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CN115942978A - 包含抗b7-h3抗体的抗体-药物缀合物 - Google Patents

包含抗b7-h3抗体的抗体-药物缀合物 Download PDF

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CN115942978A
CN115942978A CN202180050283.9A CN202180050283A CN115942978A CN 115942978 A CN115942978 A CN 115942978A CN 202180050283 A CN202180050283 A CN 202180050283A CN 115942978 A CN115942978 A CN 115942978A
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CN
China
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seq
amino acid
acid sequence
antibody
cancer
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Application number
CN202180050283.9A
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English (en)
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朴泰教
金璇暎
朴秀浩
丁头焕
徐东勋
李相光
尹尚铉
河智贤
李享俶
朴沃龟
徐范硕
金世娜
薛旻娥
宋真我
禹成昊
赵钟云
李在镐
李玄美
朴哉垠
宋英子
李恩真
李炫周
沈恩英
高允贞
李珉朱
朴荣祐
柳曜燮
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Yintusaili Co ltd
Y Biologics Inc
Original Assignee
Yintusaili Co ltd
Y Biologics Inc
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Abstract

本公开涉及抗体‑药物缀合物(ADC)，其中一种或多种活性剂通过接头缀合至抗B7‑H3抗体。所述接头可以包含将活性剂共价连接至所述抗体的单元。本公开还涉及特异性结合B7‑H3的单克隆抗体及其抗原结合片段、变体、多聚体形式或双特异性物，以及制备和在多种治疗性、诊断性和预防性适应症中使用这些抗B7‑H3抗体及其抗原结合片段的方法。

Description

包含抗B7-H3抗体的抗体-药物缀合物
相关申请
本申请要求于2020年6月26日提交的美国临时专利申请序列号63/044,764的优先权。该申请通过引用整体并入本文。
背景技术
抗体-药物缀合物(ADC)将抗体的结合特异性与化疗剂的效力组合。由于ADC技术允许药物精确地递送至靶癌细胞并在特定条件下释放，同时最小化对健康细胞的附带损害，因此ADC技术提高了治疗性抗体的功效并降低了不良反应的风险。
B7-H3(CD276)是B7家族的新成员并且共享大约高达30％的序列同源性。B7-H3最初被引入作为T细胞的共刺激分子，但是已经被证明是共抑制检查点配体，其可以调节人体免疫中的辅助性T细胞、细胞毒性T细胞以及自然杀伤细胞。B7-H3蛋白的表达在正常组织中非常有限，但在抗原呈递细胞的细胞表面上诱导并普遍存在于具有原发性和转移性癌症的多种实体瘤中。在包括癌症干细胞和肿瘤脉管系统的多种癌细胞类型上也检测到B7-H3表达。B7-H3过表达似乎与肿瘤的疾病严重程度和不良临床结果密切相关。
因此，需要改进的靶向B7-H3的抗体-药物缀合物。
发明内容
在一些方面，本公开涉及抗体-药物缀合物(ADC)。在一些实施例中，本公开涉及一种抗体-药物缀合物，其包含抗体、接头和活性剂(例如，药物)。抗体-药物缀合物可以包含自消基团，例如用于从抗体和接头中释放活性剂。
本公开提供了结合B7-H3的单克隆抗体和抗原结合片段或其任何片段、变体、多聚体形式或双特异性物。这些抗体和抗原结合片段或其任何片段、变体、多聚体形式或双特异性物在本文中统称为抗B7-H3单克隆抗体或抗B7-H3 mAb或其抗原结合片段或任何片段、变体、多聚体形式或双特异性物。优选地，单克隆抗体和抗原结合片段或其任何片段、变体、多聚体形式或双特异性物对至少人B7-H3是特异性的。在一些实施例中，识别人B7-H3的单克隆抗体和其抗原结合片段或任何片段、变体、多聚体形式或双特异性物也与至少一种其它非人B7-H3蛋白交叉反应，例如，作为非限制性实例，非人灵长类动物B7-H3，例如食蟹猴B7-H3和/或啮齿动物B7-H3。
在一些方面，本公开涉及抗体-药物缀合物(ADC)，其包含抗体，至少一个与抗体共价偶联的支化接头和至少一种或两种与支化接头共价偶联的活性剂。支化接头可以包含支链单元，其中至少一种药物通过二级接头与支链单元偶联；支链单元通过一级接头与抗体偶联。一级和/或二级接头可以包含至少一个聚乙二醇单元。
在一些方面，本公开涉及一种由式I表示的抗体缀合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
Ab-(G)n
式I
其中：
Ab是抗B7-H3抗体或其抗原结合片段，其包含可变重链互补决定区1(CDRH1)、可变重链互补决定区2(CDRH2)、可变重链互补决定区3(CDRH3)、可变轻链互补决定区1(CDRL1)、可变轻链互补决定区2(CDRL2)和可变轻链互补决定区3(CDRL3)；其中，
CDRH1包含SEQ ID NO:1、7、13、19、25、31、37或43的氨基酸序列；
CDRH2包含SEQ ID NO:2、8、14、20、26、32、38或44的氨基酸序列；
CDRH3包含SEQ ID NO:3、9、15、21、27、33、39或45的氨基酸序列；
CDRL1包含SEQ ID NO:4、10、16、22、28、34、40或46的氨基酸序列，
CDRL2包含SEQ ID NO:5、11、17、23、29、35、41或47的氨基酸序列；
CDRL3包含SEQ ID NO:6、12、18、24、30、36、42或48的氨基酸序列；
每个G独立地是包含活性剂和接头的化学部分，其中接头将Ab连接至活性剂；以及
n是1至20的整数。
附图说明
图1示出了使用S形剂量-反应非线性回归曲线拟合(GraphPad软件公司)对JIMT-1中的T-Int-102-D1-5 AB2.1生成的IC50。
图2示出了使用S形剂量-反应非线性回归曲线拟合(GraphPad软件公司)对JIMT-1中的T-Int-112-AB2.1生成的IC50。
图3示出了使用S形剂量-反应非线性回归曲线拟合(GraphPad软件公司)对NCI-N87中的T-Int-112-AB2.1生成的IC50。
图4示出了使用S形剂量-反应非线性回归曲线拟合(GraphPad软件公司)对HCT-116中的T-Int-102-D1-5 AB2.1生成的IC50。
图5示出了使用S形剂量-反应非线性回归曲线拟合(GraphPad软件公司)对HCT-116中的T-Int-112-AB2.1生成的IC50。
图6示出了使用S形剂量-反应非线性回归曲线拟合(GraphPad软件公司)对NCI-H23中的T-Int-102-D1-5 AB2.1生成的IC50。
图7示出了使用S形剂量-反应非线性回归曲线拟合(GraphPad软件公司)对NCI-H460中的T-Int-102-D1-5 AB2.1生成的IC50。
图8示出了使用S形剂量-反应非线性回归曲线拟合(GraphPad软件公司)对NCI-H23中的T-Int-112-AB2.1生成的IC50。
图9示出了使用S形剂量-反应非线性回归曲线拟合(GraphPad软件公司)对NCI-H460中的T-Int-112-AB2.1生成的IC50。
图10示出了T-20-AB2.1和T-21-AB2.1对JIMT-1异种移植物中肿瘤体积的影响。
图11示出了T-20-AB2.1和T-21-AB2.1对JIMT-1异种移植物中体重的影响。
图12示出了T-Int-102-D1-5 AB2.1和T-Int-112-AB2.1对HCT-116异种移植物中肿瘤体积的影响。
图13示出了T-Int-102-D1-5 AB2.1和T-Int-112-AB2.1对HCT-116异种移植物中体重的影响。
图14示出了T-Int-112-AB2.1对NCI-H23异种移植物中肿瘤体积的影响。
图15示出了T-Int-112-AB2.1对NCI-H23异种移植物中体重的影响。
图16示出了T-Int-112-AB2.1对NCI-H460异种移植物中肿瘤体积的影响。
图17示出了T-Int-112-AB2.1对NCI-H460异种移植物中体重的影响。
具体实施方式
抗体-药物缀合物的基本结构如下：抗体-接头-低分子量药物或毒素。接头理想地允许药物对靶癌细胞表现出作用，例如在药物到达靶细胞后与抗体分离后。通过连接抗体和药物，接头也发挥功能性作用。
B7-H3(CD276)是B7家族的成员并且表现出与该家族的高序列同源性[高达约30％]。B7-H3的表达在正常组织中非常有限，但它普遍存在于多种实体癌中，包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌和结肠癌，以及黑素瘤和成胶质细胞瘤。已经在肿瘤上皮以及肿瘤相关的脉管系统和基质中观察到B7-H3。此外，B7-H3的过表达与许多癌症疾病中的不良结果相关。在NSCLC中常见(约85％)的高B7-H3表达与转移和晚期有关。在对抗PD-1疗法耐药的癌症中观察到较高的B7-H3发生率和表达水平。因此，B7-H3的靶向被批准用于复发性或难治性NSCLC。制备并测试了一系列抗B7-H3 ADC。ADC的关键组分是OHPAS接头和配备有OHPAS相容性官能团的苯并二氮杂卓类。已经证明ADC在血浆中的稳定性，ADC在靶肿瘤细胞中有效地释放毒素，这意味着治疗窗的潜在放大。ADC在体内显示出优异的功效和最小的体重变化，为对抗PD-1疗法难治的NSCLC患者提供了新的选择。
生成一系列紧密结合的抗B7-H3 mAb及其硫单抗(thiomab)形式(Kd～1.7～5.4×10-11M)。利用新发现的OHPAS接头和OHPAS相容的苯并二氮杂卓类有效载荷，制备并测试了一系列抗B7-H3 ADC。示例性OHPAS接头在本文中进一步描述并且还公开于例如国际申请公开WO 2019/008441中，其全文以引用的方式并入本文。示例性OHPAS相容的苯并二氮杂卓类有效载荷在本文中进一步描述，并且还公开于例如美国专利申请公开US2019/0367488中，其全文以引用的方式并入本文。ADC在体外对B7-H3阳性肿瘤细胞系高度有效。当在NSCLC的小鼠异种移植模型中测试时，ADC是有效的。
