CN115960837A - 乙肝病毒x蛋白（HBx）稳定过表达细胞及其高脂模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种乙肝病毒x蛋白（HBx）稳定过表达细胞及其高脂模型的构建方法。本发明选择了C57BL/6小鼠胎鼠来源的肝前体细胞作为模型，规避了人体试验的伦理风险。本发明采用慢病毒转染法使原代细胞转化为永生化细胞株，进行长期传代及进一步实验，另外在高脂造模实验中本发明使用单一的商品化油酸钠作为诱导剂，并筛选出适宜的诱导周期与浓度，这一方法步骤固定，从实验结果看对目的细胞几乎没有损伤。综上本发明的细胞模型材料易得、简单经济、且生物学功能稳定，具有很好的应用价值。

Description

乙肝病毒x蛋白(HBx)稳定过表达细胞及其高脂模型的构建方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及细胞模型，具体涉及一种构建高脂乙肝病毒x蛋白(HBx)稳定表达细胞模型的方法。

背景技术

乙肝病毒(HBV)感染是目前一个严重的全球性公共卫生问题，每年因HBV感染所致的肝硬化、肝衰竭和原发性肝细胞癌(HCC)去世的患者达65万人。我国1～59岁的一般人群中约7.18％(1亿余)的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)检测阳性，其内约2000万人为需要治疗的活动性乙型肝炎患者。临床观察上发现，在乙型肝炎患者体内，随着病程的延长，HBV对肝细胞的破坏就更厉害，患者的进食及蛋白消化功能也随之受影响，导致蛋白质缺乏，进而不能合成载脂蛋白，以致甘油三酯不能及时转移出肝脏，积存于肝内，最后形成脂肪肝。

乙型肝炎病毒编码的X蛋白作为四种表达蛋白之一，是一种多功能调节蛋白，在病毒复制中起重要作用。目前研究已明确，HBx蛋白是HBV感染引起肝脏脂肪性病变的元凶。HBx诱导脂质积累的机制复杂，早期研究发现HBx诱导肝脂肪变性可通过抑制PTEN，上调PI3K/Akt从而激活SREBP-1或是LXRα的表达，促进FAS，ACC，SCD，CD36，AP2以及Adiponectin等脂肪形成相关蛋白的表达上调。最近发现HBx能通过激活LXRa-Srebp1c通路促进脂质的积累。另外HBx也能够激活C/EBPα，上调PPARγ的转录激活作用，促进FABP1蛋白的表达，引起肝组织的脂质积累。因此深入探究HBx诱导脂肪病变的机制以及靶向相关通路或分子是改善乙型肝炎合并脂肪肝的关键。

目前，探究HBx诱导脂肪肝病变的体外模型较少，主要的模型是通过慢病毒转染法，将HBx基因稳定转染进入人肝癌细胞HepG2或Huh7中，再通过混合脂肪酸溶液(棕榈酸：油酸＝2:1)构建高脂稳定表达HBx蛋白的人肝癌细胞。这一模型的缺点是：1)细胞为人类肿瘤来源不能模仿正常细胞感染后细胞功能的改变，由于HBV在肝脏进行感染时通常会激活动物的肝前体细胞，进而促进其增殖，使得肝纤维化发生进一步导致原发性肝细胞癌；2)由于细胞的特殊性在HBx转染后增殖受到影响；3)在构建高脂模型时通常使用棕榈酸与油酸混合液，但此诱导剂制备复杂且有明显细胞毒性。综上所述，业界亟需一种可操作性强、具有模拟正常细胞被HBx影响的模型。这对于HBx诱导肝脏脂肪性病变治疗的研究、HBV合并脂肪肝发病机制的研究具有十分重要的意义。

发明内容：

为了解决现有高脂诱导HBx转染细胞模型的多种缺陷，本发明提供一种模拟正常肝前体细胞在转染HBx后的细胞模型。同时，发明人研究出仅使用一种脂肪酸诱导的高脂HBx过表达细胞模型，这一模型可以模拟HBx感染肝前体细胞后继而在高脂环境下其持续表达对细胞多种功能的影响。在本发明中，基于人源肝前体细胞难已获得且不能构建为永生化细胞株，而小鼠来源的细胞模型可用于多种人类疾病研究，生物功能上具有高度共同性，且可以开发为稳定传代的细胞株。本发明开创性选择了C57BL/6小鼠的胎鼠来源的肝前体细胞作为模型，规避了人体试验的伦理风险。相对于其他类型的小鼠(如具有免疫缺陷的小鼠)本发明使用了廉价易得且免疫功能正常的C57BL/6小鼠，后续实验也采用常规易操作的慢病毒转染法使原代细胞转化为永生化细胞株，可进行长期传代及进一步实验，另外在高脂造模实验中本发明使用单一的商品化油酸钠作为诱导剂，并筛选出适宜的诱导周期与浓度，这一方法步骤固定，从实验结果看对目的细胞几乎没有损伤。综上本发明的细胞模型材料易得、简单经济、且生物学功能稳定，具有很好的应用价值。

本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：

一种C57BL/6小鼠鼠源永生化肝前体细胞，其特征在于，采用如下方法制备：从C57BL/6孕鼠的胎鼠体内分离肝组织，用无血清DMEM培养基冲洗，用胰蛋白酶于室温下消化10-30min，用含胎牛血清的DMEM培养基(含10％胎牛血清)终止消化，反复吹打至细胞分散；500-3000rpm离心2-8min，弃上清液,再将细胞重悬于含胎牛血清的DMEM培养基(含10％胎牛血清)，接种于Matrigel基质胶(DPBS:基质胶＝500:1)包被的T-25细胞培养瓶中，置35-40℃、2-8％CO₂孵箱培养得到C57BL/6小鼠肝前体细胞；将C57BL/6小鼠肝前体细胞使用含胎牛血清的完全培养基(含10％胎牛血清)培养传1～2代后接种于T-25细胞培养瓶中，观察细胞融和度≥40％后吸去陈旧培养基，加入含Polybrene和SSR#69逆转录病毒液的DMEM培养基(0.1％SSR#69逆转录病毒液+DMEM培养基+8μg/mL Polybrene，无血清)转染，然后通过300-500μg/mL潮霉素B溶液持续筛选1-3周，获得初代稳定的永生化鼠源肝前体细胞株；将初代稳定的永生化鼠源肝前体细胞株转移至12孔板中，用100-250μg/mL潮霉素B溶液继续筛选1-3周，获得稳定的鼠源单克隆永生化肝前体细胞(命名为HP14-19细胞)。

