CN115960268A - 一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种胶原蛋白‑芋螺肽融合蛋白及其制备方法和应用，所述胶原蛋白‑芋螺肽融合蛋白从N端至C端包括依次连接的胶原蛋白片段和芋螺肽片段，所述胶原蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述芋螺肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述胶原蛋白‑芋螺肽融合蛋白为胶原蛋白片段与芋螺肽片段的氨基酸序列偶联后得到的产物，其序列如SEQ ID NO.1所示，同时兼具胶原蛋白和芋螺肽的生物学活性功能，而且在功能上弥补了重组胶原蛋白短时去皱效果不明显的缺陷以及芋螺肽不具备长效修复功能的缺陷，并且所述产物可以广泛应用到药品和化妆品中。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
蛋白质是人体生命活动的主要承担者，是人体组织的重要组成部分，也是人体组织代谢更新和修补的主要原料，蛋白质在人体内的作用还包括运输物质、参与机体免疫、提供能量及调节激素等等。其中，胶原蛋白是人体内最丰富的蛋白质，约占体内蛋白质总量的25-33％。据统计，胶原蛋白约占人体重量的5％，约占皮肤重量的75％，占皮肤总体积的90％，而在结缔组织中胶原蛋白约占80％，可以说胶原蛋白存在于人体大部分组织，其功能是维持皮肤和组织器官的形态和结构，对于人体正常机能发挥具有不可或缺的作用。
胶原蛋白是一种细胞外蛋白质，由3条肽链拧成螺旋形的纤维状蛋白质。胶原蛋白中存在G-X-Y的重复序列，也叫胶原域，X和Y可以是Gly之外的任何氨基酸，其中，X常是脯氨酸，Y常是羟脯氨酸。羟脯氨酸残基可通过形成分子内氢键稳定胶原蛋白分子。三条α-肽链借范德化力、氢键及共价交联，以平行、右手螺旋形式缠绕成“草绳状”三股螺旋结构，因此具有很高的拉伸强度。
胶原蛋白作为人体最丰富的蛋白质之一，通过在细胞结构上形成支撑网来确保身体组织的稳定性和强度。随着时间的推移，纤维会被破坏，作为众多影响之一它会使皮肤生成不期望的皱纹。经过研究，已证实当受试者摄入胶原蛋白后，受损的纤维可以被新的纤维替代，因此胶原蛋白有助于恢复和改善组织结构。有文章证实，胶原蛋白已显示出抗氧化活性、降压活性、降脂活性以及对受损皮肤的修复活性。此外，胶原蛋白的这种性质在皮肤中具有双重作用：首先为弹性纤维和胶原纤维的形成提供基本要素，其次作为成纤维细胞的配体或结合受体刺激先前提到的成分和透明质酸。
与传统胶原蛋白的提取方法相比，重组人源胶原蛋白为基因工程构建的产物，人源蛋白避免了免疫排斥反应，极高地提高了生物相容性和生物安全性，缺少了动物来源的病原体微生物污染，在生产过程中也避免了强酸强碱高温等剧烈手段，既减少了生产过程中对环境的污染程度，更温和的生产方式也极大地保证了胶原蛋白的活性。
芋螺肽，也称精氨酸/赖氨酸多肽，是芋螺通过毒管分泌的一类特殊多肽类毒液，主要用于捕食和防御，目前已知的芋螺肽有2000多种，这些小肽类毒素一般由10-46个氨基酸组成，富含二硫键，具有特殊的结构，可以特异地作用于受体或离子通道，从而麻痹肌肉，并让肌肉松弛，在较短时间内帮助舒缓皱纹，并且保留肌肉5％神经肌肉电流传导，所以可以提供非常自然的去皱效果。
但芋螺肽的缺点是较为昂贵，因此如何在不影响功效的前提下降低芋螺肽的用量成为了一个课题。以下为几篇专利中芋螺肽的用量：《一种具有祛皱功效的化妆品组合物、面膜及制备方法》公开了一种含芋螺肽的组合物，其最优选的组合物中的芋螺肽含量为0.8％。《一种含胜肽的组合物及其应用》公开了一种含芋螺肽的组合物，其最优选的组合物中的芋螺肽含量为6％。《兼具即时和长效的多功效眼膜的配方及其制备方法》中的芋螺肽的含量范围为1％-5％。本发明将采用新技术使芋螺肽的使用量进一步降低。
多肽的合成主要有生物合成法和化学合成法，其中化学合成法广泛应用于数量较短(氨基酸数目≤10)的短肽合成。尽管化学合成法工艺成熟、易于工业化，但对于较长(氨基酸数目大于10)的多肽，化学合成法也面临着生产成本急剧上升的缺点，这种长肽往往很难在工业中大量生产。因此，提供一种成本低廉、能大规模生产的制备方法，以及生物活性高、同时具有即时抗皱和长效修复的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白具有重要的应用价值。
发明内容
本发明提供了一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白及其制备方法和应用。所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白(SEQ ID NO.1)为胶原蛋白片段(SEQ ID NO.2)与芋螺肽片段(SEQ IDNO.3)的氨基酸序列偶联后得到的产物。
针对现有技术存在的不足，本发明的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白(YLT-ColI)，为胶原蛋白片段与芋螺肽片段的氨基酸序列偶联后得到的产物，同时兼具胶原蛋白和芋螺肽的生物活性功能，并且可以广泛应用到药品和化妆品中。同时，本发明提供一种具有即时抗皱和长效修复的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法和组合物。
图2为使用本发明提供的组合物的皮肤抗皱测试的示例图，可见，使用了具有即时抗皱和长效修复效果的组合物后皱纹的面积占比减少，肌肤变得平滑，具有立竿见影的抗皱效果。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白从N端至C端包括依次连接的胶原蛋白片段和芋螺肽片段；
所述胶原蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述芋螺肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白兼具胶原蛋白和芋螺肽的优点，并且在短期去皱和长效修复上拥有更好的效果。
优选地，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白还包括HIS标签片段。
优选地，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
SEQ ID NO.1(胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列)：
EAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKG AAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGGGGGSCCRAHDRCW KSSCGKPGNCCGE。
SEQ ID NO.2(胶原蛋白片段的氨基酸序列)：
EAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKG AAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGER。
SEQ ID NO.3(芋螺肽片段的氨基酸序列)：
CCRAHDRCWKSSCGKPGNCCGE。
第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白。
优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO.4：
gaagctggtctgccgggtgctaaaggtctgaccggttctccgggttctccgggtccggacggtaaaaccggtccgccgggtccggctggtcaggacggtcgtccgggtccgccgggtccgccgggtgctcgtggtcaggctggtgttatgggtttcccgggtccgaaaggtgctgctggtgaaccgggtaaagctggtgaacgtggtgttccgggtccgccgggtgctgttggtccggctggtaaagacggtgaagctggtgctcagggtccgccgggtccggctggtccggctggtgaacgtggtggtggtggtggttcttgctgccgtgctcacgaccgatgctggaaatcttcttgcggtaaaccgggtaactgctgcggtgaataa。
第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的第二方面所述的核酸分子。
第四方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞表达第一方面所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白。
优选地，所述重组细胞的基因组中整合有第二方面所述的核酸分子；
优选地，所述重组细胞中含有第三方面所述的表达载体。
第五方面，本发明提供一种第一方面所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：构建含有编码第一方面所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的核酸分子的表达载体，将所述表达载体转入受体细胞中，筛选含有表达载体的阳性菌株；培养所述含有表达载体的阳性菌株，诱导表达，破碎菌体，并进行纯化，得到所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白。