本文公开的ADC可以靶向表达B7-H3的特定肿瘤(例如，乳腺癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌和结肠癌，以及黑素瘤和成胶质细胞瘤)(《癌细胞(Cancer Cell.)》2017年4月10日；31(4):501–515.e8)。B7-H3的过表达表现出与疾病严重程度和不良结果的良好相关性。B7-H3在宽范围的肿瘤中以高频率强烈表达。B7-H3靶向用于癌症治疗是有益的，因为其在癌症干细胞群和肿瘤脉管系统和基质上表达(《临床肿瘤学杂志(Journal of ClinicalOncology)》35，第15期增刊)。肿瘤细胞和肿瘤脉管系统都是B7-H3(CD276)阳性(《癌细胞》2017年4月10日；31(4):501–515.e8)。公开的B7-H3抗体具有通过Fab-测定证实的改善的内化能力。因此，预期靶向B7-H3的本文公开的改进的抗体-药物缀合物可用于治疗或缓解与癌症相关的症状的方法中。
B7-H3抗体的实例及其用途列于表1中。
表1示出了B7-H3 ADC的发展状态。
Figure BDA0004078574660000041
Figure BDA0004078574660000051
*指征：B7-H3表达儿童癌症(成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、尤文肉瘤、威尔姆氏瘤、促结缔组织增生性小圆细胞瘤)、难治性癌症(前列腺、黑素瘤、RCC、TNBC、头颈膀胱、NSCLC)、中高危前列腺癌。
B7-H3表达有助于肿瘤的侵袭和转移。B7-H3岩藻糖基化的不同模式或癌细胞中的不同亚型表达显示出相互矛盾的共刺激和共抑制功能(《免疫学综述(ImmunologicalReviews)》2017；276:52–65)。B7-H3在肿瘤组织中高度表达(图26A至26B)。B7-H3表达与RCC、肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、胆囊癌、食管鳞状细胞癌、宫颈癌、骨肉瘤、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌和卵巢癌患者的不良预后显着相关(《临床癌症研究(Clin Cancer Res)》2008；14:5150-7；《细胞与分子医学杂志(J.Cell.Mol.Med.)》第21卷第9期，2017年第2199至2210页；《肿瘤靶点和治疗(OncoTargets and Therapy)》2014:71465–1472；《细胞研究(CellResearch)》第27卷，第1034至1045页(2017)；《美国翻译研究杂志(Am J Transl Res)》2015；7(12):2646-2660；《临床癌症治疗(Clin Cancer Res)》，2012，18(14):3834-3845)。
B7-H3在许多血液细胞系中不表达(《组织抗原(Tissue Antigens)》2005:66:83-92)。44.8％的急性髓性白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)表现出B7-H3表达，65％的套细胞淋巴瘤(MCL)病例表现出B7-H3表达。在B细胞、T细胞和单核细胞中没有B7-H3的表达(《细胞与分子免疫(CMI)》2005 2(4)307-311)。B7-H3在巨噬细胞、DCsm和肿瘤中可诱导表达。B7-H3在衍生自单核细胞的树突细胞(Mo-DC)中组成型表达。B7-H3在单核细胞衍生的DC中弱表达(《临床癌症研究》18(14)；3834-45，2012)。
本公开还提供了单价抗体和/或双特异性抗体，其至少包括对B7-H3具有特异性的第一臂。优选地，单价抗体和/或双特异性抗体对至少人B7-H3是特异性的。在一些实施例中，识别人B7-H3的单价抗体和/或双特异性抗体还与至少一种其它非人B7-H3蛋白交叉反应，例如，作为非限制性实例，非人灵长类动物B7-H3，例如食蟹猴B7-H3和/或啮齿动物B7-H3。本公开还提供了与本文公开的抗B7-H3单价抗体和/或抗B7-H3双特异性抗体结合相同表位的抗体。
本公开的示例性抗B7-H3单克隆抗体及其抗原结合片段包括例如表19至24中列出的抗体。
在一些实施例中，本公开的示例性抗B7-H3单克隆抗体及其抗原结合片段包括选自表19中所示的CDR序列的重链互补决定区(CDR)和选自表19中所示的CDR序列的轻链CDR的组合。在一些实施例中，本公开的示例性抗B7-H3单克隆抗体及其抗原结合片段包括表20至24中所示的重结构域和轻结构域的可变序列的组合。在一些实施例中，本公开的示例性抗B7-H3单克隆抗体包括表21至24中所示的重结构域和轻结构域的恒定序列的组合。
抗体-药物缀合物
在某些方面，本文公开的抗体-药物缀合物由式I或其药学上可接受的盐或溶剂化物表示：
Ab-(G)n
式I
其中：
Ab是抗B7-H3抗体或其抗原结合片段，其包含可变重链互补决定区1(CDRH1)、可变重链互补决定区2(CDRH2)、可变重链互补决定区3(CDRH3)、可变轻链互补决定区1(CDRL1)、可变轻链互补决定区2(CDRL2)和可变轻链互补决定区3(CDRL3)；其中
CDRH1包含SEQ ID NO:1、7、13、19、25、31、37或43的氨基酸序列；
CDRH2包含SEQ ID NO:2、8、14、20、26、32、38或44的氨基酸序列；
CDRH3包含SEQ ID NO:3、9、15、21、27、33、39或45的氨基酸序列；
CDRL1包含SEQ ID NO:4、10、16、22、28、34、40或46的氨基酸序列，
CDRL2包含SEQ ID NO:5、11、17、23、29、35、41或47的氨基酸序列；
CDRL3包含SEQ ID NO:6、12、18、24、30、36、42或48的氨基酸序列；
每个G独立地是包含一种或多种活性剂和接头的化学部分，其中接头将Ab共价连接至活性剂；以及
n是1至20的整数。
在一些实施例中，Ab是单克隆抗体、结构域抗体(dAb)、单链抗体(scAb)、Fab片段、F(ab')2片段、单链可变片段(scFv)、scFv-Fc片段、单结构域重链抗体、单结构域轻链抗体、变体抗体、多聚体抗体或双特异性抗体。Ab可以是兔、小鼠、嵌合、人源化或完全人单克隆抗体。在一些实施例中，Ab是IgG同种型，如IgG1同种型。
在一些实施例中，Ab包含可变重链和可变轻链的组合，可变重链包含SEQ ID NO:49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79或81的氨基酸序列，可变轻链包含SEQ ID NO:50、52、54、56、58、60、62、64、83、85、87、89、91、93、95或97的氨基酸序列。
在一些实施例中，Ab包含选自以下的可变重链序列和可变轻链序列的组合：
(a)包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的可变轻链；
(b)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的可变轻链；
(c)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的可变轻链；
(d)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的可变轻链；
(e)包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的可变轻链；以及
(f)包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的可变轻链；
(g)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的可变轻链；以及
(h)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的可变轻链。
在一些实施例中，B7-H3是人B7-H3。
在一些实施例中，切割基团能够在靶细胞内切割。在一些实施例中，切割基团能够释放一种或多种活性剂。在一些实施例中，抗体缀合物包含Ab；至少一个与Ab共价偶联的支化接头；以及至少两种与支化接头共价偶联的活性剂。在一些实施例中，至少两个支化接头与Ab偶联，并且每个支化接头与至少两种活性剂偶联。在一些实施例中，三个支化接头与Ab偶联。在其它实施例中，四个支化接头与Ab偶联。在又其它实施例中，恰好一个支化接头与Ab偶联。在又其它实施例中，每个支化接头恰好与两种活性剂偶联。在一些实施例中，缀合物包含至少两种不同的活性剂。在一些实施例中，至少一个支化接头与两种不同的活性剂偶联。
在一些实施例中，每种活性剂通过可裂解(例如，可水解)键与支化接头偶联。在一些实施例中，每个支化接头包含支链单元，并且每种活性剂通过二级接头与支链单元偶联，并且支链单元通过一级接头与抗B7-H3抗体偶联。在一些实施例中，支链单元是例如胺或酰胺的氮原子。在一些实施例中，支链单元是酰胺，并且一级接头包含酰胺的羰基。在一些实施例中，支链单元是酰胺，并且二级接头包含酰胺的羰基。在一些优选的实施例中，支链单元是赖氨酸单元。
接头和缀合配偶体
在一些优选的实施例中，每个G独立地是具有式(II)结构的基团：
Figure BDA0004078574660000081
每个Q独立地是通过杂原子，优选地O或N连接至L'的活性剂；
Z'是连接基团；
L'是通过选自O、S和N，优选地O或N的杂原子连接至SO2的间隔基部分，并且经选择使得L'与SO2之间的键的裂解促进L'与Q之间的键的裂解以释放活性剂；
X是-O-、-C(Rb)2-或-N(Rc)-，优选地-O-；
Ar表示环，如芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基，优选地芳基或杂芳基；
Y'是-(CRb 2)yN(Ra)-、-(CRb 2)yO-或-(CRb 2)yS-，其位置使得如果y是1，则N、O或S原子附接至TG；
X和Y'位于Ar的相邻原子上；
TG是触发基团，当活化时，其生成能够与SO2反应以置换(Q)q-(L')w并形成包括X-SO2和Ar的中间原子的5至6元环的N、O或S原子；
q是具有1至约20，优选地1至约10的值的整数；
w、x和y各自独立地是具有0或1的值的整数；
每个Ra和Rc独立地是氢或低级烷基；以及
每个Rb独立地是氢或低级烷基；或
两个Rb与它们所附接的原子一起形成3至5元环，优选地3至4元环，
条件是当w是0时，q是1。
每种活性剂可以是任何合适的活性剂，如下文更详细描述的。尽管许多传统的缀合方法需要存在官能团，如胺或羟基，以形成稳定的连接，但是本文的公开内容提供了使用迄今为止不能用于该目的的官能团(如酚和叔胺)形成连接的策略。这些官能团在本文公开的缀合物中形成稳定的连接，同时仍允许在活化触发基团的预定条件下释放。
