CN115975869A - 一株经航天诱变菌种选育的解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株经航天诱变菌种选育的解淀粉芽孢杆菌及其应用。本发明提供了解淀粉芽孢杆菌HTYB‑MH71‑1，保藏登记号为CGMCC No.25355。与出发菌株相比：解淀粉芽孢杆菌HTYB‑MH71‑1生产嗜铁素、蛋白酶、纤维素酶、IAA等能力均得到了显著提高，生物膜形成和生长速度显著加快，发酵时间显著缩短，从而可以有效降低生产成本；并且，解淀粉芽孢杆菌HTYB‑MH71‑1对番茄灰霉病的防治效果大幅度增强。因此，解淀粉芽孢杆菌HTYB‑MH71‑1是一株更加高效的极具开发价值的生防菌株。

Description

一株经航天诱变菌种选育的解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一株经航天诱变菌种选育的解淀粉芽孢杆菌及其应用。

背景技术

由灰葡萄孢(Botrytis cinera)侵染引起的灰霉病是番茄保护地栽培中常见真菌病害，该病原菌可侵染番茄的茎、叶、花、果实，常导致大面积减产从而给种植户造成巨大经济损失。化学药剂是目前生产上进行番茄灰霉病防控的主要措施，长期大量使用存在病原菌抗药性出现、生态环境污染等系列问题。生物防治因具有不易产生抗药性、对环境安全友好等特点，已逐渐成为番茄灰霉病等果蔬病害绿色防控的有效替代途径。

芽孢杆菌可以产生具有抗高温、抗紫外线辐射等优良性质的芽孢，具有抗逆性强、抑菌谱广、繁殖快、安全性高等优点，是广泛应用于农业生产的重要生防类群。获得具有优良生防功能的活性菌株是植物病害有效防治的前提和关键。微生物与植物健康生长相关的一些生物学特性，是评价菌株生防潜力的关键因素。芽孢杆菌产生的一些胞外酶和抗菌蛋白类活性物质，在果蔬作物真菌病害生物防治方面具有巨大应用价值。

随着微生物学技术的不断进步和人类对于功能性菌株的多种需求，具备特殊功能的微生物菌株的相关筛选方法也得到了多样化的发展。近年来，随着人类对空间资源的深入开发利用和全球航天工业的迅猛发展，空间环境对于生命体的生物学效应也引起了广大学者的兴趣。空间诱变育种也随着这些热点，尤其是随着我国航空航天事业的飞速发展，取得了很多成果。其中国内外研究重点之一就在空间微生物的诱变育种上，具体已涉及到微生物的形态学、细胞学、生理生化和分子生物学等研究领域，并开始进行地面模拟失重试验。据有关资料报道，近些年发展迅速的航天诱变技术可以为筛选优良的生物防治应用菌株提供了一条新的可靠途径。

发明内容

本发明的目的是提供一株经航天诱变菌种选育的解淀粉芽孢杆菌及其应用。

本发明提供了解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1，其全称为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)HTYB-MH71-1，已于2022年07月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.25355。

解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1具有生长快速的性能，因此将其应用于生产能够降低生产中的发酵成本，大大提升其产品的性价比。

本发明还保护解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的应用，为如下(a)或(b)：

(a)抑制灰霉病致病菌；

(b)防治植物灰霉病。

本发明还保护解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的培养物或解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的发酵物或解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的代谢物。

解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的培养物或解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的发酵物或解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的代谢物的功能为如下(a)或(b)：

(a)抑制灰霉病致病菌；

(b)防治植物灰霉病。

本发明还保护一种菌剂，其特征在于：所述菌剂含有解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1或/和解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的培养物或/和解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的发酵物或/和解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的代谢物。

所述菌剂的功能为如下(a)或(b)：

(a)抑制灰霉病致病菌；

(b)防治植物灰霉病。

所述菌剂还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据菌剂的效果确定。

所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。

所述固体载体可为矿物材料和/或生物材料。

所述矿物材料可为草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种。

所述生物材料可为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种。

所述液体载体可为水或液体培养基。所述菌剂中，解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。

所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。

本发明还保护解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的培养物、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的发酵物、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的代谢物或所述菌剂的应用，为如下(a)或(b)：

(a)抑制灰霉病致病菌；

(b)防治植物灰霉病。

本发明还保护解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的培养物、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的发酵物、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的代谢物或所述菌剂在制备产品中的应用；