进一步，所述C57BL/6孕鼠为12-18天的C57BL/6孕鼠。更进一步，优选13-17天的C57BL/6孕鼠；最优选15d-C57BL/6孕鼠。

上述方法中，所述SSR#69逆转录病毒液的制备方法为使用脂质体法，通过联合使用lipofectamine转染试剂，制备SSR#69逆转录病毒液。

上述方法中，通过western blotting对HP14-19细胞中永生化标志物SV40大T抗原进行检测，证明细胞构建成功。

高脂稳定HBx过表达肝前体细胞模型的构建方法，其特征在于，先构建携带HBx基因的慢病毒质粒；然后使用HEK-293T细胞对慢病毒质粒进行包装得到慢病毒工作液；再使用慢病毒工作液感染HP14-19肝前体细胞，并进行稳定细胞株的筛选，获得具有绿色荧光的HBx-EGFP-HP14-19细胞；再通过qRT-PCR、Western blots鉴定构建成功细胞；最后使用油酸(OA)钠诱导HBx-EGFP-HP14-19细胞构建高脂稳定HBx过表达肝前体细胞模型。

上述高脂稳定HBx过表达肝前体细胞模型通过检测油红O染色(ORO)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、游离脂肪酸(FFA)水平确定是否造模成功。

携带HBx基因的慢病毒质粒中目的基因的扩增序列为：

HBx前引物：CCTCTCTTTACGCGGTCTCG；

后引物：TGGGTCGTTCACATTGCTGA。

高脂稳定HBx过表达肝前体细胞模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)通过构建携带HBx基因的慢病毒质粒

针对HBx基因进行引物设计，通过PCR进行扩增：用限制性内切酶EcoRI和BamHI对含有HBx的质粒和载体进行酶切；扩增后通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定与分离，然后制备表达载体pLenti-CMV-HA-3FLAG-PGK-EGFP-F2A-Puro；利用T4 DNA连接酶将目的基因片段和表达载体进行连接反应；再采用CaCl₂法制备转化Ecoli DH5α感受态细菌得到菌液；最后按照试剂盒说明书进行质粒提取；所述PCR引物序列为：

HBx前引物：CCTCTCTTTACGCGGTCTCG；

后引物：TGGGTCGTTCACATTGCTGA；

(2)使用HEK-293T细胞进行病毒包装：

(3)使用慢病毒工作液感染HP14-19肝前体细胞，并进行稳定细胞株的筛选；(4)通过qRT-PCR、Western blots鉴定所构建成功的HBx-EGFP-HP14-19细胞，所述qRT-PCR反应引物序列如下：

；

(5)使用油酸(OA)钠诱导HBx-EGFP-HP14-19细胞后建立高脂模型

(6)通过油红O染色检测模型细胞的成脂率：

(7)通过试剂盒检测模型细胞的甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和游离脂肪酸(FFA)。

上述高脂稳定HBx过表达肝前体细胞模型的构建方法，通过构建携带HBx基因的慢病毒质粒步骤中，所述基因片段和表达载体进行连接反应的反应体系为：HBx基因片段3μl、pLenti-CMV--3FLAG-PGK-EGFP-F2A-Puro基因片段1μl、10×Buffer 2μl、T4-DNA连接酶1μl、ddH2O定量至20μl；混匀后16℃连接过夜，取10μl反应液转化到DH5α感受态细菌中。

上述高脂稳定HBx过表达肝前体细胞模型的构建方法，使用HEK-293T细胞进行病毒包装包括如下步骤：

(1)转染前取六孔板，各孔铺1×10^6个HEK-293T细胞；

(2)向无菌EP管中加入目的基因质粒，以及无血清培养基，混匀后室温孵育约3-10min；

(3)将Lipofectamine溶于无血清培养基混匀；

(4)再将包含目的基因质粒和Lipofectamine 2000溶液混匀；

(5)转染开始前，去除细胞中的培养基，并用DPBS清洗；

(6)转染时每孔加入含血清完全培养基，再加入适量质粒与转染试剂混合物，30-45℃放置8-15h后，弃培养基，加入DMEM完全培养基，转染48-72小时收获上清；2000-5000rpm离心10-30min留取上清，即为扩增后慢病毒液体。

上述高脂稳定HBx过表达肝前体细胞模型的构建方法，使用慢病毒工作液感染HP14-19肝前体细胞，并进行稳定细胞株的筛选，包括如下步骤：

(1)将HP14-19细胞冻存管从液氮罐中取出，冻存液融化后将细胞移至无菌超净台内，将细胞移至细胞培养皿内，向培养皿内加入DMEM培养基(含有10％ FBS)，于35-40℃，2-7％CO₂培养箱中培养，贴壁后换液；

(2)待细胞长满后，对细胞进行传代培养；

(3)慢病毒转染前，将状态良好的HP14-19细胞接种于24孔板(每孔5×10^4个细胞)，保证第二天感染时细胞融合度为50％-70％；

(4)转染当天，提前将基础DMEM培养基于0-6℃预冷，取出病毒(-80℃冰箱保存)，0-6℃冰上融化后离心；将细胞从孵箱中取出，吸取培养基，PBS清洗后，将准备好的病毒加到无胎牛血清无双抗的培养基中混匀，再加入24孔板各孔中；1-3小时后补加含10％FBS的DMEM培养基；同时每孔加入转染增强剂polybrene；