许多合适的触发基团是本领域已知的，下文讨论了示例性触发基团和活化它们的条件，例如下文针对Y所述的部分。一些触发基团包括N、O或S原子，但为非亲核形式。例如，NO2基团是在还原条件下被还原为可与SO2反应的NH2或NHOH基团的触发基团，乙酸酯基团是在水解条件下被水解为可与SO2反应的羟基的触发基团。其它触发基团不包括N、O或S原子，但当活化时转化为亲核的N、O或S原子。例如，硼酸酯基团是在氧化条件(如过氧化物)下转化为可与SO2反应的羟基的触发基团。优选地，选择触发基团，使得活化它的条件选择性地进行，而不裂解或降解缀合物的其它部分，如靶向部分。一旦生成亲核的N、O或S原子，该原子分子内攻击SO2部分以形成环，排出部分(Q)q-(L')w-H，其中H键合至先前附接至SO2部分的Q或L'的杂原子。
在w为0的实施例中，q为1且Q通过杂原子直接附接至SO2。因此，活化触发基团生成分子内攻击SO2部分以形成环的亲核杂原子，从而排出活性剂Q-H，其中H键合至先前附接至SO2的杂原子。
在w为1的实施例中，可以选择L'以允许附接多次出现的Q，其可以相同或不同。因此，Q的每个实例通过间隔基部分间接附接至SO2。在此类实施例中，活化触发基团生成分子内攻击SO2部分以形成环的亲核杂原子，从而排出部分(Q)q-L'-H，其中H键合至先前附接至SO2的L'中的杂原子。在此类实施例中，释放的杂原子触发分子内反应，其排出活性剂Q(例如如果Q具有作为季铵附接至L'的叔胺)或Q-H。例如，杂原子可以与Q-H的羟基形成的酯部分进行分子内环化反应，形成环并排出活性剂Q-H。替代地，杂原子可以经历分子内互变异构化，其排出活性剂Q或Q-H。
Ar可以是任何合适的环，包括双环或其它多环的环，使得经历分子内环化的部分保持紧密接近以促进触发基团活化后的反应。芳族和杂芳族环的平面特征是优选的，因为在此类环上的取代基的刚性几何结构确保了反应性部分的有利放置，尽管其它类型的环，如环烯基或杂环烯基，可以实施类似的几何结构。可以选择五元或六元环，和/或环中杂原子的数目或种类，和/或其它环上的取代基(例如，给电子或吸电子取代基)，以基于环的所得键角调节环化速率。类似地，当期望减慢分子内环化的速率时，环烷基和杂环基环的更灵活的构象可能是有用的。
Z'可以是将Ar连接至一个或多个Ab基团的任何合适的连接基团。典型地，连接基团应该足够亲水以促进水溶性并阻止缀合物的聚集，例如通过包括如聚乙二醇部分、肽序列、带电荷部分(如羧酸盐、胺、含氮环等)等部分以平衡可能包括的任何烷基链的疏水特性。因为以模块方式制备缀合物通常是有利的，所以Z'可以含有连接单元，即由一个反应性部分与另一个反应性部分缀合产生的官能团。代表性的连接单元在下文中更详细地讨论(例如，与变量Z有关)，并且常见的连接基团包括酰胺、三唑、肟、氨基甲酸酯等。代表性的Z'基团包括L1'-Z基团，如下文更详细地讨论的。在一些实施例中，附接至每个Ab的所有G基团是相同的，而在其它实施例中，每个Ab可以附接至两个或更多个不同的G基团。例如，一些G基团可以具有在第一条件下活化的触发基团，而其它G基团可以具有在第二条件下活化的触发基团，使得例如一种活性剂可以在第一条件下选择性地释放，但第二活性剂可以在第二条件下选择性地释放。
在式(II)的某些实施例中，-Y'是-(CH2)yNR"-、-(CH2)yO-或-(CH2)yS-，其位置使得如果y是1，则N、O或S原子附接至TG；R"是氢或C1–C6-烷基；并且y是具有0或1的值的整数。在一些此类实施例中，TG是β-半乳糖苷、β-葡糖苷酸或β-半乳糖苷和β-葡糖苷酸的组合。
在式(II)的一些实施例中，(L')w将每个Q连接至-SO2-；并且每个Q是通过杂原子(优选地O或N)连接至L'基团之一的活性剂，并且形成包括Q的杂原子的-O-、-OC(O)-、-OC(O)O-或-OC(O)NH-键。在其它实施例中，(Q)q-(L')w-选自以下：
Figure BDA0004078574660000101
其中：
Q是通过杂原子(优选地O或N)连接至L'的活性剂，
X4不存在或形成包括Q的杂原子的-O-、-OC(O)-、-OC(O)O-或-OC(O)NH-键；
X1是-O-或-NRa-；
X2是-O-、-OC(O)-、-OC(O)O-或-OC(O)NH-；
X3是-OC(＝O)-；
w'是具有1、2、3、4或5的值的整数；
R9和R10各自独立地是氢、烷基、芳基或杂芳基，其中烷基、芳基和杂芳基是未取代的或被一个或多个取代基取代，取代基例如选自烷基、-(CH2)uNH2、-(CH2)uNRu1Ru2和-(CH2)uSO2Ru3；
Ru1、Ru2和Ru3各自独立地是氢、烷基、芳基或杂芳基；以及
u是具有1至约10的值的整数。
在一些此类实施例中，(Q)q-(L')w-选自以下：
Figure BDA0004078574660000111
在某些实施例中，Z'包括反应性基团(例如，如以下关于Z更详细论述的前体基团)，其可用于将化合物附接至触发剂、固体表面(例如，以形成固体负载阵列或传感器颗粒)，或附接至任何其它感兴趣的分子或载体。
在某些实施例中，Z'是具有式(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)或(IIh)的结构的连接基团：
Figure BDA0004078574660000112
Figure BDA0004078574660000121
其中：
*是与Ab的附接点；
**是与Ar的附接点；
Re是烷基；
X”是-O-、-S-、-NH-或-CH2-；
X4是-NHC(O)-(CH2)g-NH-或-C(O)NH-(CH2)h-NH-；
Wb1和Wb2各自独立地是-C(O)NH-、-NHC(O)-、
Figure BDA0004078574660000122
Figure BDA0004078574660000123
L2是任选存在的间隔基部分，并且可以进一步被一个或多个取代基取代，如C1-C6烷基、C5-C14芳基和C3-C8杂芳基，其中烷基、芳基和杂芳基可以进一步被例如一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：C1-C10烷基、-(CH2)uNH2、-(CH2)uNRu1Ru2、-(CH2)uCO2H、-(CH2)uCO2Ru1和-(CH2)uSO2Ru3，其中Ru1、Ru2和Ru3各自独立地是氢、C1-C15烷基、C6-C20芳基或C3-C10杂芳基；并且u是具有1至约10的值的整数；
R12是氢、C1-C8烷基或氨基酸部分，如天然氨基酸部分；
a、b、c、d、e、g、h、o和qq各自独立地是具有1至约10的值的整数；以及
s'是具有1至约10的值的整数。
在优选的实施例中，Wb1和Wb2各自独立地是
Figure BDA0004078574660000124
Figure BDA0004078574660000125
在其它实施例中，Z'是具有式(IIa')、(IIb')、(IIc')、(IId')、(IIe')、(IIf')、(IIg')或(IIh')的结构的连接基团：
Figure BDA0004078574660000131
其中：
*是与Ab的附接点；
**是与Ar的附接点。
在一些优选的实施例中，Z'是选自以下的连接基团：
Figure BDA0004078574660000141
Figure BDA0004078574660000151
Figure BDA0004078574660000161
其中
Rza是H或甲基；
Rzb是-OH、＝O或＝NHOH；
Figure BDA0004078574660000162
单键或双键；
a”表示式(II)的Z'与Ar之间的键；
b”表示Z'与Ab之间的键；以及
Z"选自
Figure BDA0004078574660000163
位于任一方向。
在一些实施例中，G包含选自以下的部分：
Figure BDA0004078574660000164
其中Q是活性剂并且
Figure BDA0004078574660000171
是将Z'连接至取代的苯基基团(在式(II)中表示为Ar)的连接基团Z'的片段。
在某些实施例中，Ab-(G)n由式(III)的化合物表示：
或其盐，其中：
Figure BDA0004078574660000172
A是
Figure BDA0004078574660000173
Figure BDA0004078574660000174
M是N、CR30或C(-L-Q)；
每个L独立地选自间隔基部分；
每个Q是活性剂；
J是B7-H3抗体，如本文所述；
R30和R31各自独立地选自吸电子基团、氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、碳环基、杂环基和卤代烷基；
R42和R43各自独立地选自-OH、烷氧基、-NR44R45、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、碳环基和杂环基，其中R44和R45与它们所附接的氮原子一起可以形成任选地与芳基或杂芳基环稠合的5至8元环；
R32、R44和R45各自独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、碳环基、杂环基和卤代烷基；以及
n是1至4。
在一些实施例中，M是N。
在某些实施例中，M是CR30，并且R30是吸电子基团。
在一些实施例中，A选自
Figure BDA0004078574660000181
其中R31是吸电子基团，优选地其中L通过选自酰胺或酯的吸电子基团与C偶联。
在一些实施例中，M是C(-L-Q)，其中L通过吸电子基团与C偶联。
在一些实施例中，R30是-CO2NR33R34或-CO2R35，且R33、R34和R35各自独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、碳环基、杂环基和卤代烷基。
在一些实施例中，每个吸电子基团独立地选自-NO2、-CN、-卤代烷基、-CO2NR33R34、-CO2R35、-C(＝O)R36、-S(＝O)R37、-S(＝O)2OR38和-NR39R40R41；并且R36、R37、R38、R39、R40和R41各自独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、碳环基、杂环基和卤代烷基。
在某些实施例中，每个吸电子基团独立地选自-CN、-CONR33R34和-CO2R35。
在一些实施例中，每个吸电子基团独立地选自-CN、-CONH2和-CO2Me。
在某些实施例中，Q是药剂。
在一些实施例中，Q包含L'和Q'，其中L'是接头并且Q'是活性剂。
在某些实施例中，L'包含偶联基团，其中偶联基团与L偶联。
在一些实施例中，偶联基团选自-C(＝O)NR32-、-C(＝O)O-、-C(＝NR32)-、-C＝NO-、-NR32-C(＝O)-NR32-、-OC(＝O)O-、-S-S-、-NR32S(＝O)2O-和-OS(＝O)2O-。
在某些优选的实施例中，偶联基团选自
Figure BDA0004078574660000182
沿任一方向取向。
在一些实施例中，L'进一步包含可裂解基团，其中可裂解基团与Q'偶联。
在某些实施例中，可裂解基团-Q'部分选自
Figure BDA0004078574660000183
其中
R49是氢或-C(＝O)R50；以及
R50是低级烷基。
在一些实施例中，L'进一步包含C6-C100亚烷基，其包含至少一个选自-NH-、-C(＝O)-、-O-、-S-、-S(O)-和-S(＝O)2-的基团。
