CN115975026B

CN115975026B - 一种抗多房棘球蚴原头节的纳米抗体、重组菌及其应用

Info

Publication number: CN115975026B
Application number: CN202211425931.7A
Authority: CN
Inventors: 辛明远; 李润乐; 高申涵; 彭司南; 马敬唯; 汤锋; 刘文婧; 赵嘉; 黄睦宁
Original assignee: Qinghai University
Current assignee: Qinghai University
Priority date: 2022-11-15
Filing date: 2022-11-15
Publication date: 2024-06-25
Anticipated expiration: 2042-11-15
Also published as: CN115975026A

Abstract

本发明提供了一种抗多房棘球蚴原头节的纳米抗体、重组菌及其应用，属于寄生虫病防治技术领域。本发明提供的抗多房棘球蚴原头节的纳米抗体克服了现有技术中多房棘球蚴不能实现有效活体检测的技术问题。本发明提供的纳米抗体特异性高、分子量较小、组织穿透性极强，并且水溶性和稳定性较高，可以大批量生产并且成本低廉，在常温和极端pH值下仍能稳定发挥作用。其结构中缺少轻链，使其具有低免疫原性，在耐热性、展开可逆性、蛋白水解性和高溶解性方面具有更好的稳定性。本发明的纳米抗体可用于中间宿主感染后病灶示踪，可以快速、特异性示踪中间宿主体内囊泡的位置，与囊泡和原头节具有高亲和性。

Description

一种抗多房棘球蚴原头节的纳米抗体、重组菌及其应用

技术领域

本发明涉及寄生虫病防治技术领域，尤其涉及一种抗多房棘球蚴原头节的纳米抗体、重组菌及其应用。

背景技术

包虫病或称棘球蚴病(echinococciosis)，是人感染棘球绦虫的幼虫(棘球蚴)所致的慢性寄生虫病，由带科棘球属绦虫感染引起故又称棘球蚴病，在我国主要分为囊型包虫病(Cystic Echinococcosis；CE)和泡型包虫病(Alveolar Echinocococosis；AE)，分别为细粒棘球蚴(Echinococus granulosus；Eg)和多房棘球蚴(Echinocococusmultilocularis；Em)感染所致。其中多房棘球绦虫的中间宿主有黄鼠，田鼠，沙鼠，小家鼠，人等。人泡型包虫病通常比细粒棘球蚴病更严重，病死率较高。泡型包虫病几乎100％原发于肝脏。肺、脑等其它部位的继发感染多由肝通过血循环转移而来。由于多房棘球蚴在肝实质内呈弥漫性浸润生长，并逐渐波及到整个肝，对肝组织的破坏特别严重，可引起肝功能衰竭而导致昏迷，或诱发肝硬化而引起门静脉高压，并发消化道大出血而致死亡。临床表现视包虫囊部位、大小和有无并发症而不同。狐、犬为多房棘球绦虫的终末宿主，在终宿主体内大约45天发育为成虫。长期以来，包虫病被认为是一种人兽(畜)共患寄生虫病。

目前针对多房棘球蚴尚无用于活体检测的有效方法。研究中目前只能通过超声的手段动态评价多房棘球蚴在小鼠体内的生长情况，因小鼠体型较小，需要的超声设备配置较高，且超声下无法与囊肿进行区分，最终评价只能借助于研究最后活体解剖的数据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗多房棘球蚴原头节的纳米抗体、重组菌及其应用，以解决现有技术中多房棘球蚴不能实现有效活体检测的技术问题。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种抗多房棘球蚴原头节的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码上述纳米抗体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种纳米抗体重组表达载体，所述重组表达载体包括初始载体和上述编码纳米抗体的基因。