(5)转染24h后更换新鲜的DMEM培养基(含10％FBS)；48h后观察慢病毒感染HP14-19细胞的荧光表达，查看病毒是否已感染细胞。

上述高脂稳定HBx过表达肝前体细胞模型的构建方法，通过qRT-PCR、Westernblots鉴定所构建成功的HBx-EGFP-HP14-19细胞步骤中，qRT-PCR反应过程：95℃-30sec→5min-94℃→15sec-65℃→30sec-72℃-30sec进行40个循环，95℃保温1min后制作溶解曲线，实验重复三次，采集各孔Ct值，采用2^-△△Ct法，进行mRNA表达量分析。

上述高脂稳定HBx过表达肝前体细胞模型的构建方法，使用油酸(OA)钠诱导HBx-EGFP-HP14-19细胞后建立高脂模型时，油酸浓度为200μmol/L，诱导时间为48h。

本发明有益效果：

(1)采用鼠源肝前体细胞，一方面规避人体试验伦理问题，进而材料易得；一方面基于物种间生理生化功能相近，鼠源肝前体细胞可以模拟人肝前体细胞多种细胞效应。

(2)采用慢病毒稳定转染HBx基因进入鼠源永生化肝前体细胞，可以长期表达，另外可以了解HBx持续表达对肝前体细胞的形态、生化功能的影响。

(3)通过反复摸索探究出使用单一外源性脂肪酸，油酸钠，在适宜浓度与诱导周期下，也可以使细胞发生明显的脂肪积累，形成稳定的高脂细胞模型。同时结合HBx转染，也可以为探究HBx诱导肝脏发生脂肪病变以及促进肝前体细胞脂代谢紊乱提供方便易得，稳定的体外模型，也可为后续药物治疗等提供研究基础。

附图说明

图1：实施例1构建的鼠源永生化肝前体细胞HP14-19细胞；

图2：实施例1通过western blotting检测HP14-19细胞中永生化指标SV40T蛋白表达；

图3：实施例2在HBx过表达慢病毒转染后通过荧光显微镜(A)、qRT-PCR(B)以及western blotting(C)检测HBx-EGFP-HP14-19细胞中目的基因表达情况；

图4：实施例2通过CCK-8法检测调零组、无处理对照组以及48h和各浓度油酸钠处理HBx-EGFP-HP14-19细胞后的细胞抑制率；

图5：实施例2造模成功后HBx-EGFP-HP14-19细胞的油红O染色形态图；

图6：实施例2对照组和模型组HBx-EGFP-HP14-19细胞的甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)以及游离脂肪酸(FFA)的含量对比。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。本发明所用原料及试剂均为市售产品，所使用的试剂信息如下列表。

本发明使用到的主要试剂信息如下(见下列表)，其他试剂均为商品化市售产品。

实施例1：构建鼠源永生化肝前体细胞

1)SSR#69逆转录病毒液的制备

第一步：在转染前16h，将HEK-293细胞使用T-25(底面积为25cm^2)培养瓶进行培养与传代，传代密度为40％～60％。

第二步：转染前提前配置好转染体系，配置方法及组分如下：200μl DMEM培养基(无血清，无抗生素)+10μl SSR#69质粒+5μl pAmpho质粒+15μlLipofectamine 2000转染试剂，将上述成分混合均匀，于室温放置10min。

第三步：在转染液体加入前，弃去培养基，将需转染细胞使用5ml DMEM(无血清、抗生素)培养基清洗若干次，加入2.5mlDMEM(无血清、无抗生素)培养基至T-25细胞培养瓶，37℃放置10min。

第四步：将设置好的转染体系加到T-25细胞培养瓶,略微倾斜混匀,37℃培养4h,将T-25细胞培养瓶中培养基换成含有血清和抗生素的完全DMEM培养基。36h后收集细胞上清液,12000rpm离心5min,去除细胞碎片。并经0.22μm醋酸纤维素滤膜过滤。最终收集液体即SSR#69逆转录病毒液。

2)从15d-C57BL/6孕鼠的胎鼠体内分离肝组织，获取原代肝前体细胞

第一步：遵照动物福利规则，使用高浓度二氧化碳处死15d的C57BL/6孕鼠后快速取出腹腔中的胎鼠的肝脏组织，并使用DPBS溶液进行洗涤。

第二步：将清洗后的肝组织使用眼科小剪刀处理为1mm左右块状组织，之后使用无血清DMEM培养基冲洗3次后，用0.25％胰蛋白酶于室温下消化20min。

第三步：消化后观察细胞离散状态，用含10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，反复吹打至细胞分散。1000rpm离心5min，弃上清液,再将细胞重悬于10％胎牛血清的DMEM培养基，接种于Matrigel基质胶(DPBS:基质胶＝500:1)包被的T-25细胞培养瓶中，置37℃、5％CO₂孵箱培养。24h后换液去除未贴壁的细胞，贴壁细胞即为小鼠肝前体细胞。

第四步：原代肝前体细胞使用完全培养基(含10％胎牛血清)培养传1～2代后进行下一步实验。

3)使用SSR#69逆转录病毒液感染原代肝前体细胞，并进行稳定株筛选

第一步：小鼠肝前体细胞传代后接种于T-25细胞培养瓶中，观察细胞融和度达40％后吸去陈旧培养基，加入含Polybrene和SSR#69逆转录病毒液的DMEM培养基(0.1％SSR#69逆转录病毒液+DMEM培养基+8μg/mL Polybrene，无血清)

