母的完整海藻糖合成酶复合物中分离出来时是不稳定的(Londesborough&Vuorio(1993)，文献出处同上)。描述了本领域技术人员可利用的共转化植物的方法，即使用处于植物启动子，例如ats1A启动子或某些组成性便利启动子控制下的TPS1基因和其他酵母海藻糖合成酶基因(TPS2和TSL1)之一或两者进行共转化。由于由TPS2和TSL1编码的亚基可稳定56KDa亚基，所以与只含有TPS1的植物相比，这种共转化可增加植物的海藻糖含量。

在用处于可诱导的启动子控制下的Tre6P合成酶基因与处于组成性启动子控制下的Tre6Pase或调节蛋白质(例如TSL1产物)的一个或多个基因共转化的植物中，由于Tre6P合成酶催化海藻糖生物合成的第一个唯一步骤，所以其中海藻糖的产生将受到可诱导性启动子的调节。

公开了被转化的产海藻糖烟草植物被证明具有提高干旱耐受性。这一点通过用离体的叶片和全植株进行的实验得以证实。成熟的植物和转化株自花授粉之子代的幼小籽苗表现有改善的干旱耐受性。在这些子代中，如根据子代的绿色组织中存在52KDa Tre6P合成酶亚基所表明的，干旱耐受性与TPS1+特性共分离。

已公开的转基因植物对水环境压力的耐受性是令人惊奇的，因为存在于其组织中的海藻糖的量实在太小以致难以对细胞内容物提供渗透缓冲作用。可能是海藻糖通过保护特异性部位例如膜而起作用，或者可能是海藻糖或其前体(Tre6P)扰乱了植物的代谢而阻止细胞发生对这种压力的次级改变。

公开了见于含嵌合TPS1基因之初级转化株中的轻微形态学改变，例如小刀形叶，主要在仍产生海藻糖的子代中消失的降低了顶尖生长优势和减低了植株高度。这些改变似乎主要是由于组织培养而人工造成的。但在最适条件下生长8周后，包括自花传粉的子代在内的产海藻糖烟草植物生长均有所减慢，较对照植物迟后1至2周。这表明在植物中合成海藻糖即使是处于ats1A启动子的控制下，也可以延缓生长。因此，可以使用环境压力诱导的启动子入LT178(Nordin et al.(1993)Plant Mol.Biol.21，641-653)以进一步有利于在非环境压力条件下保持植物的正常生长速率和产率，但同时如实施例5中所解释的，尚可在压力条件下提供海藻糖诱导的保护机制。

虽然只用编码Tre6P合成酶的酵母TPS1基因而不用编码Tre6Pase的TPS2基因转化植物，但这些转基因植物仍合成海藻糖。由此可见，某些植物具有将Tre6P转变成海藻糖的内源性能力。在某些情况下用例如编码Tre6Pase的TPS2基因进行共转染，以提高Tre6P向海藻糖转化的速率也是可行的。再者，用得自酵母以外之生物体的Tre6P合成酶(和Tre6Pase)基因进行转化显然可以得到相似的结果。这些基因许多都是与TPS1(和TPS2)同源的，并且可以使用或衍生于酵母系统之酶和基因的免疫学和寡核苷酸探针很容易地克隆之。例如，已报导来自包皮垢分支杆菌的Tre6P合成酶是一种可与抗纯化的酵母海藻糖合成酶56KDaTre6P合成酶亚基的抗血清发生交叉反应的约55KDa多肽。公开了包皮垢分支杆菌Tre6P酶之胰酶解肽的氨基酸序列，揭示出其与酵母酶的密切序列同源性。本领域技术人员可以很容易地使用这些手段从许多生物体中克隆Tre6P合成酶和Tre6Pase的基因。本发明包括用得自任何实用生物体的并融合到适当的植物启动子上的Tre6P合成酶和Tre6Pase基因转化植物。

可按几种方式使用以一个或多个海藻糖合成酶基因转化植物所得到的含海藻糖植物。例如，可以在商业化生产规模上从植物中提取海藻糖。这些海藻糖能够以足够便宜的价格大批量应用，如用于在干燥期间保持食品原料的风味和结构。为了这一应用目的，海藻糖最好是积聚在储存器官中，例如马铃薯的块茎、糖甜菜或芜菁的根或洋葱的鳞茎中。已描述了转化这些举例的植物及许多其他农作物植物的方法(Lindsey(1992)J.Biotechnol.26，1-28)，但本发明不只限于这些分子生物学家经常用来作为实验模型的植物。本领域技术人员可以将发展模型植物的方法应用于其他植物。因此，也可以在例如被转化的甘蔗茎或叶或香蕉的果实中实现本发明。致使在储藏器官中特异性表达的植物启动子是本领域已知的(例如patatin启动子)。在本发明一个方面，将Tre6P合成酶基因例如TPS1的编码序列以如TPS1编码序列融合到ats1A启动子上的同样方式融合到这样的启动子上，并用这些DNA构建体转化适当的植物。然后提取在储藏器官中积聚的海藻糖。

在本发明的另一个方面，在植物组织中积聚的海藻糖可改善收获后的储藏特性。因此，被转化烟草的离体叶片水分散失比未被转化的烟草更慢，甚至在丢失水分后也不会逐渐褪色(图5)。这个方面的优点可适用于食用植物及观赏植物。就可食植物而言，特别是对于零售市场各种商品生菜类植物于收获后出现的枯萎和褪色将带来严重的经济损失。损失最后被加在消费者身上。产海藻糖生菜将为消费者提供更便宜和更吸引人的沙拉。相似的考虑也涉及其他一些食用植物，特别是叶用产品例如甘蓝、嫩茎花椰菜、莳萝、菠菜或荷兰芹及其他绿色蔬菜如豌豆和红花菜豆。许多观赏植物如玫瑰、郁金香、黄水仙等都是在切下后运输的。既使用高成本运输方式(冷藏、空运)也会失去较多水分。较好地保留其水分含量并且对褪色的敏感性较小的产海藻糖观赏植物则以较低价格为消费者提供更喜爱的产品。在本发明的这个方面，Tre6P合成酶基因融合到所选用的植物启动子上，从而使海藻积聚在待收获的植物部分中。例如，ats1A启动子使Tre6P合成酶在烟草的叶、上部茎及花芽中表达，并且使海藻糖积聚在这些部位中。但本发明人揭示，烟草等植物可将海藻糖从其合成部位运输到并不合成海藻糖的组织中。因此，虽然非组成性ats1A启动子并不能使Tre6P合成酶在根中表达，但在这些转基因烟草植物的根中也可见到小量的海藻糖。

