CN115944784A - 一种细胞化纤维支架及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细胞化纤维支架及其制备方法和应用；该细胞化纤维支架包括纤维支架和支持细胞，支持细胞粘附和/或包绕在纤维支架表面，所述纤维支架为脱丝胶后的丝素纤维，所述支持细胞为由皮肤源性前体细胞分化得到的施万细胞（SKP‑SCs）。本发明利用SKP‑SCs制成含SKP‑SCs的纤维支架，并将其移植到宿主皮下预血管化，然后与神经导管进行组装，从而得以更加快速地构建预血管化组织工程神经同时仍含有大量存活支持细胞；之后将其用于移植修复大鼠坐骨神经长距离缺损，可实现血管及支持细胞的双重再生促进因素的叠加，进而提高神经损伤修复效果。

Description

一种细胞化纤维支架及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种细胞化纤维支架及其制备方法和应用。

背景技术

组织工程组织器官，不单单要修复形态，更重要是实现其功能化即生理性能重建；其中新的血管网络的快速重建是组织工程组织器官体内存活的前提，也是生理性能重建的基础。组织工程临床应用的瓶颈问题，即组织工程组织器官的血管新生。氧气最大的自由弥散距离约200µm，一旦超过这个距离就需要形成新的血管提供氧气以维持组织器官的生存。所以，组织工程组织器官植入体内后如何迅速地与周围组织建立起有效的血液循环，对于其自身存活和生理性能重建至关重要。

目前，组织工程神经的血管化研究集中在体内修复过程中如何增加新生血管数量的探索上，即添加某种生长因子或支持细胞用以提升血管新生从而促进神经再生。比如组织工程神经中直接加入促血管生成的生长因子，如VEGF和bFGF等，或是在组织工程神经的构建过程中加入种子细胞，如血管内皮细胞，或植入干细胞或干细胞分化的血管内皮细胞。除此之外，还可以在生物材料支架方面进行物理或化学的修饰，进一步提高组织工程神经修复神经损伤过程中的血管生成。但是，不含血管的人工神经移植物在修复神经再生过程中，尤其再生早期的神经再生局部微环境处于缺氧状态，特别是对于长距离周围神经缺损，这极大地迟缓和制约了神经再生的速度及效果。

组织工程神经的预血管化是一个更有前景的研究方向和构建策略，可以进一步提升临床周围神经损伤修复效果。目前，在体外模拟复杂天然、成熟血管系统还面临巨大的挑战。最常见的利用血管内皮细胞（或干细胞诱导分化来源的内皮细胞）体外构建血管网络后再体内移植与宿主的血管网发生吻合的缺点在于要获得成熟、稳定、长期的毛细血管网；即便是可以利用多种细胞体外构建血管网络、但涉及的过程复杂，操作性、可控性较差。较之体外，通过皮下或肌间隙等体内植入的方式实现组织工程神经的预血管化则更加简单和可行，特别是体内获取的成熟和丰富的血管网络能更快地与机体血管吻合和再通以缓解局部的缺氧状况。现有的利用一两种生长因子体内构建预血管化组织工程神经的方法，均存在构建周期较长的不足，至少需要2周的植入时间，增加了成本且限制了其临床应用的范围。因此，找寻一种更快速、更充分及更成熟的预血管化组织工程神经制备方法具有十分重要的现实和临床意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种细胞化纤维支架及其制备方法和应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种细胞化纤维支架，包括纤维支架和支持细胞，所述支持细胞粘附和/或包绕在纤维支架表面；

所述支持细胞为由皮肤源性前体细胞分化得到的施万细胞；

所述纤维支架由生物可降解材料制成，所述生物可降解材料为丝素蛋白、壳聚糖、胶原、脱细胞基质、聚乳酸或聚羟基乙酸中的一种或几种。

上述细胞化纤维支架的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，将支持细胞经体外培养得到支持细胞悬液；

