CN115975850A - 溶磷糖芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了溶磷糖芽孢杆菌及其应用。本发明提供的溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.25247。本发明所提供的溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909代表了糖芽孢杆菌属的一个新物种，同时通过碱性磷酸酶活性检测，也证明了本发明菌株具有碱性磷酸酶活性，可将土壤中的难溶性磷转化为可溶性磷，以供植物吸收利用，在降解有机磷、促进植物生长方面具有广泛的应用前景；同时，该菌株具有纤维素降解能力，在纤维素降解方面具有广泛的应用前景。因此，本发明菌株未来可用于开发解磷菌肥、环境治理、土壤改良生产以及生物燃料开发等多种不同方面。

Description

溶磷糖芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及溶磷糖芽孢杆菌及其应用。

背景技术

糖芽孢杆菌属(Saccharibacillus)(Rivas R,García-Fraile P,Zurdo-

JL,Mateos PF,Martínez-Molina E,Bedmar EJ,Sánchez-Raya J,Velázquez E(2008).Saccharibacillus sacchari gen.nov.,sp.nov.,isolated from sugar cane.Int JSyst Evol Microbiol 58,1850-1854.)建立于2008年，归属于类芽孢杆菌科Paenibacillaceae(De Vos P,Ludwig W,Schleifer K-H,Whitman WB(2009).FamilyIV.Paenibacillaceae fam.nov.In:De Vos P,Garrity GM,Jones D,Krieg NR,Ludwig W,Rainey FA,K.-H.S,Whitman WB(eds),Bergey's Manual ofSystematic Bacteriology,2nd edn,vol.3(The Firmicutes),Springer,New York,p.269.)。到目前为止，糖芽孢杆菌属共收纳了5个有效描述种：分离自棉花植物的内生菌S.endophyticus(Kampfer P,BusseHJ,Kleinhagauer T,McInroy JA,Glaeser SP(2016).Saccharibacillus endophyticussp.nov.,an endophyte of cotton.Int J Syst Evol Microbiol 66,5134-5139.)、分离自铅镉尾矿土壤样品的S.qingshengii(Han H,Gao S,Wang Q,He LY,Sheng XF(2016).Saccharibacillus qingshengii sp.nov.,isolated from a lead-cadmiumtailing.Int J Syst Evol Microbiol 66,4645-4649.)、分离自甘蔗胞外液的S.sacchari(Rivas R,Garcia-Fraile P,Zurdo-Pineiro JL,Mateos PF,Martinez-Molina E,BedmarEJ,Sanchez-Raya J,Velazquez E(2008).Saccharibacillus sacchari gen.nov.,sp.nov.,isolated from sugar cane.Int J Syst Evol Microbiol 58,1850-1854.)，以及分离自沙漠土样品的S.deserti(Sun JQ,Wang XY,Wang LJ,Xu L,Liu M,Wu XL(2016).Saccharibacillus deserti sp.nov.,isolated from desert soil.Int J Syst EvolMicrobiol 66,623-627.)和S.kuerlensis(Yang SY,Liu H,Liu R,Zhang KY,Lai R(2009).Saccharibacillus kuerlensis sp.nov.,isolated from a desert soil.Int JSyst Evol Microbiol 59,953-957.)。近年来，随着高通量测序技术的发展，Illumina公司开发的16S rRNA基因高通量测序技术能够帮助快速准确地分析得到样本中微生物群落结构及多样性信息，科研人员也越来越多的应用这一技术来研究相关问题。Bziuk等人便通过16S rRNA基因扩增子测序方法对大麦种子内的微生物群落进行研究，发现糖芽孢杆菌属菌株为该生境微生物群落中的优势菌群之一(Bziuk N,Maccario L,Straube B,Wehner G,

SJ,Schikora A,Smalla K(2021).The treasure inside barley seeds:microbial diversity and plant beneficial bacteria.Environ Microbiome 16,20.)。

