[go: up one dir, main page]

CN115960228A - 一种特异性结合cd19的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种特异性结合cd19的单克隆抗体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115960228A
CN115960228A CN202211073657.1A CN202211073657A CN115960228A CN 115960228 A CN115960228 A CN 115960228A CN 202211073657 A CN202211073657 A CN 202211073657A CN 115960228 A CN115960228 A CN 115960228A
Authority
CN
China
Prior art keywords
monoclonal antibody
seq
cell
cells
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN202211073657.1A
Other languages
English (en)
Inventor
张青
郑骏年
孙世硕
高晓鸽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xuzhou Medical College
Original Assignee
Xuzhou Medical College
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xuzhou Medical College filed Critical Xuzhou Medical College
Priority to CN202211073657.1A priority Critical patent/CN115960228A/zh
Publication of CN115960228A publication Critical patent/CN115960228A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种特异性结合CD19的单克隆抗体及其应用，本发明还公开了编码所述单克隆抗体的核酸分子、包含所述核酸分子的表达载体、包含所述表达载体的宿主细胞和宿主细胞群体、药物组合物、抗体‑药物偶联物和试剂盒，本发明为B淋巴细胞恶性肿瘤药物的开发、B淋巴细胞恶性肿瘤的治疗、B淋巴细胞恶性肿瘤的机制研究等奠定了基础。

Description

一种特异性结合CD19的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种抗CD19的单克隆抗体，具体而言，涉及一种特异性结合CD19的单克隆抗体及其应用。
背景技术
CD19是一种95kDa的跨膜糖蛋白，广泛表达于B淋巴细胞表面，是一种参与B淋巴细胞活化、增殖、分化及产生抗体等过程的重要膜抗原，此外，CD19具有如下特性：CD19只在正常或恶性B淋巴细胞表面表达，其他组织几乎不表达或只有微量表达；CD19在B淋巴细胞的恶性转化过程中不丢失，意味着即使患者复发、或难治性病例仍然可以起到作用；CD19在干细胞和B淋巴祖细胞表面不表达，所以在治疗停止后，B淋巴细胞可以通过干细胞、祖细胞得到有效地补充。由于CD19的以上特性，近年来，CD19作为B淋巴细胞恶性肿瘤免疫治疗的分子靶点受到极大的关注，且已有的临床前研究和临床研究均显示了CD19蛋白在B淋巴细胞恶性肿瘤免疫治疗中的潜在价值，包括急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblasticleukemia，ALL)、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)、非霍奇金淋巴瘤等的免疫治疗。靶向CD19的治疗方案在临床上广泛应用于B淋巴细胞恶性肿瘤的治疗中，如单克隆抗体、双特异性抗体等。目前，CD19已成为B淋巴细胞恶性肿瘤靶向治疗的理想靶标。
随着单克隆抗体临床应用逐渐增多，相关研究学者经研究发现其在恶性肿瘤、器官移植和结缔组织疾病治疗中均显示出良好的治疗效果。单克隆抗体药物具有靶向性高和纯度好等特点，近年来单克隆抗体药物迅速发展，一些单克隆抗体药物已经被应用于临床治疗多种疾病。但是，单克隆抗体药物在前期开发是较为困难的，需要综合考虑多种多样的因素，往往需要大量的筛选工作；并且一些单克隆抗体还存在着特异性不够理想或存在副作用等问题，阻碍了其在临床上的应用。目前，现有技术中虽然有靶向CD19的单克隆抗体的相关报道，但其仍然存在与CD19的特异性较差等缺陷。面对B淋巴细胞恶性肿瘤患者对于治疗药物需求，尤其是对单克隆抗体药物的需求，目前，临床上仍然亟待提供一种对CD19具有较好特异性的单克隆抗体。
发明内容
鉴于此，为了克服上述现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种特异性结合CD19的单克隆抗体及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种抗CD19的单克隆抗体。
进一步，所述单克隆抗体包含重链可变区HCVR、轻链可变区LCVR；
优选地，所述HCVR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3；
优选地，所述LCVR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；
更优选地，所述HCDR1含有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的氨基酸序列；
更优选地，所述HCDR2含有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列；
更优选地，所述HCDR3含有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的氨基酸序列；
更优选地，所述LCDR1含有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4具有至少90％同一性的氨基酸序列；
更优选地，所述LCDR2含有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的氨基酸序列；
更优选地，所述LCDR3含有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6具有至少90％同一性的氨基酸序列；
最优选地，所述HCVR的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；
最优选地，所述LCVR的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；
最优选地，所述单克隆抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
在本发明的具体实施方案中，所述与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11具有至少90％同一性的氨基酸序列是指在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11对应的氨基酸序列的基础上将任意一个或多个位置的氨基酸替换为其他任意氨基酸之后得到的氨基酸序列，只要与本发明所述的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11具有至少90％同一性的氨基酸序列均在本发明的保护范围内。
CD19是表达于B淋巴细胞及滤泡树突状细胞的表面蛋白，属于免疫球蛋白(Ig)超家族成员，位于16号染色体短臂上(16p11.2)，编码556个氨基酸的Ⅰ型跨膜糖蛋白，分子量95KD。CD19与B细胞活化、信号传导及生长调节密切相关，是B淋巴细胞表面的一种功能受体分子，在B细胞抗原受体识别抗原时构成B细胞双重抗原结合模型，参与B细胞内Ca2+的转运，调节B细胞的活化与增殖。CD19作为重要标记物被广泛应用于白血病、淋巴瘤及免疫系统疾病的诊断、预后判断和治疗中。
本发明的第二方面提供了一种药物组合物。
进一步，所述药物组合物包含有效量的本发明第一方面所述的单克隆抗体；
优选地，所述药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂；
优选地，所述药物组合物用于治疗CD19相关的血液系统恶性肿瘤；