所述产品的功能为如下(a)或(b)：

(a)抑制灰霉病致病菌；

(b)防治植物灰霉病。

本发明还保护一种产品，其包括解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的培养物、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的发酵物、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的代谢物或所述菌剂；

所述产品的功能为如下(a)或(b)：

(a)抑制灰霉病致病菌；

(b)防治植物灰霉病。

本发明还保护解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的培养物、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的发酵物、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的代谢物或所述菌剂在制备蛋白酶和/或纤维素酶和/或嗜铁素和/或吲哚乙酸中的应用。

本发明还保护一种用于制备蛋白酶和/或纤维素酶和/或嗜铁素和/或吲哚乙酸的产品，其包括解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的培养物、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的发酵物、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的代谢物或所述菌剂。

本发明还保护一种制备所述菌剂的方法，包括将解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1或/和解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的培养物或/和解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的发酵物或/和解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的代谢物作为菌剂的成分，得到所述菌剂的步骤。

以上任一所述解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的培养物，是将解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1在微生物培养基中培养得到的物质(如含有解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1和分泌到液体培养基内的物质即液体培养物，或如含有解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1和分泌到固体培养基内的物质即固体培养物)。

以上任一所述解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的发酵物，是将解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1在微生物培养基中发酵得到的物质(如含有解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1和分泌到液体培养基内的物质即发酵液，或如含有解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1和分泌到固体培养基内的物质即固体发酵物)。

以上任一所述解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的代谢物可从解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1发酵液中获得。所述解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1代谢物可为解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的无菌代谢物或解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的含菌代谢物。解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的无菌代谢物(无菌发酵滤液)具体可按照如下方法制备：在液体培养基中培养解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1，过滤除去发酵液中的解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1，即得到解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的无菌代谢物。解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的含菌代谢物具体可按照如下方法制备：在液体发酵培养基中培养解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1，收集发酵液(含有解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1和分泌到液体培养基内的物质)，该发酵液即为解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的含菌代谢物。

以上任一所述灰霉病致病菌为灰葡萄孢。

以上任一所述灰霉病致病菌为韭菜灰霉病的病原菌或番茄灰霉病病原菌。

以上任一所述灰霉病致病菌为葱鳞葡萄孢(Botrytis squamosa)或番茄灰霉病病原菌(Botrytis cinerea Pers.)。

以上任一所述灰霉病为灰葡萄孢引起的灰霉病。

以上任一所述灰霉病为韭菜灰霉病或番茄灰霉病。

以上任一所述灰霉病为韭菜灰霉病的病原菌或番茄灰霉病病原菌引起的灰霉病。

以上任一所述灰霉病为葱鳞葡萄孢(Botrytis squamosa)或番茄灰霉病病原菌(Botrytis cinerea Pers.)引起的灰霉病。

具体的，以上任一所述植物为百合科植物。

具体的，以上任一所述植物为葱属植物。

具体的，以上任一所述植物为茄科植物。

具体的，以上任一所述植物为茄属植物。

具体的，以上任一所述植物为韭菜或番茄。

本发明公开了一株经航天太空育种技术选育获得的解淀粉芽孢杆菌，将其命名为解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1。与作为出发菌株的解淀粉芽孢杆菌MH71相比：解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1生产嗜铁素、蛋白酶、纤维素酶、IAA等能力均得到了显著提高，生物膜形成和生长速度显著加快，发酵时间显著缩短，从而可以有效降低生产成本；并且，解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1对番茄灰霉病的防治效果大幅度增强。因此，解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1是一株更加高效的极具开发价值的生防菌株。

附图说明

图1为实施例1中航天诱变前的样本照片和返回后的样本照片。

图2为实施例1中生长情况比较的菌体生长状态照片。

图3为实施例1中菌的种类验证中的PCR扩增产物的电泳图和测序部分结果。

图4为实施例1中根据形态差异选择诱变后菌株培养过程中的照片。

图5为实施例1中解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的形态特征照片。

图6为实施例1中解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的遗传稳定性中对峙培养的照片。

图7为实施例2中的生长曲线。

图8为实施例2中菌落形态和菌落计数的照片。

图9为实施例3中检测检测蛋白酶活性的照片和统计结果。

图10为实施例3中检测纤维素酶活性的照片和统计结果。

图11为实施例3中检测嗜铁素分泌能力的照片和统计结果。

图12为实施例3中检测IAA生产能力的照片和统计结果。

图13为实施例4中生物膜形成能力检测的照片。

图14为实施例5中对韭菜灰霉病菌的平板抑菌活性检测的结果和照片。

图15为实施例5中对番茄灰霉病菌的抑菌活性检测的结果和照片。

图16为实施例5中对番茄灰霉病菌离体叶片防效检测的结果和照片。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，实施例中的培养基使用前均已121℃高压灭菌20min。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。