糖芽孢杆菌属具有其特征性的形态和化学分类特点：该属成员细胞均为杆状，可形成内生孢子。过氧化氢酶和氧化酶反应均为阴性。主要甲基萘醌成分是MK-7，主要的极性脂成分是双磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰甘油(PG)和一种未知的氨基磷脂(APG),此外，还可能含有未知糖脂(GL)和未知磷酸糖脂(GPL)。主要的脂肪酸是anteiso-C_15:0和C_16:0。

磷是植物生长发育不可缺少的营养元素，是植物进行光合作用、呼吸作用等物质和能量代谢等重要生命活动必不可少的营养元素。土壤中的磷大多以植物无法直接吸收利用的难溶性Fe-P、Al-P和闭蓄态磷的形式存在，导致土壤中全磷含量丰富而有效态磷素匮乏。溶磷菌能够将土壤中的难溶性磷转化为有效态磷，从而提高植物的磷素营养并促进植物生长。尽管目前研究人员已经在多种不同的植物根际土壤生境中，分离得到了多株溶磷菌，但对糖芽孢杆菌属菌株的报道还较少。

纤维素是世界上储量最丰富的可再生资源之一，为发展可再生生物燃料提供了丰富原料，但纤维素的糖化却一直是其利用过程中的瓶颈。微生物产生的内切葡聚糖酶是纤维素降解和转化的关键酶系，能够将纤维素降解为纤维寡糖，因此内切葡聚糖酶产生菌能够在纤维素的糖化过程中发挥重要作用。目前，糖芽孢杆菌属菌株的内切葡聚糖酶活性的相关报道较少。

发明内容

本发明的目的是提供一种糖芽孢杆菌属新物种及其应用。

第一方面，本发明要求保护一种糖芽孢杆菌属新物种。

本发明所要求保护的糖芽孢杆菌属新物种具体为溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.25247。

所述溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909为革兰氏阳性菌，细胞周生鞭毛，可运动，棒状尺寸为(0.4-1)μm×(2-5)μm，可产生椭球形内孢子；该菌株于28℃在胰蛋白胨大豆琼脂培养基培养48h，可形成白色至乳白色菌落；菌株S22909的pH耐受范围是6.0-8.0，生长最适pH值为7.0；氧化酶和触酶反应呈阴性；能够水解淀粉和尿素，具有硝酸盐还原能力；能够利用糊精、D-麦芽糖、D-海藻糖、D-纤维二糖、龙胆二糖、蔗糖、D-松二糖、水苏糖、D-棉子糖、α-D-乳糖、D-蜜二糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、D-水杨苷、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰神经氨酸、α-D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、L-岩藻糖、L-鼠李糖、肌苷、D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、果胶、肌醇、甘油、D-阿拉伯糖醇、L-半乳糖酸内酯、D-葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸、丙酮酸甲酯、L-乳酸、α-酮戊二酸、溴代琥珀酸、α-酮丁酸、乙酰乙酸、丙酸、D-半乳糖醛酸和吐温40作为唯一碳源。具有碱性磷酸酶、酯酶(C4)、酯酶脂肪酶(C8)、亮氨酸芳基酰胺酶、缬氨酸芳基酰胺酶、α-胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶活性。该菌株的16SrRNA序列如SEQ ID No.1所示。

第二方面，本发明要求保护一种培养物。

本发明所要求保护的培养物为前文第一方面中所述溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillusphosphatilytica)S22909的培养物，具体是将所述溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillusphosphatilytica)S22909在细菌培养基中培养得到的物质。

上述培养物中，所述物质包括所述溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillusphosphatilytica)S22909(菌体自身)和所述溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillusphosphatilytica)S22909的代谢物。

上述培养物中，所述细菌培养基可为固体培养基或液体培养基。

术语“培养物”是指经人工接种和培养后，长有微生物群体的液体或固体培养基的统称。即通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物或培养过程中产生的其他成分。术语“培养物”还包括通过将微生物传代而获得的传代培养物，其可以是某一代的培养物，也可以是若干代的混合物。

