CN115960713A - 一种深海微生物分级梯度稀释分离单菌落的装置与方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及海洋微生物分离技术领域，特指一种深海微生物分级梯度稀释分离单菌落的装置与方法。深海微生物分级梯度稀释分离单菌落的装置包括有富集系统、分离操作培养器、中央控制系统、温度控制单元和压力控制单元。在本发明中，在高压环境条件下，对极端环境条件的微生物进行富集和分离培养的高压纯培养技术，解决了现有常压分离培养技术脱离高压环境微生物原位生存的温度和压力环境条件，造成绝大多数微生物生存活性差，或者表型与原位环境差异大，不能分离纯培养的问题。

Description

一种深海微生物分级梯度稀释分离单菌落的装置与方法

技术领域

本发明涉及海洋微生物分离技术领域，特指一种深海微生物分级梯度稀释分离单菌落的装置与方法。

背景技术

长期生活在高压、低温（或高温）、无光环境的深海微生物，具有适应该环境的独特代谢途径及防御机制。破解深海微生物的遗传机制和代谢特点，揭示它们在海洋生态环境中的作用和机制，有助于加深对生命过程特别是极端生命和低能量生命过程的认识。

另外，深海微生物丰富的多样性和独特的代谢能力，使其成为解决气候、能源、环境、医药等问题不可或缺的资源宝库。研究表明，环境中（包括海洋）绝大多数微生物仍未可培养。尽管基于基因组、转录组学的研究工作有助于揭示海洋微生物在物种、代谢潜力以及生态功能等发面存在的巨大多样性，但由于缺乏可培养的菌株，使人们证实这些微生物的生理代谢特点并验证基于它们基因组分析形成的假说，也限制了对其利用价值的深入研究和发掘。

对于海洋环境中微生物的分离，现有技术主要在常压环境下进行，较少在高压环境下分离培养单菌落，即使在高压环境下的单菌落分离，其效率也比较低，导致目前可培养微生物数量不到深海环境的1%，为我们正确认识和利用海洋资源带来一定的困难。

鉴于此，本发明提出了一种针对高压环境，例如海洋微生物生活的极端环境特征，通过重塑其原位环境进行保温、保压分离梯度稀释分离并培养微生物的装置与方法，提高可培养性，为开发利用高压环境微生物资源提供重要的基础手段。

发明内容

本发明的发明目的在于：为了解决现有技术中所存在的问题，本发明提供了一种深海微生物分级梯度稀释分离单菌落的装置与方法。

为了解决现有技术中所存在的问题，本发明采用以下技术方案：

一种深海微生物分级梯度稀释分离单菌落的装置，包括有富集系统、分离操作培养器、中央控制系统、温度控制单元和压力控制单元；

所述富集系统和所述分离操作培养器相连通，且所述富集系统、所述分离操作培养室、所述温度控制单元和所述压力控制单元均与所述中央控制系统电连接；

所述富集系统用于培养微生物，所述富集系统包括有富集釜；所述富集系统包括有进气通道和/或进液通道，通过所述进气通道和/或所述进液通道向所述富集釜中对应地注入气体和/或液体，向所述富集釜进行增压；

所述中央控制系统用于进行环境数据变化的监控，并监控、实时采集、处理、存储和图像输出；所述温度控制单元用于检测和调节所述富集系统和所述分离操作培养器内的温度变化；所述压力控制单元用于检测和调节所述富集系统和所述分离操作培养器内的压力变化，并向所述分离操作培养器注入气体或液体进行增压；

所述分离操作培养器包括有从上往下设置的可拆卸上盖、主体和分离区；所述分离操作培养器内设置有分界部和凹槽，所述分界部设置在所述分离区上部，所述凹槽设置于分离操作培养器得内壁上，且与所述分离区的上部与所述分界部的最高处表面边缘通过滑道连接；所述分离区内设置有不同营养配比培养基质的固体培养基。

作为本发明深海微生物分级梯度稀释分离单菌落的装置的技术方案的一种改进，所述分离区内镶嵌有模具，所述模具内设置有多个培养区，每个所述培养区内装置有不用营养配比的培养基；