更优选地，所述CD19相关的血液系统恶性肿瘤包括多发性骨髓瘤、急性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、间变大细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤。
本发明的第三方面提供了一种抗体-药物偶联物。
进一步，所述抗体-药物偶联物包含：
(1)本发明第一方面所述的单克隆抗体；
(2)与所述单克隆抗体偶联的小分子物质；
优选地，所述小分子物质包括细胞毒素、治疗剂；
更优选地，所述细胞毒素包括MMAE、DM1、PE-T20、PE-T20-KDEL、PE4E、PE40、PE38、PE25、PE38QQR、PE35、PE38KDEL、PE38DKEL、PE38RDEL、PE38KNEL、TLR8激动剂、多柔比星、甲氨蝶呤、丝裂霉素、氟尿嘧啶、长春碱、卡奇霉素、多卡霉素、吡咯并苯并二氮卓、喜树碱类似物、伊利替康；
更优选地，所述治疗剂包括抗代谢物、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂、染色质功能抑制剂、抗血管生成剂、抗雌激素、抗雄激素、免疫调节剂。
本发明的第四方面提供了一种核酸分子。
进一步，所述核酸分子包括编码本发明第一方面所述单克隆抗体的HCVR的核苷酸序列、编码本发明第一方面所述单克隆抗体的LCVR的核苷酸序列或编码本发明第一方面所述单克隆抗体的核苷酸序列；
优选地，所述编码HCVR的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
优选地，所述编码LCVR的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
优选地，所述编码单克隆抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。
进一步，所述核酸分子是分离或纯化的。DNA分子的序列可以用常规技术，或利用杂交瘤技术获得。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明所述的单克隆抗体(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明所述单克隆抗体的序列中。
本发明的第五方面提供了一种表达载体。
进一步，所述表达载体包含本发明第四方面所述的核酸分子；
优选地，所述载体包括质粒载体、病毒来源的载体、噬菌体载体；
更优选地，所述病毒来源的载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体。
进一步，所述表达载体还包含适当启动子或者控制序列的载体。这些表达载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性实例有：细菌细胞如大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO细胞、COS7细胞、293细胞、NSO细胞或Bowes黑素瘤细胞等。
如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的单克隆抗体。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的实例包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的第六方面提供了一种经工程改造的宿主细胞。
进一步，所述经工程改造的宿主细胞包含本发明第四方面所述的核酸分子或本发明第五方面所述的表达载体；
优选地，所述宿主细胞包括原核细胞、真核细胞；
更优选地，所述原核细胞包括细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体；
最优选地，所述细菌包括大肠杆菌、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、假单胞菌属、链霉菌、葡萄球菌；
更优选地，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞。
本发明的第七方面提供了一种宿主细胞群体。
进一步，所述宿主细胞群体包含本发明第六方面所述的经工程改造的宿主细胞；
优选地，所述宿主细胞群体还包含不包含本发明第四方面所述的核酸分子或本发明第五方面所述的表达载体的宿主细胞；
更优选地，所述宿主细胞包括原核细胞、真核细胞；
最优选地，所述原核细胞包括细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体；
最优选地，所述细菌包括大肠杆菌、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、假单胞菌属、链霉菌、葡萄球菌；
最优选地，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞。
本发明的第八方面提供了一种试剂盒。
进一步，所述试剂盒包含本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第四方面所述的核酸分子、本发明第五方面所述的表达载体、本发明第六方面所述的经工程改造的宿主细胞、本发明第七方面所述的宿主细胞群体。
为了在检测时更方便，本发明提供的试剂盒中除了含有上述本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第四方面所述的核酸分子、本发明第五方面所述的表达载体、本发明第六方面所述的经工程改造的宿主细胞、本发明第七方面所述的宿主细胞群体以外，还可以包含其它检测试剂或辅助试剂，所述的辅助试剂例如是ELISA试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的，如显色剂、标记物、二抗、增敏剂等。本领域技术人员应当理解，各种变化形式的检测试剂盒均是包含在本发明中的，只要在其中利用了本发明提供的单克隆抗体作为识别CD19的试剂。此外，在所述试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方法。在获得了本发明提供的单克隆抗体和/或试剂盒后，可以利用多种免疫学相关方法来检测样品中是否存在CD19或其具体含量。
本发明的第九方面提供了如下任一种方法：
(1)一种生产本发明第一方面所述单克隆抗体的方法，所述方法包括如下步骤：培养本发明第六方面所述的经工程改造的宿主细胞或本发明第七方面所述的宿主细胞群体，从培养物中分离出本发明第一方面所述的单克隆抗体；
(2)一种非诊断和非治疗目的地检测待测样品中CD19的方法，所述方法包括如下步骤：将待测样品与本发明第一方面所述的单克隆抗体接触，检测所述单克隆抗体与CD19的复合物的形成；
优选地，所述单克隆抗体是被可用于检测的标记物标记的单克隆抗体；
更优选地，所述可用于检测的标记物包括荧光色素、亲和素、顺磁原子、放射性同位素；
最优选地，所述荧光色素为荧光素、罗丹明、Texas红、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、多甲藻黄素-叶绿素蛋白；
最优选地，所述亲和素为生物素、卵白亲和素、链亲和素、卵黄亲和素、类亲和素；
最优选地，所述放射性同位素为放射性碘、放射性铯、放射性铱、放射性钴；
(3)一种制备本发明第六方面所述经工程改造的宿主细胞的方法，所述方法包括如下步骤：将本发明第五方面所述的表达载体引入到宿主细胞中；
优选地，所述引入的方法包括物理方法、化学方法、生物方法；
更优选地，所述物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔；
更优选地，所述化学方法包括胶体分散系统、基于脂质的系统；
最优选地，所述胶体分散系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；
最优选地，所述基于脂质的系统包括水包油乳剂、胶束、混合胶束、脂质体；
更优选地，所述生物方法包括DNA载体、RNA载体、慢病毒载体、痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体；
(4)一种体外特异性地抑制CD19活性的方法，所述方法包括如下步骤：将本发明第四方面所述的核酸分子导入到生物体细胞中，通过表达本发明第一方面所述的单克隆抗体抑制CD19的活性。
此外，本发明还提供了一种诊断受试者是否患有CD19相关疾病的方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：使用本发明第一方面所述的单克隆抗体检测CD19在来自所述受试者的样品中的量；