在本发明的具体实施方式中，所述细菌培养基具体为胰蛋白胨大豆琼脂培养基。

第三方面，本发明要求保护一种代谢物。

本发明要求保护的代谢物为前文第一方面所述的溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909的代谢物。

术语“代谢物”是指微生物新陈代谢过程中产生的初级代谢产物和/或次级代谢产物。初级代谢是指微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动的物质和能量的过程。初级代谢的产物即为初级代谢产物，如单糖或单糖衍生物、核苷酸、维生素、氨基酸、脂肪酸等单体以及由它们组成的各种大分子聚合物，如蛋白质、核酸、多糖、脂质等。次级代谢是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程。次级代谢的产物即为次级代谢产物，大多是分子结构比较复杂的化合物。根据其作用，可将其分为抗生素、激素、生物碱、毒素等类型。

第四方面，本发明要求保护一种菌剂。

本发明要求保护的菌剂含有前文第一方面中所述的溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909、前文第二方面中所述的培养物和/或前文第三方面中所述的代谢物。

所述菌剂为水解纤维素和/或降解有机磷的菌剂。

上述菌剂中，所述菌剂除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。

上述菌剂中，所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。

第五方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂在如下任一中的应用：

(A1)降解纤维素；

(A2)制备用于降解纤维素的产品；

(A3)制备纤维素酶；

(A4)制备具有纤维素酶活性的产品；

(A5)制备具有内切葡聚糖酶活性的产品；

(A6)降解有机磷；

(A7)制备用于降解有机磷的产品；

(A8)制备具有碱性磷酸酶活性的产品。

第六方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂在如下任一中的应用：

(B1)促进植物生长；

(B2)开发解磷菌肥；

(B3)环境治理；

(B4)土壤改良；

(B5)生物燃料开发。

第七方面，本发明要求保护一种用于降解纤维素的产品。

本发明要求保护的用于降解纤维素的产品，其活性成分为前文第一方面中所述的溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂。

第八方面，本发明要求保护一种具有纤维素酶活性的产品。

本发明要求保护的具有纤维素酶活性的产品，其活性成分为前文第一方面中所述溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂。

第九方面，本发明要求保护一种用于降解有机磷的产品。

本发明要求保护的用于降解有机磷的产品，其活性成分为前文第一方面中所述的溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂。

第十方面，本发明要求保护一种具有碱性磷酸酶活性的产品。

本发明要求保护的具有碱性磷酸酶活性的产品，其活性成分为前文第一方面中所述溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂。

第十一方面，本发明要求保护一种降解纤维素的方法。

本发明要求保护的降解纤维素的方法，可包括如下步骤：用前文第一方面中所述的溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂对待处理样品进行处理。

第十二方面，本发明要求保护一种降解有机磷的方法。

本发明要求保护的降解有机磷的方法，可包括如下步骤：用前文第一方面中所述的溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂对待处理样品进行处理。

第十三方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909在制备前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂中的应用。

实验证明，本发明所提供的溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillusphosphatilytica)S22909与现有糖芽孢杆菌属菌株在表型、生理生化及细胞化学特征等方面存在许多显著的差异特征。同时基于基因水平的系统进化分析进一步说明了菌株S22909能区别于现有糖芽孢杆菌属的各有效种，充分证明了本发明菌株S22909代表了糖芽孢杆菌属的一个新物种，命名为溶磷糖芽孢杆菌。同时通过碱性磷酸酶活性检测，也证明了本发明菌株具有碱性磷酸酶活性，可将土壤中的难溶性磷转化为可溶性磷，以供植物吸收利用，在降解有机磷、促进植物生长方面具有广泛的应用前景；同时，该菌株具有纤维素降解能力，在纤维素降解方面具有广泛的应用前景。因此，本发明菌株未来可用于开发解磷菌肥、环境治理、土壤改良生产以及生物燃料开发等多种不同方面。