PDA固体培养基(自然pH)：葡萄糖20g、马铃薯200g、琼脂粉20g，蒸馏水1000mL。

LB固体培养基(pH7.0-7.2)：胰蛋白胨10g、NaCl 10g、酵母浸膏5g、琼脂粉20g，蒸馏水1000mL。

LB液体培养基(pH7.0-7.2)：胰蛋白胨10g、NaCl 10g、酵母浸膏5g，蒸馏水1000mL。

FB发酵培养基(pH7.0)：玉米粉36.6g、牛肉膏3.2g、氯化钠1.33g、葡萄糖14g、蛋白胨7g、七水合硫酸镁0.4g、磷酸氢二钾0.8g、碳酸钙8g，蒸馏水1000mL。

实施例1、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的获得和保藏

一、航天诱变前的准备

出发菌株：解淀粉芽孢杆菌MH71。解淀粉芽孢杆菌MH71，全称为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)MH71，已于2012年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC No.6978。已被2014年08月20日公开的授权公告号为CN 103087951 B的中国发明专利授权。

1、将超低温甘油保存的出发菌株于LB固体培养基上划线活化。

2、完成步骤1后，挑取单菌落划线接种至PDA固体培养基斜面(用2mL CORNING冻存管制作)，28℃恒温培养箱中培养48h。4个平行处理，相应得到4个含菌冻存管，分别编号为JT-1、JT-2、JT-3、JT-4，均用parafilm膜密封管口。JT-1和JT-2用于进行步骤二，JT-3和JT-4进行4℃保存以用作后续的同期对照。

3、完成步骤1后，挑取单菌落接种至LB液体培养基(500mL三角瓶装液100mL培养基)，30℃、200rpm振荡培养72h，然后4℃、6000rpm离心10min，弃上清，将剩余菌体进行真空冷冻干燥，获得菌粉，装入2mL CORNING冻存管中。4个平行处理，相应得到4个含菌粉冻存管，分别编号为JF-1、JF-2、JF-3、JF-4，均用parafilm膜密封管口。JF-1和JF-2用于进行步骤二，JF-3和JF-4进行4℃保存以用作后续的同期对照。

二、航天诱变

将JT-1和JT-2以及JF-1和JF-2搭载神舟十二号载人飞船的长征二号F遥十二运载火箭，于北京时间2021年6月17日9时22分，在酒泉卫星发射中心发射升空，经过60天的轨道运行，返回舱于2021年9月17日13时30分许在位于酒泉卫星发射中心东部并地处巴丹吉林沙漠和戈壁带的东风着陆场着陆，2021年9月22日发明人所在的工作单位收到返回的样品。

太空环境的主要特征表现为微重力、强宇宙射线、超真空、交变磁场、超净环境等。神州十二号的飞行参数为轨道高度400公里，倾角41度，辐射剂量0.4毫希弗(mSv)，舱内温度25℃、湿度是30％左右。这些空间条件都有可能引起微生物发生遗传性变异。

航天诱变前的样本照片见图1的左图，返回后的样本照片见图1的右图。

三、生长情况比较

完成步骤二的JT-1、JT-2、JF-1、JF-2，以及步骤一中活化后的出发菌株，分别划线接种至PDA固体培养基，28℃恒温培养箱中培养48h。

观察菌体生长状态，照片见图2。结果表明，航天诱变后菌生长良好，未出现菌体死亡或菌体生长弱化的现象。此结果也说明了航天诱变的细菌菌种搭载前可以选择菌体斜面或真空冷冻冻干粉的形式。

