CN115948570A - 一种与猪初生重相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种与猪初生重相关的SNP分子标记及其应用，属于分子生物技术和分子标记技术领域，SNP分子标记与位于猪2号染色体上的SLC22A11基因多态位点高度连锁，SNP位点对应国际猪基因组11.1版本参考序列2号染色体上第7619832位C>CCT突变，该位点为GWAS结果中最显著SNP位点，与SLC22A11基因内的31个SNP位点存在强连锁关系，且这31个SNP的P值均达到显著水平，确定SLC22A11为影响仔猪初生重的潜在主效基因。本发明通过优选该SNP的优势等位基因，能够逐代增加优势等位基因频率，提高种猪初生重，提高育种收益，加快猪繁殖性状的育种进展从而有效提高种猪育种的经济效益。
Description
技术领域
本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，涉及一种位于猪2号染色体上的
SLC22A11基因多态位点及其在猪初生重性状遗传改良中的应用，具体涉及一种与猪初生重相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
仔猪的初生重（Birth Weight）是猪的重要经济性状，对于仔猪的断奶重和育肥猪的出栏重都有着重要的影响，还影响着保育猪和育肥猪的健康水平和成活率，这些问题继而严重影响了生猪养殖的经济效益。值得注意的是，在育种中过分追求产仔数等性状的提高已经带来了负面效应。例如，2002年，Milligan等人发现，盲目选择增加产仔数量，会导致每窝产出更多的低出生重仔猪（Livestock Production Science, 2002, 76(1-2):181-191）。究其原因，就是许多研究人员为保证“数量”上的增多而忽视了对仔猪“质量”即初生重性状的关注。早在2008年，研究人员就初生体重降低现象进行了探究。仔猪初生重与其死亡率的增加以及仔猪断奶体重和屠宰体重或年龄的高变动性有关。当母猪产仔数从少于10头增加到15头以上时，体重不足1公斤的初生小猪数量也随之增加，且随着胎次的增加，这种现象愈发严重（Animal, 2008, 2(12): 1842-1849）。除此之外，初生重对于自身的其他重要繁殖性状、生长性状也有着重要的影响。2005年，Gondret等研究猪初生重对猪生长发育的影响时发现，低初生重的猪相较于高初生重的猪，更晚达到屠宰日龄，晚12天日龄，此外，料肉比也更低（Livestock Production Science, 2005, 93(2): 137-146）。2006年，Gondret等进一步研究猪初生重对猪肉质性状的影响时发现，低初生重的猪相较于高初生重的猪胴体瘦肉率更低，脂肪更高，肌纤维数量更少（Journalof animal science, 2006,84(1): 93-103.）。2015年，Ruusunen等在研究猪初生重对猪的影响时发现，低初生重的猪相较于高初生重的猪心脏重量更小，平均肌纤维横截面积更高（Agricultural and FoodScience, 2015, 16(3):259-266.）。这些研究结果均表明，仔猪出生重直接与其存活率、农场出栏率有着密切的正相关性。因此，采取必要措施改善低出生重不仅有利于仔猪本身重要生长性状的发育，还能为养殖业带来可观的经济效益。
目前，随着快速发展的高通量组学测序技术如全基因组测序、高密度芯片等，结合全基因组关联分析（Genome-wide Association Study, GWAS）等研究可鉴别到影响猪初生重的重要候选基因和关键分子标记，将有助于揭示影响猪重要经济性状的遗传机制。随着基因组学研究以及基因芯片技术的发展，人们已通过GWAS方法发现并鉴定了大量与复杂性状相关联的遗传变异。随着高密度SNP阵列的发展和高密度SNP分析的成本的降低，GWAS已广泛应用于人类和家畜的重要表型发生的探索中，目前，GWAS已成为筛选并鉴定家畜重要经济性状主效基因的重要方法。
由于目前商业化分子遗传标记芯片密度较低，重测序成本过高而减缓了精细定位锚定数量性状基因座（Quantitative Trait Locus，QTL）区间以及基因的步伐，但由此基因型填充技术也应运而生。基因型填充即利用参考群体的信息构建单倍型，对目标群体中缺失的基因型进行填充。基因型填充方法能够将中低密度的芯片填充至高密度甚至是测序数据，在节约育种成本的基础上提高育种准确性。综上，本专利利用该方法将50k芯片填充获得高密度位点后进行GWAS分析，获得重要QTL范围。最终，通过将基因和分子标记应用到标记辅助选择和基因组选择育种技术中，将极大的加快猪初生重的遗传研究进展，并对母猪的繁殖能力带来极大提升，从而提高养猪业的经济效益。
发明内容