保藏说明

分类命名：溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)；

参椐的生物材料：S22909；

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏机构简称：CGMCC；

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

保藏日期：2022年7月7日；

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.25247。

附图说明

图1为菌株S22909于28℃在胰蛋白胨大豆琼脂培养基培养48h细胞形态照片。

图2为菌株S22909解磷能力筛选图片。

图3为基于菌株S22909和Paenibacillaceae科相关种的16S rRNA基因序列构建系统发育树(系统发育树以Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis DSM 20072^T(GenBank accession no.M58823)为外群)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909的分离及鉴定

一、菌株S22909的分离

本发明菌株S22909分离自云南省玉溪市新平彝族傣族自治县的植物根际土壤样品，具体分离操作如下：

土壤悬液制备：将2g土壤样品加入到18mL无菌的、含有0.1％焦磷酸钠和0.85％氯化钠的混合溶液中，置于28℃摇床中180rpm、震荡40min，使土壤颗粒充分悬浮。将形成的土壤悬液进行梯度稀释至10^-4备用。

分离培养基：可溶性淀粉10g·L^-1，磷酸氢二钾1g·L^-1，七水合硫酸镁1g·L^-1，硫酸铵2g·L^-1，碳酸钙2g·L^-1，七水合硫酸亚铁0.001g·L^-1，氯化锰0.001g·L^-1，硫酸锌0.001g·L^-1，氯化钠1g·L^-1，甘油12.5mL·L^-1，精氨酸2g·L^-1，海洋微量盐0.38g·L^-1，琼脂15g·L^-1；pH 7。

分离方法：将上述稀释好的土壤悬液涂布于分离培养基平板上，28℃培养3周。挑取生长良好的单菌落，于PYG斜面培养基(配方：蛋白胨3g·L^-1，酵母膏5g·L^-1，甘油10g·L^-1，甜菜碱1.25g·L^-1，丙酮酸钠1.25g·L^-1，琼脂15g·L^-1；pH 7)上培养，得到纯培养物，以便后续研究。同时所获得的纯菌株以20％(v/v)甘油作为保护剂，进行液氮保藏和-80℃冷冻保藏。获得一株与最近缘对照菌S.kuerlensis HR1^T和S.sacchari DSM 19268^T的相似性均为96.4％的菌株，编号为S22909。

二、菌株S22909的鉴定

菌株S22909在28℃条件下，生长于胰蛋白胨大豆肉汤培养基(索莱宝)上，进行形态学、生理生化、细胞化学及基因水平研究，其他特殊情况将说明。

1、菌株S22909的细胞形态观察和生理生化特征检测

菌株S22909在28℃于胰蛋白胨大豆琼脂培养基上培养48h后，使用透射电子显微镜(日本电子JEDL，JEM-1400)进行细胞形态观察。菌株S22909的生长温度检测范围为4、10、28、30、32、37、42和45℃；生长盐浓度(NaCl)检测范围为0、1、3、5、7、10％(g/100mL)；生长pH检测范围为pH 4-11之间的8个(4、5、6、7、8、9、10、11)梯度。菌株的生理生化特征使用API50CH、API ZYM，以及BiOLOG GEN III碳源等检测试剂盒检测。其他菌株生理特征，包括革兰氏染色属性、氧需求、接触酶活性、氧化酶活性、明胶水解活性，淀粉水解活性和纤维素水解活性，主要参照《放线菌系统鉴定手册》进行(Xu L H(2007).Actinomycete systematics:principles,methods and practices.Beijing:Science Press,93-108.)。