本发明利用基因重组的方法，将胶原蛋白片段与芋螺肽片段的序列进行串联，经大肠杆菌宿主表达和纯化后，所得产物可以广泛应用在药品和化妆品行业。本发明中所述的制备方法适用于胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的生产，本方法可以有效降低融合蛋白的生产成本，提高生产效率，也给融合蛋白的生产方式提供了另外一种生物学途径。
本发明的制备方法表达的目的产物在大肠杆菌中常以可溶的形式存在，产量高，且产物经纯化后不需经过酶切步骤；产物同时兼具胶原蛋白功能和芋螺肽功能，而且在功能上弥补了胶原蛋白短时去皱效果不明显以及芋螺肽不具备长效修复功能的缺陷。
优选地，所述受体细胞包括大肠杆菌，所述受体细胞包括大肠杆菌，所述大肠杆菌包括DH5α、BL21(DE3)或BL21 STAR(DE3)。
采用本发明的制备方法培养所述含有表达载体的阳性菌株，诱导表达，破碎菌体，并进行纯化，就得到所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白。
优选地，所述诱导表达的方法包括IPTG诱导；
优选地，所述诱导表达的温度为36-38℃(例如可以是36℃、36.5℃、37℃、37.5℃或38℃等)。
本发明中所述诱导表达的转速为120-320rpm(例如可以是120rpm、140rpm、160rpm、180rpm、200rpm、220rpm、240rpm、260rpm、280rpm、300rpm、或320rpm等)，待生长OD长至0.6-0.8区间时，加入IPTG溶液对产物进行诱导，诱导表达的时间为4-6h(例如可以是4h、4.5h、5h、5.5h或6h等)。
本发明中所述IPTG诱导采用的IPTG的终浓度为0.5-1.5mM，例如可以是0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM或1.5mM等。
优选地，所述破碎菌体采用如下步骤进行：用破菌缓冲液将菌体重悬，进行高压均质，直至菌液澄清透明，将菌液离心，取上清液并过滤。
优选地，所述破菌缓冲液按摩尔浓度计包括：10-50mM PB、100-300mM NaCl，溶剂为水。
本发明中所述破菌缓冲液中PB的浓度为10-50mM，例如可以是10mM、20mM、30mM、40mM或50mM等；所述NaCl的浓度为100-300mM，例如可以是100mM、120mM、140mM、160mM、180mM、200mM、220mM、240mM、260mM、280mM或300mM等。
本发明中所述破菌缓冲液与菌体的体积比为(1-50):1，例如可以是1:1、5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1或50:1等。
本发明中所述高压均质的压力为600-1000bar，例如可以是600bar、700bar、800bar、900bar或1000bar等。
本发明中所述离心的转速为12000-16000rpm，例如可以是12000rpm、13000rpm、14000rpm、15000rpm或16000rpm等，所述离心的时间为40-60min，例如可以是40min、45min、50min、55min或60min等。
优选地，所述纯化的方法包括镍离子柱亲和层析。
优选地，所述镍离子柱亲和层析包括如下步骤：将过滤的菌液上清经镍离子柱吸附后，依次使用咪唑浓度递增的镍离子柱亲和层析预洗脱缓冲液进行一次洗杂和二次洗杂，再用咪唑浓度递增的洗脱缓冲液进行一次洗脱和二次洗脱。
优选地，所述一次洗杂采用的预洗脱缓冲液中咪唑浓度为40-60mM，例如可以是40mM、45mM、50mM、55mM或60mM等。
本发明中所述一次洗杂采用的预洗脱缓冲液按摩尔浓度计包括：10-50mM PB(例如可以是10mM、20mM、30mM、40mM或50mM等)；100-300mM NaCl(例如可以是100mM、120mM、140mM、160mM、180mM、200mM、220mM、240mM、260mM、280mM或300mM等)；40-60mM咪唑(例如可以是40mM、45mM、50mM、55mM或60mM等)；溶剂为水。
优选地，所述二次洗杂采用的预洗脱缓冲液中咪唑浓度为90-110mM，例如可以是90mM、95mM、100mM、105mM或110mM等。
本发明中所述二次洗杂采用的预洗脱缓冲液按摩尔浓度计包括：10-50mM PB(例如可以是10mM、20mM、30mM、40mM或50mM等)；100-300mM NaCl(例如可以是100mM、120mM、140mM、160mM、180mM、200mM、220mM、240mM、260mM、280mM或300mM等)；90-110mM咪唑(例如可以是90mM、95mM、100mM、105mM或110mM等)；溶剂为水。
优选地，所述一次洗脱采用的洗脱缓冲液中咪唑浓度为150-250mM，例如可以是150mM、160mM、170mM、180mM、190mM、200mM、210mM、220mM、230mM、240mM或250mM等。
本发明中所述一次洗脱采用的洗脱缓冲液按摩尔浓度计包括：10-50mM PB(例如可以是10mM、20mM、30mM、40mM或50mM等)；100-300mM NaCl(例如可以是100mM、120mM、140mM、160mM、180mM、200mM、220mM、240mM、260mM、280mM或300mM等)；150-250mM咪唑(例如可以是150mM、160mM、170mM、180mM、190mM、200mM、210mM、220mM、230mM、240mM或250mM等)；溶剂为水。
优选地，所述二次洗脱采用的洗脱缓冲液中咪唑浓度为450-550mM，例如可以是450mM、460mM、470mM、480mM、490mM、500mM、510mM、520mM、530mM、540mM或550mM等。
本发明中所述二次洗脱采用的洗脱缓冲液按摩尔浓度计包括：10-50mM PB(例如可以是10mM、20mM、30mM、40mM或50mM等)；100-300mM NaCl(例如可以是100mM、120mM、140mM、160mM、180mM、200mM、220mM、240mM、260mM、280mM或300mM等)；450-550mM咪唑(例如可以是450mM、460mM、470mM、480mM、490mM、500mM、510mM、520mM、530mM、540mM或550mM等)；溶剂为水。
优选地，所述纯化后还包括采用G25凝胶柱进行脱盐的步骤。
作为本发明的优选技术方案，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将编码所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的核酸分子连入质粒载体中，构建表达载体，将所述表达载体转入大肠杆菌中，筛选含有表达载体的阳性菌株，得到大肠杆菌基因工程菌株；
(2)发酵培养所述大肠杆菌基因工程菌株，采用IPTG诱导蛋白表达后，离心收集菌体，所述诱导表达的温度为36-38℃；
(3)将破菌缓冲液与菌体重悬，所述破菌缓冲液包括：10-50mM PB、100-300mMNaCl，溶剂为水；进行高压均质，直至菌液澄清透明，将菌液离心，取上清液并过滤；
(4)将过滤的菌液上清经镍离子柱吸附后，依次使用咪唑浓度递增的镍离子柱亲和层析预洗脱缓冲液进行一次洗杂和二次洗杂；一次洗杂采用的预洗脱缓冲液中咪唑浓度为40-60mM咪唑；二次洗杂采用的预洗脱缓冲液中咪唑浓度为90-110mM咪唑；再用咪唑浓度递增的洗脱缓冲液进行一次洗脱和二次洗脱；一次洗脱采用的洗脱缓冲液中咪唑浓度为150-250mM咪唑；二次洗脱采用的洗脱缓冲液中咪唑浓度为450-550mM咪唑；纯化后采用G25凝胶柱进行脱盐，得到所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白。
第六方面，本发明提供一种具有即时抗皱和长效修复效果的组合物，所述组合物含有第一方面所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白。
优选地，所述组合物按重量份数计包括：胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白0.01-1份、肌肽0.01-1份、苯氧乙醇0.01-1份、乙基己基甘油0.01-0.1份、甘油2-10份、甜菜碱0.3-3份和水80-100份。
本发明中所述组合物中胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的重量份数为0.01-1份，例如可以是0.01份、0.02份、0.04份、0.06份、0.08份、0.1份、0.2份、0.4份、0.6份、0.8份或1份等；肌肽的重量份数为0.01-1份，0.01份、0.02份、0.04份、0.06份、0.08份、0.1份、0.2份、0.4份、0.6份、0.8份或1份等；苯氧乙醇的重量份数为0.01-1份，例如可以是0.01份、0.05份、0.1份、0.15份、0.2份、0.3份、0.4份、0.5份、0.6份、0.7份、0.8份、0.9份或1份等；乙基己基甘油的重量份数为0.01-0.1份，例如可以是0.01份、0.02份、0.03份、0.04份、0.05份、0.06份、0.07份、0.08份、0.09份或0.1份等；甘油的重量份数为2-10份，例如可以是2份、3份、4份、5份、6份、7份、8份、9份或10份等；甜菜碱的重量份数为0.3-3份，0.3份、0.5份、0.8份、1份、1.3份、1.5份、1.8份、2份、2.3份、2.5份或3份等；水的重量份数为80-100份，例如可以是80份、82份、85份、88份、90份、92份、95份、98份或100份等。