优选地，所述方法还包括：将所述CD19在来自所述受试者的样品中的量与其在已知标准品或参照样品中的量进行比较，并确定来自所述受试者的样品的CD19的水平是否落入CD19相关疾病的CD19的水平内；
进一步，所述CD19相关疾病包括血液系统恶性肿瘤，只要是与CD19相关的疾病均在本发明的保护范围内。
此外，本发明还提供了一种用于治疗患有CD19相关疾病的受试者的方法。
进一步，所述方法包括给有需要的受试者施用有效量的本发明第二方面所述的药物组合物、本发明第三方面所述的抗体-药物偶联物。
本发明的第十方面提供了如下任一方面的应用：
(1)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的药物组合物、本发明第三方面所述的抗体-药物偶联物、本发明第四方面所述的核酸分子、本发明第五方面所述的表达载体、本发明第六方面所述的经工程改造的宿主细胞、本发明第七方面所述的宿主细胞群体在制备用于预防和/或治疗CD19相关的血液系统恶性肿瘤的药物中的应用；
(2)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的药物组合物、本发明第四方面所述的核酸分子、本发明第五方面所述的表达载体、本发明第六方面所述的经工程改造的宿主细胞、本发明第七方面所述的宿主细胞群体在制备用于预防和/或治疗CD19相关的血液系统恶性肿瘤的抗体-药物偶联物中的应用；
(3)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第四方面所述的核酸分子、本发明第五方面所述的表达载体、本发明第六方面所述的经工程改造的宿主细胞、本发明第七方面所述的宿主细胞群体、本发明第八方面所述的试剂盒在检测CD19蛋白或其抗原片段中的应用；
(4)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第四方面所述的核酸分子、本发明第五方面所述的表达载体、本发明第六方面所述的经工程改造的宿主细胞、本发明第七方面所述的宿主细胞群体、本发明第八方面所述的试剂盒在制备用于检测CD19蛋白或其抗原片段的产品中的应用；
(5)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第四方面所述的核酸分子、本发明第五方面所述的表达载体、本发明第六方面所述的经工程改造的宿主细胞、本发明第七方面所述的宿主细胞群体、本发明第八方面所述的试剂盒在制备用于诊断CD19相关的血液系统恶性肿瘤的产品中的应用；
(6)本发明第一方面所述的单克隆抗体在制备核酸分子、表达载体、经工程改造的宿主细胞、宿主细胞群体中的应用；
(7)本发明第四方面所述的核酸分子在制备表达载体、经工程改造的宿主细胞、宿主细胞群体中的应用；
(8)本发明第五方面所述的表达载体在制备经工程改造的宿主细胞、宿主细胞群体中的应用；
(9)本发明第六方面所述的经工程改造的宿主细胞在制备宿主细胞群体中的应用；
优选地，所述CD19相关的血液系统恶性肿瘤包括多发性骨髓瘤、急性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、间变大细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果如下：
本发明提供了一种新型的抗CD19的单克隆抗体、以及编码所述单克隆抗体的核酸分子、包含所述核酸分子的表达载体、包含所述表达载体的宿主细胞和宿主细胞群体、药物组合物、抗体-药物偶联物和试剂盒，本发明为B淋巴细胞恶性肿瘤药物的开发、B淋巴细胞恶性肿瘤的治疗、B淋巴细胞恶性肿瘤的机制研究等奠定了基础，在治疗CD19相关疾病的治疗中具有重要的应用前景。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为SDS-PAGE鉴定CD19纯化抗体的结果图；
图2为本发明制备得到的CD19抗体流式验证结果图；
图3为Ctrl-CAR和CD19-CAR的结构示意图，其中，Anti-CD19 scFv为新筛选的抗人CD19抗体(clone 6E1B8)，即本发明实施例1中筛选得到的抗体；
图4为本发明所述的CAR-T细胞的制备流程图；
图5为流式检测CAR表达阳性率的结果图，在细胞体外培养扩增第10天，取2×105个细胞用于流式检测，用抗C-myc的一抗和Alexa Fluor 647标记的荧光二抗检测CAR的表达；
图6为ELISA实验检测CD19-CAR-T细胞的细胞因子释放能力的结果图，取1×104个Ctrl-T或CD19-CAR-T细胞分别与人白血病细胞Raji或Nalm-6细胞以2:1的比例在U形底96孔板内共孵育24h，离心取上清，用ELISA方法检测靶细胞刺激后CAR-T细胞释放细胞因子的量；数据统计采用独立样本t检验(Independent-Samples T Test)；***P<0.001；****P<0.0001；
图7为利用流式检测CD19-CAR-T对白血病细胞杀伤效果的结果图，将2×105个靶细胞(Raji或Nalm-6)分别与4×105个Ctrl-T或CD19-CAR-T细胞共孵育48h后，将细胞离心取出进行染色，利用流式细胞仪检测杀伤效果。
具体实施方式
本发明经过广泛而深入的研究，筛选出了一种新型的抗CD19的单克隆抗体，所述单克隆抗体与CD19特异性地结合，所述单克隆抗体包含HCVR、LCVR，所述HCVR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，所述LCVR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示，所示LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
在本发明中，术语“单克隆抗体”，和“单抗”、“抗体”可互换使用，是指具有单一分子组成的抗体分子，获自一群基本相同的抗体。该单克隆抗体显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和性。典型地，免疫球蛋白具有重链和轻链。各重链和轻链包括恒定区和可变区(区域也称为“域”)。轻链可变区(Variable region of light chain，LCVR)和重链可变区(Variable region of heavy chain，HCVR)包括四个框架区(Framework region，FR)，被三个超变区(HVR)打断，也称为“互补决定区(CDR)”。CDR主要负责结合到抗原的表位。各链的CDR通常为CDR1、CDR2和CDR3，从N末端开始连续编号，通常也用特定CDR所处的链标识。LCVR的CDR1、CDR2和CDR3分别为LCDR1、LCDR2、LCDR3，HCVR的CDR1、CDR2和CDR3分别为HCDR1、HCDR2、HCDR3。此外，本发明所述的单克隆抗体还包括该单克隆抗体的功能性变异体，所述功能性变异体可结合至CD19。
具体地，所述功能性变异体包括但不限于：在一级结构序列中基本类似、但包括本发明的亲本单克隆抗体中没有的，例如体外或体内的化学和/或生物化学改性的衍生物。这些改性包括例如乙酰化、酰化、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、交联、二硫键的形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解处理、磷酸化。
可选择地，功能性变异体可为如下的单克隆抗体：与亲本单克隆抗体的氨基酸序列相比，包括含有一个或多个氨基酸的取代、插入、缺失或其组合的氨基酸序列。进一步地，功能性变异体可在氨基末端或羧基末端的其中一端或两端包括氨基酸序列的截短。与亲本单克隆抗体相比，根据本发明的功能性变异体可能具有相同或不同、较高或较低的结合性能，但仍能够键合至CD19。
在本发明中，术语“核酸分子”可包含天然的、非天然的或被改变的核苷酸；并且其可包含天然的、非天然的或被改变的核苷酸间连接，例如氨基磷酸酯连接或硫代磷酸酯连接，代替在未经修饰寡核苷酸的核苷酸之间存在的磷酸二酯。在一些实施方案中，核酸不包含任何插入、缺失、倒位和/或替换。然而，在一些情况下对核酸而言，包含一个或更多个插入、缺失、倒位和/或替换可以是合适的，因此，这些插入、缺失、倒位和/或替换形成的核酸同样在本发明的保护范围内。
在本发明的具体实施方案中，所述核酸分子包括可使用天然存在的核苷酸或被设计成提高分子的生物稳定性或提高在杂交后形成的二联体的物理稳定性的经多种修饰的核苷酸(例如硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)化学合成得到的核酸分子。可用于产生核酸的经修饰核苷酸的一些实例包括但不限于：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷(queosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-取代的腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸(v)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。