步骤2，将步骤1的支持细胞悬液与纤维支架体外共培养，得到所述细胞化纤维支架。

上述细胞化纤维支架在制备预血管化的组织工程神经中的应用。

一种预血管化的组织工程神经，由上述细胞化纤维支架制得。

上述预血管化的组织工程神经在制备周围神经缺损再生产品中的应用。

一种周围神经缺损再生产品，包括神经导管和上述预血管化的组织工程神经，所述预血管化的组织工程神经置于神经导管内。

进一步地，所述神经导管由天然或合成生物可降解材料制成，所述生物可降解材料为丝素蛋白、壳聚糖、胶原、脱细胞基质、聚乳酸或聚羟基乙酸中的一种或几种。

本发明所述的神经导管为本领域技术人员常用的组织工程神经移植物，优选表面多孔的壳聚糖导管，如 50-90%、孔径 50-300 mm 的具有多孔结构、抗拉强度高的神经导管，管状本体内径为 0.5-8 mm、壁厚 0.1-3 mm，可参照专利申请CN102343114A组织工程神经移植物及其用途或专利申请CN103041450A用于修复周围神经损伤的细胞基质修饰的组织工程神经移植物及其制备方法中所述的方法制得；或者优选纳米纤维蚕丝丝素蛋白导管，可参照专利申请CN101664346A静电纺丝制备的人工神经移植物及其制备方法和专用装置或专利申请CN103041450A用于修复周围神经损伤的细胞基质修饰的组织工程神经移植物及其制备方法所述的方法制得。

本发明所述的丝素纤维的制备可参照专利申请CN101664346A静电纺丝制备的人工神经移植物及其制备方法和专用装置所述的方法制得。

本发明利用分泌促血管生成因子的SKP-SCs作为支持细胞构建得到含SKP-SCs的细胞预血管化纤维引导支架，将其移植到宿主皮下，从而更快速地构建得到含宿主源性成熟血管网络、纤维支架和大量存活SKP-SCs组成的细胞预血管化组织工程神经。之后将该细胞预血管化组织工程神经用于移植修复大鼠坐骨神经长距离缺损，一方面可实现移植后与宿主血管网络发生融合，改善损伤局部缺氧及再生微环境，降低移植物的免疫排斥反应；另一方面可实现预生成血管与支持细胞的双重促神经再生因素的叠加效应，进而更进一步提升神经损伤修复效果；此外，内置含支持细胞的纤维支架在预血管化后再与神经导管组装的方式，使得促进神经再生的血管和细胞的双重因素聚集于神经导管管腔内部，从而更精确地引导施万细胞及神经轴突集中在近远侧神经干间再生。

附图说明

图1为本发明的细胞预血管化组织工程神经构建及应用原理。

图2为支持细胞SKP-SCs体外表达主要促血管生成因子实验结果。其中：A为SKP-SCs体外培养模式图（GFP-SKP-SCs为带绿色荧光的SKP-SCs，便于分辨和观察，余同）；B-G为SKP-SCs表达促血管生成因子VEGF、TGFb和bFGF的免疫荧光染色图。

图3为支持细胞SKP-SCs体外促进血管内皮细胞增殖、迁移和成管实验结果。其中：A为SKP-SCs与血管内皮细胞体外共培养模式图；B-M为SKP-SCs影响血管内皮细胞增殖、迁移和成管的典型图片和指标统计。

图4为体外SKP-SCs与丝素纤维支架共培养制备细胞化纤维支架实验结果。

图5为不同组别丝素纤维支架皮下植入表面血管新生实验结果。其中：A为纤维支架预血管化模式图；B为不同组别纤维支架皮下植入4 d, 7 d和14 d体式显微镜下表面血管大体观；C-F为血管指标统计。

图6为不同组别丝素纤维支架皮下植入内部血管新生实验结果。其中：A为纤维支架预血管化模式图；B为不同组别纤维支架皮下植入4 d, 7 d和14 d内部血管的切片抗CD34（血管）免疫荧光染色图片；C-F’’为血管指标统计。

图7为不同方式预血管化组织工程神经桥接修复大鼠坐骨神经缺损后4 d 和14 d的神经断端（近、远端）施万细胞迁移距离及近端轴突延伸距离的统计结果。其中：A为预血管化组织工程神经桥接修复大鼠坐骨神经缺损模式图； B-C分别为不同方式预血管化组织工程神经体内修复神经缺损后4 d和14 d施万细胞和轴突再生距离统计。

具体实施方式

皮肤来源前体细胞（祖细胞）作为一种最近发现的具有较大临床应用潜力的干细胞，有别于其他已知的皮肤干细胞，有研究认为其来源于外胚层，能够更好地向神经细胞方向诱导分化。发明人从大鼠皮肤中分离、纯化得到皮肤来源前体细胞（SKPs），并将其诱导分化为施万细胞（SKP-SCs）；进一步地体外构建以皮肤前体细胞分化施万细胞（SKP-SCs）为支持细胞、内置丝素纤维的壳聚糖导管为支架材料的组织工程神经。之后采用新型细胞组织工程神经修复大鼠坐骨神经缺损，取得了理想的神经再生效果，神经组织结构的恢复程度明显优于壳聚糖神经导管而更接近自体神经。SKP-SCs能够分泌大量生长因子从而很大地改善了局部的神经再生微环境包括血管化应是其促进神经再生的主要机制之一。