在本发明的一个相关方面中，含有海藻糖的转化植物的可食部分如番茄、浆果及其他果实，由于含有海藻糖，所以可被加工成更新鲜更富有风味的果泥、糊、果冻和果酱。已显示(WO89/00012)向这些食品原料中加入海藻糖可有利于保存其风味，特别是在进行包括干燥步骤的加工时。本发明通过提供已含有海藻糖的植物而不必再加入海藻糖。在本发明的这个方面，使用指导海藻糖主要在把植物的储藏器官中合成的启动子例如patatin启动子可能是有益的。

本发明公开的产生海藻糖的转化烟草提高了对干旱的耐受性。一般说来，含有海藻糖的被转化植物对干旱、霜冻、高盐及其他环境压力可以比未被转化的植物有更大的抗性。因此，干旱、霜冻和渗透压力基本上都因从细胞内排出水分，损伤细胞膜和蛋白质而破坏植物，已知海藻糖会在体外减缓这些损害(Crowe et al.(1992)Annu.Rev.Physiol.54，579)。在本发明的这个方面，所使用的植物启动子可以是环境压力诱导的启动子。这样的启动子是本领域中已知的，例如有LTI78(Nordin et al.(1993)Plant Mol.Biol.21，641-653)和RAB18(Lang&PalVa(1992)Plant Mol.Biol.20，951-962)。使用这些启动子将防止在尚不需要合成时合成海藻糖。对于生长良好而又含有海藻糖的植物来说，可以不需要压力诱导的启动子来实现本发明的这个方面。但是使用压力诱导的启动子防止在有所需要前合成海藻糖还有另外一些优点，其中包括避免应按其他方式转换光合成能力来合成海藻糖所造成的产量损失，并且避免如携带pats1A-TPS1嵌合体之烟草所出现生长延迟。这个方面的优点不仅可用于食用植物，而且也可用于在花园或室内展示的观赏植物。被转化的压力耐受性观赏植物只需要比相应的未被转化植物较少的照护。致使在初始转化株中观察到的某些产海藻糖植物生长较慢和很小的形态学改变并不是观赏植物的缺点：特别是对于室内观赏植物来说，生长较慢和新的外观可能是具有吸引力的特征。

在本发明的另一个方面，Tre6P合成酶基因被适当地融合到遇到特殊事件或环境条件(例如干旱或寒冻压力)时得以被激活的植物启动子(例如LTI78或RAB18)上，从而可促进植物积聚商业上可提取量海藻糖的过程发生在收获前不久的成熟植物中，以避免海藻糖对某些植物之早期发育过程的任何不利影响。

基于如上的公开，本发明的转基因植物可以是玉米、燕麦、粟、小麦、稻米、大麦、高粱、苋菜、洋葱、芦笋或甘蔗等单子叶植物，或苜蓿、大豆、矮牵牛花、棉花、甜菜、向日葵、胡萝卜、芹菜、甘蓝、黄瓜、胡椒、番茄、马铃薯、小扁豆、亚麻、嫩茎花椰菜、烟草、菜豆、莴苣、油菜、花椰菜、菠菜、抱子甘蓝、洋蓟、豌豆、秋葵、南瓜、散叶甘蓝、羽衣甘蓝、茶或咖啡等双子叶植物。

酵母基因TPS1和其表达产物是烟草的生物化学机制相适应的：基因得以高表达并且56KDa亚基导致海藻糖的显现。但本领域已知的是，与例如微生物相比植物基因常常有较低的A+T比例，并且可通过改变密码子使用，特别是改变靠近编码序列开始部分的密码子使之成为见于植物中的密码子来提高异源基因在植物中的表达水平(Perlak et al.(1991)88，3324-3328)。我们设想对基因进行这些和相似的修饰可适用于本发明。

已知在基因中发生天然突变。DNA序列中的这些改变及其他人工改变可导致所编码之多肽的氨基酸序列改变。本文所使用的术语“TPS1”(或TPS2或TSL1)包括所有与TPS1(或TPS2或TSL1)同源的DNA序列，后者编码具有酵母海藻糖合成酶56KDa(或102KDa或123KDa)亚基之预期功能或结构特征的多肽。同样，术语“编码Tre6P合成酶(或Tre6Pase或调节性多肽)的基因”不仅包括可从天然生物体中很容易分离(例如使用根据TPS1或TPS2或TSL1的已知序列设计的核苷酸探针)的基因，而且包括天然或人工变异体，这些变异体编码的多肽与原始分离的基因编码的多肽有相同功能和结构特征。

实施例一般材料和方法

材料。所使用的植物是Nicotiana tabacum cv.SR1和Arabidopsisthaliana L.Heynh.生态型C-24。

从Vuorio等人((1993)Eur.J.Biochem.216，849-861)所述的质粒pALK752和pALK754中得到编码海藻糖合成酶之56KDa Tre6P合成酶亚基的酵母基因TPS1(以前称为TSS1)和编码海藻糖合成酶之123KDa调节亚基的TSL1。酵母基因TPS2得自由Drs Claudio De Virgilio和Andres Wiemken(Botaniches Institut der Universitt Basel，Switzerland)提供的并含有克隆到质粒YCplac111之SacI位点中的TPS2基因的质粒。该基因(如Virgilio er al.(1993)Eur.J.Biochem.212，315-323所描述的)编码如Vuorio等人(1993，文献出处同上)的表1中所示的衍生于102KDa亚基的氨基酸序列。所制备的抗血清为抗酵母海藻糖合成酶的抗血清(抗TPS/P)和抗56KDa亚基的抗血清(抗57K)，通用生物化学方法参见Vuorio等人的上述文献。液泡海藻糖酶是按照Londesborough和Varimo((1984)Biochem.J.219，511-518)所述的方法从suc-gal-mel-mal-酵母菌株(ALKO2967)中部分纯化的，并且它不能水解蔗糖、麦芽糖及密二糖。

DNA操作。所有的DNA操作均按照已建立的实验室方法(Sambrooket al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NewYork)进行。使用大肠杆菌菌株DH5α和MC1061进行质粒制备。用于控制TPS1表达的启动子来自A.thaliana的编码Rubisco之小亚基的ats1A基因(Krebbers et al.(1988)，文献出处同上)。