所述分离区内均分为至少四个部分，至少四个分离部分包括有第一分离部分、第二分离部分、第三分离部分和第四分离部分，所述第一分离部分与滑道底部保持接触的位置，所述第二分离部分、所述第三分离部分和所述第四分离部分按顺时针方向设置；

所述分离操作培养器底部的外侧设置有划线小球控制区，所述划线小球控制区内设置有磁铁和手柄，通过手柄移动所述磁铁，所述磁铁控制分离操作培养器内部培养基表面划线小球的位置，所述凹槽内沾满菌液的划线小球在磁铁的作用下，在分离区内划线分离出单个菌落。

作为本发明深海微生物分级梯度稀释分离单菌落的装置的技术方案的一种改进，每个所述分离部分均倾斜设置有出球管道，所述出球管道对应地设置在于所述培养基表面持平的位置；

所述出球管道上设置有第一阀门和第二阀门，其中第一阀门位于所述第二阀门和所述分离操作培养器之间。

作为本发明深海微生物分级梯度稀释分离单菌落的装置的技术方案的一种改进，进球管道倾斜设置在于第四分离部分的上部；

所述进球管道上设置有第三阀门和第四阀门，其中第三阀门位于所述第四阀门和所述分离操作培养器之间；

所述进球管道和所述分离操作培养器的连接处与所述分离操作培养器内壁的凹槽高度保持一致。

作为本发明深海微生物分级梯度稀释分离单菌落的装置的技术方案的一种改进，所述分离操作培养器还设置在底部的支脚；

所述盖体与所述分离区通过卡扣连接；所述盖体上部的中心设有观察区，所述观察区包括有滑轨、连接支架、观察装置和可视窗，所述观察装置、所述连接支架和所述滑轨依次连接，且所述观察装置位于所述可视窗的上部。

作为本发明深海微生物分级梯度稀释分离单菌落的装置的技术方案的一种改进，每个所述模具成“＃”状。

作为本发明深海微生物分级梯度稀释分离单菌落的装置的技术方案的一种改进，所述富集釜包括有可拆卸上盖；所述富集釜内的顶部设置有搅拌杆；所述进气管道和所述进液管道上均安装有阀门；所述富集釜还设置有调节阀的取样口；所述富集釜放置在水域中，或放置在空气换热试恒温房中；

所述富集系统还包括有送液管道、微注泵、出液管道和收集装置，所述凹槽与所述收集装置相连通；所述富集釜中的菌液通过所述送液管道和所述微注泵进入到所述凹槽中，所述凹槽中多余的菌液通过所述出液管道达到所述收集装置中。

作为本发明深海微生物分级梯度稀释分离单菌落的装置的技术方案的一种改进，所述压力控制单元包括有压力传感器和增压系统，所述增压系统包括有空压机、增压泵、储气罐、调压阀和送气管道，所述送气管道与所述分离操作培养器相连通；所述压力传感器设置在所述分离操作培养室内。

深海微生物分级梯度稀释分离单菌落方法，使用如上述的深海微生物分级梯度稀释分离单菌落的装置，包括有以下步骤：

S1、对分离操作培养器进行清洗灭菌，并在分离区的底部装入不同营养配比的培养基；

S2、通过压力控制单元往分离区注入气体，使分离操作培养器内的压力值与富集系统环境的压力值一致；

S3、开启温度控制单元，使分离操作培养器与所述富集系统的环境温度一致；

S4、释放进球管道内的划线小球，通过划线小球在培养基上的移动分离至分离操作培养器内的凹槽中；

S5、由微注泵向凹槽中的划线小球滴加微生物菌液；

S6、第一次划线分离，划线小球通过滑道到达第一分离部分，通过手柄控制划线小球在第一分离部分上面移动划线，并通过观察区进行观察划线情况，最后打开第一分离部分的出球管道的阀体使小球进入；