在本发明中，所述表达载体中包含的适当启动子包括天然启动子、非天然启动子。启动子的选择(例如，强的、弱的、诱导型的、组织特异性的和发育特异性的)在技术人员的普通技术之内。类似地，核苷酸序列与启动子的组合也在技术人员的技术之内。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子，或在鼠干细胞病毒的长末端重复中发现的启动子。
本发明提供的药物组合物中所述药学上可接受的赋形剂具体示例性的例子包括但不限于：糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。所述药学上可接受的赋形剂在Remington's PharmaceuticalSciences(19th ed.,1995)中有详细的记载。
本发明提供的药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。合适的给药方式包括适用于肠胃外的给药方式，例如通过注射或输注，例如通过快速注射或连续输液、静脉内、可吸入或皮下形式。在产品用于注射或输注的情况下，其可采用在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式并且其可含有配制试剂，诸如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地，根据本发明提供的单克隆抗体可呈干燥形式，用于在使用之前用合适的无菌液体重构。还可制备适于在注射前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式。用于静脉内施用的本发明提供的药物组合物包含约0.01mg/kg至约30mg/kg的本发明第一方面所述的单克隆抗体/受试者/天。本文中所述的单克隆抗体可以以冻干形式提供并且在施用之前用无菌水再水化，但是其也以已知浓度的无菌溶液提供。然后将单克隆抗体溶液添加到包含0.9％氯化钠(USP)的输注袋中，并且在一些情况下以0.5mg/kg体重至15mg/kg体重的剂量施用。在一个实施例中，施用较高的负荷剂量，随后以较低水平施用维持剂量。例如，可在大约90分钟的时间内输注4mg/kg抗体、抗原结合片段、抗体-药物偶联物的初始负荷剂量(或包含抗体、抗原结合片段、抗体-药物偶联物的对应剂量)，随后如果在前剂量耐受良好，则在30分钟时间内输注2mg/kg的每周维持剂量进行4至8周。
本发明提供的单克隆抗体可以以未分离的或者分离的形式使用。此外，本发明所述的单克隆抗体可以单独应用或者于包含至少一种本发明的所述的单克隆抗体(或其变体或片段)的混合物中应用。换句话说，所述单克隆抗体可以组合应用，例如作为包含两个或更多种本发明的单克隆抗体、其变体或片段的药物组合物。例如，具有不同但互补活性的单克隆抗体可以组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、治疗或诊断作用，但是或者也可以将具有相同活性的单克隆抗体组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、治疗或诊断作用。
本发明提供的单克隆抗体或药物组合物在用于人体之前可以在合适的动物模型系统中检测。这种动物模型系统包括但不限于小鼠、猴。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1杂交瘤单克隆抗体制备
1、实验动物免疫
(1)抗原乳化：取0.05mg CD19抗原用PBS稀释后与弗氏佐剂按体积比1:1(总体积0.8mL)混合后在4℃环境下乳化3-5min(取出搅拌器头，在装有水的容器口轻轻敲一下，让搅拌铁丝上粘有的乳化后的免疫原掉一滴到水里，其遇水不扩散时即已乳化好。如还有扩散现象，继续加长乳化时间)。确保使用最短的时间乳化好。
(2)第一次免疫用弗氏完全佐剂，后面加强免疫则用弗氏不完全佐剂。
(3)注射抗原：将乳化好的抗原转入1mL的注射器中，排除注射器中的气泡。泡沫化装冰袋保存(当天乳化，当天免疫)。从笼中取出待免疫的小鼠放在特制的固定架中，在背部进行多点皮下注射。注射时抚去注射处的小鼠毛并用酒精消毒暴露的皮肤，提起皮肤使其出现一三角形，将针头以相对皮肤15度的角度进针，注射深度为1-2cm，小心不要刺入肌肉中。
(4)免疫周期：每次免疫相隔2周。
(5)一共免疫3-5次。
(6)三免一周后取血检测抗体效价，如果效价到达了冲击免疫后摘眼球取血脱颈处死，取脾脏。
(7)一共免疫6只小鼠。
2、效价检测
(1)包被：用包被液CB将抗原CD19稀释至2μg/mL，100μL/孔加入酶标板，4℃过夜或37℃孵育2h。
(2)封闭：取出酶标板拍干孔内液体，5％脱脂牛奶封闭(PBS溶解)，200μL/孔加入酶标板，37℃孵育2h，TBS洗板3次。
(3)加一抗：将免疫血清按1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000……进行倍比稀释(以空白血清做阴性对照)，每孔100μL，37℃孵育1h。TBS洗板3次。
(4)加二抗：加入HRP标记羊抗小鼠IgG(1:10000的稀释比例)，100μL/孔，37℃孵育40min，TBS洗板5次。
(5)显色：加TMB底物，90μL/孔，37℃避光5-20min。
(6)终止：加终止液，50μL/孔，酶标仪读数(波长450nm)，阳性反应的最大稀释度即为免疫小鼠的血清效价。
3、滋养细胞制备
(1)小鼠腹腔巨噬细胞制备
1)取8-10周Balb/C小鼠，摘眼球放血脱颈处死，将小鼠浸泡于75％酒精中消毒5min。
2)小鼠移入超净工作台并用灭过菌的针头将小鼠仰卧固定在垫有灭菌报纸的泡沫上，用剪刀镊子开腹部皮肤，钝性剥离充分暴露腹膜。
3)用5mL注射器吸取3-5mL DMEM注入腹腔内冲洗，将培养基吸出移至50mL离心管中。
(2)小鼠脾脏细胞制备
1)无菌剪开腹膜，暴露腹腔，剪去结缔组织分离脾脏，将其分成四段放置在200目分离网中央，对折分离网两次，用止血钳夹住分离网开口端，加入3-6mL DMEM，研磨，吹打混匀，吸出移至50mL离心管。
2)再次加入3-6mL DMEM，吹打混匀成单个脾细胞悬液，吸出移至50mL离心管。
(3)将巨噬细胞和脾脏细胞收集起来，1500rpm离心5min，弃上清，按一只小鼠1mL胎牛血清的量悬起细胞，4℃保存。
4、细胞融合
(1)SP2/0的活化与制备
1)融合前复苏SP2/0细胞，于10％的FBS的DMEM培养基中传代培养一周，细胞生长状态较好时，取细胞无菌操作DMEM培养基洗2次，1×106个细胞/只注射于小鼠背部皮下。大约8-10d能明显看到肿瘤，待肿瘤生长至直径1-3cm，对免疫合格鼠进行冲击免疫，3d后融合。
2)无菌剪开背部皮肤，剪下肿瘤块并剪成小块，移至200目过滤网中央放置在10cm皿中，加入5-10mL DMEM，研磨成单细胞悬液，全部吸出至50mL离心管内。
3)再加入5mL DMEM，吹打混匀，全部吸出至50mL离心管中。
4)再补加5mL DMEM，吹打混匀，全部吸出至50mL离心管中。
5)将20mL骨髓瘤细胞悬液沿管壁轻轻加入到预先加入有20mL淋巴细胞分离液的50mL离心管中，2000r/min离心15min，弃去上层细胞悬液后，将中层白色的骨髓瘤细胞悬液转移到另一50mL离心管中，用10mL DMEM培养基悬浮，1500r/min离心5min，洗细胞两次。弃去上清，用10mL DMEM培养基重悬骨髓瘤细胞，计数后备用。
(2)免疫脾细胞的制备
取免疫合格的Balb/C小鼠一只，摘除眼球放血完全后脱颈处死，收集血液并分离，血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同制备滋养细胞取脾脏的方法，分离并制备免疫脾细胞悬液。
(3)细胞融合
1)将1mL PEG和40mL DMEM培养基置于37℃、5％CO2培养箱预热。
2)骨髓瘤细胞和脾细胞的个数按1:3-1:10的比例混合，1500rpm离心5min，弃上清，吸干残留液体，轻轻敲打离心管，使细胞松散。
3)缓缓加入37℃预热的1mL PEG，在60秒内加完，再静置60秒。
4)向融合体系中加入40mL DMEM培养基以终止PEG的作用，先慢后快，边加边轻轻晃动离心管，第1min逐滴加入1mL(3sec/滴)，第2min再加2mL，最后加完剩下的7mL(5min内加完)。加完第一个10mL后，接着沿管壁补加DMEM培养基至40mL，加完后拧紧盖，缓慢颠倒几次，混匀。800rpm离心5min，弃上清。