为了解决现有技术中的不足，本发明的目的一在于提供一种与猪初生重相关的主效基因，目的二在于提供所述的主效基因在种猪初生重性状遗传改良中的应用，目的三在于一种与猪初生重相关的SNP分子标记，目的四在于提供所述的SNP分子标记在制备鉴定猪初生重性状的产品以及猪遗传育种中的应用，目的五在于一种鉴定上述SNP分子标记的引物对，目的六在于提供一种包含上述引物对的试剂盒，目的六在于提供上述引物对或试剂盒在制备鉴定猪初生重的产品、猪分子标记辅助育种以及制备提高猪初生重的产品中的应用，目的七在于提供一种鉴定与猪初生重相关的SNP分子标记基因型的方法，目的八在于提供一种猪的遗传改良的方法。
为实现上述目的，本发明采用的具体方案为：
一种与猪初生重相关的主效基因，所述主效基因为下述序列a）～b）之一：
a）位于猪2号染色体上的
SLC22A11基因，其对应于国际猪基因组11.1版本的参考序列第2号染色体上第7,590,391bp至 7,603,116bp位核苷酸；
b）在a）所示的
SLC22A11基因的DNA序列与其下游16,716bp长度组成的序列，其对应于国际猪基因组11.1版本的参考序列第2号染色体上第7,590,391bp至 7,619,832bp位核苷酸。
上述的主效基因在种猪初生重性状遗传改良中的应用。
一种与猪初生重相关的SNP分子标记，其特征在于：SNP位点对应于国际猪基因组11.1版本参考序列2号染色体上第7619832位C>CCT突变；所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，SNP位点为SEQ ID NO:1中第190位的C190-CCT190的核苷酸突变，导致猪初生重的差异。
所述的SNP分子标记在制备鉴定猪初生重性状的产品以及猪遗传育种中的应用。
所述的猪优选为杜洛克猪及其合成系。
一种鉴定上述SNP分子标记的引物对，所述引物对包含引物P001-F和引物P002-R，核苷酸序列分别如下所示：
P001-F：5’- TGCCCTCTGTTTCTACATCTGCTTG-3’，
P002-R：5’-CTCATCCTCCTGGTCCTCATCCTG-3’。
一种试剂盒，包含上述的引物对。
上述的引物对或试剂盒在如下任意一种中的应用：
a）制备鉴定猪初生重的产品；
b）猪分子标记辅助育种；
c）制备提高猪初生重的产品；
一种鉴定与猪初生重相关的SNP分子标记基因型的方法，包含如下步骤：
（1）提取待测猪的基因组DNA ；
（2）采用所述的引物对对步骤（1）获得的基因组D NA进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物；
（3）对步骤（2）获得的PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；
（4）基于所述测序结果，确定待测猪的位于猪2号染色体上与
SLC22A11基因多态位点高度连锁且影响猪初生重的SNP分子标记的基因型；
所述的猪为杜洛克猪及其合成系。
一种猪的遗传改良的方法，包含如下步骤：
确定种猪核心群中的种猪的上述的与猪初生重相关的SNP分子标记，并根据所述SNP分子标记做出相应的选择：在所述种猪核心群中选择国际猪参考基因组11.1版本2号染色体上第7,619,832位点为CCT基因型的种猪个体，淘汰在第7619832位点为C基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因CCT的频率，从而提高后代猪的初生重；
所述的猪为杜洛克猪及其合成系。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
（1）本发明利用杜洛克种猪，采用基因型填充技术获得猪全基因组序列数据，通过全基因组关联分析、连锁不平衡分析等方法，在猪2号染色体上鉴别到一个影响猪初生重的主效QTL。GWAS结果中最显著SNP位点（
P= 3.86e-08）与SLC22A11基因内的31个SNP位点存在强连锁关系（
r 2>0.96），且这31个SNP的
P值均达到显著水平（
P<4.04e-07），确定
SLC22A11基因为潜在的主效基因。为验证其对初生重性状的影响效应，通过比较最显著SNP位点的不同基因型的初生重性状，发现其有利等位基因型频率为18.87%。最终，通过优选该SNP的优势等位基因，建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于提高种猪初生重的遗传改良中，能够逐代增加优势等位基因频率，从而提高母猪群体的繁殖能力，加快母猪相关繁殖性状的改良进展从而有效提高种猪育种的经济效益。
（2）本发明提供一种简便的利用
SLC22A11基因对初生重性状进行遗传改良的方法，因
SLC22A11基因多态位点与所述SEQ ID N0:1中第190位核苷酸高度连锁，因此本发明提供该分子标记的引物对，通过该引物对，可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，快速准确地对种猪高初生重进行提高性选育改良，加快育种进展。