S7、第二次划线分离，释放进球管道内的划线小球，划线小球在培养基上移动，并找到第一次划线小球划线的末端，以第一次划线分离的末端为起点划线，通过手柄控制划线小球在第二分离部分上面移动划线，并通过观察区进行观察划线情况，最后打开第二分离部分的出球管道的阀体使小球进入；

S8、根据S6和S7的方式，依次进行第三次划线分离和第四次划线分离。

本发明的有益效果：

1、本发明实现高压环境，如在海洋原位的温度和压力环境条件下，微生物的富集培养以及采用划线小球分级划线分离并培养微生物的装置与方法，解决高效分离纯培养高压环境微生物的难题；

2、相对于现有的纯培养技术，本发明提出了在高压环境条件下，对极端环境条件的微生物进行富集和分离培养的高压纯培养技术，解决了现有常压分离培养技术脱离高压环境微生物原位生存的温度和压力环境条件，造成绝大多数微生物生存活性差，或者表型与原位环境差异大，不能分离纯培养的问题；

3、相对于现有的高压分离培养技术，可以实现保温、保压分级梯度稀释分离培养单个菌落并结合不同培养基的类型，实现最大程度的单菌落分离，解决在高压环境下分离效率低的问题；

4、相对于现有的分离培养技术，本发明可有效地减少专业人员的投入，并且可以进行规模化富集和分离培养，提高难培养微生物的筛选效率，提高高压环境功能均的筛选和培养效率。

附图说明

图1为本发明深海微生物保温保压分级梯度稀释分离单菌落的装置的结构示意图；

图2为本发明深海微生物保温保压分级梯度稀释分离单菌落的装置中的模具的平面示意图；

图3为本发明中深海微生物保温保压分级梯度稀释分离单菌落的装置的中央控制系统电路模块连接示意图；

图4为本发明深海微生物保温保压分级梯度稀释分离单菌落的方法的流程示意图。

附图标记说明：1 - 中央控制系统；2 - 分离操作培养器；21 - 支脚；22 - 分离区；221 - 分界部；222 - 划线小球；223 - 凹槽；224 - 滑道；225 - 第一阀门；226 - 第二阀门；227 - 进球管道；228 - 出球管道；229 - 小球控制区；2291 - 磁铁；2292 - 手柄；23 - 盖体；231 - 观察区；2311 - 滑轨；2312 - 连接支架；2313 - 观察装置；2314 -可视窗；3 - 温度控制单元；31 - 温度传感器；4 - 压力控制单元；41 - 空压机；42 - 增压泵；43 - 储气罐；44 - 调压阀；45 - 进气阀；46 - 送气管道；47 -压力传感器；5 - 富集系统；51 - 富集釜；511 - 搅拌杆；512 - 可拆卸上盖；52 - 送液管道；53 - 微注泵；55- 放空泵；56 - 出液管道；57 - 收集装置；6 - 模具；61 - 培养区。

具体实施方式

为使本发明的发明目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

如图1至图3所示，包括有富集系统5、分离操作培养器2、中央控制系统1、温度控制单元3和压力控制单元4；

富集系统5和分离操作培养器2相连通，且富集系统5、分离操作培养室、温度控制单元3和压力控制单元4均与中央控制系统1电连接；

富集系统5用于培养微生物，富集系统5包括有富集釜51；富集系统5包括有进气通道和/或进液通道，通过进气通道和/或进液通道向富集釜51中对应地注入气体和/或液体，向富集釜51进行增压；

中央控制系统1用于在高压环境进行环境数据变化的监控，并监控、实时采集、处理、存储和图像输出；温度控制单元3包括有温度传感器31，温度控制单元3用于检测和调节富集系统5和分离操作培养器2内的温度变化；压力控制单元4用于检测和调节富集系统5和分离操作培养器2内的压力变化，并向分离操作培养器2注入气体或液体进行增压；

分离操作培养器2包括有从上往下设置的可拆卸上盖512、主体和分离区22；分离操作培养器2内设置有分界部221和多个凹槽223，分界部221设置在分离区22上部，凹槽223设置于分离区22的上部与分界部221的最高处表面边缘通过滑道224连接；分离区22内设置有不同营养配比培养基质的固体培养基。