如图1所示，本发明利用分泌促血管生成因子的SKP-SCs作为支持细胞构建含SKP-SCs的细胞化纤维支架，并将其移植到宿主皮下，从而更快速地构建得到含宿主源性成熟血管网络、纤维支架和大量存活SKP-SCs组成的细胞预血管化组织工程神经。之后将该细胞预血管化组织工程神经用于移植修复大鼠坐骨神经长距离缺损，一方面可实现移植后与宿主血管网络发生融合，改善损伤局部缺氧及再生微环境，降低移植物的免疫排斥反应；另一方面可实现预生成血管与支持细胞的双重促神经再生因素的叠加效应，进而更进一步提升神经损伤修复效果。

本发明的内容具体包括以下几方面：

（1）体外SKP-SCs表达促血管生成因子和促进血管生成评价及细胞化纤维支架构建

通过对体外培养的SKP-SCs进行抗主要促血管生成因子VEGF、TGFb和bFGF的免疫荧光染色，确定支持细胞SKP-SCs表达和分泌促血管生成因子的能力。进一步利用SKP-SCs和血管内皮细胞体外共培养模型，检测并明确支持细胞SKP-SCs对血管生成的促进作用。将SKP-SCs与纤维支架体外共培养，使支持细胞粘附、包绕于丝素纤维表面，制备细胞化纤维支架。

（2）体内SKP-SCs细胞化纤维支架预血管化血管新生和细胞存活评估及植入时间选择

将SKP-SCs细胞化纤维支架移植到大鼠背部皮下进行预血管化，植入后不同时间点通过体视显微镜下的大体观察及组织切片后的免疫荧光染色观察细胞化纤维支架表面及内部血管新生数量，同时观察纤维支架支持细胞存活的情况。与非细胞化纤维支架和VEGF浸润纤维支架相比，SKP-SCs细胞化纤维支架经皮下预移植4天即可获得充分预血管化且包含大量SKP-SCs的细胞预血管化细胞纤维支架。

（3）预血管化细胞纤维支架与神经导管组装构建细胞预血管化组织工程神经及修复周围神经缺损再生评估

利用标准化组装的细胞预血管化组织工程神经修复大鼠坐骨神经10 mm缺损，选取未经体内预血管化的神经导管人工神经移植物修复大鼠坐骨神经缺损为阴性对照，VEGF体内预血管化组织工程神经为阳性对照。桥接术后4 d 和14 d，利用免疫组化荧光染色测量和分析神经断端（近、远端）施万细胞迁移距离及近端轴突延伸再生距离，评价该细胞预血管化组织工程神经修复周围神经缺损的效果。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。

以下实施例中所采用的培养基及配方如下：

SKP培养基：DMEM/F12（3：1），40ng/mL FGF2，20ng/mL EGF，2% B27 supplement；

SKP-SCs分化培养基：DMEM/F12（3：1），40 ng/mL FGF2，20 ng /mL EGF，2% B27supplement，5-10% FBS；

SKP-SCs培养基：DMEM/F12（3：1），5µm/mL forskolin，50ng /mL HRG，2% N2supplement，1-5% FBS；

实施例1

1、皮肤源前体细胞（SKPs）的培养

取1日龄SD大鼠，75%酒精消皮肤。将大鼠移至细胞培养室无菌超净台中，用眼科剪剪取2cm²的皮肤放入预冷的DMEM/F12（3：1）培养基中并除去全部皮下脂肪、血管等结缔组织层。将处理好的皮肤移入离心管并将皮肤剪为1mm²大小的皮肤碎片。PBS漂洗2次后，加入3倍皮肤体积的预热胶原酶Ⅺ，置于37℃，CO₂细胞培养箱消化45-60分钟，期间每15分钟吹打一次，待液体呈乳和（或）乳糜样，皮肤形态完全消失，加入消化终止液10-15mL。400目滤网过滤，并用15mL DMEM/F12（3:1）冲洗，收集全部过滤液1200 rpm离心7分钟。弃去上清液，加入2mL DMEM/F12（3:1）重悬细胞，台盼蓝染色后计数。将细胞按照10⁵/mL的细胞密度种入SKP培养基中。培养1-3周，期间每3天添加一次新鲜SKP培养基1mL，即补充全部营养因子同时补足消耗培养基。