附图说明
图1是杜洛克猪在2号染色体上关于初生重性状的50K芯片填充后的全基因组关联分析曼哈顿图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-log
P值。
具体实施方式
本发明深入研究可能影响仔猪初生重的主效基因，本发明所述的猪优选为杜洛克猪群体，通过基因型填充技术和GWAS技术等，在猪2号染色体上鉴别到与猪初生重相关的主效QTL。随后，利用连锁不平衡分析等，发现GWAS结果中最显著SNP位点（
P值为3.86e-08）与
SLC22A11基因内的31个SNP位点存在强连锁关系（
r 2>0.96），且这31个SNP的
P值均达到显著水平（
P<4.04e-07），确定
SLC22A11基因为潜在的主效基因。另外，通过比较最显著SNP位点的不同基因型的初生重性状，发现其有利等位基因型频率为18.87%，采取保留有利基因型个体，淘汰不利基因型个体的策略，将显著提高仔猪的初生重性状，加快猪初生重的遗传研究进展。
本发明提供一种位于猪2号染色体上的
SLC22A11基因的核苷酸序列及其核苷酸序列与其上游16,716bp长度的序列，它为下述序列a）～b）之一：
a）DNA序列（dna:chromosome chromosome:Sscrofa11.1:2:7590391:7603116）：
SLC22A11基因的DNA序列，其对应于国际猪基因组11.1版本的参考序列第2号染色体上第7,590,391bp至 7,603,116bp位核苷酸；
b）DNA序列（dna:chromosome chromosome:Sscrofa11.1:2:7590391:7619832）：
SLC22A11基因（Reverse Strand）的DNA序列与其下游16,716bp长度组成的序列，其对应于国际猪基因组11.1版本的参考序列第2号染色体上第7,590,391bp至 7,619,832bp位核苷酸。
使用上述序列a）或序列b），对待测的猪基因组DNA进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测；
使用序列表SEQ ID NO:1核苷酸序列，对待测猪的DNA进行PCR扩增，然后对扩增产物进行单核苷酸多态性检测，其SNP位点对应于国际猪基因组11.1版本参考序列2号染色体上第7,619,832位C>CCT突变。
位于猪2号染色体上与初生重相关的SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中序列中的M是C或CCT，其与
SLC22A11基因多态位点高度连锁，导致猪初生重的差异；
所述的位于猪2号染色体上与初生重相关的SNP分子标记，其SNP位点为SEQ IDNO:1序列标注位置为190位的C190-CCT190的核苷酸突变；
所述的位于猪2号染色体上与初生重相关的SNP分子标记在制备鉴定猪初生重相性状的产品和猪遗传育种中的应用；
利用上述位于猪2号染色体上与与
SLC22A11基因多态位点高度连锁且影响猪初生重的SNP分子标记筛选高初生重的猪品种的方法，包含如下步骤：
检测上述位于猪2号染色体上与
SLC22A11基因多态位点高度连锁且影响猪初生重的SNP分子标记，所述分子标记的5’端第190位单核苷酸是C还是CCT，淘汰C保留CCT；
所述的猪优选为杜洛克猪及其合成系；
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
（1）实验动物
本发明所使用的实验猪群群体为温氏食品集团股份有限公司种猪分公司的纯种杜洛克猪2857头，为种猪分公司核心群。
本实验共选取该资源群体中杜洛克猪，猪群自由采食、饮水，整个饲喂方式、饲养条件等始终保持一致，为常规方法。
（2）样本采集
收集上述仔猪断尾及耳组织浸泡于体积分数为75％的乙醇溶液中，置于-20℃冰箱保存备用。
（3）猪全基因组50K SNP判型
对上述资源群体2857头杜洛克猪中的每个个体采集耳组织或断尾组织，用标准苯酚-氯仿法提取全基因组DNA，经Nanodrop2000/2000C核酸蛋白检测仪准确测定每一份样品的DNA的浓度和OD比值（OD260/280、OD260/230）。经NanoDrop2000/2000C核酸蛋白检测仪检测合格的DNA样品，按照检测的浓度将DNA稀释至50ng/μL左右。再将6μL已提取好的待测DNA样品与2μL Loading Buffer 混合，上样到质量体积比为1%的琼脂糖凝胶中，150V电压下电泳25min，在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照，观察DNA的完整性。