在某些实施例中，L包含C6-C100亚烷基，其包含至少一个选自-NH-、-C(＝O)-、-O-、-S-、-S(O)-和-S(＝O)2-的基团。例如，L包含
Figure BDA0004078574660000191
Figure BDA0004078574660000192
其中
a'是与含M芳族环的键，并且b'是与L'的键；以及
n是2至20。
在一些实施例中，A是
Figure BDA0004078574660000193
Figure BDA0004078574660000194
例如，A可以是
Figure BDA0004078574660000195
替代地，A可以是
Figure BDA0004078574660000196
在其它实施例中，A可以是
Figure BDA0004078574660000197
Figure BDA0004078574660000198
在一些实施例中，A是
Figure BDA0004078574660000199
在某些实施例中，R42是-OH或-NR44R45。
在一些实施例中，本公开涉及制备本文公开的ADC的方法，其包含使本文公开的抗体与式(IV)或式(V)的化合物反应：
Figure BDA00040785746600001910
其中A'是
Figure BDA0004078574660000201
M是N、CR30或C(-L-Q)；
每个L独立地选自间隔基部分；
每个Q独立地选自活性剂或反应性基团；
X选自-Cl、-Br和-I；
R30和R31各自独立地选自吸电子基团、氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、碳环基、杂环基和卤代烷基；
R46选自烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、碳环基、杂环基和卤代烷基；
R32选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、碳环基、杂环基和卤代烷基；
R47是O-、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、碳环基、杂环基；以及
n是1至4。
在一些实施例中，M是N。
在某些实施例中，M是CR30，并且R30是吸电子基团。
在一些实施例中，A'选自
Figure BDA0004078574660000202
其中R31是吸电子基团，优选地其中L通过选自酰胺或酯的吸电子基团与C偶联。
在一些实施例中，A'是
Figure BDA0004078574660000203
其中R46是被C1-3烷基取代的芳基。
在一些实施例中，A'是
Figure BDA0004078574660000204
在一些实施例中，A'是
Figure BDA0004078574660000205
其中X是-C(O)NH2。
在一些实施例中，M是C(-L-Q)，其中L通过吸电子基团与C偶联。
在一些实施例中，R30是-CO2NR33R34或-CO2R35，且R33、R34和R35各自独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、碳环基、杂环基和卤代烷基。
在一些实施例中，每个吸电子基团独立地选自-NO2、-CN、-卤代烷基、-CO2NR33R34、-CO2R35、-C(＝O)R36、-S(＝O)R37、-S(＝O)2OR38和-NR39R40R41；并且R36、R37、R38、R39、R40和R41各自独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、碳环基、杂环基和卤代烷基。
在某些实施例中，每个吸电子基团独立地选自-CN、-CONR33R34和-CO2R35。
在一些实施例中，每个吸电子基团独立地选自-CN、-CONH2和-CO2Me。
在某些实施例中，Q是活性剂。
在一些实施例中，Q包含L'和Q'，其中L'是接头并且Q'是活性剂。
在某些实施例中，L'包含偶联基团，其中偶联基团与L偶联。
在一些实施例中，偶联基团选自-C(＝O)NR32-、-C(＝O)O-、-C(＝NR32)-、-C＝NO-、-NR32-C(＝O)-NR32-、-OC(＝O)O-、-S-S-、-NR32S(＝O)2O-和-OS(＝O)2O-。
在某些实施例中，偶联基团选自
Figure BDA0004078574660000211
沿任一方向取向。
在一些实施例中，L'进一步包含可裂解基团，其中可裂解基团与Q'偶联。
在某些实施例中，偶联至Q'的可裂解基团选自
Figure BDA0004078574660000212
其中
R49是氢或-C(＝O)R50；以及
R50是低级烷基。
在一些实施例中，L'进一步包含C6-C100亚烷基，其包含至少一个选自-NH-、-C(＝O)-、-O-、-S-、-S(O)-和-S(＝O)2-的基团。
在某些实施例中，L包含C6-C100亚烷基，其包含至少一个选自-NH-、-C(＝O)-、-O-、-S-、-S(O)-和-S(＝O)2-的基团。例如，L包含
Figure BDA0004078574660000221
Figure BDA0004078574660000222
其中
a是与含M芳族环的键，并且b是与L'的键；以及
n是2至20。
在一些实施例中，Q'是激素、寡核苷酸、毒素、亲和配体、用于检测的探针或其组合。
在某些实施例中，Q'选自细胞因子、免疫调节化合物、抗癌剂、抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂、驱肠虫剂或其组合。
在某些实施例中，Q是反应性基团。
在一些实施例中，反应性基团选自-N3、-C≡CH、
Figure BDA0004078574660000223
-S(O)2Hal、-NH2、-CO2Hal、-OH、-C(O)H、-SH、-N＝C＝O和-N＝S＝C，其中Hal是-Cl、-Br或-I。
在一些实施例中，A是
Figure BDA0004078574660000224
在某些实施例中，R31是-CN、-CO2NR33R34或-CO2R35。
在某些实施例中，A是
Figure BDA0004078574660000225
在一些实施例中，R32是氢或C1-3烷基。
在一些实施例中，A是
Figure BDA0004078574660000226
在某些实施例中，R46是可任选取代的C1-3烷基、可任选取代的C6-C12芳基或可任选取代的杂芳基。
在一些实施例中，A是
Figure BDA0004078574660000227
在某些实施例中，R47是O-或C1-3烷基。
在某些实施例中，A是
Figure BDA0004078574660000231
活性剂
如上所述，在本公开的优选实施例中，Q是形成本文公开的ADC的一部分的活性剂。在一些实施例中，活性剂独立地选自化疗剂和毒素。在一些实施例中，活性剂是免疫调节化合物、抗癌剂、抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂或其组合。
用于缀合的示例药物
本发明的ADC提供靶向疗法，其可以例如在将一种或多种活性剂递送至特定细胞时减少抗癌疗法经常见到的副作用。
例如，活性剂可以选自由以下组成的组：埃罗替尼(erlotinib)(TARCEVA；基因泰克公司(Genentech)/OSI制药)；硼替佐米(bortezomib)(VELCADE；MilleniumPharm.)；氟维司群(fulvestrant)(FASLODEX；阿斯利康公司(AstraZeneca))；舒尼替尼(sutent)(SU11248；辉瑞公司(Pfizer))；来曲唑(letrozole)(FEMARA；诺华公司(Novartis))；甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)(GLEEVEC；诺华公司)；PTK787/ZK 222584(诺华公司)；奥沙利铂(oxaliplatin)(Eloxatin；赛诺菲公司(Sanofi))；5-氟尿嘧啶(5-FU)；甲酰四氢叶酸(leucovorin)；雷帕霉素(rapamycin)(西罗莫司(Sirolimus)，RAPAMUNE；惠氏公司(Wyeth))；拉帕替尼(lapatinib)(TYKERB，GSK572016；葛兰素史克公司(GlaxoSmithKline))；洛那法尼(lonafarnib)(SCH 66336)；索拉非尼(sorafenib)(BAY43-9006；拜耳实验室(Bayer Labs.))；吉非替尼(gefitinib)(IRESSA；阿斯利康公司)；AG1478、AG1571(SU 5271；Sugen)；烷化剂(例如，噻替哌(thiotepa)或
Figure BDA0004078574660000232
环磷酰胺)；烷基磺酸盐(例如，白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)或哌泊舒凡(piposulfan))；氮丙啶(例如，苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)或乌瑞替哌(uredopa))；乙烯亚胺(ethylenimine)、甲基三聚氰胺、六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphormide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)、三羟甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)；乙酸衍生物(例如，泡番荔枝辛(bullatacin)或布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)，包括合成类似物拓扑替康(topotecan)；苔藓抑素(bryostatin)；卡莉司汀(callystatin)；CC-1065(包括阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)或其比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素类(cryptophycins)(例如，念珠藻素1或念珠藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；多卡霉素(duocarmycin)(包括合成类似物、KW-2189和CB1-TM1)；软珊瑚醇(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；浆果赤霉素(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥(mechlorethamine)(例如，苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯代磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)或尿嘧啶氮芥(uracil mustard))；亚硝脲(nitrousurea)(例如，卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)或雷莫司汀(ranimnustine))；抗生素(例如，选自刺孢霉素γ1I和刺孢霉素ωI 1的卡利奇霉素(calicheamicin)或包括作为烯二炔类抗生素的达内霉素A的达内霉素(dynemicin))；双膦酸盐(例如，氯膦酸盐(clodronate))；埃斯培拉霉素、新制癌菌素生色团(neocarzinostatin chromophore)或相关的色蛋白烯二炔抗生素生色团、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(antramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡拉霉素(carabicin)、癌霉素(carninomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、detorubucin、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、