为了构建ats1A-TPS1基因嵌合体，经PCR从质粒pGSFR401扩增缺乏转运肽之编码序列的ats1A启动子片段。使用合成的寡核苷酸引物在扩增之片段的5′端造成一个EcoRI位点并在3′端造成一个XbaI位点。用适当的限制性酶消化PCR扩增产物，在琼脂糖凝胶上纯化后连接到用EcoRI和MluI消化的pUC19质粒中。从上述的质粒pALK752中扩增酵母TPS1基因。所得到的片段即含有5′MluI酶切位点及3′XbaI酶切位点。经酶消化和琼脂糖胶纯化后将所得片段连接到pUC19中pats1A的后面。用EcoRI和XbaI切割带有启动子-TPS1构建体的片段，然后将其插入到pBluescript II SK+(Stratagene)衍生质粒中，其中该衍生质粒携带有包括其聚腺苷酸化信号和T-DNA右侧边缘之T-DNA基因GF的3′末端。最后，将整个嵌合基因作为EcoRI-SacI片段插入到嵌合有选择性标记卡那霉素抗性基因pNOS-NEO-3′OCS的载体pDE1001(Denecke et al.(1992)EMBO J.11，2345-2355)中。这样得到的质粒pKOH51携带有嵌合的pats1A-TPS1-3′GF基因。通过转化将所得构建体转入大肠杆菌菌株DH5α中，然后经电穿孔(Dower，Miller&Ragsdale(1988)Nucl.Acids Res.16，6127-6145)将其转移到含有非致癌性Ti质粒pGV2260(Deblare et al.(1995)Nucl.Acids Res.13，2777-2788)的根瘤农杆菌(C58C1rif^R)中。

以相似方法制得其他构建体。

植物材料的生长。为了进行纯性培养，将经过灭菌的Nicotiana tabacum(SR1)的外植体植于含有添加了2％蔗糖的MS(Murashige&Skoog(1962)Physiol.Plant 15，473-497)固体培养基(SM-2)的玻璃罐中。然后将这些罐放在控制培养条件的培养室中，使植物于22℃光照生长16小时。按时将外植体移至新的加有MS-2培养基的罐中继续培养纯性材料。使温室植物生长于盒内的土壤中并每天洒水。首先按上述培养烟草的方法使被转化的A.thaliana植物在受控制的环境中于小型食物罐内纯性生长，然后转移到温室内，使之在盛有土壤的盆中产生种子。将由初始转化株产生的种子直接植入土壤中产生新的种子，或者经表面灭菌后使之在24孔组织培养板上纯性生长，以进行分子分析。

植物转化。按照下述方法用被切下的烟草叶和A.thaliana的根转化烟草和A.thaliana。基本上按照Valvekens等人((1988)Proc.Natl.Acad.Sci，USA，85，5536-5540)所述的方法进行转化和组织培养，但对方法作了如下改动。将分离的根或叶在愈伤组织诱导固体培养基(CIM)上预培养4天，将根切成小段(1-2mm)并将叶切成较大的碎片(10-20mm)，然后移入20ml CIM液体培养基中。加入3′，5′-二甲氧基-4′-羟基乙酰苯(0.2mg/L)后进行农杆菌(C58C1 rif^R)感染。将用于感染的细菌加在含有适当抗生素的YEβ培养基(Vervliet et al.(1975)J.Gen.Virol.26，33-48)中28℃增殖过夜，并离心收集之。然后将细菌沉淀物重新悬浮在10mM MgSO₄中，加至植物组织中并轻轻混合约15分钟。倒掉过量的液体并将根转印在无菌滤纸上。在固体CIM上共培养2天后，用液体CIM将植物组织淋洗3-4次以洗掉细菌，并转移到选择的生芽培养基(SIM)上。生长7天后，将形态发生分化的外植体部分转移到新鲜SIM中。

提取蛋白质用以Westem分析。在含有100μl蛋白质提取缓冲液(50mM Tris/HCl pH7.2，250mM蔗糖、5mM EDTA、10mM MgCl₂、1mM CaCl₂、10mM β-巯基乙醇、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、30μM胃酶抑制剂、50μM亮抑蛋白酶肽和15μM抑蛋白酶肽)的1.5ml微量离心管中，用玻璃匀浆100-200mg鲜重的植物样品。经两次离心(13,000g，10分钟)除去不溶性材料。按照Bradford((1976)Anal.Biochem.72，248-254)的方法，使用牛血清蛋白作为标准品测定上清液中的蛋白质浓度。将等量的可溶性蛋白质加于SDS-PAGE凝胶上进行免疫学研究。

SDS-PAGE和免疫学技术。以SDS-PAGE法(Laemmli(1970)Nature 227，680-685)分离蛋白质。为了检测蛋白质，用抗57的抗血清(1/1000稀释)和偶联了碱性磷酸酶的抗兔第二抗体进行免疫印迹分析。为了进行Western印迹反应，将蛋白质电泳转移到硝酸纤维素滤膜上并用加在5％乙酸中的0.5％丽春红(Ponceau Red)染色，以确保有相等的上样量并且已转移成功。然后用5％脱脂干奶粉封闭滤膜，并用标准方法探查和染色。

Tre6P合成酶检测法。称取约500mg冷冻的植物材料，然后在固态CO₂上用研钵和研杵将其研磨成细粉末。将粉末转移到0.7ml含有1mM苄脒、2mM MgCl₂、1mM EDTA和1mM二硫苏糖醇(其中还含有1mM PMSF和各10μg/ml胃酶抑制剂A和亮抑蛋白酶肽)的50mMHEPES/KOH(pH7.0)(HBMED)中，并使之逐渐溶解。以17,000×g将所得匀浆液离心10分钟并基本上按照Lapp等人((1971)J.Biol.Chem.246，4567-4579)所述的方法检测上清液中的Tre6P合成酶。将样品(10μl)加到90μl含有40mM HEPES/KOH(pH7.0)、10mMMgCl₂、10mM葡萄糖-6-磷酸、5mM果糖-6-磷酸、5mM尿苷二磷酸葡糖(UDPG)和1mg/ml牛血清白蛋白的反应混合物中，并于30℃保温所需的时间。到2分钟时加热至100℃终止反应。加入50μl 0.6M HCl并于100℃加热5分钟，然后加入50μl 8％NaOH并于100℃加热15分钟，以破坏除海藻糖和海藻糖-6-磷酸外的糖衍生物(包括所生成的蔗糖)。然后用蒽酮检测法(Trevelyan&Harrison(1956)Biochem.J.63，23-33)检测保留的碳水化合物(即海藻糖和海藻糖-6-磷酸)。