本发明所述具有即时抗皱和长效修复效果的组合物中，胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白在功能上弥补了重组胶原蛋白短时去皱效果不明显以及芋螺肽不具备长效修复功能的缺陷。其中胶原蛋白可以通过整合素促进细胞黏附、增殖；芋螺肽可以通过阻断神经肌肉的电流传导进而淡化皱纹，特别是针对肌肉的NAV1.4通道，以达到去皱的效果。肌肽作为抗氧化剂，可以避免胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白被氧化；同时肌肽有很好的抗糖化、抗衰的效果，可以促进皮肤胶原蛋白的合成，和胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白起到协同增效的作用。苯氧乙醇作为防腐剂，可以抑制微生物生长，有效减少微生物对蛋白的降解，保证体系的长期稳定性，进而有助于提高对蛋白的保存效果。乙基己基甘油和甘油均作为体系增稠剂，增加体系粘度，保持体系稳定，可以在被保存的蛋白质的周边起保护作用，减少蛋白降解的可能性，从而防止胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的析出；甜菜碱作为保湿剂，可以在皮肤表面保持润湿，形成一层水化膜，协同胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白和肌肽被皮肤吸收。
第七方面，本发明提供第一方面所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白和/或第六方面所述的具有即时抗皱和长效修复效果的组合物在在药品和化妆品中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)对于胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白，本方法可以有效降低融合蛋白的生产成本，提高生产效率，也给融合蛋白的生产方式提供了另外一种生物学途径。
(2)本发明所述制备方法表达的目的融合蛋白在大肠杆菌中以可溶的形式存在，产量高，产物经纯化后不需经过酶切步骤，产物同时兼具胶原蛋白功能和芋螺肽功能，而且在功能上弥补了重组胶原蛋白短时去皱效果不明显以及芋螺肽不具备长效修复功能的缺陷。
(3)本发明所述具有即时抗皱和长效修复效果的组合物，其中的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白可以通过整合素促进细胞黏附、增殖，芋螺肽片段可以通过阻断神经肌肉的电流传导进而淡化皱纹，特别是针对肌肉的NAV1.4通道，以达到去皱的效果。肌肽作为抗氧化剂，可以避免胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白被氧化，同时肌肽有很强的抗糖化、抗衰的效果，可以促进皮肤胶原蛋白的合成，和胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白起到协同增效的作用。
(4)本发明所述的具有即时抗皱和长效修复效果的组合物，其中与芋螺肽融合的胶原蛋白为人源胶原蛋白。因人源胶原蛋白与人体的相容性更好，使得含有芋螺肽片段的融合蛋白更容易被人体吸收，降低了芋螺肽的最低起效量，因此可以使用更少的芋螺肽以达到相同的功效。
附图说明：
图1是实施例1中胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白SDS-PAGE凝胶电泳结果(图1中框线内为目的蛋白及其对应的蛋白分子量标准)。
图2为应用例1中组合物的皮肤抗皱测试的示例图。
具体实施方式：
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道获得的常规产品。
本发明中的实施例、对比例、应用例和对比应用例中所用到的实验材料的来源如表1所示：
表1
| 组分 | 厂家 | 货号 |
| pET28a载体 | 实验室保存 | / |
| BL21 STAR(DE3)细胞 | 实验室保存 | / |
| IPTG | 苏州天可 | KI90541 |
| NI柱 | 蓝晓生物 | A4013203 |
| G25凝胶柱 | 博格隆 | AG0063 |
| 苯氧乙醇 | 托尔专用化学品(镇江)有限公司 | 122-99-6 |
| 乙基己基甘油 | 托尔专用化学品(镇江)有限公司 | 70445-33-9 |
| 甘油 | 吉隆坡甲洞油脂化工有限公司 | 56-81-5 |
| 甜菜碱 | 德州昂立达生物技术有限公司 | / |
实施例1
本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)宿主菌构建
将胶原蛋白片段和芋螺肽片段的序列按1:1的方式进行串联，串联后的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，N端加上6×HIS标签，氨基酸序列经大肠杆菌密码子优化后构建至pET28a载体上，构建好的载体导入大肠杆菌宿主BL21 STAR(DE3)细胞中。
(2)菌株表达
挑取单个重组大肠杆菌的克隆，转接到50mL LB培养基，加入终浓度为50μg/mL的卡那霉素，在37℃、220rpm条件下过夜培养。第二天，从种子液中吸取菌液，按1:100的比例接种到新鲜LB培养基中，在37℃、220rpm条件下培养，待生长OD长至0.6-0.8区间时，加入终浓度为1mM的IPTG溶液对产物进行诱导，诱导处理的温度为37℃，诱导处理的转速为220rpm，大肠杆菌诱导表达5h后离心收取菌体。
(3)菌体破碎
取适量菌体，按体积比10:1将破菌缓冲液与菌体重悬，所述破菌缓冲液为20mM PB+200mM NaCl、pH 7.4的水溶液，使用高压均质机在800bar条件下将菌体破碎三次，直至菌液澄清透明，在镜检下可观察到菌体被破碎完毕；将菌液在14000rpm条件下离心50min，收取上清液体作为菌体破碎上清液，并用0.45μm滤膜对菌液进行过滤。
(4)纯化
菌液上清经镍离子柱(NI柱)吸附后，依次用20mM PB+200mM NaCl+50mM咪唑，pH7.4的水溶液和20mM PB+200mM NaCl+100mM咪唑，pH 7.4的水溶液进行洗杂，再用20mM PB+200mM NaCl+200mM咪唑，pH 7.4的水溶液和20mM PB+200mM NaCl+500mM咪唑，pH 7.4的水溶液进行洗脱。洗脱液进一步用G25凝胶柱进行脱盐，得到胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
(5)蛋白的鉴定和保存
取适量蛋白液进行SDS-PAGE检测，用灰度扫描法判断YLT-ColI蛋白(胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白)占整个泳道的比例即为纯度。胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白凝胶电泳结果如图1所示：泳道M：蛋白分子量标志物，上样量5μL；泳道1：上样混合液，上样量10μL；泳道2：流穿液，上样量10μL；泳道3：洗脱液1(一次洗杂的洗脱液)，上样量10μL；泳道4：洗脱液2(二次洗杂的洗脱液)，上样量10μL；泳道5：洗脱液3(一次洗脱的洗脱液)，上样量10μL；泳道6：洗脱液4(二次洗脱的洗脱液)，上样量10μL。泳道1-6展示了YLT-ColI蛋白的纯化过程，泳道5-6为纯化后的蛋白，纯度为90％。将融合蛋白长期冻存于低温(-20～-80℃)，或将融合蛋白冻干成粉。
实施例2
本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)宿主菌构建
同实施例1。
(2)菌株表达
挑取单个重组大肠杆菌的克隆，转接到50mL LB培养基，加入终浓度为45μg/mL的卡那霉素，在37℃、170rpm条件下过夜培养。第二天，从种子液中吸取菌液，按1:100的比例接种到新鲜LB培养基中，在37℃、170rpm条件下同样条件下培养，待生长OD长至0.6-0.8区间时，加入终浓度为0.7mM的IPTG溶液对产物进行诱导，诱导处理的温度为37℃，诱导处理的转速为170rpm，大肠杆菌诱导表达4.5h后离心收取菌体。
(3)菌体破碎
取适量菌体，按体积比为10:1将破菌缓冲液与菌体重悬，所述破菌缓冲液为30mMPB+150mM NaCl、pH 7.4的水溶液，使用高压均质机在700bar条件下将菌体破碎三次，直至菌液澄清透明，在镜检下可观察到菌体被破碎完毕；将菌液在13000rpm条件下离心45min，收取上清液体作为菌体破碎上清液，并用0.45μm滤膜对菌液进行过滤。
(4)纯化
菌液上清经NI柱吸附后，依次用30mM PB+150mM NaCl+55mM咪唑，pH 7.4的水溶液和30mM PB+150mM NaCl+105mM咪唑，pH 7.4的水溶液进行洗杂，再用30mM PB+150mM NaCl+220mM咪唑，pH 7.4的水溶液和30mM PB+150mM NaCl+520mM咪唑，pH 7.4的水溶液进行洗脱。洗脱液进一步用G25凝胶柱进行脱盐，得到胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