Figure BDA0004078574660000241
多柔比星(doxorubicin)(例如，吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星、脂质体多柔比星或脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、埃索霉素(esorubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)(例如，丝裂霉素C(mitomycin C)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链霉黑素(streptomigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)或佐柔比星(zorubicin))；抗代谢物(例如，5-氟尿嘧啶(5-FU))；叶酸类似物(例如，二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)或三甲曲沙(trimetrexate))；嘌呤类似物(例如，氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫米嘌呤(thiamiprine)或硫鸟嘌呤(thiguanine))；嘧啶类似物(例如，环胞苷(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)或氟尿苷(floxuridine))；雄激素(例如，卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美匹硫坦(mepitiostane)或睾内酯(testolactone))；抗肾上腺药(例如，氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)或曲洛司坦(trilostane))；叶酸补充剂(例如，亚叶酸(leucovorin))；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；阿莫司汀(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；乙环氧啶(etoglucid)；硝酸镓(galliumnitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱(maytansinoid)(例如，美登素(maytansine)或安丝菌素(ansamitocin)；单端孢霉烯(trichothecene)(例如，T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)或蛇形菌素(anguidine))；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；苯来美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；
Figure BDA0004078574660000254
多糖；雷佐生(razoxane)；根毒素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯(trichothecene)(特别是，T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素(roridin)A或蛇形菌素(anguidine))；尿烷；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；噻替哌(thiotepa)；紫杉烷类(例如，
Figure BDA0004078574660000251
紫杉醇(新泽西州普林斯顿百时美施贵宝肿瘤科(Bristol-MyersSquibb Oncology,Princeton,N.J.))、ABRAXANETM无克列莫佛(cremophor)、白蛋白工程化的紫杉醇纳米颗粒制剂、美国制药伙伴公司(American Pharmaceutical Partners)，Schaumber，I11.或
Figure BDA0004078574660000252
多西他赛(doxetaxel)((法国安东尼的罗纳普朗克制药公司(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France))))；瘤可宁(chloranbucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫代鸟嘌呤；巯嘌呤(mercaptopurine)；铂类似物(例如，顺铂(cisplatin)或卡铂(carboplatin))；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)、异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；
Figure BDA0004078574660000253
长春瑞滨(vinorelbine)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DFMO)；类视黄醇(例如，视黄酸)；卡培他滨(capecitabine)；及其药学上可接受的盐、其溶剂化物、其酸或其衍生物。
有丝分裂抑制剂
在一些实施例中，本公开的接头可用于将抗体缀合至一种或多种有丝分裂抑制剂以形成用于治疗癌症的ADC。本文所用的术语“有丝分裂抑制剂”是指阻断有丝分裂或细胞分裂(对癌细胞特别重要的生物过程)的细胞毒性剂和/或治疗剂。有丝分裂抑制剂通常通过影响微管聚合或微管解聚来破坏微管，从而阻止细胞分裂。因此，在某些实施例中，抗体与一种或多种通过抑制微管蛋白聚合而破坏微管形成的有丝分裂抑制剂缀合。在某些实施例中，本公开的ADC中使用的有丝分裂抑制剂是
Figure BDA0004078574660000261
(紫杉醇(paclitaxel))、
Figure BDA0004078574660000262
(多西他赛(docetaxel))或
Figure BDA0004078574660000263
(伊沙匹隆(ixabepilone))。下文提供了可用于本文公开的ADC的有丝分裂抑制剂的实例。包括在有丝分裂抑制剂属中的是上述的澳瑞他汀类(auristatins)。
澳瑞他汀类
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种澳瑞他汀。澳瑞他汀类代表一组多拉司他汀类似物(dolastatin analogs)，其通常已显示通过干扰微管动力学和GTP水解而具有抗癌活性，从而抑制细胞分裂。例如，澳瑞他汀E(美国专利第5,635,483号)是海洋天然产物多拉司他汀10的合成类似物，多拉司他汀10是一种通过与抗癌药物长春新碱结合到微管蛋白上的相同位点来抑制微管蛋白聚合的化合物(G.R.Pettit，《有机天然产物化学研究进展(Prog.Chem.Org.Nat.Prod)》，70:1-79(1997))。多拉司他汀10、澳瑞他汀PE和澳瑞他汀E是具有四个氨基酸的线性肽，其中三个是多拉司他汀类化合物所特有的。有丝分裂抑制剂的澳瑞他汀亚类的示例性实施例包括但不限于单甲基澳瑞他汀D(MMAD或澳瑞他汀D衍生物)、单甲基澳瑞他汀E(MMAE或澳瑞他汀E衍生物)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF或澳瑞他汀F衍生物)、澳瑞他汀F苯二胺(AFP)、澳瑞他汀EB(AEB)、澳瑞他汀EFP(AEFP)和5-苯甲酰基戊酸-AE酯(AEVB)。澳瑞他汀衍生物的合成和结构描述于美国专利申请公开第2003-0083263号、第2005-0238649号和第2005-0009751号；国际专利公开第WO 04/010957号、国际专利公开第WO 02/088172号和美国专利第6,323,315号；第6,239,104号；第6,034,065号；第5,780,588号；第5,665,860号；第5,663,149号；第5,635,483号；第5,599,902号；第5,554,725号；第5,530,097号；第5,521,284号；第5,504,191号；第5,410,024号；第5,138,036号；第5,076,973号；第4,986,988号；第4,978,744号；第4,879,278号；第4,816,444号；以及第4,486,414号，其各自通过引用并入本文。
多拉司他汀
在某些实施例中，本文所述的ADC中的活性剂是多拉司他汀。多拉司他汀是分离自印度洋海兔Dolabella auricularia的短肽化合物(参见Pettit等人，《美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)》，1976，98，4677)。多拉司他汀的实例包括多拉司他汀10和多拉司他汀15。多拉司他汀15，一种来源于Dolabella auricularia的七亚基缩酚酸肽，是一种强效的抗有丝分裂剂，在结构上与抗微管蛋白剂多拉司他汀10相关，多拉司他汀10是从相同生物体获得的五亚基肽。因此，在某些实施例中，本公开的ADC包含抗体、本文所述的接头和至少一种多拉司他汀。如上所述的澳瑞他汀是多拉司他汀10的合成衍生物。
美登木素生物碱