四、菌的种类验证

供试样本：完成步骤二的JT-1、JT-2、JF-1、JF-2，步骤一中4℃保存的JT-3、JT-4、JF-3、JF-4。

将供试样本中的菌划线接种至LB固体培养基进行活化，然后采用细菌基因组试剂盒(北京博迈德基因技术有限公司)提取基因组DNA。以基因组DNA为模板，采用27F和1492R组成的引物对进行PCR扩增，通过序列比对确定菌的分类地位。

27F和1492R的靶序列位于16S rDNA基因。27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3。

PCR扩增产物的电泳图(每个泳道代表一种样本)和测序部分结果(每行代表一种样本)见图3。结果表明，所有样本的菌的序列相似性为99.46％，仅存在个别碱基的差异，所有样本的菌均鉴定为解淀粉芽孢杆菌。此结果也说明了经过航天诱变的菌未被污染，且未发生种类上的显著变异。

五、根据形态差异选择诱变后菌株

1、完成步骤二的JT-1、JT-2、JF-1、JF-2，分别划线接种至PDA固体培养基，然后挑取单菌落接种至LB液体培养基，28℃、180rpm振荡培养24h，然后用无菌水10倍梯度稀释。分别取稀释度为10^-6至10^-11的菌液100μL涂布于LB固体培养基平板，28℃恒温培养箱中培养48h。

2、完成前一步骤后，观察菌落形态并挑取不同形态的单菌落接种至LB液体培养基，28℃、180rpm振荡培养24h，然后用无菌水10倍梯度稀释。分别取稀释度为10^-6至10^-11的菌液100μL涂布于PDA固体培养基平板上，28℃恒温培养箱中培养48h。重复多次。

将出发菌株作为形态观察的对照菌株。

培养过程中的照片见图4(A为出发菌株的照片，B为示例性的诱变后菌株的照片)。出发菌株的菌落直径较小，近圆形，扁平干燥，菌落周围锯齿状。诱变后菌株有的呈不规则状且凸起呈液泡水滴状(命名为解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1)，有的直径较小呈圆形(命名为解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-2)。

六、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的形态特征

在PDA固体培养基平板上：培养初期，菌落呈圆形或连接成片的不规则形，表面凸起水滴状；随着培养时间的延长，凸起的菌落逐渐变为近白色或浅褐色，凸起逐渐消失变为扁平，且成表面皱缩或周围锯齿状的圆形汉堡状。形态照片见图5。

经染色，为革兰氏阳性菌。

七、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的遗传稳定性

解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1连续传代15次(采用PDA固体培养基平板)，分别将每次传代的菌株作为供试菌株。

将供试菌株用接种环接种1环菌体至LB液体培养基(500mL三角瓶装液100mL培养基)中，30℃、200rpm振荡培养20h(此时称为种子液)，然后用无菌水稀释，然后涂布于PDA固体培养基平板，28℃恒温培养箱中培养72h，然后统计菌落数，计算种子液中的菌含量。菌含量结果见表1。

将上述步骤得到的种子液以1％接种量接种于FB发酵培养基，30℃200rpm振荡培养72h，然后取样并作为供试液。用7mm无菌打孔器在培养有番茄灰霉病菌的PDA固体培养基平板上打孔，获得致病菌菌饼。取新的PDA固体培养基平板，将致病菌菌饼菌丝面朝下放置在平板中心，然后在两侧划线接种供试液(左侧和右侧各取1μL划一条线)，然后28℃恒温培养箱中培养72h。将出发菌株进行平行试验作为对照。示例照片见图6(CK代表出发菌株；A-1和A-2代表解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1传代15代的菌株；B-1、B-2和B-3代表解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1第1代菌株)。

表1

	<![CDATA[菌含量结果(×10<sup>10</sup>CFU/mL)]]>	抑菌活性结果
			传代15代的菌株	5.2	+++
第1代菌株	5.5	+++

结果表明，解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1经过转接传代15次，其菌落形态未发生异常变化，活菌数及其对番茄灰霉病菌的抑菌活性均表现稳定，且保持在较高的水平，表明该菌株是一株极具开发应用潜力的生防菌株。

八、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的保藏

解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1，全称为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)HTYB-MH71-1，已于2022年07月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.25355。