海藻糖检测法。快速称量约500mg冷冻的植物材料加到玻璃试管中。加入热蒸馏水后将混合物煮沸20分钟，用圆头玻璃棒将叶子捣碎。用吸管收获液相并用0.5ml水再次提取固形物。离心澄清合并的液相。于107℃干燥合并的固态残留物使之达到恒重(叶子的干重平均为鲜重的5.1％)。使用配有Dionex脉冲电化学检测器(PED-2)的DionexDX-300液相层析仪分析上清液。通过Carbopac PA-1(4×50mm)前置柱将样品(20μl；一式三份)注射到Carbopac PA-1(4×250mm)柱上并以1ml/分钟的流速用水洗脱。将洗脱物与后置柱试剂(流速为0.6ml/分钟的0.3M NaOH)混合。海藻糖出现在约3分钟时，远在约20分钟时出现的葡萄糖和蔗糖峰之前。实施例1：用处于ats1A启动子控制下的酵母TPS1基因转化烟草植物并

     由之产生海藻糖

使烟草转化株和对照植物生长于无菌的“试管内”条件下和温室中。与未被转化的对照组和用载体pDE1001(缺少TPS1)转化的对照组相比，成熟的转化株没有明显的表型改变。于0900小时收集叶片、冷冻并储存于-70℃或-70℃以下备分析时使用。

试验了26个卡那霉素抗性转化株，结果当用抗纯化的酵母海藻糖合成酶56 KDa Tre6P合成酶亚基的抗血清探查时，发现有20株产生可检测水平有预期大小的免疫反应性多肽。实例示于图2中。表1中总结了叶片的海藻糖含量。

  表1  烟草之TPS1转化株的海藻糖含量烟草植株          特殊处理        海藻糖

                            (mg/新鲜叶)试管内植株未被转化的SR1       -             ≤0.002pDE1001对照        -             ≤0.002转化株1          -               0.02转化株3          -               0.009转化株4          -               0.067转化株8          -               0.075转化株8   乙醇提取代替水提取     0.055温室植株pDE1001对照         -             ≤0.002转化株1          -               0.16转化株4          -               0.16转化株4      碱性磷酸酶^a        0.13转化株5          -               0.052转化株6          -               0.044转化株8          -               0.039转化株8      特异性海藻糖        0.021转化株19         -               0.053转化株19     碱性磷酸酶^a        0.060转化株19     特异性海藻糖        0.016转化株25         -               0.036转化株26         -               0.11

a在使载体[¹⁴C]海藻糖-6-磷酸去磷酸化的条件下用碱性磷酸酶处理提取物。

这些结果揭示，当酵母TPS1基因的启动子被ats1A启动子取代时，其可在烟草中得以有效地表达。在Westem印迹上观察到的特定信号具有正确的分子量。加到凝胶上的每单位蛋白质的最强信号(例如得自生长于试管内的转化株4的信号)只比得自静止期酵母的信号稍弱些。TPS1的表达伴随叶组织中出现海藻糖，后者则是根据其HPLC行为和它可被高特异性海藻糖酶降解而认定的(也参见图3)。基于尚未明确的原因，不同的转化株以不同的水平表达TPS1产物，并且(就转化株8的表观表达来说)见于叶片中的海藻糖量大致与Western印迹中的56KDa信号的强度相关(比较图2和表1)。虽然这些转化株并不携带编码重组Tre6Pase的基因，但并没有证据表明植物中积聚了比海藻糖更多的TreP。很明显，烟草具有能够将Tre6P转变成海藻糖的磷酸酶，表明至少对于这种植物来说为导入海藻糖合成途径所必需的关键酶是Tre6P合成酶，并且尽管不一定是最佳的，单独导入该酶也是足够的。

检测56KDa Tre6P合成酶亚基在转基因植物系4中的组织分别显示，可在除植物下部茎和根以外所有绿色部分中见有相当量的这种多肽(参见图4)。这一分布是与ats1A基因表达的组织特异性相符合的(DeAlmeida et al.(1989)Mol.Gen.Genet.218，78)。图4也显示表达Tre6P合成酶的组织中也含有海藻糖。此外，在根中可见有较小量的海藻糖，表明转基因烟草可从其合成部位向其他组织输送海藻糖。

结果还揭示，表达处于ats1A启动子控制下的TPS1并在光照期间在其绿色组织中积聚海藻糖的烟草植物是健康的并且外观是正常的。虽然含有嵌合TPS1基因的初始转化株有某些小的形态学改变，例如呈现小刀形叶片、降低了顶端优势并减低了高度(见图5和6)，但大多数改变并没有出现于仍产生海藻糖的自花授粉的TPS1阳性子代中。因此，初始转化株的形态学改变似乎是因组织培养而人为造成的，而不是因产生海藻糖造成的。但与未被转化的对照组相比，产生高水平Tre6P合成酶亚基并存在海藻糖没有致使转基因植物在正常条件下的生长速度明显(20～50％)降低。这些转基因植物的显然正常的表型与已报导的外源加入海藻糖对某些植物的毒性相反(Veluthambi et al.(1981)，文献出处同上)。这些结果揭示，虽然在sts1A启动子控制下于植物内产生海藻糖可能使植物的生长速度有些减慢，但对烟草植物并没有毒性。可使用由干旱或寒冷等特定过程激发的可诱导性启动子，通过只在需要时才引起海藻糖产生来尽可能地减小生长速度的降低。

基于蛋白质含量，表1中所示的最好转化株的海藻糖含量(例如≥16mg/g转化株4的蛋白质)已经是在酵母中观察到的使热耐受性有明确改善之含量水平的至少20％(De Virgilio et al.(1990)FEBS Letters273，107-110)。

检测某些TPS1转化株和对照植物中的Tre6P合成酶活性。表2中所示的结果是从一式两份0和15或30分钟检测所得到的平均值±最大范围。就对照组来说，Tre6P合成酶活性几乎等于零。就转化株4来说，在UDPG和G1c6P存在下积聚了酸和碱稳定性碳水化合物。这种积聚需要G1c6P，但不需要6-磷酸果糖(Fru6P；该磷酸己糖激活酵母的天然海藻糖合成酶复合物)，并且当用ADPG代替UDPG时可抑制这种积聚(从酵母中纯化的酶也不能使用ADPG)。因为其他可能的产物均被水解破坏，所推测其中积聚的碳水化合物是海藻糖或Tre6P。因此，在这些体外检测条件下，由转化株4的提取物合成Tre6P要比将其转变成海藻糖更快。这表明可以用编码Tre6Pase亚基的TPS2共转化来增加叶子中海藻糖合成的总速率。