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种美登木素生物碱以形成ADC。美登木素生物碱是有效的抗肿瘤剂，其最初分离自高等植物科卫矛科(Celastraceae)、鼠李科(Rhamnaceae)和大戟科(Euphorbiaceae)的成员，以及一些藓类物种(Kupchan等人，《美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)》94:1354-1356[1972]；Wani等人，《化学学会和化学通讯杂志(J.Chem.Soc.Chem.Commun)》390:[1973]；Powell等人，《天然产物杂志(J.Nat.Prod.)》46:660-666[1983]；Sakai等人，《天然产物杂志(J.Nat.Prod.)》51:845-850[1988]；以及Suwanborirux等人，《Experientia》46:117-120[1990])。证据表明，美登木素生物碱通过抑制微管蛋白微管蛋白的聚合来抑制有丝分裂，从而防止微管的形成(参见，例如，美国专利第6,441,163号和Remillard等人，《科学(Science)》，189，1002-1005(1975))。已经证明美登木素生物碱在体外使用细胞培养模型和在体内使用实验动物系统抑制肿瘤细胞生长。此外，美登木素生物碱的细胞毒性是常规化疗剂(例如甲氨蝶呤、柔红霉素和长春新碱)的1,000倍(参见，例如，美国专利第5,208,020号)。
美登木素生物碱包括美登素、美登醇、美登醇的C-3酯，和其它美登醇类似物和衍生物(参见，例如，美国专利第5,208,020号和第6,441,163号，其各自通过引用并入本文)。美登醇的C-3酯可以是天然存在的或合成衍生的。此外，天然存在的和合成的C-3美登醇酯可以分类为具有简单羧酸的C-3酯，或具有N-甲基-L-丙氨酸衍生物的C-3酯，后者比前者更具细胞毒性。合成的美登木素生物碱类似物描述于例如Kupchan等人，《药物化学杂志(J.Med.Chem.)》，21，31-37(1978)。
用于本公开的ADC的合适的美登木素生物碱可以分离自天然来源、合成产生的或半合成产生的。此外，美登木素生物碱可以以任何合适的方式修饰，只要在最终的缀合物分子中保持足够的细胞毒性。下面提供了示例性美登木素生物碱美登素(mertansine，DM1)的结构。
Figure BDA0004078574660000281
美登木素生物碱的代表性实例包括但不限于DM1(N2'-脱乙酰基-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素；也称为美登素，药物美登木素生物碱1；ImmunoGen公司；另见Chari等人(1992)《癌症研究(Cancer Res)》52:127)、DM2、DM3(N2'-脱乙酰基-N2'-(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素)、DM4(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素)和美登醇(合成的美登木素生物碱类似物)。美登木素生物碱的其它实例描述于美国专利第8,142,784号，其通过引用并入本文。
安丝菌素(Ansamitocins)是从各种细菌来源分离的一组美登木素生物碱抗生素。这些化合物具有有效的抗肿瘤活性。代表性实例包括但不限于安丝菌素P1、安丝菌素P2、安丝菌素P3和安丝菌素P4。
植物生物碱
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种植物生物碱，例如紫杉烷或长春花生物碱。植物生物碱是来源于某些类型植物的化疗药物。长春花生物碱由长春花属植物长春花(catharanthus rosea)制成，而紫杉烷由太平洋紫杉树(Pacific Yew tree taxus)的树皮制成。长春花生物碱和紫杉烷类也被称为抗微管剂，并在下面更详细地描述。
紫杉烷类
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种紫杉烷。本文所用的术语“紫杉烷”是指具有微管作用机制并具有包括紫杉烷环结构和细胞抑制活性所需的立体特异性侧链的结构的一类抗肿瘤剂。术语“紫杉烷”还包括各种已知的衍生物，包括亲水性衍生物和疏水性衍生物。紫杉烷衍生物包括但不限于国际专利申请第WO 99/18113号中所述的半乳糖和甘露糖衍生物；WO 99/14209中所述的哌嗪子基和其它衍生物；WO 99/09021、WO 98/22451和美国专利第5,869,680号中所述的紫杉烷衍生物；WO 98/28288中所述的6-硫代衍生物；美国专利第5,821,263号中所述的亚磺酰胺衍生物；以及美国专利第5,415,869号中所述的紫杉醇衍生物，其各自通过引用并入本文。紫杉烷化合物先前也已描述于美国专利第5,641,803号、第5,665,671号、第5,380,751号、第5,728,687号、第5,415,869号、第5,407,683号、第5,399,363号、第5,424,073号、第5,157,049号、第5,773,464号、第5,821,263号、第5,840,929号、第4,814,470号、第5,438,072号、第5,403,858号、第4,960,790号、第5,433,364号、第4,942,184号、第5,362,831号、第5,705,503号和第5,278,324号，所有这些专利明确地以引用的方式并入。紫杉烷的其它实例包括但不限于多西他赛(
Figure BDA0004078574660000291
赛诺菲·安万特集团(Sanofi Aventis))、卡培他滨(paclitaxel)(
Figure BDA0004078574660000292
或
Figure BDA0004078574660000293
阿博利斯肿瘤学公司(Abraxis Oncology))，和纳米微粒卡培他滨(ABI-007/
Figure BDA0004078574660000294
阿博利斯生物科学(Abraxis Bioscience))。
在某些实施例中，本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种多西他赛。在某些实施例中，本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种卡培他滨。
长春花生物碱
在某些实施例中，本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种长春花生物碱。长春花生物碱是一类细胞周期特异性药物，其通过作用于微管蛋白并防止微管形成而抑制癌细胞的分裂能力。可用于本公开的ADC的长春花生物碱的实例包括但不限于硫酸长春地辛(vindesine sulfate)、长春新碱、长春碱和长春瑞滨(vinorelbine)。
抗肿瘤抗生素
本公开的接头可用于将抗体缀合至一种或多种抗肿瘤抗生素以治疗癌症。本文所用的术语“抗肿瘤抗生素”是指通过干扰DNA而阻断细胞生长并由微生物制备的抗肿瘤药物。通常，抗肿瘤抗生素破坏DNA链或减慢或停止DNA合成。可以包括在本文公开的ADC中的抗肿瘤抗生素的实例包括但不限于放线菌素(例如，吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂卓)、蒽环类抗生素、卡利奇霉素和多卡霉素，下文更详细地描述。
放线菌素
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种放线菌素。放线菌素是分离自链霉菌属细菌的抗肿瘤抗生素的亚类。放线菌素的代表性实例包括但不限于放线菌素D(更生霉素(Cosmegen)[也称为放线菌素、放线菌素D、放线菌素IV、放线菌素C1]，丹麦灵北公司(Lundbeck,Inc.))、安曲霉素、奇卡霉素A(chicamycin A)、DC-81、甲基胺茴霉素(mazethramycin)、新茴霉素A、新茴霉素B、泊罗霉素(porothramycin)、普拉卡素B(prothracarcin B)、SG2285、西班米星(sibanomicin)、西伯利亚霉素(sibiromycin)和茅屋霉素(tomaymycin)。在某些实施例中，D是吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)。PBD的实例包括但不限于安曲霉素、奇卡霉素A、DC-81、甲基胺茴霉素、新茴霉素A、新茴霉素B、泊罗霉素、普拉卡素B、SG2000(SJG-136)、SG2202(ZC-207)、SG2285(ZC-423)、西班米星、西伯利亚霉素和茅屋霉素。因此，在某些实施例中，D是放线菌素，例如放线菌素D，或PBD，例如吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)二聚体。
PBD的结构可以在例如美国专利申请公开第2013/0028917号和第2013/0028919号，以及第WO 2011/130598 A1号中找到，其各自通过引用整体并入本文。下面提供PBD的通用结构。
Figure BDA0004078574660000301
PBD在其芳族A环和吡咯并C环中的取代基的数目、类型和位置以及C环的饱和度方面不同。在B环中，通常在N10-C11位存在亚胺(N＝C)、甲醇胺(NH-CH(OH))或甲醇胺甲基醚(NH-CH(OMe))，N10-C11位是负责烷基化DNA的亲电中心。所有已知的天然产物在手性C11α位具有(S)-构型，当从C环向A环观察时，这为它们提供右旋扭曲。可以通过本文所公开的接头缀合至抗体的PBD的其它实例可见于例如美国专利申请公开第2013/0028917A1号和第2013/0028919A1号、美国专利第7,741,319B2号，以及WO 2011/130598 A1和WO 2006/111759 A1中，其各自通过引用整体并入本文。
蒽环类抗生素
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种蒽环类抗生素。蒽环类抗生素是分离自链霉菌属细菌的抗肿瘤抗生素的亚类。代表性实例包括但不限于柔红霉素(Cerubidine，Bedford Laboratories)、多柔比星(Adriamycin，Bedford Laboratories；也称为盐酸多柔比星、羟基柔红霉素和Rubex)、表柔比星(Ellence，辉瑞公司)和伊达比星(Idamycin；辉瑞公司)。因此，在某些实施例中，D是蒽环类抗生素，例如多柔比星。
卡利奇霉素
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种卡利奇霉素。卡利奇霉素是来源于土壤生物体棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)的烯二炔抗生素家族。卡利奇霉素结合DNA的小沟并诱导双链DNA断裂，导致细胞死亡，与其它化疗药物相比增加100倍(Damle等人(2003)《药理学当前观点》3:386)。已经描述了可在本公开中用作药物缀合物的卡利奇霉素的制备，参见美国专利第5,712,374号；第5,714,586号；第5,739,116号；第5,767,285号；第5,770,701号；第5,770,710号；第5,773,001号；以及第5,877,296号。可使用的卡利奇霉素的结构类似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG和θI 1(Hinman等人，《癌症研究》53:3336-3342(1993)，Lode等人，《癌症研究》58:2925-2928(1998)和上述美国专利第5,712,374号；第5,714,586号；第5,739,116号；第5,767,285号；第5,770,701号；第5,770,710号；第5,773,001号；以及第5,877,296号)。因此，在某些实施例中，D是卡利奇霉素。