鉴定结果显示，菌株S22909为革兰氏阳性菌，细胞周生鞭毛，可运动(图1)，棒状尺寸为(0.4-1)μm×(2-5)μm，可产生椭球形内孢子。该菌株于28℃在胰蛋白胨大豆琼脂培养基培养48h，可形成白色至乳白色菌落。菌株S22909的pH耐受范围是6.0-8.0，生长最适pH值为7.0。氧化酶和触酶反应呈阴性。能够水解淀粉和尿素，具有硝酸盐还原能力。能够利用糊精、D-麦芽糖、D-海藻糖、D-纤维二糖、龙胆二糖、蔗糖、D-松二糖、水苏糖、D-棉子糖、α-D-乳糖、D-蜜二糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、D-水杨苷、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰神经氨酸、α-D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、L-岩藻糖、L-鼠李糖、肌苷、D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、果胶、肌醇、甘油、D-阿拉伯糖醇、L-半乳糖酸内酯、D-葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸、丙酮酸甲酯、L-乳酸、α-酮戊二酸、溴代琥珀酸、α-酮丁酸、乙酰乙酸、丙酸、D-半乳糖醛酸和吐温40作为唯一碳源。具有碱性磷酸酶、酯酶(C4)、酯酶脂肪酶(C8)、亮氨酸芳基酰胺酶、缬氨酸芳基酰胺酶、α-胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶活性。菌株S22909与糖芽孢杆菌属近缘物种代表菌株的差异性特征见表1。

表1、菌株S22909与糖芽孢杆菌属近缘菌株的差异性特征

注：表中，+表示为阳性，-表示为阴性，ND表示为未搜索到相关数据。

由表1所示结果可见，本发明菌株S22909与已发表的糖芽孢杆菌属近缘菌株在部分生理生化特征方面存在显著差异。

2、菌株S22909的细胞化学特征检测

通过GC气相色谱、HPLC液相色谱和TLC薄层色谱检测菌株S22909的脂肪酸、醌类型、极性脂等细胞化学组分(Sasser M.Identification of bacteria by gasghromatography of cellular fatty acids,MIDI Technical Note 101.Newark,DE:MIDIinc；1990.Minnikin DE,O’Donnell AG,Goodfellow M,Alderson G,Athalye M et al.Anintegrated procedure for the extraction of bacterial isoprenoid quinones andpolar lipids.J Microbiol Methods 1984；2:233-241.)。

实验结果显示，本发明菌株S22909的主要脂肪酸成分为anteiso-C_15:0(30.4％)、iso-C_15:0(39.7％)、C_16:0(9.5％)。其中主要成分anteiso-C_15:0和C_16:0与糖芽孢杆菌属其他种一致。但本发明菌株S22909又有与其他近源种不同的独特之处，iso-C_15:0就是其独有成分。另外，本发明菌株S22909的主要极性脂成分包括双磷脂酰甘油(DPG)和磷脂酰甘油(PG)。参见表1。本发明菌株S22909主要甲基萘醌成分是MK-7，与糖芽孢杆菌属主要甲基萘醌成分一致。上述结果均提示，菌株S22909为糖芽孢杆菌属的新物种。

3、菌株S22909的碱性磷酸酶活性测定

利用卵磷脂作为平板中的唯一磷源，进行平板筛选菌株S22909的碱性磷酸酶活性。具体步骤如下：配制有机磷固体筛选培养基(配方：葡萄糖3g·L^-1，硫酸铵0.5g·L^-1，氯化钠0.3g·L^-1，氯化钾0.3g·L^-1，七水合硫酸亚铁0.03g·L^-1，七水合硫酸锰0.03g·L^-1，碳酸钙5g·L^-1，卵磷脂1g·L^-1，琼脂15g·L^-1；pH 7)，于115℃高压灭菌30min。随后将处于对数生长期的菌株S22909，挑取单菌落接种于有机磷固体筛选培养基上，28℃培养4天后，分别测定细菌菌落直径(d)和溶磷圈直径(D)，计算可溶性指数(D/d)。

实验结果显示(图2)，本发明菌株S22909在有机磷固体筛选培养基上能够产生溶磷圈，其菌落直径为5.0mm，透明圈直径为17.0mm，可溶性指数为3.4。

同时，对菌株S22909进行碱性磷酸酶活性的液体筛选。将处于对数生长期的菌株S22909接种到20mL的有机磷液体培养基中，并以不接菌的空白培养基作为对照组，于28℃培养14天后，离心取上清液测定培养液中有机磷浓度，并以空白组作为对照，计算菌株降解有机磷产生的PO4³⁺(mg/L)浓度变化(用△PO4³⁺表示)。根据磷酸盐标准液制备标准曲线，M0为空白对照组中检测的PO4³⁺浓度，M1为实验组中检测的PO4³⁺浓度。