优选的，所述初始载体为pET28a载体，上述编码纳米抗体的基因克隆至所述重组载体的NdeⅠ与XholⅠ酶切位点之间。

本发明还提供了一种表达上述抗多房棘球蚴原头节的纳米抗体的重组菌，所述重组菌中转化有上述纳米抗体重组表达载体。

优选的，所述重组菌以大肠杆菌BL-21(DE3)为初始菌。

优选的，所述重组菌通过IPTG进行诱导表达。

本发明还提供了上述抗多房棘球蚴原头节的纳米抗体在如下A1-A13至少一种中的应用：

(A1)制备识别并结合或辅助识别并结合多房棘球蚴原头节和/或囊泡的产品；

(A2)制备捕获或提取待测样品中的多房棘球蚴原头节和/或囊泡产品；

(A3)制备识别或辅助识别多房棘球蚴原头节和/或囊泡产品；

(A4)制备结合或辅助结合多房棘球蚴原头节和/或囊泡产品；

(A5)制备检测或辅助检测待测样品中是否含有多房棘球蚴原头节和/或囊泡的产品；

(A6)制备检测或辅助检测待测样品中多房棘球蚴原头节含量和/或囊泡的产品；

(A7)制备多房棘球蚴囊泡示踪的产品。

优选的，所述产品为试剂盒或探针或靶向物质。

本发明的技术效果和优点：

本发明提供的纳米抗体特异性高、分子量较小、组织穿透性极强，并且水溶性和稳定性较高，可以大批量生产并且成本低廉，在常温和极端pH值下仍能稳定发挥作用。结构中缺少轻链使其具有低免疫原性，在耐热性、展开可逆性、蛋白水解性和高溶解性方面具有更好的稳定性。相对于分子量非常大、携带四个多肽链以致于限制了接近目标肿瘤的单克隆抗体来说，本发明提供的纳米抗体可作为更小且高度稳定的抗体替代品。本发明的纳米抗体可用于中间宿主感染后病灶示踪，可以快速、特异性示踪中间宿主体内囊泡的位置，与囊泡和原头节具有高亲和性。

附图说明

图1为针对多房棘球蚴原头节高亲和噬菌体的筛选；

图2为针对多房棘球蚴原头节高亲和噬菌粒亲和鉴定；

图3为针对多房棘球蚴原头节高亲和纳米抗体分子对接模拟评分；

图4为抗多房棘球蚴原头节高亲和纳米抗体PN5表达部位鉴定；

图5为抗多房棘球蚴原头节高亲和纳米抗体PN5的纯化结果；

图6为EmPN5对原头节总蛋白及肝细胞总蛋白的亲和评价结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下列实施例中的试剂配制方法：

IPTG溶液：称取2.4g IPTG溶于10mL无菌水，用0.22μm滤器过滤除菌，分装、-20℃保存。

氨苄青霉素(Amp)贮液(100mg/mL)：称取1g氨苄青霉素(Amp)溶于10mL无菌水，制得浓度为100mg/mL的贮存液，通过0.22μm细菌滤器过滤除菌，溶液分装保存于-20℃冰箱中。

卡纳霉素(kana)贮液(50mg/mL)：称取0.5g卡那霉素溶于10mL无菌水，制得浓度为50mg/mL的贮存液，通过0.22μm细菌滤器过滤除菌，溶液分装保存于-20℃冰箱中。

四环素贮液(10mg/mL)：称取0.1g四环素溶于10mL无菌水，制得浓度为10mg/mL的贮存液，通过0.22μm细菌滤器过滤除菌，溶液分装保存于-20℃冰箱中。

培养基：

(1)LB液体培养基：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5gNaCl，加蒸馏水至1L，调整pH至7.4，高压蒸气灭菌。

(2)LB固体培养基：1.5g琼脂粉/100mLLB培养液，高压灭菌后，倾倒平板。

(3)AYT液体培养基：称取10g胰蛋白胨、10g酵母提取物和5gNaCl，加蒸馏水至1L，调整pH至7.4，高压蒸气灭菌。

(4)2YT固体培养基：1.5g琼脂粉/100mL 2YT培养液，高压灭菌后，倾倒平板。

DNA电泳缓冲液(50×TAE)：称取242g Tris、37.2g Na₂EDTA·2H₂O和57.1ml冰乙酸，加水至1L，使用时稀释50倍。

SDS-PAGE电泳缓冲液(5×)：称取Tris粉末15.1g、甘氨酸94g、SDS 5.0g；加入800mL的去离子水，搅拌溶解；加去离子水定容至1L，室温保存；注意：加水时应让水延着壁缓缓流下，以避免由于SDS的原因产生很多泡沫。

考马斯亮蓝蛋白染色试剂：

(1)考马斯亮蓝G-250染液(蛋白质定量用)：考马斯亮蓝G-250100mg溶解在50mL95％乙醇中，然后加入86％磷酸100mL，用蒸馏水稀释至1000mL。

(2)脱色液：250mL乙醇、80mL冰醋酸用蒸馏水稀释至1000mL。

ELISA试剂：

(1)包被液：1.6g Na₂CO₃，2.9g NaHCO₃，0.2gNaN₃，加双蒸水至1L，调pH值至9.6。

(2)洗涤液：分别称取0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，8.0g NaCl，0.2g KCl，0.5ml Tween-20，加入ddH₂O定容至1L(PBST)。