5)用2-4mL胎牛血清悬起融合后的混合细胞，根据融合完的细胞量加入到含有滋养细胞、谷氨酸胺、双抗和HAT的25％胎牛血清的半固体培养基中，轻轻混匀。将混合好的半固体倒入3.5cm平皿内(2-3mL)，再将所有的皿放置在灭过菌的湿盒内，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(4)选择性培养
从融合当天算起为0d，前面3d尽量不要动平皿，只需注意细胞有没有污染，保持培养箱内环境稳定。在第7天，如果培养基变得较黄则可以在每皿中加0.5-0.8mL的HT完全培养基。一般细胞生长到第十天可以根据细胞集落大小将集落挑到96孔板内(每孔200μL含滋养细胞的HT完全培养基)培养，2-3d后，即可取细胞培养上清，同时用间接ELISA方法和间接竞争ELISA方法进行筛选。一般平皿里面的细胞会分2-3批挑出来培养检测。
5、亚克隆和亚克隆检测
(1)亚克隆
1)亚克隆前一天制备滋养细胞，在96孔板内铺好。
2)取需要亚克隆的细胞轻轻吹打，制成单细胞悬浮，加人计数板计数，计算细胞密度。
3)取100μL需要亚克隆的细胞，稀释至1×103个/mL。
4)5个/孔亚克隆浓度为1×103个/mL的细胞悬液中，取200μL加入至3.8mL培养基中混匀(加100μL至96孔板)，100μL/孔铺4条至含滋养细胞的96孔板。
5)0.5个/孔亚克隆混匀的4mL(5个/孔)的细胞悬液中，取700μL加入至6.3mL培养基中混匀(加入100μL至96孔板)。100μL/孔铺8条至含滋养细胞的96孔板。也可以只用1个/孔亚克隆，浓度为1×103个/mL的细胞悬液中，取50μL加入至4.95mL培养基中混匀，100μL/孔铺6条至含滋养细胞的96孔板。
(2)亚克隆检测
1)包被：用包被液CB将抗原稀释至2μg/mL，100μL/孔加入酶标板，4℃过夜或37℃孵育2h。
2)封闭：取出酶标板拍干孔内液体，5％脱脂牛奶封闭(PBS溶解)，200μL/孔加入酶标板，37℃孵育2h，TBS洗板3次。
3)加样：按100μL/孔细胞上清加样，37℃孵育1h，TBS洗板3次。
4)加二抗：加入HRP标记羊抗小鼠IgG(1:10000的稀释比例)，100μL/孔，37℃孵育40min，TBS洗板5次。
5)显色：加TMB底物，90μL/孔，37℃避光20-30min。
6)终止：加终止液，50μL/孔，酶标仪读数(波长450nm)，OD值为2.0时对应的稀释值即为细胞的效价。
6、细胞冻存与复苏扩大培养
(1)冻存：细胞个数大于1×106个时冻存，1500rpm离心5min。使用DMSO与胎牛血清比例为1:9的冻存液来冻存细胞，每支细胞冻存管内放0.8-1mL。细胞冻存管放入室温的梯度冻存盒内，再直接放入-80℃过夜。取出梯度冻存盒内细胞，置于液氮罐长期保存。
(2)复苏：快速将细胞冻存管从液氮罐中取出，置37℃恒温水浴锅内快速摇晃至细胞融化。加入5mL DMEM培养基混匀，1200rpm离心5min，弃上清，加入20％的完全培养基，37℃、5％CO2的培养箱内培养，传代。
7、抗CD19的单克隆抗体的制备和纯化
(1)抗CD19的单克隆抗体的制备
1)小鼠腹腔注射液体石蜡或者不完全佐剂，0.5mL/只。
2)7-10天后，用无菌的PBS或DMEM基础培养基稀释杂交瘤细胞，使其浓度为1×106个/mL，每只小鼠用无菌注射器取1mL注入小鼠腹腔内。
3)间隔6天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时有紧张感，即可用无菌注射器腹水针采集腹水。
4)10000rpm离心2min，除去细胞成分和其他沉淀物，收集上清，-20℃保存。
(2)抗CD19的单克隆抗体纯化
1)取亲和层析柱，水洗10倍柱床体积，乙酸钠缓冲液冲洗10倍柱床体积。
2)取血清，4℃、12000rpm离心10min，收集上清，过滤，与乙酸钠缓冲液混合。
3)以0.5mL/min的速度上Protein G柱，收集穿透，上样结束后，继续以乙酸钠缓冲冲洗至G250检测无色。
4)用冰乙酸洗脱缓冲冲洗柱床，搜集洗脱峰，迅速用饱和碳酸钠调洗脱峰pH至中性，水洗10倍柱床体积。
5)用10mL NaCl-叠氮钠缓冲封闭层析柱，置于4℃。
6)将洗脱峰超滤浓缩到血清等体积，装入透析袋透析过夜。
7)等12个小时后换液一次。取出样品，4℃12000rpm离心10min，收集上清，置于4℃保存，进行SDS-PAGE检测。
8、实验结果
抗体亚型测定的结果见表1，结果显示，本发明制备得到的抗体亚型为IgG1。CD19细胞打腹水制备抗体和CD19细胞收集细胞上清制备抗体的SDS检测结果见图1，结果显示，腹水通过Pro G亲和纯化，得到的CD19-6E1B8抗体纯度95％，细胞上清通过Pro G亲和纯化，得到CD19-6E1B8抗体纯度95％。本发明制备得到的CD19抗体流式验证结果图见图2，结果显示，细胞上清纯化的抗体和腹水纯化的抗体，与杂交瘤细胞上清结果相差不大，均可以作为最终的抗体，且本发明制备得到的CD19抗体能够与细胞表面的CD19蛋白特异性结合。
表1 CD19抗体亚型鉴定结果统计
Figure BDA0003830441140000131
对本发明制备得到的抗CD19抗体进行测序的结果如下：
(1)CD19抗体重链可变区CD19-VH(HCVR)的氨基酸序列：
EVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSHGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWGDGRTSYHSALISRLSISKSDSKSQVFLKLNSLQTDDTATYYCAKKGAYYGSDYRYYAMDSWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:7)；
其中，HCDR1的氨基酸序列：GFSLTSHG(SEQ ID NO:1)，HCDR2的氨基酸序列：IWGDGRT(SEQ ID NO:2)，HCDR3的氨基酸序列：AKKGAYYGSDYRYYAMDS(SEQ ID NO:3)；
(2)CD19抗体轻链可变区CD19-VL(LCVR)的氨基酸序列：
DIQLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVYSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKASNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:8)；
其中，LCDR1的氨基酸序列：QSLVYSNGNTY(SEQ ID NO:4)，LCDR2的氨基酸序列：KAS(SEQ ID NO:5)，LCDR3的氨基酸序列：SQSTHVPWT(SEQ ID NO:6)；
(3)CD19抗体重链可变区CD19-VH(HCVR)的核苷酸序列：
GAGGTCCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACTGTCTCAGGTTTCTCATTAACCAGCCATGGTGTAAGCTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTGACGGGAGGACAAGTTATCATTCAGCTCTCATATCCAGACTGAGCATCAGCAAGTCTGACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAACTGAACAGTCTACAAACTGATGACACAGCCACGTACTACTGTGCCAAAAAGGGGGCTTACTACGGTAGTGACTACCGTTACTATGCTATGGACTCCTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:9)；
(4)CD19抗体轻链可变区CD19-VL(LCVR)的核苷酸序列：
GACATCCAGCTGACACAGACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTATACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGCTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGG(SEQ ID NO:10)。
实施例2 CD19-CAR的构建