(5)蛋白的鉴定和保存
同实施例1。
实施例3
本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)宿主菌构建
同实施例1。
(2)菌株表达
挑取单个重组大肠杆菌的克隆，转接到50mL LB培养基，加入终浓度为55μg/mL的卡那霉素，在37℃、270rpm条件下过夜培养。第二天，从种子液中吸取菌液，按1:100的比例接种到新鲜LB培养基中，在37℃、270rpm条件下同样条件下培养，待生长OD长至0.6-0.8区间时，加入终浓度为1.3mM的IPTG溶液对产物进行诱导，诱导处理的温度为37℃，诱导处理的转速为270rpm，大肠杆菌诱导表达5.5h后离心收取菌体。
(3)菌体破碎
取适量菌体，按体积比为10:1将破菌缓冲液与菌体重悬，所述破菌缓冲液为10mMPB+250mM NaCl、pH 7.4的水溶液，使用高压均质机在900bar条件下将菌体破碎三次，直至菌液澄清透明，在镜检下可观察到菌体被破碎完毕；将菌液在15000rpm条件下离心55min，收取上清液体作为菌体破碎上清液，并用0.45μm滤膜对菌液进行过滤。
(4)纯化
菌液上清经NI柱吸附后，依次用10mM PB+250mM NaCl+45mM咪唑，pH 7.4的水溶液和10mM PB+250mM NaCl+95mM咪唑，pH 7.4的水溶液进行洗杂，再用10mM PB+250mM NaCl+180mM咪唑，pH 7.4的水溶液和10mM PB+250mM NaCl+480mM咪唑，pH 7.4的水溶液进行洗脱。洗脱液进一步用G25凝胶柱进行脱盐，得到胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
(5)蛋白的鉴定和保存
同实施例1。
实施例4
本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)宿主菌构建
同实施例1。
(2)菌株表达
挑取单个重组大肠杆菌的克隆，转接到50mL LB培养基，加入终浓度为40μg/mL的卡那霉素，在36℃、120rpm条件下过夜培养。第二天，从种子液中吸取菌液，按1:100的比例接种到新鲜LB培养基中，在36℃、120rpm条件下培养，待生长OD长至0.6-0.8区间时，加入终浓度为0.5mM的IPTG溶液对产物进行诱导，诱导处理的温度为36℃，诱导处理的转速为120rpm，大肠杆菌诱导表达4h后离心收取菌体。
(3)菌体破碎
取适量菌体，按体积比为10:1将破菌缓冲液与菌体重悬，所述破菌缓冲液为40mMPB+100mM NaCl、pH 7.4的水溶液，使用高压均质机在600bar条件下将菌体破碎三次，直至菌液澄清透明，在镜检下可观察到菌体被破碎完毕；将菌液在12000rpm条件下离心40min，收取上清液体作为菌体破碎上清液，并用0.45μm滤膜对菌液进行过滤。
(4)纯化
菌液上清经NI柱吸附后，依次用40mM PB+100mM NaCl+40mM咪唑，pH 7.4的水溶液和40mM PB+100mM NaCl+90mM咪唑，pH 7.4的水溶液进行洗杂，再用40mM PB+100mM NaCl+150mM咪唑，pH 7.4的水溶液和40mM PB+100mM NaCl+450mM咪唑，pH 7.4的水溶液进行洗脱。洗脱液进一步用G25凝胶柱进行脱盐，得到胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
(5)蛋白的鉴定和保存
同实施例1。
实施例5
本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)宿主菌构建
同实施例1。
(2)菌株表达
挑取单个重组大肠杆菌的克隆，转接到50mL LB培养基，加入终浓度为60μg/mL的卡那霉素，在38℃、320rpm条件下过夜培养。第二天，从种子液中吸取菌液，按1:100的比例接种到新鲜LB培养基中，在38℃、320rpm条件下培养，待生长OD长至0.6-0.8区间时，加入终浓度为1.5mM的IPTG溶液对产物进行诱导，诱导处理的温度为38℃，诱导处理的转速为320rpm，大肠杆菌诱导表达6h后离心收取菌体。
(3)菌体破碎
取适量菌体，按体积比为10:1将破菌缓冲液与菌体重悬，所述破菌缓冲液为50mMPB+300mM NaCl、pH 7.4的水溶液，使用高压均质机在1000bar条件下将菌体破碎三次，直至菌液澄清透明，在镜检下可观察到菌体被破碎完毕；将菌液在16000rpm条件下离心60min，收取上清液体作为菌体破碎上清液，并用0.45μm滤膜对菌液进行过滤。
(4)纯化
菌液上清经NI柱吸附后，依次用50mM PB+300mM NaCl+60mM咪唑，pH 7.4的水溶液和50mM PB+300mM NaCl+110mM咪唑，pH 7.4的水溶液进行洗杂，再用50mM PB+300mM NaCl+250mM咪唑，pH 7.4的水溶液和50mM PB+300mM NaCl+550mM咪唑，pH 7.4的水溶液进行洗脱。洗脱液进一步用G25凝胶柱进行脱盐，得到胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
(5)蛋白的鉴定和保存
同实施例1。
实施例6
本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列与实施例1中一致，本实施例与实施例1的区别仅在于，所述重组人源胶原蛋白的制备方法中，步骤(2)菌株表达中，诱导表达的条件中：诱导处理的温度为35℃。
实施例7
本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列与实施例1中一致，本实施例与实施例1的区别仅在于，所述重组人源胶原蛋白的制备方法中，步骤(2)菌株表达中，诱导表达的条件中：诱导处理的温度为39℃。
实施例8
本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列与实施例1中一致，本实施例与实施例1的区别仅在于，所述重组人源胶原蛋白的制备方法中，步骤(3)菌体破碎中，所述破菌缓冲液中PB的摩尔浓度为5mM。
实施例9
本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列与实施例1中一致，本实施例与实施例1的区别仅在于，所述重组人源胶原蛋白的制备方法中，步骤(3)菌体破碎中，所述破菌缓冲液中PB的摩尔浓度为60mM。
实施例10
本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列与实施例1中一致，本实施例与实施例1的区别仅在于，所述重组人源胶原蛋白的制备方法中，步骤(3)菌体破碎中，所述破菌缓冲液中NaCl的摩尔浓度为50mM。
实施例11
本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列与实施例1中一致，本实施例与实施例1的区别仅在于，所述重组人源胶原蛋白的制备方法中，步骤(3)菌体破碎中，所述破菌缓冲液中NaCl的摩尔浓度为350mM。
实施例12
本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列与实施例1中一致，本实施例与实施例1的区别仅在于，在步骤(4)纯化过程中，一次和二次洗杂采用的预洗脱缓冲液中咪唑的摩尔浓度分别为20mM、70mM。
实施例13
本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列与实施例1中一致，本实施例与实施例1的区别仅在于，在步骤(4)纯化过程中，一次和二次洗杂采用的预洗脱缓冲液中咪唑的摩尔浓度分别为80mM、130mM。
实施例14
本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列与实施例1中一致，本实施例与实施例1的区别仅在于，在步骤(4)纯化过程中，一次和二次洗脱采用的洗脱缓冲液中咪唑的摩尔浓度分别为100mM、400mM。
实施例15
本实施例提供一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列与实施例1中一致，本实施例与实施例1的区别仅在于，在步骤(4)纯化过程中，一次和二次洗脱采用的洗脱缓冲液中咪唑的摩尔浓度分别为300mM、600mM。
对实施例1-15中的制备方法制备得到的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白进行质量检测，检测结果如表2所示。
表2
| 样品 | 纯度 | 样品 | 纯度 |
| 实施例1 | 91.8％ | 实施例9 | 77.6％ |
| 实施例2 | 90.1％ | 实施例10 | 81.1％ |
| 实施例3 | 89.8％ | 实施例11 | 85.3％ |
| 实施例4 | 85.7％ | 实施例12 | 70.9％ |
| 实施例5 | 83.9％ | 实施例13 | 79.2％ |
| 实施例6 | 69.4％ | 实施例14 | 79.6％ |
| 实施例7 | 71.1％ | 实施例15 | 71.8％ |
| 实施例8 | 75.6％ | / | / |
通过表2可知，实施例1-15中的制备方法所得的重组人源胶原蛋白的纯度高低不一，实施例1所得的重组人源胶原蛋白的纯度最高。
通过实施例1和实施例6-7的对比可知，当诱导的温度超出原定范围时，会导致所得产品的纯度的下降。
通过实施例1和实施例8-11的对比可知，当缓冲体系中PB和NaCl的浓度发生改变时，会影响所得产品的纯度。