△PO4³⁺浓度＝M1-M0

经计算本发明菌株S22909具有碱性磷酸酶活性，降解有机磷产生的△PO4³⁺浓度值为0.40mg/L。

另外，运用diamond软件将菌株S22909基因组数据分别与eggNOG数据库(http://eggnog.embl.de/)和KEGG数据库(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do)进行比对，设置E值低于e^-5。我们从该菌株基因组中搜索到了碱性磷酸酶A基因(pho A)和碱性磷酸酶E(pho E)基因，具体信息详见表2。

表2、菌株S22909基因组中的碱性磷酸酶基因

4、菌株的内切葡聚糖酶活性检测

菌株S22909的内切葡聚糖酶活性，利用羟甲基纤维素钠CMC-Na作为平板中的唯一C源进行平板筛选(Reinhold-Hurek,B.,Hurek.T.,Claeyssens,M.,van Montagu,M.(1993).Cloning,expression in Escherichia coli,and characterization ofcellulolytic enzymes of Azoarcus sp.,a root-invading diazotroph.J Bacteriol175,7056-7065.)。具体步骤如下：配置CMC-Na筛选培养基(配方：(NH₄)₂SO₄ 4g·L^-1，NaCl0.1g·L^-1，MgSO₄·7H₂0 0.1g·L^-1，CaCl₂ 0.1g·L^-1，酵母提取物0.5g·L^-1，Fe(Ⅲ)EDTA0.033g·L^-1，CMC-Na 2g·L^-1，琼脂15g·L^-1；pH 7.0),将处于对数生长期的菌株S22909，挑取单菌落接种于CMC-Na筛选培养基上，培养48h后，采用刚果红染液对菌株的内切葡聚糖酶活性进行检测。结果所示菌株S22909周围产生了明显的透明圈，说明菌株S22909具有较好的纤维素水解活性。并采用相同的实验方法进行复筛验证发现与初筛相同的实验结果(Teather,R.M.,Wood,P.J.(1982).Use of Congo red-polysaccharide interactions inenumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovinerumen.Appl Environ Microbiol 43,777-780.)。

另外，运用diamond软件将菌株S22909基因组数据分别与eggNOG数据库(http://eggnog.embl.de/)和KEGG数据库(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do)进行比对，设置E值低于e^-5。我们从该菌株基因组中搜索到了2个拷贝的内切葡聚糖酶基因，二者均归属于GH5内切葡聚糖酶基因。具体信息详见表3。

表3、菌株S22909基因组中的内切葡聚糖酶基因

5、菌株系统进化地位的确定

提取本发明菌株S22909的基因组DNA进行测序，并将其中的16S rRNA基因序列(SEQ ID No.1)在国际权威细菌分类学分析数据库(http://www.ezbiocloud.net/)中进行在线比对(Kim,O.S.,Cho,Y.J.,Lee,K.,,Yoon SH,Kim M,Na H,Park SC,Jeon YS,Lee JH,Yi H,Won S,Chun J(2012).Introducing EzTaxon-e:aprokaryotic 16S rRNA genesequence database with phylotypes that represent uncultured species.Int JSyst Evol Microbiol 62,716-721.)。结果显示本发明菌株S22909与糖芽孢杆菌属的菌种相似性最高，其中序列两两相似性最高的物种代表菌株分别为S.kuerlensis HR1^T(相似性为96.4％)和S.sacchari DSM 19268^T(相似性为96.4％)，该值明显低于细菌不同物种的界定阈值98.7％(Stackebrandt E,Ebers J(2006).Taxonomic parameters revisited:tarnished gold standards.Microbiol Today 33,152-155.)。在EZbiocloud上比较并计算菌株S22909的全基因组序列与近缘对照菌的全基因组序列的平均核苷酸相似性(ANI值)，结果显示，菌株S22909与近缘对照菌S.kuerlensis HR1^T的ANI比值为77.1％，菌株S22909与近缘对照菌S.sacchari DSM 19268^T的ANI比值为77.9％，均低于细菌不同物种的界定阈值95.0％(Yoon SH,Ha SM,Lim J,Kwon S,Chun J(2017).A large-scaleevaluation of algorithms to calculate average nucleotide identity.Antonie vanLeeuwenhoek 110,1281-1286.)。