实施例2、三株解淀粉芽孢杆菌的生长特性

供试菌：解淀粉芽孢杆菌MH71、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-2。

一、生长曲线

1、挑取供试菌单菌落，接种至LB液体培养基(500mL三角瓶装液100mL培养基)，30℃、200rpm振荡培养20h，即为种子液。

2、将种子液以1％的接种量接种至LB液体培养基(50mL三角瓶装液10mL)，30℃、200rpm振荡培养。培养时间共计24h，以1h为间隔进行取样，在0h开始进行第一次取样。每个培养时间设置3个平行处理。

3、完成步骤2后，在分光光度计(Utrospec 2100pro)的OD_600nm下检测吸光值。OD值在0.2-0.6之间的为有效数据，OD值超过0.6的，需利用LB液体培养基进行适当稀释后重新检测。

生长曲线见图7。解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1迟缓期的生长表现一直很稳定，未有起起落落的现象出现，10h后就进入快速生长阶段，进入对数期的时间比解淀粉芽孢杆菌MH71提前5h左右。解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-2的生长趋势与解淀粉芽孢杆菌MH71基本一致。

二、菌落形态和菌落计数

取步骤一中培养时间为17h的菌液，用无菌水稀释后涂布于PDA固体培养基平板，28℃恒温培养箱中培养48h，然后观察菌落形态并计数。

结果见图8。

解淀粉芽孢杆菌MH71的菌液中的菌含量为2.75×10¹⁰CFU/mL。

解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-2的菌液中的菌含量为8.3×10¹⁰CFU/mL。

解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的菌液接种培养后，菌落很快生长连成片，致使无法统计出明确的菌落数，结合目测，菌含量应显著高于解淀粉芽孢杆菌MH71和解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-2。

上述结果表明，解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1具有生长快速的性能，因此将其应用于生产能够降低生产中的发酵成本，大大提升其产品的性价比。

实施例3、产素产酶特性分析

供试菌：解淀粉芽孢杆菌MH71、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-2。

一、制备培养基

1、蛋白酶检测平板：奶粉琼脂溶液与LB固体培养基按照1：9的体积配比混匀，然后倒平板。奶粉琼脂溶液：进口脱脂奶粉10g，琼脂15g，蒸馏水1000mL；115℃高压灭菌20min后使用。

2、嗜铁素检测平板：将溶液3倒入溶液2中，然后与30mL过滤除菌后的10g/100mlcasamimo acid(酸水解酪蛋白)溶液混合，最后加入溶液1，缓慢混匀(避免产生泡沫)，然后倒平板。

溶液1(CAS/HDTMA溶液)：50mL CAS溶液和10mL铁溶液混匀后加到40mL HDTMA溶液中，混匀的蓝黑色液体即CAS/HDTMA溶液；121℃高压灭菌后使用。CAS溶液：60.5mg CAS(铬天青)溶于50mL蒸馏水。铁溶液(pH2.0)：0.216g的FeCl₃·6H₂O溶于10mL的10mmol/L HCl水溶液中。HDTMA溶液：72.9mg HDTMA(三甲基十六烷基溴化铵)溶于40mL蒸馏水。

溶液2(Salts/Buffer溶液)：将30.24g Pipes(哌嗪-1,4-二乙磺酸)溶解于750mLSalts溶液，然后用50g/100mL KOH水溶液调pH至6.8，然后加入15g琼脂，然后用蒸馏水定容至800mL；121℃高压灭菌后冷却至50℃。Salts溶液(750mL)：KH₂PO₄ 0.3g、NaCl 0.5g、NH₄Cl1g，蒸馏水定容至750mL。

溶液3：葡萄糖2g，MgSO₄·7H₂O 493mg，甘露醇2g，CaCl₂ 11mg，ZnSO₄·7H₂O 1.2mg，H₃BO₃ 1.4mg，MnSO₄·2H₂O 1.17mg，CuSO₄ 40μg，Na₂MoO₄·2H₂O 1mg，用蒸馏水定容至750mL；121℃高压灭菌后冷却至50℃。

3、纤维素酶检测平板(pH7.0)：MgSO₄·7H₂O 0.25g，K₂HPO₄ 0.5g，纤维素1.88g，刚果红0.2g，琼脂14g，明胶2g，蒸馏水定容至1000mL；121℃高压灭菌20min后使用。