通过实施例1和实施例12-15的对比可知，当洗杂过程中的咪唑浓度过低时，不能有效洗脱杂质；当洗杂过程中的咪唑浓度过高时，又会导致产品流失。当洗脱过程中的咪唑浓度过低时，部分产品因没被洗脱而浪费；当洗脱过程中的咪唑浓度过高时，大量杂质也同时被洗脱，导致纯度的下降。
对比例1
本对比例提供一种人源胶原蛋白ColI，所述胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
对比例2
本对比例提供一种市售胶原蛋白Ctrl-Col，其氨基酸序列与SEQ ID NO.2不同。
对比例3
本对比例提供一种芋螺肽，所述芋螺肽(YLT)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
对比例4
本对比例提供另一种芋螺肽，所述芋螺肽(YLT2)的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
SEQ ID NO.5：GDCKPCMHPDCRFNPGRCR。
对比例5
本对比例提供另一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白(YLT2-ColI)，所述芋螺肽(YLT2)的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述胶原蛋白(ColI)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本对比例与实施例1的区别在于，用芋螺肽(YLT2)替换了实施例1融合蛋白中的芋螺肽(YLT)。
对比例6
本对比例提供一种胶原蛋白ColI和芋螺肽(YLT)的混合物，所述胶原蛋白ColI的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，芋螺肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
应用例1
本应用例提供一种具有即时抗皱效果且能长效修复肌肤的组合物，所述组合物中含有实施例1所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白，所述组合物按重量分数计包括：胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白0.1份、肌肽0.1份、苯氧乙醇0.4份、乙基己基甘油0.05份、甘油5份、甜菜碱1份和水93.35份。
所述具有即时抗皱效果且能长效修复肌肤的组合物的制备方法如下：依次将胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白、肌肽、苯氧乙醇、乙基己基甘油、甘油、甜菜碱和水混合，得到所述具有即时抗皱效果且能长效修复肌肤的组合物。
应用例2
本应用例提供一种具有即时抗皱效果且能长效修复肌肤的组合物，所述组合物中含有实施例1所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白，所述组合物按重量分数计包括：胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白0.05份、肌肽0.05份、苯氧乙醇0.2份、乙基己基甘油0.03份、甘油3份、甜菜碱0.7份和水95.97份。
所述具有即时抗皱效果且能长效修复肌肤的组合物的制备方法同应用例1。
应用例3
本应用例提供一种具有即时抗皱效果且能长效修复肌肤的组合物，所述组合物中含有实施例1所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白，所述组合物按重量分数计包括：胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白0.5份、肌肽0.5份、苯氧乙醇0.7份、乙基己基甘油0.07份、甘油7份、甜菜碱2份和水89.23份。
所述具有即时抗皱效果且能长效修复肌肤的组合物的制备方法同应用例1。
应用例4
本应用例提供一种具有即时抗皱效果且能长效修复肌肤的组合物，所述组合物中含有实施例1所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白，所述组合物按重量分数计包括：胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白0.01份、肌肽0.01份、苯氧乙醇0.01份、乙基己基甘油0.01份、甘油2份、甜菜碱0.3份和水97.66份。
所述具有即时抗皱效果且能长效修复肌肤的组合物的制备方法同应用例1。
应用例5
本应用例提供一种具有即时抗皱效果且能长效修复肌肤的组合物，所述组合物中含有实施例1所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白，所述组合物按重量分数计包括：胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白1份、肌肽1份、苯氧乙醇1份、乙基己基甘油0.1份、甘油10份、甜菜碱3份和水83.9份。
所述具有即时抗皱效果且能长效修复肌肤的组合物的制备方法同应用例1。
应用例6
本应用例提供一种具有即时抗皱效果且能长效修复肌肤的组合物，所述组合物中含有实施例1所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白，所述组合物按重量分数计包括：胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白0.2份、肌肽0份、苯氧乙醇0.4份、乙基己基甘油0.05份、甘油5份、甜菜碱1份和水93.35份。
所述具有即时抗皱效果且能长效修复肌肤的组合物的制备方法同应用例1。
应用例7
本应用例提供一种具有即时抗皱效果且能长效修复肌肤的组合物，所述组合物中含有实施例1所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白，所述组合物按重量分数计包括：胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白0份、肌肽0.2份、苯氧乙醇0.4份、乙基己基甘油0.05份、甘油5份、甜菜碱1份和水93.35份。
所述具有即时抗皱效果且能长效修复肌肤的组合物的制备方法同应用例1。
对比应用例1
本对比应用例提供一种具有护肤效果的组合物，所述组合物与应用例1的区别仅在于以对比例1提供的胶原蛋白ColI替代应用例1里面的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白。
对比应用例2
本对比应用例提供一种具有护肤效果的组合物，所述组合物与应用例1的区别仅在于以对比例2提供的胶原蛋白Ctrl-Col替代应用例1里面的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白。
对比应用例3
本对比应用例提供一种具有护肤效果的组合物，所述组合物与应用例1的区别仅在于以对比例3提供的芋螺肽(YLT)替代应用例1里面的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白。
对比应用例4
本对比应用例提供一种具有护肤效果的组合物，所述组合物与应用例1的区别仅在于以对比例4提供的芋螺肽2(YLT2)替代应用例1里面的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白。
对比应用例5
本对比应用例提供一种具有护肤效果的组合物，所述组合物与应用例1的区别仅在于以对比例5提供的胶原蛋白-芋螺肽2融合蛋白(YLT2-ColI)替代应用例1里面的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白。
对比应用例6
本对比应用例提供一种具有护肤效果的组合物，所述组合物与应用例1的区别仅在于以对比例6提供的胶原蛋白(ColI)和芋螺肽(YLT)的混合物替代应用例1里面的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白。
测试例1斑马鱼胶原蛋白和弹性蛋白的相对表达量检测
对实施例1-5和对比例1-6中的融合蛋白进行斑马鱼胶原蛋白和弹性蛋白的相对表达量检测。
1、斑马鱼胶原蛋白的相对表达量检测
皮肤的生长、修复、营养以及弹性、张力都与胶原蛋白有关，它的流失会使皮肤光滑度下降，产生皱纹。在四足动物中，I型胶原蛋白是一个三聚体，主要由两个α肽链和一个α2链组成，分别由col1a1a和col1a2基因编码，在结缔组织和骨中执行胶原蛋白相关生物功能。在斑马鱼中存在三种I型胶原基因，分别编码α1(I)、α2(I)和α3(I)链的colIa1a、col1a1b和col1a2。因此，通过检测colIa1a或(和)col1a1b或(和)col1a2基因的相对表达量可表明样品是否具有修护的功效。
实验方法：
实验最高浓度不得高于预实验确定的NOEC值。根据实验要求，受试物浓度等比稀释。
根据实验要求，预先筛选好足够数量且正常发育的96hpf的斑马鱼幼鱼，并随机分配到6孔板中，每孔30条，每组浓度设置3个孔。在不伤害幼鱼的情况下除去6孔板中的缓冲水，并加入不同浓度受试物溶液3mL，空白对照组加入缓冲水。盖上培养板面，在28.5℃±0.5℃的生化培养箱中避光孵育至120hpf(孵育时长为24h)。