作为本发明的第一种实施方式，分离区22内镶嵌有模具6，模具6内设置有多个培养区61，每个培养区61内装置有不用营养配比的培养基；

分离区22内均分为至少四个部分，至少四个分离部分包括有第一分离部分、第二分离部分、第三分离部分和第四分离部分，第一分离部分位于与滑道224底部保持接触的位置，第二分离部分、第三分离部分和第四分离部分按顺时针方向设置；

第四分离部分的上部侧壁倾斜设置有进球管道227；第一分离部分、第二分离部分、第三分离部分和第四分离部分与培养基表面持平的位置倾斜设置有出球管道228；

分离操作培养器2的底部外侧设置有划线小球222控制区，划线小球222控制区内设置有磁铁2291和手柄2292，通过手柄2292移动磁铁2291，磁铁2291控制分离操作培养器2内部培养基表面划线小球222的位置，凹槽223内沾满菌液的划线小球222在磁铁2291的作用下，在分离区22内划线分离出单个菌落。

作为本发明的第二种实施方式，每个分离部分均倾斜设置有出球管道228，出球管道228对应地设置在于培养基表面持平的位置；

出球管道228上设置有第一阀门225和第二阀门226，其中第一阀门225位于第二阀门226和分离操作培养器2之间。

作为本发明的第三种实施方式，分离操作培养器2还设置在底部的支脚21；

盖体23与分离区22通过卡扣连接；盖体23上部的中心设有观察区231，观察区231包括有滑轨2311、连接支架2312、观察装置2313和可视窗2314，观察装置2313、连接支架2312和滑轨2311依次连接，且观察装置2313位于可视窗2314的上部。

作为本发明的第四种实施方式，每个模具6成“＃”状，填充不同培养基是借助模具完成，模具的大小可镶嵌在为每个分离部分内，模具中有多个培养区，不同培养区装有不同营养配比的培养基。

作为本发明的第五种实施方式，富集釜51包括有可拆卸上盖512；富集釜51内的顶部设置有搅拌杆511；进气管道和进液管道上均安装有阀门；富集釜51还设置有调节阀的取样口；富集釜51放置在高温或低温的水域中，或放置在空气换热试恒温房中；

富集系统5还包括有送液管道52、微注泵53、出液管道56和收集装置57，凹槽223与收集装置57相连通；富集釜51中的菌液通过送液管道52和微注泵53进入到凹槽223中，凹槽223中多余的菌液通过出液管道56达到收集装置57中。

作为本发明的第六种实施方式，压力控制单元4包括有压力传感器47和增压系统，增压系统包括有空压机41、增压泵42、储气罐43、调压阀44和送气管道46，送气管道46与分离操作培养器2相连通；压力传感器47设置在分离操作培养室内。

在本发明中，通过在高压环境的分离操作培养器2里面构建微生物的生长环境，如海洋环境生活的高压与极端温度环境条件，提高了微生物的可培养性。其中，通过富集系统5培养得到纯度较高的目标性微生物，同时通过多级划线小球222的划线，将菌液在固体培养基上的分离，获得单个的微生物菌落；而且整个富集和分离的全过程都在微生物原位压力、温度环境条件下进行。其中，本发明中的划线小球222可以为呈球状的滚动物件，且划线小球222的直径略小于进球通道和出球通道的宽度，可以便于在进球通道和出球通道的滚动。由于装置的体积较小，可以通过较小直径球状滚动物件实现在进球通道和出球通道的滚动。

详细地说，在本发明中，富集釜51需要维持恒温，其是将富集釜51安放于温度高或温度低的温水浴中，通过与水浴系统的热交换作用，维持富集釜51内的恒温状态。或者将富集釜51放置于空气换热式恒温房中。

富集釜51的顶部设置有进气通道和/或进液通道，进气通道和/或进液通道上均安装有调节阀，通过进气通道和/或进液通道向富集釜51内注入培养需要的气体或惰性气体和/或液体，实现向富集釜51内增压的效果，实现了富集釜51内的压力值与其原位实际高压环境一致。进一步的，富集釜51上设置有调节阀取样口，用于在富集过程中，取样进行分析检测，以便进行相应的环境参数调整，优化富集培养的流程。