(3)封闭液：称取3.0gBSA溶解于100ml洗涤缓冲液中，过滤除菌后4℃保存。

(4)底物液：可溶性单组份TMB底物溶液。

(5)终止液：量取蒸馏水178.3mL，逐滴加入浓硫酸21.7mL(1MH₂SO₄)。

实验动物来源：

Balb/c小鼠：为SPF级，雄性，6～8周龄，购自西安交通大学医学部实验动物中心，许可证号：SCXK(陕)2018-001。

实施例1针对多房棘球蚴原头节高亲和噬菌体筛选

1.5mL Ep管用washbuffer洗涤后用3％脱脂奶粉室温封闭1h，将分离出的原头节放置在Ep管中，使用washbuffer洗涤3次，离心后弃干净上清，管内加入100μL噬菌体文库(4.15×10⁸数量级全天然羊驼抗体噬菌体展示文库，购自艾柏森江苏生物科技有限公司)，37℃孵育2h，washbuffer洗涤4次，每次洗涤离心后弃干净上清，加入100μL Glycine-HCl进行洗脱，洗脱后立刻用74μL Tris-HCl调节pH值为7.4。将上述洗脱液与5mL大肠杆菌XL-Blue混合并置于50mL离心管中，37℃静置孵育30min，Ep管中分别添加100μLXL-Blue菌液室温静置孵育30min，二者混合后在37℃恒温摇床中震荡培养1h。添加10μL辅助噬菌体及5mL2YT-ATG培养基静置孵育30min，震荡培养2h后离心弃上清，添加5mL 2YT-ATK培养基后30℃震荡培养过夜，离心后上清为扩增后噬菌体文库。重复上述步骤3-5次，每次增加洗脱次数，挑取单克隆进行扩增后，采用ELISA检测抗体亲和。

结果如图1所示(图中，M DNAmarker；1-5：挑取的高亲和单克隆噬菌粒)，说明本发明利用全天然羊驼抗体噬菌体展示文库成功筛选出了针对多房棘球蚴原头节高亲和噬菌粒，经PCR验证条带均一。

实施例2噬菌粒单克隆检测

1.5mL Ep管用washbuffer洗涤后用3％脱脂奶粉室温封闭1h，将分离出的原头节放置在Ep管中，以BSA包被的Ep管作为对照，使用washbuffer洗涤3次，离心后弃干净上清，添加上述单克隆扩增噬菌体，各100μL室温孵育1h，1:3000添加M13-HRP二抗100μL室温孵育1h，TMB显色液显色，OD₄₅₀进行吸光度检测，噬菌体稀释5倍以上OD值大于0.5视为阳性结果，包被BSA作为对照。

结果如图2所示，筛选出的高亲和噬菌粒针对多房棘球蚴囊泡原头节具有较高的亲和活性。

实施例3抗多房棘球蚴原头节高亲和噬菌粒选择

上述筛选出的单克隆噬菌粒进行测序，合并测序中重复序列，采用DNAMAN对纳米抗体序列进行2级结构分析，然后使用AlphaFord对序列进行空间结构模拟，模拟后序列使用Z-DOCK软件与多房棘球绦虫基底膜蛋白进行分子对接。

经测序后，首先合并筛选出的单克隆噬菌粒中的重复序列，其中五个序列未重复。二级结构分析结果显示五个纳米抗体分子亲水性和稳定性均较高。模拟对接后发现NP3无法与目的分子进行对接，NP1和NP5最优对接位置一致，评分结果如图3所示，显示NP5序列对接评分最高，NP5的氨基酸序列为HVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYAIGWFRQAPG KEREGVSCISSSGGSTNYLDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNS，如SEQ ID NO.1所示。

实施例4抗多房棘球蚴原头节高亲和纳米抗体EmPN5原核表达

将上述筛选出的最优纳米抗体序列命名为EmNP5，对获得的氨基酸序列进行密码子优化，以获得适合原核表达系统的碱基序列，化学合成该序列(核酸序列为CATGTACAGCTGGTTGAATCTGGTGGTGGTCTGGTACAG CCTGGTGGTTCTCTGCGTCTGTCTTGTGCTGCGTCTGGTTTTACTCTGGATTACTACGCCATCGGTTGGTTCCGTCAGGCTCCGGGTAAAGAACGTGAGGGTGTTAGCTGTATCAGCTCCTCCGGTGGTTCCACCAACTACCTGGACAGCGTGAAGGGCCGTTTCACGATTTCTCGTGACAACGCGAAAAACACCGTTTACCTGCAGATGAACAGC，如SEQ ID NO.2所示)，并添加NdeⅠ、XholⅠ双酶切位点后插入pET28a质粒构建重组表达质粒pET28a-EmPN 5，将构建成功质粒转化入大肠杆菌Bl-21(DE3)中，经IPTG诱导，对诱导后表达菌株表达部位进行鉴定。