4、CCM液体培养基(pH7.0)：甘露醇5.0g，蔗糖5.0g，乳酸0.5mL，MgSO₄·7H₂O0.2g，KH₂PO₄ 0.2g，K₂HPO₄ 0.8g，CaCl₂·2H₂O 0.06g，NaCl 0.1g，NaMo0₄·2H₂O 2.5mg，酵母粉0.1g，Na·Fe·EDTA溶液4mL(1.64％)，色氨酸0.1g，NH₄NO₃ 1.0g，蒸馏水定容至1000mL；121℃高压灭菌20min后使用。

二、检测蛋白酶活性

1、将供试菌单菌落接种至LB液体培养基(500mL三角瓶装液100mL培养基)，30℃、200rpm振荡培养过夜，然后用LB液体培养基调整菌浓度，得到1×10⁸CFU/mL的菌悬液。

2、将步骤1制备的菌悬液点接种至蛋白酶检测平板上(均匀设置3个点位，每个点位接种1μL)，28℃培养72h，拍照并统计透明圈直径。

设置三个以上重复处理，结果取平均值。

示例性照片见图9的左图(编号1、2、3依次对应解淀粉芽孢杆菌MH71、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1和解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-2)，透明圈直径统计结果见图9的右图。结果表明：解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1和解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-2的蛋白酶活性均优于解淀粉芽孢杆菌MH71；解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的蛋白酶活性优于解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-2。

三、检测纤维素酶活性

1、同步骤二的1。

2、将步骤1制备的菌悬液点接种至纤维素酶检测平板上(均匀设置3个点位，每个点位接种1μL)，28℃培养72h，拍照并统计透明圈直径。

设置三个以上重复处理，结果取平均值。

示例性照片见图10的左图(编号1、2、3依次对应解淀粉芽孢杆菌MH71、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1和解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-2)，透明圈直径统计结果见图10的右图。结果表明：解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1和解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-2的纤维素酶活性均优于解淀粉芽孢杆菌MH71；解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的纤维素酶活性优于解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-2。

四、检测嗜铁素

1、同步骤二的1。

2、将步骤1制备的菌悬液点接种至嗜铁素检测平板上(均匀设置3个点位，每个点位接种1μL)，28℃培养72h，拍照并统计透明圈直径。

设置三个以上重复处理，结果取平均值。

两个示例性照片见图11的上图(编号1、2、3依次对应解淀粉芽孢杆菌MH71、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1和解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-2)，透明圈直径统计结果见图11的下图。结果表明：解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的嗜铁素分泌能力优于解淀粉芽孢杆菌MH71和解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-2，解淀粉芽孢杆菌MH71和解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-2的产素能力未表现出明显差异。

五、检测吲哚乙酸

1、同步骤二的1。

2、将1mL步骤1制备的菌悬液接种于50mL CCM液体培养基(容器为500mL三角瓶)，28℃、130rpm振荡培养12d。

3、IAA定性检测

完成步骤2后，取样100μL培养液滴于白色比色板上(阳性对照孔用等体积10mg/mLIAA水溶液代替培养液)，再滴加100μL比色液(比色液：0.5M FeCl₃ 1mL+H₂SO₄30mL+蒸馏水50mL；下同)。将白色比色板放置室温下15min后观察其颜色变化，溶液颜色呈粉色的为阳性，否则为阴性，以此来确定菌株是否具备产生生长素IAA的能力。照片见图12的A(编号1、2、3依次对应解淀粉芽孢杆菌MH71、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1和解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-2)。

4、IAA定量检测

(1)将IAA标准品(sigma公司)配制为10mg/L、5mg/L、2.5mg/L、1.25mg/L、0.625mg/L系列梯度浓度的标准液，4℃冰箱保存备用。

(2)完成步骤2后，4℃、12000rpm离心5min，收集上清液(供试上清)。

(3)将1mL步骤(2)获得的上清液与1mL比色液混合，避光环境中静置30min，立即用分光光度计测定各反应液以及IAA标准液在530nm下的吸光值，并在excel中制作IAA标准曲线，进而计算各供试上清的IAA含量。

设置三个以上重复处理，结果取平均值。

结果见图12的B。

结果表明：解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的IAA分泌能力最强，定量检测的含量为1.19mg/L，解淀粉芽孢杆菌MH71的定量检测含量为0.82mg/L，而解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-2的定量检测含量仅为0.07mg/L。