优选的，富集釜51为可开盖式结构设置，方便放入培养底物和进行灭菌处理操作。富集釜51顶部设置有搅拌杆511，可通过手动或机械搅拌增强传质，增强培养过程中基质的反应过程，增加微生物的能量和营养利用效率。

通过前期室内长期富集培养，并在定向营养条件供给胁迫下，获得高度纯化的目标微生物。目标微生物的分离转移可以通过微注泵53将富集釜51中的富集液通过取样口取出泵入分离操作培养器2中。在整个富集与分离纯化培养的过程中，培养釜内的温度、压力环境条件都与微生物在深海的环境条件一致，保证富集培养的有效性。

在本发明中的分离操作培养器2是利用多级划线小球222的划线，将菌液在固体培养基上分离的原理，将富集系统5的培养液通过微注泵53注入分离操作培养器2的凹槽223内，凹槽223内沾满菌液的划线小球222在磁铁2291的作用下，在分离区22分离出单个菌落。

在本实施方式中，本发明中的分离操作培养器2包括有分离支架，为了有效地利用空间，分离支架为圆台或圆柱式分离支架，这样可以在有限的空间内最大程度地增加了能够供微生物分离培养的空间、面积。

分离操作培养器2中的凹槽223位于分离区22的上部与分界部221的最高处的表面边缘通过滑道224连接，且该滑道224的直径稍大于划线小球222的直径，可以便于小球的滑动；分离区22内填充有不同营养配比培养基质的固体培养基，为微生物的分离培养提供营养。

在分离区22中设置有多个模具6，模具6是用于填充不同培养基的，模具6可拆卸地镶嵌在每个分离部分中，且模具6内形成多个培养区61，不同培养区61内装有不同营养配比的培养基。

作为本实施方式的一个实施例，本发明分离操作培养器2中包括有一个分离区22，将分离区22平均分成四个部分，分别为第一分离部分、第二分离部分、第三分离部分和第四分离部分。

其中，第一分离部分位于划线小球222通过滑道224可以第一次进入的区域，继而，第二分离部分、第三分离部分和第四分离部分按照顺时针方向设置。在第四分离部分的上部侧壁上设置有进球管道227，进球管道227的直径稍大于划线小球222的直径，进球管道227底部与分界部221最高处的距离大于等于0cm，进球管道227的外部与水平线具有一定夹角，该夹角大于零且小于等于90度，保证在该夹角的作用下可以使得划线小球222在重力的作用下自动下移即可，进球管道227上设置有第一阀门225和第二阀门226，第一阀门225位于第二阀门226与分离操作培养器2之间。第一分离部分、第二分离部分、第三分离部分、第四分离部分与培养基表面持平的位置均设置有出球管道228，为保证划线小球222顺利进入出球管道228，出球管道228的直径大于划线小球222的直径，出球管道228的外部与水平线具有一定夹角，该夹角小于零且大于等于负90度，保证在该夹角的作用下可以使得划线小球222在重力的作用下自动下移即可；出球管道228上也设置有第一阀门225和第二阀门226，第一阀门225也位于第二阀门226与分离操作培养器2之间。

进一步的，在本发明中，富集系统5还包括有送液管道52、微注泵53、出液管道56和收集装置57。由于在本发明中，通过分离操作培养器2进行分离操作，分离操作的菌液来自富集釜51，而且通过富集系统5中的送液管道52和微注泵53注入到凹槽223中，当凹槽223内的菌液过多时，则会通过出液管道56流动到收集装置57中进行收，避免菌液的浪费。

为了保证本发明的压力稳定，出液管道56和送液管道52上均安装有阀门。进一步的，分离操作培养器2包括有设置在上部的盖体23、设置在下部的分离区22和设置在底部的支脚21，盖体23和分离区22通过卡扣连接。盖体23上部的中心设有观察区231，观察区231包括滑轨2311、连接支架2312、观察装置2313、可视窗2314，可视窗2314位于盖体23上面的正中心，观察装置2313、连接支架2312和滑轨2311依次连接，且观察装置2313位于可视窗2314的上部。优选的，为方便观察，连接装置可为“L”形，且连接装置的两端都具有收缩性。