第二步：转染后12h，换新鲜完全培养基培养。同时加350μg/mL潮霉素B溶液持续筛选两周，即获得初代稳定的永生化鼠源肝前体细胞株。

4)永生化肝前体细胞株筛选培养并进行传代，命名为HP14-19细胞

第一步：初代细胞获得后，将细胞转移至12孔板中，改用175μg/mL潮霉素B溶液继续筛选两周，最终获得稳定的鼠源单克隆永生化肝前体细胞，命名为HP14-19细胞(见图1)。

第二步：去除12孔板中筛选后细胞中陈旧的培养基，接着使用DPBS进行清洗若干次。紧接着，使用0.25％胰蛋白酶于室温下消化，直至在倒置显微镜下观察，可明显看见细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即加入新鲜的培养液终止消化，用吸管反复吹打瓶底数次，使细胞脱离瓶底形成悬液。再逐步扩增至T-25细胞培养瓶，再分瓶培养进行传代。

第三步：传代后，将细胞进行冻存。将细胞陈旧培养基去除后，使用DPBS清洗若干次后，使用0.25％胰蛋白酶于室温下消化，直至在倒置显微镜下观察，可明显看见细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即加入新鲜的培养液终止消化，用吸管反复吹打瓶底数次，使细胞脱离瓶底形成悬液，将悬液移植15mL无菌离心管中以12000rpm离心5min，结束后弃去上层液体，获得白色固体细胞沉淀。向沉淀中加入适量细胞冻存液(90％胎牛血清+10％DMSO，提前配置，放置15min)，充分重悬后转移至细胞冻存管，在进行密封，进行梯度冻存：4℃，30min→-20℃，2h→-80℃，12h→液氮，长期保存。

5)HP14-19细胞中永生化标志物SV40大T抗原检测，证明细胞构建成功

第一步：使用western blotting法检测细胞内SV40大T抗原的表达

步骤如下：

1-1：细胞总蛋白提取：

①移除HP14-19细胞以及对照组原代肝前体细胞中的陈旧培养液，每个T-25培养瓶中加入500μl蛋白裂解液(RIPA:PMSF＝100:1)，细胞刮刮下细胞收集于1.5ml EP管中；冰上裂解45min，每5min振荡一次；离心15min，12000rpm，4℃，收集上清液于另一个1.5ml EP管中

②测定蛋白浓度：a.蛋白标准品的配制：蛋白标准品(20mg BSA)溶于0.8ml PBS缓冲液，配制成25mg/ml的蛋白标准溶液，保存于-20℃，备用(使用时将其稀释成浓度为0.5mg/ml的蛋白标准液)；b.BCA工作液配制：按试剂A：试剂B＝50:1的比例配制BCA工作液，充分混匀，现用现配；c.蛋白浓度测定：将0.5mg/ml的蛋白标准液按0、1、2、4、8、12、16、20μl依次加入到96孔板中，加入PBS缓冲液将每孔的量补足到20μl，相当于标准液的浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml；加2.0μl样品和18.0μl PBS缓冲液到96孔板的样品孔中；每孔加入200μl BCA工作液，分别设置三个副孔，37℃放置30min，酶标仪在562nm处测定吸光度；根据标准曲线和OD值计算样本的蛋白浓度。

③加入RIPA将蛋白稀释至同样浓度，根据体积加入1/4的5X蛋白上样缓冲液，混匀，100℃煮沸5min，冷却后分装并置于-80℃保存，备用。

1-2：配胶

①配置10％分离胶与5％浓缩胶

②10％分离胶加入玻璃板中，液面高度至玻璃板2/3处，再加入1ml无水乙醇压平液面，置于37℃烘箱中，25min；倒掉上层无水乙醇，待乙醇挥发后加入5％浓缩胶，于室温自然凝固，25min。

1-3：SDS-PAGE垂直凝胶电泳

①上样：每孔加入30μg蛋白样品，另外加入2.5μl蛋白分子量指示Marker(蛋白分子量指示剂)(蛋白分子量指示剂)；

②电泳：80V恒压30min，再恒压120V至Marker完全分离后停止电泳；

③转膜：250mA恒流电转，将凝胶上的蛋白转至PVDF膜，1.5min/kDa；

④封闭：PVDF膜置于5％脱脂奶粉中室温封闭2h；

⑤一抗孵育：GAPDH，SV40大T抗原抗体以1:1000的比例稀释，PVDF膜置于其中，4℃摇床过夜；

⑥二抗孵育：TBST洗涤孵育过一抗的PVDF膜3次，5min/次，室温孵育二抗2h；

⑦显影：TBST洗涤孵育过二抗的PVDF膜3次，5min/次，ECL发光液曝光。

实验结果显示相对鼠源原代肝前体细胞，HP14-19细胞中HBx蛋白呈现高表达(见图2)。

实施例2：构建高脂稳定HBx过表达肝前体细胞模型

1)通过构建携带HBx基因的慢病毒质粒

第一步：PCR扩增目的基因

(1)通过GenBank查询到HBx基因的上下游的序列，用Oligo7.0软件进行引物设计。序列如下：HBx前引物：CCTCTCTTTACGCGGTCTCG；后引物：TGGGTCGTTCACATTGCTGA。接下来对目的基因进行扩增。

(2)通过PCR进行基因片段扩增：使用PrimeSTAR酶扩增HBx基因，反应体系为：5×Prime

Buffer(Mg2+plus)10μL，dNTP Mixture(各2.5mmol/L)4μL，上、下引物各1μL，模板0.6μg，DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL，加灭菌蒸馏水至50μL。反应条件：98℃10s；-55℃15s；-72℃60s依上述反应顺序进行45个循环。之后将条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，做胶回收。

(3)HBx基因约487bp，扩增后通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定与分离

①制备琼脂糖凝胶电泳向：向30ml的1×TBE中加入0.3g琼脂糖，微波炉加热至沸腾，冷却至60℃时向溶液内加入6μl gold view，混匀后将配好的凝胶倒入干净的胶板中，插好梳子。待胶凝固后即可使用。