在CD19-CAR编码DNA序列的5’端依次加上限制性酶切位点Nde I(CATATG)、起始密码子(ATG)、hCD8信号肽(GCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG)和C-myc标签(GAGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTG)的DNA序列，在3’端依次加上终止密码子(TAA)、限制性内切酶Spe I(ACTAGT)DNA序列。通过全基因合成编码上述DNA序列。将合成的DNA片段通过限制性内切酶位点Nde I和Spe I插入慢病毒载体pRRL中，构建pRRL-CD19-CAR表达质粒。
构建得到的CD19-CAR的结构示意图见图3，所述CD19-CAR由EF1α启动子、hCD8信号肽(SP)、C-myc标签、本发明制备得到的抗CD19抗体、CD8铰链区和跨膜区、HVEM共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域依次连接得到，其中，所述抗CD19抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述CD8铰链区和跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，所述HVEM共刺激信号结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述CD3ζ胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，所述抗CD19抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示，所述CD8铰链区和跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示，所述HVEM共刺激信号结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，所述CD3ζ胞内信号传导结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。所述CD19-CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，所述CD19-CAR的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。所述EF1α启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示，所述hCD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，所述hCD8信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示，所述C-myc标签的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，所述C-myc标签的核苷酸序列如SEQ IDNO:25所示。
实施例3 CD19-CAR-T细胞的制备
1、包装慢病毒pRRL-CD19-CAR
(1)预处理培养皿：使用10％的多聚赖氨酸溶液5mL加入到15cm的细胞培养皿中均匀覆盖培养皿底部，于超净工作台中静置5min后回收，使用PBS冲洗，晾干；
(2)选择预先培养的293T细胞，确定状态良好，消化后计数，取1.8×107个铺板，置于培养箱孵育过夜；
(3)质粒转染前将PBS、质粒、PEI升至室温；
(4)准备转染试剂：从-20℃冰箱取出PEI(1μg/μL)，常温下复温至PEI完全溶解。从-20℃冰箱中取出质粒，室温解冻后，混匀(Vector质粒，packaging质粒delta8.9，envelope质粒VSVG)；
(5)准备PEI/DNA复合物(以下所用体积或质粒按照一个15cm的量，可等比例扩大)，①PEI混合物：用500μL PBS稀释75μL PEI(1μg/μL)；②DNA混合物：取500μL PBS至EP管中，分别加入27μg vector质粒，18μg packaging质粒，9μg VSVG质粒，移液枪上下吹打小心混匀；③一边轻轻涡旋质粒混合物，一边将PEI混合物加入其中，室温下静置15min；④将上述DNA/PEI复合物缓慢逐滴分散的加入到一个15cm培养皿中，立即“米”字轻轻晃动培养皿，充分混匀。将培养皿置于37℃培养6小时后，将含有PEI的培养基去掉，更换为新鲜含1％丙酮酸那的DMEM完全培养基；
(6)转染24h后收集上清，换液，置于培养箱继续培养；
(7)将转染24h、48h、72h后收集的上清离心2000rpm，5min，彻底去除细胞碎片；
(8)使用20mL注射器吸取含有病毒液的培养基经0.45μm滤膜过滤，除菌；
(9)配平以后使用超速离心机离心，25000rpm，3小时；
(10)离心后，弃去上清，使用L500基础培养基重悬，放置于4℃过夜。使用EP管分装后于-80℃保存。
2、检测制备病毒的滴度
(1)使用状态良好的293T细胞铺24孔板，1×105个/孔，置于培养箱过夜培养；
(2)第二天按照预定慢病毒浓度梯度，分别加入1μL、2μL、4μL、8μL病毒液，添加助转染试剂Polybrene(终浓度8μg/mL)；
(3)第四天使用5mM EDTA消化293T细胞，PBS清洗；
(4)使用一抗c-myc抗体(使用2％FPBS 400倍稀释)避光孵育30min，2％FPBS清洗；
(5)使用二抗Alexa Fluor647(使用2％FPBS 800倍稀释)避光孵育30min，2％FPBS清洗；
(6)用200μL 1％甲醛重悬细胞，流式上机检测。计算病毒滴度；
(7)选取阳性率在10％-20％之间的浓度计算病毒滴度，公式：细胞数*阳性率/最适阳性率对应浓度。
3、T细胞的活化
从徐州医科大学附属医院收集健康供者的外周血，所有受试者均已签署知情同意书，分离外周血单个核细胞PBMC冻存备用。取上述制备的PBMC细胞悬液，将其接于10cm培养皿。于培养箱中静置2h以去除MDSC等贴壁细胞，收集悬浮细胞，计数。调整细胞密度，使用T细胞完全培养基将密度调整为1×106/mL。清洗磁珠，按照与细胞等量计算所需CD3/CD28磁珠体积，放置于磁力架上，使用基础培养基清洗CD3/CD28磁珠，清洗完成后使用完全培养基重悬磁珠。将磁珠与细胞混合吹打混匀。将磁珠与细胞的混合物接种于48孔板。
4、慢病毒感染
(1)抗人CD3/CD28抗体偶联磁珠刺激T细胞24小时后，半量弃去培养基。分组为：Untreated、CAR-T组。从-80℃取出病毒，放置于冰上缓慢融化，按照MOI＝5加入慢病毒液，加入促转染试剂Polybrene，终浓度为5μg/mL；
(2)使用水平离心机离心，将离心机设置为升4降1、1500g，2h，放入培养箱过夜，第2日将每孔补充500μL对应的完全培养基；
(3)感染72h后，收集细胞400g离心5min。弃去上清，使用完全培养基重悬后，放置于磁力架上去除磁珠。继续培养至第10天，进行阳性率检测。
5、实验结果
Ctrl-CAR和CD19-CAR的结构示意图见图3，CAR-T细胞的制备流程图见图4，流式检测CAR表达阳性率的结果图见图5，结果显示，CD19-CAR-T细胞具有较高的CAR表达阳性率。
实施例4 ELISA实验检测CD19-CAR-T细胞的细胞因子释放能力
1、实验方法
分别取1×104个Ctrl-T或CD19-CAR-T细胞分别与人白血病细胞Raji或Nalm-6细胞以2:1的比例在U形底96孔板内共孵育24小时，离心取上清，用ELISA方法检测靶细胞刺激后CAR-T细胞释放IFN-γ、Granzyme B的量。
2、实验结果
结果显示，CD19-CAR-T组与人白血病细胞Raji或Nalm-6细胞共孵育后，其细胞上清中细胞因子IFN-γ、Granzyme B的释放量显著优于Ctrl-T组，即本发明构建得到的CD19-CAR-T细胞上清中分泌了较高的细胞因子IFN-γ、Granzyme B(见图6)。
实施例5流式检测CD19-CAR-T对人白血病细胞的杀伤效果
1、实验方法
将2×105个靶细胞(人白血病细胞Raji或Nalm-6)与4×105个Ctrl-T细胞或CD19-CAR-T细胞以效靶比1:2的比例进行混合，培养在24孔板中，放入培养箱中共孵育48h后，将细胞离心取出进行染色，利用流式细胞仪检测CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效果。CD45+CD3+为CAR-T细胞，CD45-CD3-为靶细胞，并进行统计分析。
2、实验结果
结果显示，本发明构建得到的CD19-CAR-T细胞治疗组对人白血病细胞Raji或Nalm-6均具有较好的杀伤效果，且显著优于Ctrl-T细胞对照组，也即含有CAR基因CD19-CAR-T细胞对表达CD19的细胞具有特异性的杀伤活性，与对照组相比差异显著，说明了本发明构建得到的CD19-CAR-T细胞对CD19阳性细胞具有更强的杀伤作用(见图7)，进一步表明了本发明构建得到的CD19-CAR-T细胞能够用于B淋巴细胞恶性肿瘤的有效治疗中。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (10)