DNA样品在Illumina Beadstration平台上根据公司标准流程进行猪全基因组50KSNP芯片（Illumina，美国）基因型判定。利用plink对所有样本50K芯片扫描分型数据进行质量控制，剔除检出个体率低于90%、家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代-温伯格平衡显著性水平高于10-6的SNP，经基因型填充后最终得到12694777个SNP的有效基因型数据。
（4）全基因组关联（GWAS）分析
本发明利用GCTA软件采用线性混合模型单点回归分析进行GWAS 分析，GWAS模型：y=a+bx+g+e，其中y为初生重，a为初生重的平均值，b为加性效应，包括性别，场年效应，窝产仔数和前五个主成分，g为随机效应，e为随机残差。采用Bonferrini法确定SNP与初生重性状关联程度的显著性阈值，基因组水平显著阈值为0.05除以有效SNP位点数量，即基因组显著水平阈值为3.94e-09，即0.05/ 12,694,778（有效SNP数量）；染色体水平显著阈值为1除以有效SNP位点数量，即染色体显著水平阈值为7.88e-08，即1/ 12,694,778（有效SNP数量）。
GWAS分析结果如图1所示。从图1可知，在杜洛克猪2号染色体上存在显著影响初生重的位点，最显著关联的SNP为SEQ ID NO:1中第190位核苷酸g.190C>CCT（
P值为3.86e-08）。
（5）连锁不平衡分析
申请人利用PLINK软件计算大白猪群体中不同标记位点之间的连锁不平衡程度（
r 2 ）。计算了GWAS最高点与SLC22A11基因内的SNP标记位点的连锁不平衡程度。本发明的GWAS最高点（
P<3.86e-08）与
SLC22A11基因内的SNP位点存在高度连锁（
r 2>0.96），且SLC22A11基因内有8个SNP位点（
P值均为 2.02e-07）为该基因内最显著位点。
（6）与
SLC22A11基因多态位点高度连锁的GWAS最高点对应的不同基因型与初生重表型的关联性分析
根据表1可知，分子标记的SNP位点g.190C>CCT（SEQ ID NO:1中第190位核苷酸，即对应于国际猪基因组11.1版本参考序列2号染色体上第7619832位C>CCT突变）与初生重性状极显著相关（
P<0.001），说明此分子标记显著影响猪的初生重，可以通过对猪的此SNP位点的选择，从而提高该群体的初生重，进而加快育种进程。
根据表1还可知，基因型CCCT的个体比CC型个体的初生重高，有利等位基因型CCT型的等位基因频率为18.87%，C的等位基因频率为81.13%，体现了很大的育种价值。因此，在育种中逐步保留CCCT基因型的种猪，以逐代提高该位点的等位基因CCT的频率，可以显著提高仔猪的初生重，为养殖企业带来更多的经济效益。
表1 分子标记的rs7619832 SNP位点g.190 C>CCT与初生重的相关性分析。
实施例2目的DNA序列扩增及测序
（1）引物设计
通过Ensembl网站（http://asia.ensembl.org/index.html）下载猪的2号染色体上SEQ ID NO:1的DNA序列，并利用引物设计软件OLIGO7设计引物。设计的引物的DNA序列如下所示：
P001-F：5’- TGCCCTCTGTTTCTACATCTGCTTG-3’，
P002-R：5’-CTCATCCTCCTGGTCCTCATCCTG-3’；
（2）PCR扩增
10μL的反应体系中加入DNA模板1μL，双蒸水3.4μL，2×Tag PCR StanMix withLoading Dye 5μL，引物P001-F和P002-R各0.3μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸45s，35个循环，最后72℃延伸5min。
（3）DNA序列测定
DNA序列测序鉴定：在深圳华大基因科技有限公司进行，基因片段测正反两个反应。将所测得的序列与NCBI基因组序列对比，得出对应SNP位点的突变。测序结果如下所示：
TGCCCTCTGTTTCTACATCTGCTTG TTGACTGCCGTCCCTCGTCCTCTGCTGGAGTGGAGGCTCTGTGAGGCAGGGCTTGGGGGGGCGGGGGGGGACACCCTCAGGAGTTGCACAGCAGGAGTTCAGGAAATGTTTGTTGAATGAATGAATGAACACAAATGAGTGGGTAAGGTGTTCACCCCAAGTGCTM(C>CCT)TGCCTGCTCC CAGGATGAGGAC CAGGAGGATGAG。
注：序列表中标注的M为突变位点，用标有下划线+加粗显示（括号中为突变碱基，为等位基因突变），在该序列的首尾下划线+斜体显示为设计引物序列位置。
实施例3分子标记的SNP位点g.190C>CCT效应分析