用表2中所示方法测知的酵母提取物的Tre6P合成酶活性与按Londesborough和Vuorio((1991)J.Gen.Microbiol.137，323-330)所述检测UDP出现的方法测知的活性相一致。此外，在烟草植物提取物存在下检测的酵母提取物没有受到抑制。因此，表2中对照植物没有测得活性并不是由于受烟草植物中所存在的某些因子的干扰所致。

表2  TPS1转化的烟草叶和对照组烟草叶的Tre6P合成酶活性

(所有结果都是用在无菌条件下试管内生长的植物得到的)

 转化株      检测混合物     Tre6P合成酶活性

                              (mU/g新鲜叶)

                            15min     30min未被转化的对照组    全部         3±47     3±21PDE1001对照组       全部        22±35     7±8转化株4，实验1      全部       259±147   60±6转化株4，实验2      全部       128±39   155±22

             较少Glc6P      12±19    -1±12

             较少Fru6P     153±10   144±3

           ADPG代替UDPG      0±52     4±21

见于转化株4中的Tre6P合成酶活性是不稳定的。某些提取物在冰上存放几个小时活性便会消失。但见于Western分析中的特异性带仍以其差不多原有的强度存在于室温下储存了24小时的提取物中。因此，有可能是在烟草提取物的储存期间发生了Tre6P合成酶亚基构象的改变。这些结果表明，可同时用TPS1和一个或多个酵母海藻糖合成酶的其他亚基基因转化烟草，以提高Tre6P合成酶亚基的构象稳定性，从而达到提高Tre6P合成酶活性的目的。实施例2：转基因Arabidopsis thaliana

以上述构建烟草转化株的同样方法构建含有处于ats1A启动子控制下之TPS1的A.thaliana植物。这些被转化的拟南芥属植物也是健康的并有正常的外观，而且产生了能育的种子。对从初始转化株的种子长出的植物进行Western分析，显示它们含有酵母海藻糖合成酶的56KDa亚基(图10)。显然可以预略的是，这些植物可在其绿色组织中积聚海藻糖。实施例3：产海藻糖烟草植物的干旱抗性

为了检测是否转基因烟草中所产生之海藻糖的量足以提高它们的干旱耐受性，对试管内增殖的对照组和转基因系植物的离体叶片进行风干(25％相对湿度，RH)(图5)。对照植物的离体叶片迅速丢失水分并在施加环境压力3小时后显示出变为褐色的征象，而产海藻糖植物的叶片在长达24小时后仍呈绿色，同时明显降低了水分丢失。因此，海藻糖的保护作用看来是两方面的：首先，合成海藻糖的转基因植物的离体叶片似乎最初就有改善了的保水作用。只是在延长了干燥处理后产海藻糖植物和对照组植物之间的这种差异才消失。第二，对照组叶片表现出明确的标志和变褐色的征象。相反，含海藻糖植物的叶片只是24小时后仍呈绿色，并且只有在延长干燥环境下的暴露时间后(例如几天)才出现变褐色的征象。甚至在同样水含量情况下产海藻糖植物和对照植物之间也有清楚可见的差异。因此，海藻糖似乎可阻止植物组织遭受脱水的影响，并且可降低水分丢失的速度。叶片变褐色的一部分原因可能是由于Maillard反应所致，即其中还原糖与多肽的游离氨基及产生褐颜色的氨基酸反应。银非还原糖海藻糖并不参与该反应，甚至抑制其他糖与蛋白质之间的反应(Roser&Colaco(1993)，New Sciennist 1973，24)。

海藻糖保护被切下的叶子免受干旱损伤表明海藻糖既使在完整植物水平上也可能有相似的作用。为了估测是否海藻糖能够提高完整植物的干旱耐受性，我们使试管内增殖的完整植物暴露于风干条件下(30％RH，图6A)。在3至4小时内对照植物失去充盈状态并出现萎蔫。相反，产海藻糖的基因植物在经过长时间风干后只显示出充盈状态丧失的征象。干燥处理17小时之后，使植物重新水化并记录植物的存活率(图6A)。未被转化的对照植物既使在长时间重新水化后仍没有恢复，因而经此处理后未能存活。相反，产海藻糖的转基因植物系虽然明显萎蔫并且丢失了大部分组织水分(降至鲜重的30％)，但干燥17小时后却仍然存活。

幼小籽苗也表现有提高的干旱存活性(图6B)。将转基因系8产生的3周令籽苗连同未被转化的和载体转化的对照籽苗一起暴露于风干条件(50％RH)下，证明产海藻糖植物和对照植物间在干旱耐受性上存在明显的差异。与对照植物相比，转基因的海藻糖阳性系8显示出延迟的充盈状态丢失和在脱水环境压力下的较高存活性(图6B)。实施例4：由编码Tre6P合成酶和一个或多个编码Tre6Pase或调节性多

     肽的基因共转化的植物产生海藻糖

本领域技术人员可以制备含有处于ats1A启动子控制下的酵母TPS2和TSL1基因之编码序列的载体，并按“一般材料和方法”及实施例1中所述的方法用它们转化烟草、拟南芥及其他植物。为了得到同时用TPS1和其他基因即TPS1和TSL1之一或两者转化的植物，可以使个别转化株相互杂交，或用第二个基因进一步转化一株已被转化的植物，或者用含有连接到适当启动子上之两个或三个基因的载体进行转化：例如，可将TPS1连接到非组成性ats1A启动子上以在海藻糖合成过程中提供控制作用，并由组成性启动子驱动其他基因的表达。

预期受控制的酵母海藻糖合成酶复合物之两个或多个亚基(至少一个是56 KDa亚基)基因的表达将导致海藻糖在植物绿色组织中积聚量的增加，因为其他基因的存在将使56KDa亚基得以稳定化。此外，导入102KDa Tre6Pase亚基将是有利的，因为当Tre6P合成酶亚基的稳定性增加时，可望它将降低Tre6P的潜在积聚量。