多卡霉素
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种多卡霉素。多卡霉素是分离自链霉菌属细菌的抗肿瘤抗生素的亚类。(参见Nagamura和Saito(1998)《杂环化合物化学(Chemistry of Heterocyclic Compounds)》，第34卷，第12期)。多卡霉素结合DNA的小沟并在N3位烷基化核碱基腺嘌呤(Boger(1993)《理论化学与应用化学(Pure and Appl Chem)》65(6):1123；和Boger和Johnson(1995)《美国科学院院刊(PNAS USA)》92:3642)。多卡霉素的合成类似物包括但不限于阿多来新(adozelesin)、比折来新(bizelesin)和卡折来新(carzelesin)。因此，在某些实施例中，D是多卡霉素。
其它抗肿瘤抗生素
除了上述以外，可用于本公开的ADC中的另外的抗肿瘤抗生素包括博来霉素(Blenoxane，百时美施贵宝公司)、丝裂霉素(mitomycin)和普卡霉素(plicamycin，也称为光神霉素(mithramycin))。
免疫调节剂
在一些实施例中，本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种免疫调节剂。本文所用的术语“免疫调节剂”是指可刺激或改变免疫应答的药剂。在某些实施例中，免疫调节剂是增强受试者免疫应答的免疫刺激剂。在一些实施例中，免疫调节剂是免疫抑制剂，其预防或降低受试者的免疫应答。免疫调节剂可以调节骨髓细胞(单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、巨核细胞和粒细胞)或淋巴细胞(T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞)及其任何进一步分化的细胞。代表性实例包括但不限于卡介苗(BCG)和左旋咪唑(Ergamisol)。可用于本公开的ADC的免疫调节剂的其它实例包括但不限于癌症疫苗、细胞因子和免疫调节基因治疗。
癌症疫苗
本公开的接头可用于将抗体缀合至癌症疫苗。如本文所用，术语“癌症疫苗”是指引发肿瘤特异性免疫应答的组合物(例如，肿瘤抗原和细胞因子)。通过施用癌症疫苗，或在本公开的情况下，施用包含抗体和癌症疫苗的ADC，从受试者自身的免疫系统引发应答。在优选的实施例中，免疫应答导致体内肿瘤细胞(例如，原发性或转移性肿瘤细胞)的根除。癌症疫苗的使用通常涉及施用特定的抗原或抗原组，抗原或抗原组例如存在于特定癌细胞的表面上，或存在于显示促进癌症形成的特定感染剂的表面上。在一些实施例中，癌症疫苗的用途是用于预防目的，而在其它实施例中，该用途是用于治疗目的。可用于本文公开的ADC的癌症疫苗的非限制性实例包括重组二价人乳头瘤病毒(HPV)疫苗16型和18型疫苗(希瑞适(Cervarix)，葛兰素史克公司)、重组四价人乳头瘤病毒(HPV)6型、11型、16型和18型疫苗(加德西(Gardasil)，默克公司(Merck&Company))和sipuleucel-T(普列威(Provenge)，丹德里昂公司(Dendreon))。因此，在某些实施例中，D是癌症疫苗，其是免疫刺激剂或是免疫抑制剂。
细胞因子
本公开的接头可用于将抗体与至少一种细胞因子缀合。术语“细胞因子”通常是指由一种细胞群体释放的蛋白质，其作为细胞间介质作用于另一种细胞。细胞因子直接刺激肿瘤部位的免疫效应细胞和基质细胞并增强细胞毒性效应细胞对肿瘤细胞的识别(Lee和Margolin(2011)《癌症(Cancers)》3:3856)。许多动物肿瘤模型研究已经证明，细胞因子具有广泛的抗肿瘤活性，并且这已经被转化为用于许多基于细胞因子的癌症治疗方法(Lee和Margoli，同上)。近年来，许多细胞因子，包括GM-CSF、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21，已经进入晚期癌症患者的临床试验(Lee和Margoli，同上)。
可用于本公开的ADC的细胞因子的实例包括但不限于甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；前松弛素；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子；苗勒氏管抑制物；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，如NGF；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素α、β和γ、集落刺激因子(CSF)；粒细胞-巨噬细胞-C-SF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)，如IL-1、IL-la、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12；肿瘤坏死因子；以及其它多肽因子，包括LIF和试剂盒配体(KL)。如本文所用，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物活性等价物。因此，在某些实施例中，D是细胞因子。
集落刺激因子(CSF)
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种集落刺激因子(CSF)。集落刺激因子(CSF)是帮助骨髓产生红细胞的生长因子。因为一些癌症治疗(例如，化疗)可能会影响白细胞(其帮助对抗感染)，所以可以引入集落刺激因子以帮助支持白细胞水平和增强免疫系统。也可以在骨髓移植后使用集落刺激因子以帮助新的骨髓开始产生白细胞。可用于本文公开的ADC的CSF的代表性实例包括但不限于红细胞生成素(Epoetin)、非格司亭(filgrastim)(Neopogen)(也称为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；安进公司(Amgen,Inc.))、沙格司亭(sargramostim)(leukine(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和GM-CSF)；健赞公司(Genzyme Corporation))、promegapoietin和奥普瑞白介素(Oprelvekin)(重组IL-11；辉瑞公司)。因此，在某些实施例中，D是CSF。
基因治疗
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种核酸(直接或通过载体间接)用于基因治疗。基因治疗通常是指将遗传物质导入细胞，由此设计遗传物质以治疗疾病。由于涉及免疫调节剂，基因治疗用于刺激受试者抑制癌细胞增殖或杀死癌细胞的天然能力。在某些实施例中，本公开的ADC包含编码功能性治疗性基因的核酸，该功能性治疗性基因用于替换与癌症相关的突变的或以其它方式功能异常的(例如，截短的)基因。在其它实施例中，本公开的ADC包含编码或以其它方式提供用于产生治疗性蛋白质以治疗癌症的核酸。编码治疗性基因的核酸可以直接缀合至抗体，或者替代地通过载体缀合至抗体。可用于递送用于基因治疗的核酸的载体的实例包括但不限于病毒载体或脂质体。
烷化剂
本公开的接头可用于将抗体缀合至一种或多种烷化剂。烷化剂是一类将烷基附接到DNA的抗肿瘤化合物。可用于本公开的ADC的烷化剂的实例包括但不限于烷基磺酸盐、亚乙基亚胺、甲胺衍生物、环氧化物、氮芥、亚硝基脲、三嗪和肼。
烷基磺酸盐
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种烷基磺酸盐。烷基磺酸盐是具有以下通式的烷化剂的一个亚类：R-SO2-O-R1，其中R和R1通常是烷基或芳基。烷基磺酸盐的代表性实例是白消安(
Figure BDA0004078574660000331
葛兰素史克公司；Busulfex
Figure BDA0004078574660000332
PDL生物制药公司)。
氮芥
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种氮芥。这一亚类抗癌化合物的代表性实例包括但不限于苯丁酸氮芥(
Figure BDA0004078574660000333
葛兰素史克公司)、环磷酰胺(
Figure BDA0004078574660000334
百时美施贵宝公司；Neosar，辉瑞公司)、雌莫司汀(雌莫司汀磷酸钠或
Figure BDA0004078574660000337
)，辉瑞公司)、异环磷酰胺(
Figure BDA0004078574660000335
百时美施贵宝公司)、氮芥(
Figure BDA0004078574660000336
丹麦灵北公司)，和苯丙氨酸氮芥(
Figure BDA0004078574660000341
或
Figure BDA0004078574660000342
或苯丙氨酸氮芥；葛兰素史克公司)。
亚硝基脲
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种亚硝基脲。亚硝基脲是脂溶性烷化剂的一个亚类。代表性实例包括但不限于卡莫司汀(BCNU[也称为BiCNU，N,N-双(2-氯乙基)-N-亚硝基脲，或1,3-双(2-氯乙基)-1-亚硝基脲]，百时美施贵宝公司)、福莫司汀(也称为
Figure BDA0004078574660000343
)、洛莫司汀(CCNU或1-(2-氯乙基)-3-环己基-1-亚硝基脲，百时美施贵宝公司)、尼莫司汀(也称为ACNU)和链脲霉素(
Figure BDA0004078574660000344
梯瓦制药公司(TevaPharmaceuticals))。
三嗪和肼
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种三嗪或肼。三嗪和肼是含氮烷化剂的一个亚类。在一些实施例中，这些化合物自发分解或可以被代谢以产生烷基重氮中间体，其促进烷基转移至核酸、肽和/或多肽，从而引起诱变、致癌或细胞毒性作用。代表性实例包括但不限于达卡巴嗪(DTIC-Dome，拜耳医药保健公司(Bayer Healthcare PharmaceuticalsInc.))、丙卡巴肼(
Figure BDA0004078574660000345
西格玛托制药公司(Sigma-Tau Pharmaceuticals,Inc.))和替莫唑胺(
Figure BDA0004078574660000346