②使用Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0进行胶回收。在紫外灯照射下切出含目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体。再切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，以便提高DNA回收率。切碎胶块后称重，并计算体积。加入胶块溶解液Buffer GM。混匀后室温震荡溶解胶块，使胶块充分溶解。当凝胶完全溶解后，加入3M醋酸钠溶液10μl，混合直至溶液恢复为黄色。将溶液加入Spin Column中，12000rpm离心一分钟，弃掉滤液。加入700μl的Buffer WB，12000rpm离心30秒，弃掉滤液。重复两次。

(4)表达载体制备：表达载体pLenti-CMV-HA-3FLAG-PGK-EGFP-F2A-Puro大小约为9004bp，为商业化常规载体，本实验购买自上海和元生物技术有限责任公司。

第二步：目的基因质粒构建

(1)利用T4 DNA连接酶将目的基因片段和表达载体以3:1浓度进行连接反应。反应体系：HBx基因片段3μl、pLenti-CMV--3FLAG-PGK-EGFP-F2A-Puro基因片段1μl、10×Buffer2μl、T4-DNA连接酶1μl、ddH2O定量至20μl。将上述混匀后16℃连接过夜，取10μl反应液转化到DH5α感受态细菌中。

(2)采用CaCl₂法制备转化Ecoli DH5α感受态细菌，制备为菌液。

(3)通过试剂盒进行质粒提取：

①取5ml菌液于离心管中，8,000xg离心5分钟，弃上清，再加入1mL ResuspensionBuffer和10μL RNase A Buffer，均匀悬浮细菌沉淀，不残留有小的菌块。

②接着向离心管加1mL Lysis Buffer，充分地温和上下翻转4-6次，混合均匀使菌体充分裂解，直至变为清亮而黏稠的溶液，注意裂解时间不宜超过5min。

③裂解结束后，1mL Neutralization Buffer，上下翻转混合6-8次，充分混匀，至溶液出现白色絮状沉淀，12,000×g离心5min。

④将上清液转移至新的15mL离心管中，加入等体积的Binding Buffer，颠倒混匀，室温静置3min。

⑤将上清液分多次将溶液倒入吸附柱中，8,000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱重新放入收集管中。

⑥加入3mL Wash Buffer，8,000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱重新放入收集管中，此步骤重复两次。

⑦8,000rpm离心2min，弃废液，开盖于室温放置5～10min，以彻底晾干吸附材料中残余的洗涤液。

⑧将吸附柱置于新的EP管，向吸附膜的中央加入2mL Elution Buffer或ddH2O洗脱，室温放置2min，8,000rpm离心2min。将洗脱产物称重并置于-20℃保存，此产物即为目的基因质粒。

2)使用HEK-293T细胞进行病毒包装与扩增

步骤如下：

(1)转染前取六孔板，各孔铺1×10^6个HEK-293T细胞。

(2)向1.5ml无菌EP管中加入0.5μg目的基因质粒，以及250μl的无血清培养基。混匀后室温孵育约5min。

(3)将9μl Lipofectamine溶于250μl无血清培养基轻柔混匀，室温静置5min。

(4)再将包含目的基因质粒和Lipofectamine 2000溶液轻柔混匀，室温静置20min。

(5)转染开始前，去除细胞中的陈旧培养基，并用DPBS清洗若干次。

(6)转染时每孔加入1ml含血清完全培养基，再加入适量质粒与转染试剂混合物，37℃温箱过夜。次日约12h后，弃培养基，加入DMEM完全培养基，转染48-72小时收获上清。3000rpm离心20min留取上清，即为扩增后慢病毒液体。

3)使用慢病毒工作液感染HP14-19肝前体细胞，并进行稳定细胞株的筛选步骤如下：

(1)将HP14-19细胞冻存管从液氮罐中取出，置于37℃恒温水浴锅内，快速摇晃，使冻存管内冻存液在一分钟内融化，将细胞移至无菌超净台内，将细胞移至细胞培养皿内，向培养皿内加入DMEM培养基(含有10％ FBS)，于37℃，5％CO2培养箱中培养，贴壁后换液。

(2)待细胞长满后，需对细胞进行传代。将细胞从孵箱中取出，置于超净操作台内，用PBS轻轻清洗贴壁细胞两次后，弃掉PBS，向细胞培养瓶内加入0.25％胰酶1ml，静置1min。在显微镜下观察细胞由贴壁逐渐脱落，细胞形态逐渐变圆后，轻轻拍打培养瓶两侧，再加入1ml培养基终止消化，吸管轻轻吹落培养瓶贴壁细胞，使细胞完全脱落下来。将混悬液全部移入离心管中，800rpm离心5min。弃去上清液，细胞沉淀在离心管底部。向离心管中加入含10％FBS的DMEM培养基，用吸管吹开细胞后，将细胞混悬液吸入新的细胞培养瓶中。完成细胞传代。

(3)慢病毒转染前，将状态良好的HP14-19细胞接种于24孔板(每孔5×10^4个细胞)，保证第二天感染时细胞融合度为50％-70％。

(4)转染当天，提前将基础DMEM培养基于4℃预冷，取出病毒(-80℃冰箱保存)，4℃冰上融化，简易离心机离心。将细胞从孵箱中取出，吸取培养基，PBS清洗两次后，将准备好的病毒加到250μl无胎牛血清无双抗(青-链霉素)的培养基中混匀，再加入24孔板各孔中，每孔含病毒原液1.5μl。2小时后(中间每隔半小时均匀摇晃一次，增加感染效率)补加250μl含10％FBS的DMEM培养基。同时每孔加入2.5μl的转染增强剂polybrene。

(5)转染24h后更换新鲜的DMEM培养基(含10％FBS)，同时在显微镜下观察细胞存活状态。48h倒置荧光显微镜下观察慢病毒感染HP14-19细胞的荧光表达，以便粗略查看病毒是否已感染细胞。