很显然，对于这种类型的构建来说，可以用某些其他Tre6P合成酶结构基因的编码序列取代TPS1的编码序列，用某些其他Tre6Pase基因的编码序列取代TPS2序列并用某些其他编码对Tre6P合成酶和Tre6Pase赋予调节性质或稳定性之基因的编码序列取代TSL1序列，其中所采取的方式如同由TSL1产物对天然酵母海藻糖合成酶赋予这些性质一样。实施例5：用处于环境压力诱导的启动子控制下的Tre6P合成酶基因转

     化植物

已知例如LTI78(Nordin et al.(1993)Plant：Mol.Biol.21，641-653)和RAB18(Lang&Palva(1992)Plant Mol.Biol.20，951-962)等植物启动子是在对干旱和寒冷压力的反应中被诱导的。单独用处于这些压力诱导的启动子控制下的Tre6P合成酶基因如TPS1的编码序列，或者连同处于常规植物启动子控制下的Tre6Pase或调节肽或两者的基因一起转化烟草、拟南芥属植物或其他植物，可使海藻糖在植物组织中的积聚只在对这些环境压力发生反应时出现。这样，优点在于只有(1)当植物偶然暴露于环境压力时(由海藻糖提供保护作用，然后克服任何不利影响)，或者(2)当植物预先有准备地暴露于环境压力时才引起海藻糖的积聚，然后再从收获的植物中提取海藻糖，这样就可能避免不同量的海藻糖对某些植物的某些组织带来的不利影响，以及光合合成能力向产率降低方向偏转和可能的植物生长迟滞。实施例6：其他Tre6P合成酶的纯化、分析和克隆

尽管可能有产生海藻糖的其他代谢途径，但似乎正如Cabib和Leloir(1958，文献出处同上)所述，主要合成途径还是通过Tre6P。该途径中的关键酶是Tre6P合成酶，因为如上所述，一旦制得Tre6P，许多细胞就将能够使之去磷酸化而成为游离海藻糖。因此，本发明中的关键性原则是向靶植物内导入Tre6P合成酶活性。至于这种活性来自何处则不是最重要的。我们使用了碰巧是酵母海藻糖合成酶复合物之亚基(该复合物至少还含有其他两个亚基)的酵母酶。在这种情况下，虽然有证据表明来自酵母的56KDa Tre6P合成酶亚基，可在没有102和123KDa亚基的情况下在烟草中有效地发挥功能，但Tre6P合成酶亚基的最适活性可能需要存在有一个或多个其他亚基。

已知催化多种不同生物体内同一反应的酶常常是同源的，从而一旦克隆了该家族的一个成员后，便将有利于完成对其他成员的克隆工作。因为克隆了酵母Tre6P合成酶(Londesborough and Vuorio，(1992)USPA07/836,021)，所以进一步了解到存在一个包括来自大肠杆菌之Tre6P合成酶和来自热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)之蛋白质(McDougall et al.，(1993)FEMS Microbiology Letters 107，25-30)的同源蛋白质家族。我们决定试验是否其他生物体也含有同源Tre6P合成酶。

包皮垢分支杆菌含有已部分纯化的由Elbein的小组研究过的肝素活化的Tre6P合成酶(Liu et al.，(1969)J.Biol.Chem.244，3728-3791；Lapp et al，.(1971)J.Biol.Chem 246，4567-4579；Elbein and Mitchell(1975)Arch.Biochem.Biophys.168，369-377；Pan et al.，(1978)Arch.Biochem.Biophys.186，392-400)。由这些研究者纯化的酶在37℃及在最适量肝素存在下，用Glc6P和UDPG作底物(该酶可使用核苷二磷酸葡糖衍生物的光谱)进行检测，表明其具有0.8U/mg蛋白质的比活性。该制剂含有SDS-PAGE分子量约为45和90KDa的两个多肽。我们对作者的纯化方法进行了改动，其中包括在所使用的缓冲液中加入蛋白酶抑制剂及其他蛋白质保护剂，并在非离子型去污剂Triton X-100存在下加进一个最后的层析步骤。以下是我们最后使用的方法：

1)在含有1mM苄脒、2mM MgCl₂、1mM EDTA、1mM二硫苏糖醇、1mM苯甲基磺酰氟(DMSF)和10μg胃酶抑制剂A/ml的40ml 50mM HEPES/KOH(pH7.5)中裂解包皮垢分支杆菌细胞(在Luria培养液中生长3天并冷冻保存的28湿重细胞)，然后在Franch匀浆器中破坏之。将匀浆液以28,000g离心20分钟。向上清液内加入(NH₄)₂SO₄(每100ml加30g)。收集沉淀的蛋白质，溶解于含有0.1mMEDTA并加有0.1mM PMSF及10μg胃酶抑制剂A/ml之0.2mM二硫苏糖醇的20mM HEPES/KOH(pH7.5)(HED缓冲液)中，并对HED缓冲液透析过夜。

2)将透析液上样于3.4×25cm DEAE纤维素柱上并用加在1.2 LHED缓冲液中的达到0.9M NaCl的线性梯度，以20ml/小时的流速洗脱酶。合并酶的峰值部分(在0.2M NaCl时被洗脱)(33ml)，并调整到其中含0.5mM PMSF和5μg胃酶抑制剂A/ml。加入9.9g(NH₄)₂SO₄以沉淀蛋白质，并将沉淀的蛋白酶溶解在含有50mM NaCl、0.1mMEDTA和0.2mM二硫苏糖醇的50mM Tris/HCl(pH7.5)(TNED缓冲液)中。

3)使溶解的蛋白质(3.7ml)以36ml/小时的流速通过一个用TNED缓冲液平衡过的2.8×34cm Sephadex G100柱。然后将酶的峰值部分直接上样于一个1.5×8.5cm肝素-Sepharose(在TNED缓冲液中)柱上。用达到1.0M NaCl的梯度(在100ml缓冲液中)以5ml/小时的流速洗脱柱。在大约0.5M NaCl时洗脱出酶。

4)将肝素-Sepharose洗脱物(表3中的组分H37)的样品转移到加在Amincon小池内之PM10膜上的TNED/0.1％(V/V)Triton×100中，然后上样于用含有0.1％(V/V)Triton×100的TNED平衡过的0.7×8cm肝素-Sepharose柱上，并用加在50ml上述缓冲液中的达到1.0M的NaCl梯度洗脱。

       表3  从包皮垢分支杆菌中纯化Tre6P合成酶基本上按Londesborough和Vuorio(1993)所述方法，于35℃和0.25μg肝素/ml存在下检测Tre6P合成酶