本发明中的压力控制单元4主要用于向微生物分离培养室内注入气体增压，使得分离操作培养器2内的压力环境与微生物在海洋原位所处的压力值一致，同时监控分离操作培养器2内的压力变化。通过压力传感器47实时监控培养室内的压力变化，通过主动充气/放气进行培养室的增压、减压，使培养室和分离室内的压力值保持与微生物生长的海洋环境条件一致。

其中，压力控制单元4包括有增压系统，增压系统包括有空压机41、增压泵42、储气罐43、调压阀44、管道和阀体等配件组成。本发明涉及的温度控制系统主要是监控富集釜51和分离操作培养器2内的温度变化。

本发明中的中央控制系统1包括数据采集器、数据中央处理器、操作电脑等实现微生物富集菌在高压环境进行富集、分离、纯化过程中各项环境数据信息变化的监控、以及实时采集、处理、存储和图像输出等功能。

本发明深海微生物保温、保压分级梯度稀释分离单菌落的装置的工作流程主要包括有两个步骤。

通过富集系统5培养目标微生物，得到纯度较高的目标菌群后，在保压情况下进入分离操作培养器2进行固体培养分离，并且通过不同培养基和环境条件的组合工艺同时筛选，得到纯培养菌株。

如图4所示，本发明还提供了一种深海微生物保温、保压分级梯度稀释分离单菌落的方法，其包括有以下步骤：

S1、对分离操作培养器2进行清洗灭菌，并在分离区22的底部装入不同营养配比的培养基；

S2、通过压力控制单元4往分离区22注入气体，使分离操作培养器2内的压力值与富集系统5环境的压力值一致；

S3、开启温度控制单元3，使分离操作培养器2与富集系统5的环境温度一致；

S4、释放进球管道227内的划线小球222，通过划线小球222在培养基上的移动分离至分离操作培养器2内的凹槽223中；

S5、由微注泵53向凹槽223中的划线小球222滴加微生物菌液；

S6、第一次划线分离，划线小球222通过滑道224到达第一分离部分，通过手柄2292控制划线小球222在第一分离部分上面移动划线，并通过观察区231进行观察划线情况，最后打开第一分离部分的出球管道228的阀体使划线小球222进入；

S7、第二次划线分离，释放进球管道227内的划线小球222，划线小球222在培养基上移动，并找到第一次划线小球222划线的末端，以第一次划线分离的末端为起点划线，通过手柄2292控制划线小球222在第二分离部分上面移动划线，并通过观察区231进行观察划线情况，最后打开第二分离部分的出球管道228的阀体使划线小球222进入；

S8、根据S6和S7的方式，依次进行第三次划线分离和第四次划线分离。

详细地说，首先是将富集釜51及其附带管阀件进行灭菌处理，然后依次装入待培养的底物如深海沉积物、与微生物共生的宏生物组织及提取液等，然后从注液口装入培养需要的营养液，然后从注气口注入培养需要的气体（若不需要可注入惰性气体）使得培养腔内的压力值增加至与深海实际环境条件一致。在培养的过程中，通过顶部的搅拌装置进行搅拌，增加传质作用，优化培养进程。