(6)通过CCK-8法测算好嘌呤霉素对HP14-19细胞的杀灭曲线浓度为5μg/ml。因此在将已感染的细胞传代至6孔板中，待细胞贴壁后，向细胞培养基中加入5μg/ml嘌呤霉素，对感染病毒细胞进行筛选。24小时后，置于倒置荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。连续传代培养筛选4次，置于倒置显微镜下观察。紧接着，连续筛查2周后，即为HBx-EGFP-HBx细胞，镜下可观察到过表达HBx细胞相对对照细胞具有明显绿色荧光(见图3A)，实验证明稳定过表达HBx细胞构建成功，并进行后续分子生物学验证检测。

4)通过qRT-PCR、Western blots鉴定所构建成功的HBx-EGFP-HP14-19细胞第一步：Real-time PCR检测HBx mRNA在HBx-EGFP-HP14-19细胞中的表达情况

(1)提取细胞的总RNA(T-RNA)

①使用柱层析试剂盒分离法移除细胞培养液，每个培养皿中加入1ml裂解液，使用移液器反复吹打使细胞裂解，室温放置5min，使核酸复合物完全分离，收集于1.5ml无酶EP管。

②每1ml裂解液加入200μl氯仿，振荡15s后4℃放置5min；离心10min，12000rpm，4℃，上层水相(含有RNA)移到一个新的无酶管中；再在管中加入与上层水相等体积的70％乙醇，颠倒混匀，将管中溶液全部加入收集管的吸附柱中，离心20s，12000rpm，4℃，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

③吸附柱中加入600μl漂洗液，离心20s，12000rpm，4℃，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中；吸附柱中再加入600μl漂洗液，离心20s，12000rpm，4℃，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中；重复两次充分清洗与回收RNA；

④离心2min，12000rpm，4℃，取出吸附柱室温下放置数分钟；再将吸附柱放入一个新的无酶EP管中，加入50μl RNase free ddH2O，放置1min后离心，1min，12000rpm，4℃，收集RNA溶液；使用赛默飞NanoDrop one超微量分光光度计测定RNA溶液浓度，保存于-80℃冰箱备用。

(2)RNA逆转录为cDNA

①按照商品化逆转录试剂盒说明书进行，首先进行去除基因组DNA反应

在RNase-free的离心管中配制如下混合液：用移液器轻轻吹打混匀：42℃2min。

②配制逆转录反应体系

在①的反应管中直接加入5×HiScript II qRT SuperMix II，进行逆转录反应：50℃，15min→85℃，5sec，冷却至0℃。

上述完成后，将cDNA工作液保存于-20℃冰箱。

(3)荧光定量PCR反应

①操作均于冰上进行，按照如下配置反应体系进行PCR

②PCR反应过程：95℃-30sec→5min-94℃→15sec-65℃→30sec-72℃-30sec进行40个循环，95℃保温1min后结束扩增并获得样本溶解曲线，实验重复三次，采集各孔Ct值，采用2^-△△Ct法，进行mRNA表达量分析。

③本实验引物序列如下：

实验结果显示相对HP14-19细胞，HBx-EGFP-HP14-19细胞中HBx-mRNA呈现高表达(见图3B)。

第二步：Western blots检测HBx蛋白在HBx-EGFP-HP14-19细胞中的表达情况1-1：细胞总蛋白提取：

①移除HBx-EGFP-HP14-19细胞以及对照组HP14-19细胞中的陈旧培养液，每个T-25培养瓶中加入500μl蛋白裂解液(RIPA:PMSF＝100:1)，细胞刮刮下细胞收集于1.5ml EP管中；冰上裂解45min，每5min振荡一次；离心15min，12000rpm，4℃，收集上清液于另一个1.5ml EP管中

②测定蛋白浓度：a.蛋白标准品的配制：蛋白标准品(20mg BSA)溶于0.8ml PBS缓冲液，配制成25mg/ml的蛋白标准溶液，保存于-20℃，备用(使用时将其稀释成浓度为0.5mg/ml的蛋白标准液)；b.BCA工作液配制：按试剂A：试剂B＝50:1的比例配制BCA工作液，充分混匀，现用现配；c.蛋白浓度测定：将0.5mg/ml的蛋白标准液按0、1、2、4、8、12、16、20μl依次加入到96孔板中，加入PBS缓冲液将每孔的量补足到20μl，相当于标准液的浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml；加2.0μl样品和18.0μl PBS缓冲液到96孔板的样品孔中；每孔加入200μl BCA工作液，分别设置三个副孔，37℃放置30min，酶标仪在562nm处测定吸光度；根据标准曲线和OD值计算样本的蛋白浓度。

③加入RIPA将蛋白稀释至同样浓度，根据体积加入1/4的5X蛋白上样缓冲液，混匀，100℃煮沸5min，冷却后分装并置于-80℃保存，备用。

1-2：配胶

①配置10％分离胶与5％浓缩胶

②10％分离胶加入玻璃板中，液面高度至玻璃板2/3处，再加入1ml无水乙醇压平液面，置于37℃烘箱中，30min；倒掉上层无水乙醇，待乙醇挥发后加入5％浓缩胶，插入梳子，置于37℃烘箱中，30min。