为进一步明确菌株的系统进化地位，选取糖芽孢杆菌属所有菌种的代表菌株以及Paenibacillaceae科相关菌种的16S rRNA基因序列构建系统进化树(图3)。

综上所述，本发明菌株S22909与现有糖芽孢杆菌属菌种有部分明显的特征差异，包括表型、生理生化及细胞化学组分等方面。同时基于基因水平的系统进化分析进一步说明了菌株S22909能区别于现有糖芽孢杆菌属的各有效种，充分证明了本发明菌株S22909代表了糖芽孢杆菌属的一个新物种，命名为溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillusphosphatilytica)。同时通过碱性磷酸酶活性检测，也证明了本发明菌株具有碱性磷酸酶活性，可将土壤中的难溶性磷转化为可溶性磷，以供植物吸收利用，在降解有机磷、促进植物生长方面具有广泛的应用前景；同时，该菌株具有纤维素降解能力，在纤维素降解方面具有广泛的应用前景。因此，本发明菌株未来可用于开发解磷菌肥、环境治理、土壤改良生产以及生物燃料开发等多种不同方面。

溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909已经于2022年7月7日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC NO.25247。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.25247。

2.权利要求1所述溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909的培养物，是将权利要求1所述的溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909在细菌培养基中培养得到的物质。

3.权利要求1所述的溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909的代谢物。

4.菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1所述的溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909、权利要求2所述的培养物和/或权利要求3所述的代谢物。

5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为降解纤维素和/或降解有机磷的菌剂。

6.权利要求1所述的溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909或权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的代谢物或权利要求4或5所述的菌剂在如下任一中的应用：

(A1)降解纤维素；

(A2)制备用于降解纤维素的产品；

(A3)制备纤维素酶；

(A4)制备具有纤维素酶活性的产品；

(A5)制备具有内切葡聚糖酶活性的产品；

(A6)降解有机磷；

(A7)制备用于降解有机磷的产品；

(A8)制备具有碱性磷酸酶活性的产品。

7.权利要求1所述的溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909或权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的代谢物或权利要求4或5所述的菌剂在如下任一中的应用：

(B1)促进植物生长；

(B2)开发解磷菌肥；

(B3)环境治理；

(B4)土壤改良；

(B5)生物燃料开发。

8.一种用于降解纤维素的产品，其活性成分为权利要求1所述的溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909或权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的代谢物或权利要求4或5所述的菌剂；

或

一种具有纤维素酶活性或内切葡聚糖酶活性的产品，其活性成分为权利要求1所述的溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909或权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的代谢物或权利要求4或5所述的菌剂；

或

一种用于降解有机磷的产品，其活性成分为权利要求1所述的溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909或权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的代谢物或权利要求4或5所述的菌剂；

或

一种具有碱性磷酸酶活性的产品，其活性成分为权利要求1所述的溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909或权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的代谢物或权利要求4或5所述的菌剂。

9.一种降解纤维素的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述的溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909或权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的代谢物或权利要求4或5所述的菌剂对待处理样品进行处理；

或

一种降解有机磷的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述的溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909或权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的代谢物或权利要求4或5所述的菌剂对待处理样品进行处理。

10.权利要求1所述的溶磷糖芽孢杆菌(Saccharibacillus phosphatilytica)S22909在制备权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的代谢物或权利要求4或5所述的菌剂中的应用。

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