按照RNA快速提取试剂盒操作说明书提取各组斑马鱼总RNA，利用超微量紫外分光光度计对总RNA进行测定，要求各实验组在260nm和280nm处的吸光度比值在1.90-2.20范围。提取出来的RNA根据反转录试剂盒说明书合成cDNA，备用。
利用SYBR Green荧光染料试剂盒进行点板，配置成20μL的反应体系。包含SYBRGreen Mix 10μL、上下游引物共1μL、DNA模板2μL、7μL DEPC水，分别将反应液加入反应孔中，然后放在荧光定量PCR仪上运行PCR反应程序。具体运行参数如下：94℃，30s；94℃，5s，61℃，35s；98℃，10s；65℃，60s；98℃，1s；40个循环。
记录各组内参基因(β-actin)、目的基因col1a1a的qPCR检测的Ct值。
斑马鱼胶原蛋白Col1a1a表达量的测试结果如表3所示：
表3
| 待测样品 | Col1a1a的相对表达量 | 待测样品 | Col1a1a的相对表达量 |
| 空白对照 | 1.0 | 对比例1 | 1.36 |
| 实施例1 | 1.79 | 对比例2 | 1.31 |
| 实施例2 | 1.74 | 对比例3 | 1.24 |
| 实施例3 | 1.75 | 对比例4 | 1.20 |
| 实施例4 | 1.70 | 对比例5 | 1.49 |
| 实施例5 | 1.71 | 对比例6 | 1.62 |
2、斑马鱼弹性蛋白的相对表达量检测
弹性蛋白是皮肤组织中弹性纤维的主要成分，能为肌肤提供结构性支撑，让肌肤免受老化、松弛的困扰。弹性蛋白由两种类型的短肽段交替排列构成，eln1、eln2负责编码弹力蛋白不同的肽段，两个基因共同负责调控弹力蛋白的表达水平，使皮肤紧致，具有弹性。斑马鱼具有与人相似的弹性蛋白(eln1、eln2)基因。因此，通过检测eln1或(和)eln2基因相对表达量可表明样品是否具有抗皱紧致的功效。
实验方法：
实验最高浓度不得高于预实验确定的NOEC值。根据实验要求，受试物浓度等比稀释。
根据实验要求，预先筛选好足够数量且正常发育的96hpf的斑马鱼幼鱼，并随机分配到6孔板中，每孔30条，每组浓度设置3个孔。在不伤害幼鱼的情况下除去6孔板中的缓冲水，并加入不同浓度受试物溶液3mL，空白对照组加入缓冲水，非水溶性样品需设置溶剂对照组。盖上培养板面，在28.5℃±0.5℃的生化培养箱中避光孵育至120hpf(孵育时长为24h)。
按照RNA快速提取试剂盒操作说明书提取各组斑马鱼总RNA，利用超微量紫外分光光度计对总RNA进行测定，要求各实验组在260nm和280nm处的吸光度比值在1.90-2.20范围。提取出来的RNA根据反转录试剂盒说明书合成cDNA，备用。
利用SYBR Green荧光染料试剂盒进行点板，配置成20μL的反应体系。包含SYBRGreen Mix 10μL、上下游引物共1μL、DNA模板2μL、7μL DEPC水，分别将反应液加入反应孔中，然后放在荧光定量PCR仪上运行PCR反应程序。具体运行参数如下：94℃，30s；94℃，5s，61℃，35s；98℃，10s；65℃，60s；98℃，1s；40个循环。
记录各组内参基因(β-actin)、目的基因eln1的qPCR检测的Ct值。
斑马鱼胶原蛋白eln1表达量的测试结果如表4所示：
表4
| 待测样品 | eln1的相对表达量 | 待测样品 | eln1的相对表达量 |
| 空白对照 | 1.0 | 对比例1 | 1.21 |
| 实施例1 | 1.61 | 对比例2 | 1.19 |
| 实施例2 | 1.50 | 对比例3 | 1.25 |
| 实施例3 | 1.47 | 对比例4 | 1.23 |
| 实施例4 | 1.43 | 对比例5 | 1.38 |
| 实施例5 | 1.46 | 对比例6 | 1.40 |
从表3和表4可知，实施例1-5提供的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白，与空白对照组和其它对比例相比，能显著增加胶原蛋白col1a1a基因以及弹性蛋白eln1基因的相对表达量，因此胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白具有修护和抗皱紧致的功效。
测试例2安全性评估
选取符合要求的志愿者30名，年龄18-60岁，女性24名，男性6名，分别测试应用例1-7所得的融合蛋白和对比应用例1-6所得的组合物。分别取受试样品溶液0.025mL，放入斑试器小室内，对照孔不做任何处理。将加有受试样品的斑试器用低致敏胶带贴敷于受试者的前臂内侧，用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，等待24h。去除斑试器30min、24h、48h后(待压痕消失后)按表5标准观察皮肤反应。
表5
结果显示：应用例1-5均为阴性反应，说明本发明所涉及的组合物及其衍生产品的安全性有保证，没有皮肤刺激性、致敏性(易过敏人群或对本品过敏的人群除外)等不良反应。安全性评估的实验结果如表6所示：
表6
从表6的结果可知，应用例1-5提供的组合物的安全性有保证，没有皮肤刺激性、致敏性(易过敏人群或对本品过敏的人群除外)等不良反应。
测试例3皮肤弹性测试
在技术人员的指导下，由受试人员使用应用例1-7和对比应用例1-6提供的组合物，然后使用皮肤弹性测试仪(Cutometer MPA580)测定涂抹部位的弹性数值R2的变化情况。
受试群体：年龄为30-60岁的有皱纹者39名。其中男性12名，女性27名，皮肤健康无损伤。
测试环境温度：21℃±1℃，湿度：50±10％，并且进行实时动态监测。测试前，受试者用指定清洁产品清洁受试部位，清水冲洗干净后用无屑吸水干纸巾擦干。清洁受试部位后，受试者在符合标准的测试环境中静坐30min，不能喝水和饮料，保持放松，避免触碰受试部位。
(1)取本应用例1-7和对比应用例1-6提供的组合物，每个样品分别在3个受试者身上测试，每人测三次。
(2)在受试者手臂内侧选取3个实验部位。
(3)受试者手臂内侧部位涂抹样品，每天早晚各涂抹一次。实验期间，受试者在实验部位不能涂抹任何其它化妆品。
(4)受试者在连续使用组合物14天、28天后，测定涂抹部位的弹性数值R2，并与未使用组合物的皮肤弹性数值(空白)作对比。
(5)统计受试者实验部位每次测得的数值，分析其皮肤弹性变化规律，以评价其皮肤弹性的变化情况。
皮肤的R2值衡量皮肤的总弹性，其越接近1，皮肤弹性越好。R2值的测试结果如表7所示：
表7
其中变化率的计算公式为：
变化率＝(R2(D14或D28)-R2(D0))/R2(D0)×100％
从表7可知，应用例1-7中的组合物对皮肤弹性均有一定程度的改善，其中应用例1提供的组合物对皮肤弹性的改善明显优于其它应用例和对比应用例。从应用例1与对比应用例6可看出，芋螺肽与胶原蛋白的融合蛋白的效果是优于芋螺肽与胶原蛋白的混合物的。应用例1的效果优于应用例6和7，说明了芋螺肽与胶原蛋白的融合蛋白可能与肌肽发生了协同效应，导致对皮肤弹性的改善略微提升。
测试例4皮肤屏障修护测试
招募志愿者39人，年龄介于30-60之间，男性12名，女性27名，分别测试应用例1-7和对比应用例1-6修护的功效，每个样品分别在3个受试者身上测试，每人测三次。在受试者手臂内侧选取3个实验部位，用0.5％十二烷基硫酸钠(SLS)溶液反复涂抹皮肤形成化学损伤模型，然后分别使用50μg/mL应用例1-7和对比应用例1-6制成的膏霜涂抹皮肤受损处，连续涂抹14天和28天后，记录皮肤经皮水分流失数值(TEWL)的变化情况，结果如表8所示：
其中变化率的计算公式为：
变化率＝(TEWL(第n天)-TEWL(第0天))/TEWL(第0天)×100％
表8
表8结果显示：自然条件下，急性损伤模型的皮肤屏障会自然修复，经皮水分流失数值会逐渐减小。应用例1-5表明使用本发明提供的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白会加快皮肤屏障的修复过程。从应用例1、6、7可知，组合物中的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白与肌肽产生了协同效应，其效果比单纯的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白(应用例6)或肌肽(应用例7)的效果要好。
通过表7和表8中应用例1(YLT-ColI)与对比应用例6(ColI和YLT的混合物)的对比，可知应用例1在使用14天和28天后的抗皱和修护效果比对比应用例6的普通混合物好，表明芋螺肽与胶原蛋白的融合蛋白比芋螺肽与胶原蛋白的混合物的功效要好。
从表7和表8可知，应用例1作为本发明的最优选，在保证即时抗皱和长效修复的功效的前提下，其胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白(YLT-ColI)的使用量仅为0.1％，芋螺肽的实际使用量比大部分其它市面上的产品要低。这是因为人源胶原蛋白与人体的相容性好，所以选用人源胶原蛋白与芋螺肽连接，可以使芋螺肽更容易被吸收，从而降低了芋螺肽的实际使用量。
测试例5皮肤抗皱测试
测试仪器：美国Canfield Visia7面部图像分析仪，爱尔兰Miravex Antera-3D皮肤成像分析仪。
受试者一共39人，年龄介于30-60之间，男性12名，女性27名，分别测试应用例1-7和对比应用例1-6提供的组合物。受试者脸部先用清水冲洗干净，再用无屑吸水纸巾吸干，然后受试者在标准环境(温度20℃-22℃，湿度40％-60％)中静坐30min。
测试方法：在使用应用例1-7和对比应用例1-6提供的组合物之前，测量受试者面部皱纹面积占比作为初始值，记为T0。使用应用例1-7和对比应用例1-6提供的组合物，静坐15分钟和30分钟后，测量受试者面部皱纹面积占比，记为T15和T30。测试结果如表9所示：