1-3：SDS-PAGE垂直凝胶电泳

①上样：每孔加入30μg蛋白样品，另外加入2.5μl蛋白分子量指示Marker(蛋白分子量指示剂)；

②电泳：80V恒压30min，再恒压120V至Marker完全分离后停止电泳；

③转膜：250mA恒流电转，将凝胶上的蛋白转至PVDF膜，1.5min/kDa；

④封闭：PVDF膜置于5％脱脂奶粉中室温封闭2h；

⑤一抗孵育：GAPDH，SV40大T抗原抗体以1:1000的比例稀释，PVDF膜置于其中，4℃摇床过夜；

⑥二抗孵育：TBST洗涤孵育过一抗的PVDF膜3次，5min/次，室温孵育二抗2h；

⑦显影：TBST洗涤孵育过二抗的PVDF膜3次，5min/次，ECL发光液曝光。

实验结果显示相对HP14-19细胞，HBx-EGFP-HP14-19细胞中HBx蛋白呈现高表达(见图3C)。

5)使用200μmol/L油酸(OA)钠诱导HBx-EGFP-HP14-19细胞48h后建立高脂模型

(1)配置100mmol/L的油酸钠母液：提前称取250mg油酸于普通15mL离心管(高压灭菌处理)中，加入8.2mL无菌超纯水(高压灭菌处理)，配置好后至于65℃水浴中溶解，直至液体澄清无沉淀。

(2)在超净台中，使用0.22μm针头式过滤器，将配置好的油酸钠溶液进行过滤除菌，其后按照500μl每管进行分装并置于-80℃冰箱进行储存，浓度为100mmol/L。

(3)在进行正式成脂诱导前，通过CCK-8法与油红O染色法筛选出适宜的诱导浓度。首先通过CCK-8检测油酸(OA)钠对目的细胞的毒性，将目的细胞以5×10^4的浓度种于96孔板的每孔中。依照筛选的浓度，共分为8组，其中第一组为调零组，本组为排除培养基干扰；第二组为对照组，本组排除细胞自身所致干扰；第三至八组为给药组，其中所给予的油酸钠浓度依次为：50、100、200、400、800、1600μmol/L，每组重复9孔。实验开始时，对每孔中融合为60％至70％的细胞换液并使用无菌PBS溶液清洗，之后将含有各浓度药物的完全培养基重新加入每孔，培养48h后，去除每孔中液体，在避光条件下每孔加入1mL(含10μLCCK-8溶液)的无血清无双抗培养基，于37℃孵育1h，再于酶联免疫仪上选择450nm波长进行吸光度测定，最后统计各组吸光度平均值，依据公式抑制率％＝(对照－给药)/(对照－调零)×100％计算出药物的抑制率，结果发现50、100、200三个浓度对细胞无毒性，抑制率小于1％(见图4)。之后对三个浓度进行成脂效率筛选，通过油红O染色(见步骤6)发现200μmol/L合并48h能使细胞发生明显脂肪堆积且无毒性。

6)通过油红O染色检测模型细胞的成脂率：

①油红O配制：称取1g油红O干粉，溶于200ml异丙醇中，将溶液加热至75℃10分钟，期间不停地搅拌，使用滤纸趁热过滤，待冷却后再过滤一次，配成0.5％的油红储存液，棕色瓶保存。使用前，按双蒸水/储存液2：3配置，静置5～10分钟，再次过滤，分装于4℃储存。②造模48h后，去除培养基用PBS漂洗3-5次，4％多聚甲醛固定30分钟，再用PBS清洗残留多聚甲醛，并用70％异丙醇进行分选，接着用油红O染色22-25分钟，70％异丙醇脱底色30秒，再用PBS清洗残留异丙醇，用苏木素对细胞核复染5分钟，水封片，倒置显微镜下观察细胞内橘红色脂滴含量(见图5)，结果显示相比对照组，模型组有明显的脂肪蓄积，胞质中有大量橘红色脂肪颗粒，证明造模成果。

7)通过试剂盒检测模型细胞的甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和游离脂肪酸(FFA)：

造模完成后收集细胞，PBS清洗细胞三次后，用0.25％胰蛋白酶处理细胞使之分离，并用移液枪吹打下细胞，4℃，12000rpm离心5分钟收集细胞；弃上清，各组中均加入200μl蛋白裂解液(RIPA:PMSF＝100:1)，吹打均匀，冰浴30分钟，每5分钟涡旋一次；将细胞碎片及裂解液移入1.5ml EP管中，4℃12,000rpm离心30分钟，立即吸取上清至一预冷的EP管中；用三个指标的商用试剂盒(按照说明书进行操作测定)检测上清中的TG、TC、FFA的含量。结果显示相对对照组，模型组中TG、TC、FFA水平显著升高，证明造模成功(见图6)。

Claims (10)

1.一种C57BL/6小鼠鼠源永生化肝前体细胞，其特征在于，采用如下方法制备：从C57BL/6孕鼠的胎鼠体内分离肝组织，用无血清DMEM培养基冲洗，用胰蛋白酶于室温下消化10-30min，用含胎牛血清的DMEM培养基(含10％胎牛血清)终止消化，反复吹打至细胞分散；500-3000rpm离心2-8min，弃上清液,再将细胞重悬于含胎牛血清的DMEM培养基(含10％胎牛血清)，接种于Matrigel基质胶(DPBS:基质胶＝500:1)包被的T-25细胞培养瓶中，置35-40℃、2-8％CO₂孵箱培养得到C57BL/6小鼠肝前体细胞；将C57BL/6小鼠肝前体细胞使用含胎牛血清的完全培养基(含10％胎牛血清)培养传1～2代后接种于T-25细胞培养瓶中，观察细胞融和度≥40％后吸去陈旧培养基，加入含Polybrene和SSR#69逆转录病毒液的DMEM培养基(0.1％SSR#69逆转录病毒液+DMEM培养基+8μg/mL Polybrene，无血清)转染，然后通过300-500μg/mL潮霉素B溶液持续筛选1-3周，获得初代稳定的永生化鼠源肝前体细胞株；将初代稳定的永生化鼠源肝前体细胞株转移至12孔板中，用100-250μg/mL潮霉素B溶液继续筛选1-3周，获得稳定的鼠源单克隆永生化肝前体细胞。