结果如图4所示(图中，M：蛋白marker；1：阴性对照；2：18℃诱导后总蛋白；3：18℃诱导后上清；4：18℃诱导后沉淀；5：37℃诱导后总蛋白；6：37℃诱导后上清；7：37℃诱导后沉淀)，抗多房棘球蚴高亲和纳米抗体EmPN5在包涵体部分表达，诱导需要温度为37℃。

实施例5抗多房棘球蚴原头节高亲和纳米抗体的纯化

(1)重组菌的细胞破碎

将菌体沉淀重悬于20ml lysis buffer(20mM Tris-HCl containing 1mM PMSFand bacteriaprotease inhibitor cocktail，pH 8.0)，超声破碎(功率400W，工作4sec，间歇8sec，共20min)；将超声破碎的细胞裂解液4℃10000g离心20min，收集上清；

(2)Ni-IDA镍离子亲和层析柱的纯化

利用低压层析系统，蛋白溶液以0.5ml/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱；用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；用Ni-IDAWashing-Buffer(20mM Tris-HCl，20mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；用Ni-IDA Elution-Buffer(20mM Tris-HCl，250mM咪唑，0.15MNaCl，pH8.0)以1mL/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS(PH7.4)进行透析过夜。

结果如下：经Ni-IDA镍离子亲和层析柱的纯化后，收集的各个蛋白峰进行SDS-PAGE分析，可以发现目的蛋白集中在500mM咪唑洗脱产生的蛋白峰。通过凝胶成像检测仪分析在500mM咪唑洗脱的目的蛋白纯度可达电泳纯，如图5所示(图中M：蛋白marker；1：50mM咪唑洗脱-1；2：泳道3：50mM咪唑洗脱-2；3：50mM咪唑洗脱-3；4：500mM咪唑洗脱-1；5：500mM咪唑洗脱-2；6：500mM咪唑洗脱-3)。

实施例6抗多房棘球蚴原头节高亲和纳米抗体EmPN5亲和活性

(1)抗多房棘球蚴高亲和纳米抗体生物素标记

将纯化后EmPN5进行浓缩至抗体浓度为2mg/mL，将生物素溶解为浓度20mg/mL，按照生物素与抗体分子摩尔比1:20的比例加入抗体溶液，室温反应1h，去除游离生物素，添加抗体保护液，-20℃保存备用。

(2)提取原头节及囊泡的总蛋白，以10μ/mL浓度包被到ELISA板中，1％BSA37℃封闭2h后加入生物素标记的EmPN5(倍比稀释)，37℃孵育1h后，PBST洗涤4次后加入1:10000稀释二抗IgG-Streptavidin，PBST洗涤4次，加入100μLTMB显色液，避光显色5～20min，加入50μL终止液，读取OD₄₅₀吸光度。

结果如图6所示，EmPN5对多房棘球蚴总蛋白具有高亲和性，对BSA及肝细胞总蛋白无亲和性，表明该纳米抗体EmPN5对多房棘球蚴具有高度亲和性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种抗多房棘球蚴原头节的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述纳米抗体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.一种纳米抗体重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括初始载体和权利要求2所述的编码纳米抗体的基因。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述初始载体为pET28a载体，权利要求2所述的编码纳米抗体的基因克隆至所述重组表达载体的NdeI与XholⅠ酶切位点之间。

5.一种表达权利要求1所述抗多房棘球蚴原头节的纳米抗体的重组菌，其特征在于，所述重组菌中转化有权利要求3或4所述的纳米抗体重组表达载体。

6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌以大肠杆菌BL-21(DE3)为初始菌。

7.根据权利要求5或6所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌通过IPTG进行诱导表达。

8.权利要求1所述的抗多房棘球蚴原头节的纳米抗体在如下A1-A7至少一种中的应用：

(A3)制备识别或辅助识别多房棘球蚴原头节和/或囊泡产品；

(A4)制备结合或辅助结合多房棘球蚴原头节和/或囊泡产品；

(A7)制备多房棘球蚴囊泡示踪的产品。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂盒或探针或靶向物质。