1.一种抗CD19的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包含重链可变区HCVR、轻链可变区LCVR；
优选地，所述HCVR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3；
优选地，所述LCVR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；
更优选地，所述HCDR1含有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的氨基酸序列；
更优选地，所述HCDR2含有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列；
更优选地，所述HCDR3含有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的氨基酸序列；
更优选地，所述LCDR1含有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4具有至少90％同一性的氨基酸序列；
更优选地，所述LCDR2含有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的氨基酸序列；
更优选地，所述LCDR3含有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6具有至少90％同一性的氨基酸序列；
最优选地，所述HCVR的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；
最优选地，所述LCVR的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；
最优选地，所述单克隆抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
2.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含有效量的权利要求1所述的单克隆抗体；
优选地，所述药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂；
优选地，所述药物组合物用于治疗CD19相关的血液系统恶性肿瘤；
更优选地，所述CD19相关的血液系统恶性肿瘤包括多发性骨髓瘤、急性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、间变大细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤。
3.一种抗体-药物偶联物，其特征在于，所述抗体-药物偶联物包含：
(1)权利要求1所述的单克隆抗体；
(2)与所述单克隆抗体偶联的小分子物质；
优选地，所述小分子物质包括细胞毒素、治疗剂；
更优选地，所述细胞毒素包括MMAE、DM1、PE-T20、PE-T20-KDEL、PE4E、PE40、PE38、PE25、PE38QQR、PE35、PE38KDEL、PE38DKEL、PE38RDEL、PE38KNEL、TLR8激动剂、多柔比星、甲氨蝶呤、丝裂霉素、氟尿嘧啶、长春碱、卡奇霉素、多卡霉素、吡咯并苯并二氮卓、喜树碱类似物、伊利替康；
更优选地，所述治疗剂包括抗代谢物、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂、染色质功能抑制剂、抗血管生成剂、抗雌激素、抗雄激素、免疫调节剂。
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括编码权利要求1所述单克隆抗体的HCVR的核苷酸序列、编码权利要求1所述单克隆抗体的LCVR的核苷酸序列或编码权利要求1所述单克隆抗体的核苷酸序列；
优选地，所述编码HCVR的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
优选地，所述编码LCVR的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
优选地，所述编码单克隆抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求4所述的核酸分子；
优选地，所述载体包括质粒载体、病毒来源的载体、噬菌体载体；
更优选地，所述病毒来源的载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体。
6.一种经工程改造的宿主细胞，其特征在于，所述经工程改造的宿主细胞包含权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的表达载体；
优选地，所述宿主细胞包括原核细胞、真核细胞；
更优选地，所述原核细胞包括细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体；
最优选地，所述细菌包括大肠杆菌、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、假单胞菌属、链霉菌、葡萄球菌；
更优选地，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞。
7.一种宿主细胞群体，其特征在于，所述宿主细胞群体包含权利要求6所述的经工程改造的宿主细胞；
优选地，所述宿主细胞群体还包含不包含权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的表达载体的宿主细胞；
更优选地，所述宿主细胞包括原核细胞、真核细胞；
最优选地，所述原核细胞包括细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体；
最优选地，所述细菌包括大肠杆菌、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、假单胞菌属、链霉菌、葡萄球菌；
最优选地，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞。
8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的单克隆抗体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的表达载体、权利要求6所述的经工程改造的宿主细胞、权利要求7所述的宿主细胞群体。
9.如下任一种方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)一种生产权利要求1所述单克隆抗体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：培养权利要求6所述的经工程改造的宿主细胞或权利要求7所述的宿主细胞群体，从培养物中分离出权利要求1所述的单克隆抗体；
(2)一种非诊断和非治疗目的地检测待测样品中CD19的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将待测样品与权利要求1所述的单克隆抗体接触，检测所述单克隆抗体与CD19的复合物的形成；
优选地，所述单克隆抗体是被可用于检测的标记物标记的单克隆抗体；
更优选地，所述可用于检测的标记物包括荧光色素、亲和素、顺磁原子、放射性同位素；
最优选地，所述荧光色素为荧光素、罗丹明、Texas红、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、多甲藻黄素-叶绿素蛋白；
最优选地，所述亲和素为生物素、卵白亲和素、链亲和素、卵黄亲和素、类亲和素；
最优选地，所述放射性同位素为放射性碘、放射性铯、放射性铱、放射性钴；
(3)一种制备权利要求6所述经工程改造的宿主细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求5所述的表达载体引入到宿主细胞中；
优选地，所述引入的方法包括物理方法、化学方法、生物方法；
更优选地，所述物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔；
更优选地，所述化学方法包括胶体分散系统、基于脂质的系统；
最优选地，所述胶体分散系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；