根据表1可知，SNP位点g.190 CCT优势等位基因型频率仅为18.87%，并且目前猪场尚未有CCTCCT纯合基因型猪，因此通过分子辅助育种手段培育出CCTCCT纯合基因型猪将大幅度提升仔猪初生重性状。研究表明，初生重表型会影响仔猪断奶存活率、断奶重和出栏重等，对猪只本身乃至猪场效益的影响是连续而深远的。若将g.190 CCT优势等位基因频率增至90%以上，将对于养殖上万头母猪群规模化猪场而言，其增加的经济效益极为可观。因此，通过分子标记辅助选择或基因组选择，逐步对群体内基因型为CCCT的猪进行选种保留，则能显著提高等位基因CCT的等位基因频率，提高仔猪的初生重，加快猪的改良进展从而有效提高种猪育种的经济效益。
本发明通过对SEQ ID NO:1序列中的第190位碱基突变位点进行检测，初步进行其基因型与仔猪的初生重之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择和基因组选择提供了一个新的分子标记。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种与猪初生重相关的主效基因，其特征在于：所述主效基因为下述序列a）～b）之一：
a）位于猪2号染色体上的SLC22A11基因，其对应于国际猪基因组11.1版本的参考序列第2号染色体上第7,590,391bp至 7,603,116bp位核苷酸；
b）在a）所示的SLC22A11基因的DNA序列与其下游16,716bp长度组成的序列，其对应于国际猪基因组11.1版本的参考序列第2号染色体上第7,590,391bp至 7,619,832bp位核苷酸。
2.如权利要求1所述的主效基因在种猪初生重性状遗传改良中的应用。
3.一种与猪初生重相关的SNP分子标记，其特征在于：SNP位点对应于国际猪基因组11.1版本参考序列2号染色体上第7619832位C>CCT突变；所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，SNP位点为SEQ ID NO:1中第190位的C190-CCT190的核苷酸突变，导致猪初生重的差异。
4.如权利要求3所述的SNP分子标记在制备鉴定猪初生重性状的产品以及猪遗传育种中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的猪为杜洛克猪及其合成系。
6.一种鉴定权利要求3所述SNP分子标记的引物对，其特征在于：所述引物对包含引物P001-F和引物P002-R，核苷酸序列分别如下所示：
P001-F：5’- TGCCCTCTGTTTCTACATCTGCTTG-3’，
P002-R：5’-CTCATCCTCCTGGTCCTCATCCTG-3’。
7.一种试剂盒，包含权利要求6所述的引物对。
8.权利要求6所述的引物对或权利要求7所述的试剂盒在如下任意一种中的应用：
a）制备鉴定猪初生重的产品；
b）猪分子标记辅助育种；
c）制备提高猪初生重的产品。
9.一种鉴定与猪初生重相关的SNP分子标记基因型的方法，其特征在于：包含如下步骤：
（1）提取待测猪的基因组DNA ；
（2）采用权利要求6所述的引物对对步骤（1）获得的基因组D NA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
（3）对步骤（2）获得的PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；
（4）基于所述测序结果，确定待测猪的位于猪2号染色体上与SLC22A11基因多态位点高度连锁且影响猪初生重的SNP分子标记的基因型；
所述的猪为杜洛克猪及其合成系。
10.一种猪的遗传改良的方法，其特征在于：包含如下步骤：
确定种猪核心群中的种猪的如SEQ ID NO:1所示的与猪初生重相关的SNP分子标记，并根据所述SNP分子标记做出相应的选择：在所述种猪核心群中选择国际猪参考基因组11.1版本2号染色体上第7,619,832位点为CCT基因型的种猪个体，淘汰在第7619832位点为C基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因CCT的频率，从而提高后代猪的初生重；
所述的猪为杜洛克猪及其合成系。
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| CN110541038A (zh) * | 2019-08-23 | 2019-12-06 | 华南农业大学 | 一种位于猪1号染色体上与猪日增重相关的snp分子标记及应用 |
| CN114085914A (zh) * | 2021-10-27 | 2022-02-25 | 华南农业大学 | 一种位于猪9号染色体上与健仔数和健仔率相关的snp分子标记及应用 |
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2022
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