2、SKPs向施万细胞分化

将悬浮SKP细胞球的培养基移入离心管，1000 rpm 离心3-5分钟。弃上清后，加入胶原酶Ⅺ 0.5mL，37℃消化，待细胞解离为单细胞，终止消化后离心。离心后的细胞用SKP培养基重悬细胞，台盼蓝染色后计数，以10⁶/mL的细胞密度种入含SKP培养基的包被培养皿中，置于37℃，5% CO₂培养箱中，培养3天。3天以后，将培养基弃去并换为SKP-SCs分化培养基继续培养，以后每3天更换一次培养基，待施万细胞出现并逐渐增殖为纯度较高的集落。用1mm²大小的灭菌滤纸片，浸入0.125%胰蛋白酶，在显微镜下小心消化SKP-SCs集落，小心收集细胞种在新的包被培养皿中，继续用SKP-SCs培养基（扩大培养。如此2-3次后，SKP-SCs细胞均匀平铺于皿底，根据生长情况，每2-3代传代一次。需2-3周时间。

3、体外SKP-SCs表达促血管生成因子和促进血管生成评价

将小圆玻片取出置于24孔板中，使用0.2mg/mL PDL+0.02mg/mL Laminin包被液进行包被。SKP-SCs培养基重悬SKP-SCs，均匀种于24孔板中，置于37℃、5% CO₂的培养箱中培养，待细胞铺满孔板底80%左右使用4% PA固定后进行相应蛋白的细胞免疫荧光染色，并使用荧光显微镜观察和拍摄。通过抗VEGF、TGFb和bFGF的免疫荧光染色，观察和分析支持细胞SKP-SCs表达和分泌促血管生成因子的情况。

为了进一步评价SKP-SCs的促进血管生成能力，利用Transwell小室构建SKP-SCs与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的体外共培养模型，分别分析SKP-SCs对血管内皮细胞增殖（EdU染色）和迁移（结晶紫染色）的影响。此外，使用ECM基础培养基重悬状态良好的HUVECs，以2.2×10⁴/孔的密度接种于铺有基质胶（Matrigel ）的96孔板中，加入培养24 h后的SKP-SCs上清液，培养6h进行平面成管分析，倒置显微镜拍摄，使用ImageJ软件分析血管生成情况。

如图2所示，三种分泌性促血管生成因子在SKP-SCs中蛋白水平上均有高表达，且三种促生长因子在细胞中分布位置也有细微差异。TGFb在细胞体和细胞突中均明显表达，VEGF和bFGF主要在细胞体中表达。

如图3所示，SKP-SCs通过分泌促血管生成因子显著提升了HUVECs的增殖和迁移能力；并且HUVECs在基质胶平面上的成管能力明显增强，体现在连接数、节点数、网格数和总长度上（ImageJ软件）。

4、SKP-SCs细胞化纤维支架构建

将丝素纤维支架用0.2mg/mL PDL+0.02mg/mL Laminin包被，置于培养箱6 h后PBS洗涤3次（10min）。将SKP-SCs用SKP-SCs培养基重悬（1×10⁷/mL），细胞悬液覆盖丝素纤维支架，每个加40µL，37ºC培养箱静置贴附4-6 h，将丝素纤维支架翻转180°，再加入40 µL细胞悬液，培养箱静置4-6 h。加入SKP-SCs培养基覆盖丝素纤维支架，培养2 d，换成含50µg/mLVc的SKP-SCs培养基，每2 d全量换液，培养12 d后弃培养液置于PBS中备用。

如图4所示，大量支持细胞SKP-SCs以头尾相接的方式粘附和包绕在丝素纤维支架表面。

实施例2

1. 体内预血管化SKP-SCs细胞化纤维支架血管生成评价

将SKP-SCs细胞化的丝素纤维支架植入皮下进行预血管化。SD大鼠经腹腔深度麻醉后，剪开背部皮肤（1.5cm左右开口），使用眼科剪剪开皮下筋膜，钝性分离，将SKP-SCs细胞化纤维支架、VEGF预浸润的纤维支架（作为对照的VEGF预浸润的纤维支架，通过内置丝素纤维的壳聚糖神经导管浸润于1.0 μg/mL VEGF水溶液24 h制得）和空白组纤维支架置于皮下筋膜腔内。术后4d、7d和14d小心分离、取材预血管化的纤维支架，分别通过大体透明化（50%、75%、85%和100%梯度甘油水溶液）后体式显微镜观察表面新生血管，通过冰冻切片的抗血管内皮细胞（CD34）免疫荧光染色观察内部新生血管（AngioTool软件）。