最优选地，所述基于脂质的系统包括水包油乳剂、胶束、混合胶束、脂质体；
更优选地，所述生物方法包括DNA载体、RNA载体、慢病毒载体、痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体；
(4)一种体外特异性地抑制CD19活性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求4所述的核酸分子导入到生物体细胞中，通过表达权利要求1所述的单克隆抗体抑制CD19的活性。
10.如下任一方面的应用，其特征在于，所述应用包括：
(1)权利要求1所述的单克隆抗体、权利要求2所述的药物组合物、权利要求3所述的抗体-药物偶联物、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的表达载体、权利要求6所述的经工程改造的宿主细胞、权利要求7所述的宿主细胞群体在制备用于预防和/或治疗CD19相关的血液系统恶性肿瘤的药物中的应用；
(2)权利要求1所述的单克隆抗体、权利要求2所述的药物组合物、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的表达载体、权利要求6所述的经工程改造的宿主细胞、权利要求7所述的宿主细胞群体在制备用于预防和/或治疗CD19相关的血液系统恶性肿瘤的抗体-药物偶联物中的应用；
(3)权利要求1所述的单克隆抗体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的表达载体、权利要求6所述的经工程改造的宿主细胞、权利要求7所述的宿主细胞群体、权利要求8所述的试剂盒在检测CD19蛋白或其抗原片段中的应用；
(4)权利要求1所述的单克隆抗体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的表达载体、权利要求6所述的经工程改造的宿主细胞、权利要求7所述的宿主细胞群体、权利要求8所述的试剂盒在制备用于检测CD19蛋白或其抗原片段的产品中的应用；
(5)权利要求1所述的单克隆抗体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的表达载体、权利要求6所述的经工程改造的宿主细胞、权利要求7所述的宿主细胞群体、权利要求8所述的试剂盒在制备用于诊断CD19相关的血液系统恶性肿瘤的产品中的应用；
(6)权利要求1所述的单克隆抗体在制备核酸分子、表达载体、经工程改造的宿主细胞、宿主细胞群体中的应用；
(7)权利要求4所述的核酸分子在制备表达载体、经工程改造的宿主细胞、宿主细胞群体中的应用；
(8)权利要求5所述的表达载体在制备经工程改造的宿主细胞、宿主细胞群体中的应用；
(9)权利要求6所述的经工程改造的宿主细胞在制备宿主细胞群体中的应用；
优选地，所述CD19相关的血液系统恶性肿瘤包括多发性骨髓瘤、急性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、间变大细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤。
CN202211073657.1A 2022-09-02 2022-09-02 一种特异性结合cd19的单克隆抗体及其应用 Withdrawn CN115960228A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211073657.1A CN115960228A (zh) 2022-09-02 2022-09-02 一种特异性结合cd19的单克隆抗体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211073657.1A CN115960228A (zh) 2022-09-02 2022-09-02 一种特异性结合cd19的单克隆抗体及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115960228A true CN115960228A (zh) 2023-04-14

Family

ID=87362393

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211073657.1A Withdrawn CN115960228A (zh) 2022-09-02 2022-09-02 一种特异性结合cd19的单克隆抗体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115960228A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20250051451A1 (en) Anti-b7-h3 monoclonal antibody and use thereof in cell therapy
JP3600617B2 (ja) ヒト上皮細胞成長因子レセプターに特異的なモノクローナル抗体及びそれを用いた治療剤
ES2645026T3 (es) Anticuerpos de NKG2D para su uso en el tratamiento de artritis reumatoide o enfermedad de Crohn
RU2177805C2 (ru) Средство, применяемое при лечении опухолей лимфатической ткани
UA124417C2 (uk) БІСПЕЦИФІЧНИЙ КОНСТРУКТ АНТИТІЛА, ЩО ЗВ&#39;ЯЗУЄ EGFRvIII І CD3
UA125717C2 (uk) Конструкція антитіла до flt3 і cd3
CN110396129A (zh) 人源化cd19抗原结合单链抗体及其嵌合抗原受体、免疫细胞和应用
LV11624B (en) Immuno-stimulatory monoclonal antibodies
JP2008532488A (ja) オンコスタチンｍレセプターに対する抗体
TW200902038A (en) Kits of parts for treating a malignant pathology, an auto-immune disease or an infectious disease
WO2012176765A1 (ja) 抗ヒトｐ－カドへリン（ｃｄｈ３）遺伝子組み換え抗体
CN116082519A (zh) 一种靶向bcma的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
WO2021052307A1 (zh) 一种抗b7-h3抗体及其应用
CN110475566A (zh) 工程细胞和使用方法
US12338284B2 (en) Binder against programmed death-ligand and application thereof
CN108997497A (zh) 特异结合人质膜膜泡关联蛋白pv-1的单克隆抗体及其制备方法与应用
CN113621077B (zh) 一种tim-3/cd28融合蛋白及所述融合蛋白修饰的car-t细胞
KR20090122911A (ko) Ｂ-세포 만성 림프구성 백혈병의 진단 및 치료에 유용한 종양 세포에서 세포사멸을 유도할 수 있는 약학 조성물
TW201206468A (en) Treating oral cancer with anti-IL-20 antibody
EP0862919A1 (en) Remedy for hepatitides
ES2269266T3 (es) Anticuerpos monoclonales que reconocen los receptores de flk-2 y el aislamiento de poblaciones de celulas madre hematopoyeticas primitivas.
CN116333150B (zh) 一种eno1抗体及其在治疗肿瘤中的应用
CN115960228A (zh) 一种特异性结合cd19的单克隆抗体及其应用
CN116063569B (zh) Epha2嵌合抗原受体及其用途
WO2016073647A2 (en) COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING HIF-1alpha OVER-EXPRESSING CANCERS

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20230414