实施例4、生物膜形成能力检测

供试菌：解淀粉芽孢杆菌MH71、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-2。

供试菌单菌落接种至LB液体培养基(500mL三角瓶装液100mL培养基)，30℃、200rpm振荡培养过夜，然后室温静置放置48h，观察培养液表面的生物膜形成情况。

照片见图13(编号1、2、3依次对应解淀粉芽孢杆菌MH71、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1和解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-2)。结果表明：解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的生物膜形成能力均强于解淀粉芽孢杆菌MH71和解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-2。生防菌株具备较强的生物膜形成能力，预示其能够在作物根际形成强健的定殖能力，进而有效防控病原菌侵害植株。

实施例5、对植物灰霉病菌的抑菌活性测定

供试生防菌：解淀粉芽孢杆菌MH71、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-2。

韭菜灰霉病菌，即韭菜灰霉病的病原菌，采用葱鳞葡萄孢(Botrytis squamosa)，记载于如下文献：防治韭菜灰霉病的药剂筛选试验，李亚萌、毕扬、卢彩鸽等，中国植保导刊，2020年第8期，63-68。

番茄灰霉病菌，即番茄灰霉病病原菌(Botrytis cinerea Pers.)，记载于如下文献：解淀粉芽胞杆菌MH71的生防活性及脂肽类抗生素基因检测，卢彩鸽等，植物保护，2015，41(3)：12-18。

改良LB液体培养基(pH7.2-7.4)：葡萄糖10.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，牛肉膏3.0g，硫酸锰5.0mg，蒸馏水1000mL。

一、对韭菜灰霉病菌的平板抑菌活性检测

1、将供试生防菌单菌落接种至LB液体培养基(500mL三角瓶装液100mL培养基)，30℃、200rpm振荡培养过夜，然后用LB液体培养基调整菌浓度，得到1×10⁸CFU/mL的菌悬液。

2、用7mm无菌打孔器在培养有韭菜灰霉病菌的PDA固体培养基平板上打孔，获得致病菌菌饼。取新的PDA固体培养基平板，将致病菌菌饼的菌丝面朝下反贴在平板中心，然后将步骤(1)得到的菌悬液点接种在致病菌菌饼周围(均匀设置3个点位，分别接种三种供试生防菌的菌悬液，每个点位接种1μL),25℃恒温培养箱中培养72h。设置用等体积无菌水代替菌悬液的对照。

照片见图14(A图为接种三种供试生防菌的示例性照片，编号1、2、3依次对应解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1、解淀粉芽孢杆菌MH71和解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-2；B图为对照的示例性照片)。结果表明，三株菌对韭菜灰霉病菌均有较强的抑菌活性，但解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1在与韭菜灰霉病菌对峙中，能够更加快速生长占据生态位，从而抑制病原菌的扩展生长。

二、对番茄灰霉病菌的抑菌活性检测

1、将新鲜培养好的番茄灰霉病菌平板上的孢子用无菌水清洗，四层无菌纱布过滤，制备成1×10⁸CFU/mL孢子悬浮液。

2、将供试生防菌单菌落接种至改良LB液体培养基(500mL三角瓶装液100mL培养基)，30℃、180rpm振荡培养72h，然后4℃、10000rpm/min离心5min，收集上清液，用0.45μm孔径Millpore的无菌滤膜过滤，收集滤液。

3、取直径9cm的培养皿，倒入25mL融化的PDA固体培养基，培养基凝固后加入100μL步骤1制备的番茄灰霉病菌孢子悬浮液，用涂布器涂布涂匀，然后用直径7mm无菌打孔器打孔(均匀设置3个打孔点位)，用无菌牙签挑出琼脂块后，在孔中加入步骤2制备的滤液(分别注入三种供试生防菌制备的滤液，每个孔注入100μL),用parafilm封口膜封口，30℃恒温培养箱中培养72h。

设置三个以上重复处理，结果取平均值。

照片见图15(A图为示例性照片，编号1、2、3依次对应解淀粉芽孢杆菌MH71、解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1和解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-2；B图为抑菌圈直径统计结果)。结果表明：解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1的发酵液对番茄灰霉病菌的抑菌活性最强，优于解淀粉芽孢杆菌MH71和解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-2，解淀粉芽孢杆菌MH71和解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-2的抑菌活性无显著差异。