其中变化率的计算公式为：
T15变化率＝(T15-T0)/T0×100％
T30变化率＝(T30-T0)/T0×100％
表9
从表9可知，在使用不同组合物后的30分钟内，皱纹面积占比都有不同程度的下降，其中应用例1-5的效果较其它的更好。通过应用例1与对比应用例6的比较可知，应用例1提供的YLT-ColI融合蛋白比对比应用例6的芋螺肽和胶原蛋白的混合物的效果要好，说明芋螺肽与胶原蛋白的融合蛋白能进一步提升其即时抗皱的功效。
通过对比可知，应用例1-7所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白(YLT-ColI)具有即时抗皱效果且具有长效修复肌肤的功效；替换其中的序列后其抗皱和修复的功能会降低，无法发挥最佳效果；与单独的胶原蛋白或芋螺肽相比，所述融合蛋白兼具两者的优势，胶原蛋白片段可以通过整合素促进细胞黏附、增殖，芋螺肽片段可以通过阻断神经肌肉的电流传导进而淡化皱纹，特别是针对肌肉的NAV1.4通道，以达到去皱的效果；所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白与将胶原蛋白和芋螺肽简单混合的方案相比，所述融合蛋白所述融合蛋白在功能上弥补了重组胶原蛋白短时去皱效果不明显，以及芋螺肽不具备长效修复功能的缺陷。
综上，本申请提供了一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白及其制备方法，本发明所述的制备方法能够降低表达的目的产物在大肠杆菌中常以可溶的形式存在，产量高，且产物经纯化后不需经过酶切步骤，所得胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白同时兼具胶原蛋白功能和芋螺肽功能，而且在功能上弥补了重组胶原蛋白短时去皱效果不明显的缺陷以及芋螺肽不具备长效修复功能的缺陷。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白，其特征在于，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白从N端至C端包括依次连接的胶原蛋白片段和芋螺肽片段；
所述胶原蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述芋螺肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白，其特征在于，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白还包括HIS标签片段；
优选地，所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白；
优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的权利要求3所述的核酸分子。
5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞表达权利要求1或2所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白；
优选地，所述重组细胞的基因组中整合有权利要求3所述的核酸分子；
优选地，所述重组细胞中含有权利要求4所述的表达载体。
6.一种权利要求1或2所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：构建含有编码权利要求1或2所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的核酸分子的表达载体，将所述表达载体转入受体细胞中，筛选含有表达载体的阳性菌株；培养所述含有表达载体的阳性菌株，诱导表达，破碎菌体，并进行纯化，得到所述胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白。
7.根据权利要求6所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述受体细胞包括大肠杆菌，所述大肠杆菌包括DH5α、BL21或BL21 STAR；
优选地，所述诱导表达的方法包括IPTG诱导；
优选地，所述诱导表达的温度为36-38℃；
优选地，所述破碎菌体采用如下步骤进行：用破菌缓冲液将菌体重悬，进行高压均质，直至菌液澄清透明，将菌液离心，取上清液并过滤；
优选地，所述破菌缓冲液按摩尔浓度计包括：10-50mM PB、100-300mM NaCl，溶剂为水；
优选地，所述纯化的方法包括镍离子柱亲和层析；
优选地，所述镍离子柱亲和层析包括如下步骤：将过滤的菌液上清经镍离子柱吸附后，依次使用咪唑浓度递增的镍离子柱亲和层析预洗脱缓冲液进行一次洗杂和二次洗杂，再用咪唑浓度递增的洗脱缓冲液进行一次洗脱和二次洗脱；
优选地，所述一次洗杂采用的预洗脱缓冲液中咪唑浓度为40-60mM；
优选地，所述二次洗杂采用的预洗脱缓冲液中咪唑浓度为90-110mM；
优选地，所述一次洗脱采用的洗脱缓冲液中咪唑浓度为150-250mM；
优选地，所述二次洗脱采用的洗脱缓冲液中咪唑浓度为450-550mM；
优选地，所述纯化后还包括采用G25凝胶柱进行脱盐的步骤。
8.一种具有即时抗皱和长效修复效果的组合物，其特征在于，所述组合物含有权利要求1或2所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述组合物按重量份数计包括：胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白0.01-1份、肌肽0.01-1份、苯氧乙醇0.01-1份、乙基己基甘油0.01-0.1份、甘油2-10份、甜菜碱0.3-3份和水80-100份。
10.权利要求1或2所述的胶原蛋白-芋螺肽融合蛋白和/或权利要求8或9所述的具有即时抗皱效果的组合物在药品和化妆品中的应用。
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|---|---|
| CN (1) | CN115960268B (zh) |
Citations (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5320958A (en) * | 1989-02-24 | 1994-06-14 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Isolated bacterial reverse transcriptase |
| AU3322799A (en) * | 1998-04-16 | 1999-11-08 | University Of Queensland, The | Novel Omega Conotoxin Peptides |
| CN1423659A (zh) * | 1999-11-12 | 2003-06-11 | 法布罗根股份有限公司 | 重组明胶 |
| US20050101531A1 (en) * | 2002-09-11 | 2005-05-12 | Bouwstra Jan B. | Use of recombinant gelatin-like proteins as plasma expanders and compositions suitable for plasma substitution |
| US6992172B1 (en) * | 1999-11-12 | 2006-01-31 | Fibrogen, Inc. | Recombinant gelatins |
| CN101041691A (zh) * | 2007-02-06 | 2007-09-26 | 中山大学 | 中国南海信号芋螺神经毒素基因lt5.4及其应用 |
| US20080050460A1 (en) * | 2006-06-08 | 2008-02-28 | Savidge Tor C | Uses of lectin-conotoxin |
| US20080292704A1 (en) * | 2001-03-09 | 2008-11-27 | Iterative Therapeutics, Inc. | Methods and Compositions Involving Polymeric Immunoglobulin Fusion Proteins |
| US20090062211A1 (en) * | 2003-03-05 | 2009-03-05 | Florida Atlantic University | Conopeptides and methods of use |
| US20090169615A1 (en) * | 2007-12-26 | 2009-07-02 | Pinsky Mark A | Collagen Formulations for Improved Skin Care |
| CN102020716A (zh) * | 2010-10-29 | 2011-04-20 | 西安华澳丽康生物工程有限公司 | 基因重组人胶原蛋白融合肽段及其制备方法和应用 |
| CN102190708A (zh) * | 2011-03-30 | 2011-09-21 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种桶形α芋螺多肽Bt1.3及其应用 |