      组分                 体积     比活性    总活性

                           (ml)    (mU/mg)     (U)28,000g上清液                   154       9        25.0透析的(NH₄)₂SO₄沉淀物       52       21        35.2DE52洗脱物                      33      139        23.4G100洗脱物                      21      385        14.6第一肝素-Sepharose洗脱物组分H33                         2.7    1880         0.9组分H34                         2.7    4380         2.1组分H35                         2.7    6190         2.7组分H36                         2.7    7890         2.8组分H37                         2.7    6340         1.6第二肝素-Sepharose洗脱物(只上样H37)组分T21                        1.4      ND         0.08组分T22                        1.4      ND         0.14组分T23                        1.4      ND         0.06

虽然经过第一个肝素-Sepharose层析步骤后的比活性比Pan等人(19878)报导的高得多，但SDS-PAGE(图7)却显示这些组分是不纯的。令人惊奇的是，在大约55KDa处的带只是强度与酶活性密切相关的主带。切掉55KDa带并在凝胶中用胰蛋白酶消化，然后经HPLC分离出胰酶解肽并按上述方法(Londesborough and Vuorio，1993，文献同上)进行序列分析。序列示于表4中并在序列表中给出。对于给出的双股序列的肽峰值部分29和31来说，已将氨基酸按表4中所述的同样方式随意地指定为SEQ ID NO 3和4(来自峰29)及SEQ ID NO 6和7(来自峰31)。肽13的前9个残基有89％完全相同于酵母之56KDa Tre6P合成酶的残基250-258(VGAFPIGID，参见Vuorio等人的上述文献(1993)；EMBL登录号为X67499)。

      表4  得自从包皮垢分支杆菌纯化之Tre6P

        合成酶的内部胰酶解肽的氨基酸序列

 肽峰                序列                   序列表

 13             VGAFPISIDSAEL            SEQ ID NO：1

 21             AT/GFLDALAATGETGDSGVT    SEQ ID NO：2

 29(双股)       RVVVNNTSR                SEQ ID NO：3

                YLEGAR                   SEQ ID NO：4

 25             QVLAHDVDR                SEQ ID NO：5

 31(双股)       IGGAQPAD                 SEQ ID NO：6

                VGALQVLL                 SEQ ID NO：7

 43             GEVQVGFR                 SEQ ID NO：8

为了进一步证实该约55KDa带代表Tre6P合成酶，作进一步的纯化尝试。该酶强有力地结合到UDP-葡糖醛酸琼脂糖柱上，但是不能被回收。因此，将组分H37转移到含有0.1％Triton×100的缓冲液中(在此转移过程中有2/3的活性丢失)并于Triton×100存在下再次过肝素-Sepharose柱进行层析。图8显示，除了两个比细胞色素c小的微弱带外，约55KDa带是存在于活性部分中的仅有的考马斯亮兰反应性材料。很明显，Pan等人(1978)所报导的90KDa多肽并不是来自包皮垢分支杆菌的该Tre6P合成酶的基本成分，而且约55KDa基本多肽的大小显著大于这些作者所报导的较小的45KDa成分。图9显示该多肽是由抗酵母海藻糖合成酶之56KDa Tre6P合成酶亚基的抗血清而不是由预免疫血清识别的，这表明包皮垢分支杆菌的Tre6P合成酶于酵母酶分享抗原决定基。研究了存在于相对粗的酶制剂中的其他免疫反应性带(见图9中泳道5和6)的性质：所有这些都不是由于大的蛋白质上样量人为造成的，而且代表某些相关的蛋白质。尽管如此，仍可使用抗酵母酶的抗血清从用皮皮垢分支杆菌基因库转化的宿主细胞中检测并分离出阳性克隆。同样，可使用表4中所示的氨基酸数据检查被分离之基因的序列。从酵母和包皮垢分支杆菌中分离的酶之间的免疫学和氨基酸序列相似性表明，也可以成功地使用根据TPS1基因设计的核苷酸探针筛选包皮垢分支杆菌基因。

总之，对包皮垢分支杆菌酶所作免疫学和测序研究证实，来自不同生物体的Tre6P合成酶都是同一个家族的成员。可以按使用TPS1的同样方式使用这些酶的基因制得能够合成海藻糖并改善了环境压力耐受性的转基因植物。

                            序列表(1)一般信息(i)申请人：Alko Group Ltd和

          Londesborough，John

          Tunnela，Outi

          Holmstrm，Kjell-Ove

          Mntyl，Einar

          Welin，Bjrn

          Mandal，Abul

          Palva，E.Tapio(ii)发明题目：产生海藻糖的转基因植物(iii)序列数：8(iv)通讯地址：

 (A)地址：Alko Group Ltd

 (B)街：Salmisaarenranta 7

 (C)城市：Helsinki

 (D)州：-

 (E)国家：Finland

 (F)区号：FIN-00180(v)计算机可读形式：

 (A)介质类型：Diskette，3.5 inch，720 kb

 (B)计算机：IBM PC/XT/AT

 (C)操作系统：PC-DOS

 (D)软件：WP5.1 file exported as DOS text file(vi)现有申请资料：

 (A)申请号：？

 (B)提交日：29 June 1995

 (C)分类：？(vii)先有申请资料：

 (A)申请号：FI 943133

 (B)提交日：29-JUNE-1994(2)SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征：

 (A)长度：13个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(iii)假设：无(iv)片段类型：N末端(v)序列描述： SEQ ID NO：1Val  Gly  Ala  Phe  Pro  Ile  Ser  Ile  Asp  Ser  Ala  Glu  Leu

                  5                       10(2)SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征：

 (A)长度：19个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(iii)假设：无(iv)片段类型：N末端(v)序列描述：SEQ ID NO：2Ala  Xaa  Phe  Leu  Asp  Ala  Leu  Ala  Ala  Thr  Gly  Glu  Thr  Gly  Asp

                  5                       10                       15Ser  Gly  Val  Thr(2)SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特征：

 (A)长度：9个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(iii)假设：有(iv)片段类型：N末端   (v)序列描述：SEQ ID NO：3Arg Val Val Val Asn Asn Thr Ser Arg

              5(2)SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特征：

 (A)长度：6个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(iii)假设：有(iv)片段类型：  N末端(v)序列描述：SEQ ID NO：4Tyr Leu Glu Gly Ala Arg