三、对番茄灰霉病菌离体叶片防效检测

供试番茄植株的番茄品种为硬粉状元，种子购自京研益农(北京)种业科技有限公司。

1、从供试番茄植株上获取叶龄相同的新鲜健康叶片，将叶片用自来水流水清洗干净并自然晾干。

2、将供试生防菌单菌落接种至改良LB液体培养基(500mL三角瓶装液100mL培养基)，30℃、180rpm振荡培养72h，获得发酵原液(即含有菌和培养基的整个体系)。用无菌水将发酵原液稀释至5倍体积，即为发酵稀释液。

3、用7mm无菌打孔器在培养有番茄灰霉病菌的PDA固体培养基平板上打孔，获得致病菌菌饼。

4、将步骤1获得的叶片浸入步骤2制备的发酵原液或发酵稀释液中，室温浸泡20min，然后取出摆放至铺有3-5层无菌纱布的托盘中自然晾干。

5、将步骤3获得的致病菌菌饼反贴至步骤4获得的叶片的中央位置，托盘铺设的无菌纱布用水浸湿，托盘上面用封口膜封上，在膜上多个位点扎孔透气，室温放置72h，然后观察拍照并测量病斑直径，计算防病效果。

设置用无菌水代替发酵原液的处理，作为阳性对照。

设置用无菌水代替发酵原液且不加入致病菌菌饼的处理，作为空白对照。

设置至少5个重复处理，结果取平均值。

结果见图16。图16中，A对应发酵原液，B对应发酵稀释液。图16的叶片照片中，自左至右，第1列对应解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-2，第2列对应解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1，第3列对应解淀粉芽孢杆菌MH71，第4列对应阳性对照，第5列对应空白对照。结果表明：经过三个菌株发酵液原液处理72h的番茄叶片均未出现任何病斑，与阳性对照相比，按照病斑面积计算防效，防效均为100％。结果表明：经过解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1发酵稀释液处理72h的番茄叶片均未出现明显的病斑，病原菌利用菌丝块的营养进行生长，即在菌丝块上偶尔有一点点病原菌的菌丝出现；经过解淀粉芽孢杆菌MH71发酵稀释液或者经过解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-2发酵稀释液处理72h后，叶片上出现了病斑，但小于阳性对照；按照病斑面积计算防效，解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-1对番茄灰霉病菌的离体防效为100％，而解淀粉芽孢杆菌HTYB-MH71-2和解淀粉芽孢杆菌MH71的防效分别为49.75％和42.14％。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HTYB-MH71-1，其保藏登记号为CGMCC No.25355。

2.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的应用，为如下(a)或(b)：

(a)抑制灰霉病致病菌；

(b)防治植物灰霉病。

3.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的培养物或发酵物或代谢物。

4.菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌或/和权利要求3所述培养物或/和权利要求3所述发酵物或/和权利要求3所述代谢物。

5.权利要求3所述培养物、权利要求3所述发酵物、权利要求3所述代谢物或权利要求4所述菌剂的应用，为如下(a)或(b)：

(a)抑制灰霉病致病菌；

(b)防治植物灰霉病。

6.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌、权利要求3所述培养物、权利要求3所述发酵物、权利要求3所述代谢物或权利要求4所述菌剂在制备产品中的应用；

所述产品的功能为如下(a)或(b)：

(a)抑制灰霉病致病菌；

(b)防治植物灰霉病。

7.一种产品，其包括权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌、权利要求3所述培养物、权利要求3所述发酵物、权利要求3所述代谢物或权利要求4所述菌剂；

所述产品的功能为如下(a)或(b)：

(a)抑制灰霉病致病菌；

(b)防治植物灰霉病。

8.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌、权利要求3所述培养物、权利要求3所述发酵物、权利要求3所述代谢物或权利要求4所述菌剂在制备蛋白酶和/或纤维素酶和/或嗜铁素和/或吲哚乙酸中的应用。

9.一种用于制备蛋白酶和/或纤维素酶和/或嗜铁素和/或吲哚乙酸的产品，其包括权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌、权利要求3所述培养物、权利要求3所述发酵物、权利要求3所述代谢物或权利要求4所述菌剂。

10.制备权利要求4所述的菌剂的方法，包括将权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌或/和权利要求3所述培养物或/和权利要求3所述发酵物或/和权利要求3所述代谢物作为菌剂的成分，得到所述菌剂的步骤。

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