2.如权利要求1所述的C57BL/6小鼠鼠源永生化肝前体细胞，其特征在于，所述C57BL/6孕鼠为12-18天的C57BL/6孕鼠；优选13-17天的C57BL/6孕鼠；最优选15d-C57BL/6孕鼠。

3.一种高脂稳定HBx过表达肝前体细胞模型的构建方法，其特征在于，先构建携带HBx基因的慢病毒质粒；然后使用HEK-293T细胞对慢病毒质粒进行包装得到慢病毒工作液；再使用慢病毒工作液感染如权利要求1或2所述的HP14-19肝前体细胞，并进行稳定细胞株的筛选，获得具有绿色荧光的HBx-EGFP-HP14-19细胞；再通过qRT-PCR、Western blots鉴定构建成功细胞；最后使用油酸(OA)钠诱导HBx-EGFP-HP14-19细胞构建高脂稳定HBx过表达肝前体细胞模型。

4.如权利要求3所述高脂稳定HBx过表达肝前体细胞模型的构建方法，其特征在于，通过检测油红O染色(ORO)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、游离脂肪酸(FFA)水平确定是否造模成功。

5.如权利要求3或4所述高脂稳定HBx过表达肝前体细胞模型的构建方法，其特征在于，携带HBx基因的慢病毒质粒中目的基因的扩增序列为：

HBx前引物：CCTCTCTTTACGCGGTCTCG；

后引物：TGGGTCGTTCACATTGCTGA。

6.如权利要求3所述高脂稳定HBx过表达肝前体细胞模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)通过构建携带HBx基因的慢病毒质粒

针对HBx基因进行引物设计，通过PCR进行扩增：用限制性内切酶EcoRI和BamHI对含有HBx的质粒和载体进行酶切；扩增后通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定与分离，然后制备表达载体pLenti-CMV-HA-3FLAG-PGK-EGFP-F2A-Puro；利用T4 DNA连接酶将目的基因片段和表达载体进行连接反应；再采用CaCl₂法制备转化EcoliDH5α感受态细菌得到菌液；最后按照试剂盒说明书进行质粒提取；所述PCR引物序列为：

HBx前引物：CCTCTCTTTACGCGGTCTCG；

后引物：TGGGTCGTTCACATTGCTGA；

(2)使用HEK-293T细胞进行病毒包装；

(3)使用慢病毒工作液感染HP14-19肝前体细胞，并进行稳定细胞株的筛选；

(4)通过qRT-PCR、Western blots鉴定所构建成功的HBx-EGFP-HP14-19细胞，所述qRT-PCR反应引物序列如下：

；

(5)使用油酸(OA)钠诱导HBx-EGFP-HP14-19细胞后建立高脂模型；

(6)通过油红O染色检测模型细胞的成脂率；

(7)通过试剂盒检测模型细胞的甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和游离脂肪酸(FFA)。

7.如权利要求6所述高脂稳定HBx过表达肝前体细胞模型的构建方法，其特征在于，使用HEK-293T细胞进行病毒包装包括如下步骤：

(1)转染前取六孔板，各孔铺1×10^6个HEK-293T细胞；

(2)向无菌EP管中加入目的基因质粒，以及无血清培养基，混匀后室温孵育约3-10min；

(3)将Lipofectamine溶于无血清培养基混匀；

(4)再将包含目的基因质粒和Lipofectamine 2000溶液混匀；

(5)转染开始前，去除细胞中的培养基，并用DPBS清洗；

(6)转染时每孔加入含血清完全培养基，再加入适量质粒与转染试剂混合物，30-45℃放置8-15h后，弃培养基，加入DMEM完全培养基，转染48-72小时收获上清；2000-5000rpm离心10-30min留取上清，即为扩增后慢病毒液体。

8.如权利要求6或7所述高脂稳定HBx过表达肝前体细胞模型的构建方法，其特征在于，使用慢病毒工作液感染HP14-19肝前体细胞，并进行稳定细胞株的筛选，包括如下步骤：

(1)将HP14-19细胞冻存管从液氮罐中取出，冻存液融化后将细胞移至无菌超净台内，将细胞移至细胞培养皿内，向培养皿内加入DMEM培养基(含有10％FBS)，于35-40℃，2-7％CO₂培养箱中培养，贴壁后换液；

(2)待细胞长满后，对细胞进行传代培养；

(3)慢病毒转染前，将状态良好的HP14-19细胞接种于24孔板(每孔5×10^4个细胞)，保证第二天感染时细胞融合度为50％-70％；

(4)转染当天，提前将基础DMEM培养基于0-6℃预冷，取出病毒(-80℃冰箱保存)，0-6℃冰上融化后离心；将细胞从孵箱中取出，吸取培养基，PBS清洗后，将准备好的病毒加到无胎牛血清无双抗的培养基中混匀，再加入24孔板各孔中；1-3小时后补加含10％FBS的DMEM培养基；同时每孔加入转染增强剂polybrene；

(5)转染24h后更换新鲜的DMEM培养基(含10％FBS)；48h后观察慢病毒感染HP14-19细胞的荧光表达，查看病毒是否已感染细胞。

9.如权利要求6-8任一项所述高脂稳定HBx过表达肝前体细胞模型的构建方法，其特征在于，通过qRT-PCR、Western blots鉴定所构建成功的HBx-EGFP-HP14-19细胞步骤中，qRT-PCR反应过程：95℃-30sec→5min-94℃→15sec-65℃→30sec-72℃-30sec进行40个循环，95℃保温1min后制作溶解曲线，实验重复三次，采集各孔Ct值，采用2^-△△Ct法，进行mRNA表达量分析。

10.如权利要求6-8任一项所述高脂稳定HBx过表达肝前体细胞模型的构建方法，其特征在于，使用油酸(OA)钠诱导HBx-EGFP-HP14-19细胞后建立高脂模型时，油酸浓度为200μmol/L，诱导时间为48h。

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