如图5所示， SKP-SCs植入的支架表面血管生成能力更强，特别是在植入后4 d，SKP-SCs植入的支架表面已经生长了大量的新血管；而VEGF支架只有少量血管，空白支架几乎没有血管，只有一层较薄结缔组织包裹。从动态角度看，VEGF支架和空白支架组在植入后7 d至14 d时，支架表面血管数量有所下降，而SKP-SCs支架则在持续增加。

如图6所示，SKP-SCs支架内的新生血管在各时间点均与VEGF支架和空白支架内的新生血管有显著性差异。植入后4 d，大量血管已穿透纤维单丝全长；此时，VEGF支架的一端可见少量单丝之间的血管，而空白支架的单丝间不存在血管。动态线图更清楚地说明了SKP-SCs支架的血管化优势，与表面血管一致，SKP-SCs种植支架始终保持较强的血管生成能力，而其他两组在7 d后血管生成能力开始减弱。

2. 体内预血管化SKP-SCs细胞化纤维支架支持细胞存活评价及植入时间选择

通过使用自带绿色荧光的GFP-SKP-SCs，观察和追踪体内植入后支持细胞的存活情况。植入后4 d，SKP-SCs细胞化纤维支架仍存活大量支持细胞，结合预血管化情况，表明4d的体内植入已能构建充分预血管化且含有大量支持细胞的纤维支架，与现有技术和方案相比，大大缩短了制备周期。

如图6所示，细胞化纤维支架植入后4 d，仍有大量GFP-SKP-SCs粘附、包绕在丝素蛋白单丝上，7 d后减少，14 d基本消失。

实施例3

细胞预血管化组织工程神经修复周围神经缺损再生的效果评价

制备SD大鼠坐骨神经10mm缺损模型，分别使用SKP-SCs细胞预血管化组织工程神经（细胞化的丝素纤维内置于壳聚糖神经导管管腔内）、VEGF预血管化组织工程神经（内置丝素纤维的壳聚糖神经导管浸润于1.0 μg/mL VEGF水溶液24 h，然后大鼠背部皮下植入14d后制得）和非预血管化壳聚糖神经导管（壳聚糖神经导管内置丝素纤维制得）桥接修复周围神经缺损。术后4 d和14 d，灌注固定后取各组桥接段再生神经组织进行冰冻切片，通过抗施万细胞（S100）、轴突（NF）和血管（CD34）的免疫荧光染色，测量两侧施万细胞迁移及近侧轴突再生距离（ImageJ软件），评价SKP-SCs细胞预血管化组织工程神经修复周围神经缺损再生效果。

如图7所示，对照组术后4 d和14 d，由于新生血管生长缓慢，施万细胞迁移和轴突延伸较为缓慢。由于SKP-SCs和VEGF的预血管化，施万细胞和轴突沿着预先生长的血管快速迁移和再生。双侧施万细胞的最远迁移距离和近端轴突的延伸距离，一方面两组预血管化的再生效果均明显优于对照组；并且，SKP-SCs预血管化组的施万细胞迁移和轴突延伸距离更大于VEGF预血管化组。

Claims (7)

1.一种细胞化纤维支架，其特征在于：包括纤维支架和支持细胞，所述支持细胞粘附和/或包绕在纤维支架表面；

所述支持细胞为由皮肤源性前体细胞分化得到的施万细胞；

所述纤维支架由生物可降解材料制成，所述生物可降解材料为丝素蛋白、壳聚糖、胶原、脱细胞基质、聚乳酸或聚羟基乙酸中的一种或几种。

2.权利要求1所述的细胞化纤维支架的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1，将支持细胞经体外培养得到支持细胞悬液；

步骤2，将步骤1的支持细胞悬液与纤维支架体外共培养，得到所述细胞化纤维支架。

3.权利要求1所述的细胞化纤维支架在制备预血管化的组织工程神经中的应用。

4.一种预血管化的组织工程神经，其特征在于：由权利要求1所述的细胞化纤维支架制得。

5.权利要求4所述的预血管化的组织工程神经在制备周围神经缺损再生产品中的应用。

6.一种周围神经缺损再生产品，其特征在于：包括神经导管和权利要求4所述的预血管化的组织工程神经，所述预血管化的组织工程神经置于神经导管内。

7.根据权利要求6所述的周围神经缺损再生产品，其特征在于：所述神经导管由生物可降解材料制成，所述生物可降解材料为丝素蛋白、壳聚糖、胶原、脱细胞基质、聚乳酸或聚羟基乙酸中的一种或几种。

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