当富集过程的目标菌液浓度经鉴定达到需求后，进入分离培养过程。分离培养过程主要包括，首先，将分离操作培养器2及其内部所有器件及相关的管阀件进行灭菌处理，保持无菌状态。然后，在分离区22的底部上填充好灭菌后的固体培养基，固体培养基的高度应与分界部221持平；打开进球管道227的第二阀门226，放入划线小球222并关闭第二阀门226。为了避免固体琼脂培养基在高压条件下液化，可在平板内填充氧化铝粉末、微细玻璃珠/钢球、钢丝球等作为支撑，满足固体分离培养的需求。在进球管道227内加入划线小球222。然后，开启高/低温水浴系统，保证分离操作培养器2的温度与微生物在海洋环境的温度条件一致。然后通过注气口往培养室内注入气体增压，使分离操作培养器2内的压力条件与微生物在海洋环境生活的压力条件一致。确保所有系统部件工作正常后，打开进球管道227的第一阀门225，使得进球管道227内的小球可以进入分离操作培养器2内的固体培养基表面，然后通过小球控制区229的磁铁2291，使得划线小球222通过滑轨2311达到凹槽223内，再开启微注泵53通过从富集釜51内向分离操作培养器2内注入微生物富集液，微生物富集液滴落在小球的顶部，再打开出液管道56的第一阀门225，使得多余的菌液进入管道，再打开第二阀门226并关闭第一阀门225，多余的微生物富集液则进入收集装置57。单菌落的分离培养一共分为4次划线：通过观察装置2313观察，第一次划线通过小球控制区229控制划线小球222在培养基的第一分离部分上面以“Z”形移动，最后打开第一分离部分出球管道228的第一阀门225，把划线小球222置入第一分离部分的出球管道228内，再关闭第一阀门225并打开第二阀门226，及时取出划线小球222并清洗干净；第二次划线，首先通过释放进球管道227内的划线小球222，此时划线小球222依然掉落在第四分离部分，通过小球控制区229控制划线小球222在培养基上的移动，并通过观察装置2313找到第一次划线小球222划线的末端，观察装置2313通过滑轨2311在平面内移动，此时的划线小球222以上一次划线分离的末端为起点，在第二分离培养区61内进行以“Z”形移动划线，后续操作方法与第一分离区22相同，把划线小球222置于第二分离培养区61内的出球管道228，按照上述方式，进行第三次、第四次的划线分离单菌落。整个过程的操作，均通过观察装置2313进行观察，进而操作小球的位置与划线。每换一个划线小球222使得菌液被分离成单个菌落的概率得到提高，而不是只有一次划线分离，且随着分离培养区61内的培养基类型差异，可获得不同营养状态的单菌落。

基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (9)

1.一种深海微生物分级梯度稀释分离单菌落的装置，其特征在于，包括有富集系统、分离操作培养器、中央控制系统、温度控制单元和压力控制单元；

所述富集系统和所述分离操作培养器相连通，且所述富集系统、所述分离操作培养室、所述温度控制单元和所述压力控制单元均与所述中央控制系统电连接；

所述富集系统用于培养微生物，所述富集系统包括有富集釜；所述富集系统包括有进气通道和/或进液通道，通过所述进气通道和/或所述进液通道向所述富集釜中对应地注入气体和/或液体，向所述富集釜进行增压；

所述分离操作培养器用于培养微生物；所述分离操作培养器包括有可拆卸上盖、主体和分离区；所述分离操作培养器内设置有分界部和多个凹槽，所述分界部设置在所述分离区上部，所述凹槽设置于所述分离操作培养器的内壁上，且与所述分离区的上部与所述分界部的最高处表面边缘通过滑道连接；所述分离区内设置有不同营养配比培养基质的固体培养基；

所述中央控制系统用于进行环境数据变化的监控，并监控、实时采集、处理、存储和图像输出；所述温度控制单元用于检测和调节所述富集系统和所述分离操作培养器内的温度变化；所述压力控制单元用于检测和调节所述富集系统和所述分离操作培养器内的压力变化，并向所述分离操作培养器注入气体或液体进行增压。

2.根据权利要求1所述的深海微生物分级梯度稀释分离单菌落的装置，其特征在于，所述分离区内镶嵌有模具，所述模具内设置有多个培养区，每个所述培养区内装置有不用营养配比的培养基；

所述分离区内均分为至少四个部分，至少四个分离部分包括有第一分离部分、第二分离部分、第三分离部分和第四分离部分，所述第一分离部分与所述滑道底部保持接触，所述第二分离部分、所述第三分离部分和所述第四分离部分按顺时针方向设置；