| CN103012597A (zh) * | 2012-12-31 | 2013-04-03 | 黑龙江大学 | 用于治疗骨质疏松症和止痛的OGP-CTx融合蛋白及编码该融合蛋白的核酸 |
| CN103122027A (zh) * | 2012-11-26 | 2013-05-29 | 杨霞 | 一种重组人源胶原蛋白及其生产方法 |
| WO2018111018A2 (ko) * | 2016-12-16 | 2018-06-21 | 한양대학교 에리카산학협력단 | 플라스미드 기반의 ｃｔｘ 파지 복제시스템 및 ｃｔｘ 파지에 감염되고 콜레라 독소를 생산할 수 있는 비브리오 콜레라 균주 |
| CN113621052A (zh) * | 2021-08-23 | 2021-11-09 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种重组i型人源化胶原蛋白多肽及其制备方法和用途 |
| CN114106202A (zh) * | 2021-11-25 | 2022-03-01 | 西安德诺海思医疗科技有限公司 | 一种芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白及其制备方法和应用 |
| CN114395595A (zh) * | 2021-12-20 | 2022-04-26 | 广州栋方生物科技股份有限公司 | 一种重组人源胶原蛋白的制备方法及其产品与应用 |
-
2022
- 2022-12-30 CN CN202211736718.8A patent/CN115960268B/zh active Active
Patent Citations (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5320958A (en) * | 1989-02-24 | 1994-06-14 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Isolated bacterial reverse transcriptase |
| AU3322799A (en) * | 1998-04-16 | 1999-11-08 | University Of Queensland, The | Novel Omega Conotoxin Peptides |
| CN1423659A (zh) * | 1999-11-12 | 2003-06-11 | 法布罗根股份有限公司 | 重组明胶 |
| US6992172B1 (en) * | 1999-11-12 | 2006-01-31 | Fibrogen, Inc. | Recombinant gelatins |
| US20080292704A1 (en) * | 2001-03-09 | 2008-11-27 | Iterative Therapeutics, Inc. | Methods and Compositions Involving Polymeric Immunoglobulin Fusion Proteins |
| US20050101531A1 (en) * | 2002-09-11 | 2005-05-12 | Bouwstra Jan B. | Use of recombinant gelatin-like proteins as plasma expanders and compositions suitable for plasma substitution |
| US20090062211A1 (en) * | 2003-03-05 | 2009-03-05 | Florida Atlantic University | Conopeptides and methods of use |
| US20080050460A1 (en) * | 2006-06-08 | 2008-02-28 | Savidge Tor C | Uses of lectin-conotoxin |
| CN101041691A (zh) * | 2007-02-06 | 2007-09-26 | 中山大学 | 中国南海信号芋螺神经毒素基因lt5.4及其应用 |
| US20090169615A1 (en) * | 2007-12-26 | 2009-07-02 | Pinsky Mark A | Collagen Formulations for Improved Skin Care |
| CN102020716A (zh) * | 2010-10-29 | 2011-04-20 | 西安华澳丽康生物工程有限公司 | 基因重组人胶原蛋白融合肽段及其制备方法和应用 |
| CN102190708A (zh) * | 2011-03-30 | 2011-09-21 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种桶形α芋螺多肽Bt1.3及其应用 |
| CN103122027A (zh) * | 2012-11-26 | 2013-05-29 | 杨霞 | 一种重组人源胶原蛋白及其生产方法 |
| CN103012597A (zh) * | 2012-12-31 | 2013-04-03 | 黑龙江大学 | 用于治疗骨质疏松症和止痛的OGP-CTx融合蛋白及编码该融合蛋白的核酸 |
| WO2018111018A2 (ko) * | 2016-12-16 | 2018-06-21 | 한양대학교 에리카산학협력단 | 플라스미드 기반의 ｃｔｘ 파지 복제시스템 및 ｃｔｘ 파지에 감염되고 콜레라 독소를 생산할 수 있는 비브리오 콜레라 균주 |
| CN113621052A (zh) * | 2021-08-23 | 2021-11-09 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 一种重组i型人源化胶原蛋白多肽及其制备方法和用途 |
| CN114106202A (zh) * | 2021-11-25 | 2022-03-01 | 西安德诺海思医疗科技有限公司 | 一种芋螺毒素和胶原蛋白融合蛋白及其制备方法和应用 |
| CN114395595A (zh) * | 2021-12-20 | 2022-04-26 | 广州栋方生物科技股份有限公司 | 一种重组人源胶原蛋白的制备方法及其产品与应用 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| ANAÏS M J MØLLER等: "Fusion Potential of Human Osteoclasts In Vitro Reflects Age, Menopause, and In Vivo Bone Resorption Levels of Their Donors-A Possible Involvement of DC-STAMP", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES》, vol. 21, no. 17, 2 September 2020 (2020-09-02), pages 6368 * |
| GENBANK: "AAA75386.1: alpha-1 type I collagen, partial [Homo sapiens]", 《GENBANK》, 26 July 2016 (2016-07-26) * |
| GENBANK: "WP_077320050.1: hypothetical protein [Virgibacillus proomii]", 《GENBANK》, 20 February 2017 (2017-02-20) * |
| GENBANK: "XP_025217425.1: collagen alpha-1(I) chain isoform X9 [Theropithecus gelada]", 《GENBANK》, 29 June 2018 (2018-06-29) * |
| SHUNYI ZHU等: "DrTx(1-42), a C-terminally truncated analogue of drosotoxin, is a candidate of analgesic drugs", 《BIOCHEMICAL PHARMACOLOGY》, vol. 81, no. 03, 1 February 2011 (2011-02-01), pages 425 - 431, XP027572189 * |
| 吴赟、曹锟、张广献: "4种α-芋螺毒素来源多肽合成及功能鉴定", 《广东医科大学学报》, vol. 39, no. 03, 30 June 2021 (2021-06-30), pages 253 - 258 * |
| 李宝珠等: "芋螺毒素基因资源研究进展", 《生物技术通报》, no. 2011, 26 January 2011 (2011-01-26), pages 29 - 36 * |
| 高炳淼等: "融合表达载体pET32a/Trx-EK-MrVIB的构建及在大肠杆菌中表达", 《基因组学与应用生物学》, vol. 34, no. 02, 25 February 2015 (2015-02-25), pages 326 - 331 * |
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