              5(2)SEQ ID NO：5的信息：(i)序列特征：

 (A)长度：9个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(iii)假设：无(iv)片段类型：N末端(v)序列描述：SEQ ID NO：5Gln Val Leu Ala His Asp Val Asp Arg

              5(2)SEQ ID NO：6的信息：(i)序列特征：

 (A)长度：8个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (D)拓扑结构：线性   (ii)分子类型：肽(iii)假设：有(iv)片段类型：N末端(v)序列描述：SEQ ID NO：6

Ile  Gly Gly  Ala  Gln  Pro  Ala  Asp

                     5(2)SEQ ID NO：7的信息：(i)序列特征：

 (A)长度：8个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(iii)假设：有(iv)片段类型：N末端(v)序列描述：SEQ ID NO：7

Val  Gly  Ala  Leu  Gln  Val  Leu  Leu

                      5(2)SEQ ID NO：8的信息：(i)序列特征：

 (A)长度：8个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(iii)假设：无(iv)片段类型：N末端(v)序列描述：SEQ ID NO：8Gly  Glu  Val  Gln  Val  Gly  Phe  Arg

                  5

Claims (29)

1.一种用融合到非组成性植物启动子上的海藻糖-6-磷酸合成酶基因的编码序列转化的植物，从而使被转化的植物具有新的海藻糖合成能力。

2.权利要求1的植物，其中植物启动子是组织特异的。

3.权利要求1的植物，其中植物启动子是光激活的。

4.权利要求1的植物，其中植物启动子是可因经受干燥、高盐碱或极端温度变化等环境压力而被激活。

5.权利要求1至4中任一项的植物，其中海藻糖-6-磷酸合成酶基因是微生物来源的。

6.权利要求5的植物，其中海藻糖-6-磷酸合成酶基因是编码酵母海藻糖合成酶之56KDa亚基的酵母基因TPS1。

7.权利要求1至6中任一项的植物，其为用编码海藻糖-6-磷酸酶的或编码与被导入之海藻糖-6-磷酸合成酶或海藻糖-6-磷酸酶相互作用之调节性多肽的至少一个基因共转化的。

8.权利要求7的植物，其中编码海藻糖-6-磷酸酶的基因是酵母TPS2基因，编码调节蛋白质的基因是酵母TSL1基因。

9.权利要求6的植物，其中植物启动子是pats1A。

10.权利要求1至8中任一项的植物，其中所使用的植物启动子是环境压力激活的启动子，例如LTI78或RAB18。

11.权利要求1至10中任一项的植物，其中所说的植物比未被转化的植物有更大环境压力耐受性。

12.权利要求1至11中任一项的植物，其为单子叶植物例如玉米、燕麦、粟、小麦、稻米、大麦、高粱、苋菜、洋葱、芦笋或甘蔗。

13.权利要求1至11中任一项的植物，其为双子叶植物例如苜蓿、大豆、矮牵牛花、棉花、甜菜、向日葵、胡萝卜、芹菜、甘蓝、黄瓜、胡椒、番茄、马铃薯、小扁豆、亚麻、嫩茎花椰菜、烟草、菜豆、莴苣、油菜、花椰菜、菠菜、抱子甘蓝、洋蓟、豌豆、秋葵、南瓜、散叶甘蓝、羽衣甘蓝、茶或咖啡。

14.从权利要求1至13中任一项的植物中海藻糖的产生。

15.由权利要求1至13中任一项的植物产生的种子。

16.增加植物的海藻糖含量的方法，该方法包括以下步骤：

—至少用海藻糖-6-磷酸合成酶的结构基因转化感兴趣的植物，以及

—表达处于适当启动子控制下的基因，以允许在基因表达过程中进行时序的、局部分布的或环境压力诱导的控制。

17.权利要求16的方法，其中基因是编码酵母海藻糖合成酶之56KDa亚基的酵母基因TPS1。

18.权利要求16或17的方法，其中植物是用处于非组成性启动子如pats1A控制下的海藻糖-6-磷酸合成酶的基因，和至少一个处于任何适当的启动子控制下的海藻糖-6-磷酸酶或海藻糖合成酶之调节亚基的基因共转化的，这样海藻糖的合成即受到控制海藻糖-6-磷酸合成酶基因之启动子的调节。

19.权利要求18的方法，其中海藻糖-6-磷酸酶或调节亚基的基因分别是酵母基因TPS2或TSL1。

20.权利要求16至19中任一项的方法，其中海藻糖合成酶基因的编码序列被融合到植物启动子上，供以引起在储藏器官中的特异性地表达。

21.生产海藻糖的方法，其包括以下步骤：

—用海藻糖-6-磷酸合成酶的结构基因转化植物，以产生转基因植物，

—于将诱导海藻糖-6-磷酸合成酶在植物中表达的条件下培养转基因植物，以及

—从植物的组织中提取海藻糖。

22.权利要求21的方法，其中基因是在允许对基因的表达进行时序性、局部分布性或环境压力诱导性控制之启动子的控制下表达的。

23.权利要求21的方法，其中转基因植物在其储藏器官中积聚海藻糖。

24.权利要求23的方法，其中植物是块根作物如马铃薯、甜菜或芜菁。

25.保护主要农作物植物以对抗干旱、高盐碱或极端温度变化的方法，其包括至少用与植物启动子融合的海藻糖-6-磷酸合成酶基因的编码序列转化植物，这样只有在植物遭遇到干旱、高盐碱或极端温度条件时才能实现基因的充分表达。

26.保护有可食果实的植物以防花受到霜冻损害的方法，其包括至少用与植物启动子融合的海藻糖-6-磷酸合成酶基因的编码序列转化植物，这样只有在植物遭遇到低温时才能实现基因的充分表达。

27.改善包括绿色食品原料、采摘的果实及观赏植物在内的已收获植物的贮藏性质的方法，该方法包括至少用与植物启动子融合的海藻糖-6-磷酸合成酶基因转化植物，以便提供这样的植物、其已收获的部分具有改善保水能力、改善脱水耐受性或两者。

28.有利于培养和维护观赏植物的方法，其包括至少用与植物启动子融合的海藻糖-6-磷酸合成酶基因转化植物，以便使植物与未被转化的植物相比具有改善了的环境压力耐受性。

29.改善由植物的可食部分制备的泥、糊、冻和酱的味道和质地的方法，其包括用与植物启动子融合的海藻糖-6-磷酸合成酶基因的编码序列转化植物，以便实现海藻糖在植物可食部分中的积聚。

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