所述分离操作培养器的底部的外侧设置有划线小球控制区，所述划线小球控制区内设置有磁铁和手柄，通过手柄移动所述磁铁，所述磁铁控制所述分离操作培养器内部培养基表面划线小球的位置，所述凹槽内沾满菌液的划线小球在磁铁的作用下，在分离区内划线分离出单个菌落。

3.根据权利要求2所述的深海微生物分级梯度稀释分离单菌落的装置，其特征在于，每个所述分离部分均倾斜设置有出球管道，所述出球管道对应地设置在于所述培养基表面持平的位置；

所述出球管道上设置有第一阀门和第二阀门，其中第一阀门位于所述第二阀门和所述分离操作培养器之间。

4.根据权利要求3所述的深海微生物分级梯度稀释分离单菌落的装置，其特征在于，进球管道倾斜设置于所述第四分离部分的上部；

所述进球管道上设置有第三阀门和第四阀门，所述第三阀门位于所述第四阀门和所述分离操作培养器之间；

所述进球管道和所述分离操作培养器的连接处与所述分离操作培养器内壁的凹槽的高度保持一致。

5.根据权利要求3所述的深海微生物分级梯度稀释分离单菌落的装置，其特征在于，所述分离操作培养器还设置在底部的支脚；

所述盖体与所述分离区通过卡扣连接；所述盖体上部的中心设有观察区，所述观察区包括有滑轨、连接支架、观察装置和可视窗，所述观察装置、所述连接支架和所述滑轨依次连接，且所述观察装置位于所述可视窗的上部。

6.根据权利要求2所述的深海微生物分级梯度稀释分离单菌落的装置，其特征在于，每个所述模具成“＃”状。

7.根据权利要求1所述的深海微生物分级梯度稀释分离单菌落的装置，其特征在于，所述富集釜包括有可拆卸上盖；所述富集釜内的顶部设置有搅拌杆；所述进气管道和所述进液管道上均安装有阀门；所述富集釜还设置有调节阀的取样口；所述富集釜放置在水域中，或放置在空气换热试恒温房中；

所述富集系统还包括有送液管道、微注泵、出液管道和收集装置，所述凹槽与所述收集装置相连通；所述富集釜中的菌液通过所述送液管道和所述微注泵进入到所述凹槽中，所述凹槽中多余的菌液通过所述出液管道达到所述收集装置中。

8.根据权利要求1所述的深海微生物分级梯度稀释分离单菌落的装置，其特征在于，所述压力控制单元包括有压力传感器和增压系统，所述增压系统包括有空压机、增压泵、储气罐、调压阀和送气管道，所述送气管道与所述分离操作培养器相连通；所述压力传感器设置在所述分离操作培养室内。

9.深海微生物分级梯度稀释分离单菌落方法，其特征在于，使用如权利要求2-8任意一项所述的深海微生物分级梯度稀释分离单菌落的装置，包括有以下步骤：

S1、对分离操作培养器进行清洗灭菌，并在分离区的底部装入不同营养配比的培养基；

S2、通过压力控制单元往分离区注入气体，使分离操作培养器内的压力值与富集系统环境的压力值一致；

S3、开启温度控制单元，使分离操作培养器与所述富集系统的环境温度一致；

S4、释放进球管道内的划线小球，通过划线小球在培养基上的移动分离至分离操作培养器内的凹槽中；

S5、由微注泵向凹槽中的划线小球滴加微生物菌液；

S6、第一次划线分离，划线小球通过滑道到达第一分离部分，通过手柄控制划线小球在第一分离部分上面移动划线，并通过观察区进行观察划线情况，最后打开第一分离部分的出球管道的阀体使小球进入；

S7、第二次划线分离，释放进球管道内的划线小球，划线小球在培养基上移动，并找到第一次划线小球划线的末端，以第一次划线分离的末端为起点划线，通过手柄控制划线小球在第二分离部分上面移动划线，并通过观察区进行观察划线情况，最后打开第二分离部分的出球管道的阀体使小球进入；

S8、根据S6和S7的方式，依次进行第三次划线分离和第四次划线分离。

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