先灵葆雅公司(Schering Plough))。
其它烷化剂
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种乙烯亚胺、甲胺衍生物或环氧化物。乙烯亚胺是通常含有至少一个氮丙啶环的烷化剂的一个亚类。环氧化物代表烷化剂的一个亚类，其特征为仅具有三个环原子的环醚。
乙烯亚胺的代表性实例包括但不限于thiopeta(Thioplex，安进公司)、地吖醌(也称为氮丙啶基苯醌(AZQ))和丝裂霉素C。丝裂霉素C是含有氮丙啶环的天然产物，并且似乎通过交联DNA诱导细胞毒性(Dorr R T等人《癌症研究》1985；45:3510；Kennedy K A等人，《癌症研究》1985；45:3541)。甲胺衍生物及其类似物的代表性实例包括但不限于六甲蜜胺(Hexalen，MGI制药公司)，其也称为六甲胺和hexastat。这类抗癌化合物的环氧化物的代表性实例包括但不限于二去水卫矛醇。二去水卫矛醇(1,2:5,6-二去水卫矛醇)在化学上与氮丙啶相关，并且通常通过与上述类似的机理促进烷基的转移。二溴卫矛醇水解成二去水卫矛醇，因此是环氧化物的前药(Sellei C等人《癌症化疗报告(Cancer Chemother Rep.)》1969；53:377)。
抗血管生成剂
在一些实施例中，本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种抗血管生成剂。抗血管生成剂抑制新血管的生长。抗血管生成剂以多种方式发挥其作用。在一些实施例中，这些药剂干扰生长因子到达其靶标的能力。例如，血管内皮生长因子(VEGF)是通过与细胞表面上的特定受体结合而参与引发血管生成的主要蛋白质之一。因此，阻止VEGF与其同源受体相互作用的某些抗血管生成剂阻止VEGF引发血管生成。在其它实施例中，这些药剂干扰细胞内信号级联。例如，一旦细胞表面上的特定受体被触发，就启动其它化学信号的级联以促进血管的生长。因此，已知促进有助于例如细胞增殖的细胞内信号级联的某些酶(例如一些酪氨酸激酶)是癌症治疗的靶标。在其它实施例中，这些药剂干扰细胞间信号级联。然而，在其它实施例中，这些药剂使活化和促进细胞生长的特异性靶标失效或通过直接干扰血管细胞的生长而失效。已经在300多种具有许多直接和间接抑制作用的物质中发现了血管生成抑制性质。
可用于本公开的ADC的抗血管生成剂的代表性实例包括但不限于血管抑素、ABXEGF、C1-1033、PKI-166、EGF疫苗、EKB-569、GW2016、ICR-62、EMD 55900、CP358、PD153035、AG1478、IMC-C225(爱必妥(Erbitux)、ZD1839(易瑞沙(Iressa))、OSI-774、埃罗替尼(特罗凯(tarceva))、血管抑素、抑制蛋白、内皮抑素、BAY 12-9566和w/氟尿嘧啶或阿霉素、血管能抑素、羧胺三唑和紫杉醇、EMD121974、S-24、vitaxin、二甲基呫吨酮乙酸、IM862、白细胞介素-12、白细胞介素-2、NM-3、HuMV833、PTK787、RhuMab、血管酶(核酶)、IMC-1C11、新伐司他(Neovastat)、马立马司他(marimstat)、普马司他(prinomastat)、BMS-275291、COL-3、MM1270、SU101、SU6668、SU11248、SU5416、卡培他滨、吉西他滨和顺铂、伊立替康和顺铂、放射、替考加兰(tecogalan)、替莫唑胺(temozolomide)和PEG干扰素α2b、四硫钼酸盐、TNP-470、沙利度胺、CC-5013、泰索帝、肿瘤抑素(tumstatin)、2-甲氧基雌二醇、VEGF捕获剂、mTOR抑制剂(deforolimus、依维莫司(everolimus)(Afinitor，诺华制药公司)和替西罗莫司(temsirolimus)(Torisel，辉瑞公司))、酪氨酸激酶抑制剂(例如，埃罗替尼(Tarceva，基因科技公司(Genentech，Inc.))、伊马替尼(Gleevec，诺华制药公司)、吉非替尼(Iressa，阿斯利康制药公司(AstraZeneca Pharmaceuticals))、达沙替尼(Sprycel，百时美施贵宝公司)、舒尼替尼(Sutent，辉瑞公司)、尼罗替尼(Tasigna，诺华制药公司)、拉帕替尼(Tykerb，葛兰素史克制药公司)、索拉非尼(Nexavar，拜耳公司和Onyx公司)、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)。
抗代谢物
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种抗代谢物。抗代谢物是与细胞内正常物质非常相似的一种化学疗法治疗类型。当细胞将抗代谢物掺入细胞代谢中时，结果对细胞是负面的，例如细胞不能分裂。抗代谢物根据它们干扰的物质进行分类。可用于本公开的ADC中的抗代谢物的实例包括但不限于叶酸拮抗剂(例如，甲氨蝶呤)、嘧啶拮抗剂(例如，5-氟尿嘧啶、氟尿苷(Foxuridine)、阿糖胞苷、卡培他滨和吉西他滨)、嘌呤拮抗剂(例如，6-巯基嘌呤和6-硫代鸟嘌呤)和腺苷脱氨酶抑制剂(例如，克拉屈滨、氟达拉滨、奈拉滨和喷司他丁)，如下文更详细地描述的。
抗叶酸剂
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种抗叶酸剂。抗叶酸剂是结构上类似于叶酸的抗代谢物的一个亚类。代表性实例包括但不限于甲氨蝶呤、4-氨基叶酸(也称为氨基蝶呤和4-氨基蝶呤)、洛美曲索(LMTX)、培美曲塞(Alimpta，美国礼来公司(Eli Lilly andCompany))和三甲曲沙(Neutrexin，Ben Venue实验室公司)。
嘌呤拮抗剂
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种嘌呤拮抗剂。嘌呤类似物是抗代谢物的一个亚类，其结构类似于称为嘌呤类化合物。嘌呤拮抗剂的代表性实例包括但不限于硫唑嘌呤(Azasan，Salix；Imuran，葛兰素史克公司)、克拉屈滨(cladribine)(Leustatin[也称为2-CdA]，杨森生物技术公司(Janssen Biotech,Inc.))、巯嘌呤(Purinethol[也称为6-巯基乙醇]，葛兰素史克公司)、氟达拉滨(fludarabine)(Fludara，健赞公司)、喷司他丁(pentostatin)(Nipent，也称为2'-脱氧助间型霉素(DCF))、6-硫鸟嘌呤(Lanvis[也称为硫鸟嘌呤]，葛兰素史克公司)。
嘧啶拮抗剂
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种嘧啶拮抗剂。嘧啶拮抗剂是抗代谢物的一个亚类，其结构类似于称为嘌呤类化合物。嘧啶拮抗剂的代表性实例包括但不限于阿扎胞苷(Vidaza，新基公司(Celgene Corporation))、卡培他滨(Xeloda，罗氏研究所(RocheLaboratories))、阿糖胞苷(也称为阿糖胞苷和阿糖胞嘧啶，Bedford Laboratories)、地西他滨(Dacogen，卫材制药公司(Eisai Pharmaceuticals))、5-氟尿嘧啶(Adrucil，梯瓦制药公司；Efudex，威朗制药公司(Valeant Pharmaceuticals,Inc))、5-氟-2'-脱氧尿苷5'-磷酸(FdUMP)、5-氟尿嘧啶核苷三磷酸和吉西他滨(Gemzar，美国礼来公司)。
含硼剂
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种含硼剂。含硼剂包括一类干扰细胞增殖的癌症治疗化合物。含硼剂的代表性实例包括但不限于硼霉素(borophycin)和硼替佐米(bortezomib)(Velcade，Millenium制药公司)。
化学保护剂
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种化学保护剂。化学保护性药物是一类化合物，其有助于保护身体免受化疗的特定毒性作用。化学保护剂可以与各种化疗一起施用，以保护健康细胞免受化疗药物的毒性作用，同时允许用施用的化学治疗剂治疗癌细胞。代表性的化学保护剂包括但不限于氨磷汀(Ethyol，Medimmune公司)，其用于降低与顺铂、右雷佐生(Totect，Apricus制药公司；Zinecard)的累积剂量相关的肾毒性，用于治疗由施用蒽环类抗生素(Totect)引起的外渗，和用于治疗由施用抗肿瘤抗生素多柔比星(Zinecard)和美司钠(Mesnex，百时美施贵宝公司)引起的心脏相关并发症，其用于预防在用异环磷酰胺化疗期间的出血性膀胱炎。
激素剂
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种激素剂。激素剂(包括合成激素)是干扰内分泌系统内源性产生的激素的产生或活性的化合物。在一些实施例中，这些化合物干扰细胞生长或产生细胞毒性作用。非限制性实例包括雄激素、雌激素、醋酸甲羟孕酮(Provera，辉瑞公司)和孕激素。
抗激素剂
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种抗激素剂。“抗激素”剂是抑制某些内源性激素的产生和/或防止其功能的药剂。在某些实施例中，抗激素剂干扰选自雄激素、雌激素、孕酮和促性腺激素释放激素的激素的活性，从而干扰各种癌细胞的生长。抗激素剂的代表性实例包括但不限于氨鲁米特、阿那曲唑(anastrozole)(Arimidex，阿斯利康制药公司)、比卡鲁胺(bicalutamide)(Casodex，阿斯利康制药公司)，醋酸环丙孕酮(Cyprostat，拜耳公司(Bayer PLC))、地加瑞克(degarelix)(Firmagon，辉凌制药公司(FerringPharmaceuticals))、依西美坦(exemestane)(Aromasin，辉瑞公司)、氟他米特(flutamide)(Drogenil，先灵葆雅公司(Schering-Plough Ltd))、氟维司群(Faslodex，阿斯利康制药公司)、戈舍瑞林(goserelin)(Zolodex，阿斯利康制药公司)、来曲唑(Femara，诺华制药公司)、亮丙瑞林(Prostap)、利普安(lupron)、醋酸甲羟孕酮(Provera，辉瑞公司)、醋酸甲地孕酮(Megace，百时美施贵宝公司)、三苯氧胺(tamoxifen)(Nolvadex，阿斯利康制药公司)和曲普瑞林(triptorelin)(Decapetyl，辉凌制药公司)。
皮质类固醇
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种皮质类固醇。皮质类固醇可用于本公开的ADC中以减轻炎症。皮质类固醇的实例包括但不限于糖皮质激素，例如强的松(prednisone)(Deltasone，法玛西亚普强制药公司(Pharmacia&Upjohn Company)，辉瑞公司的分公司)。
光活性治疗剂
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种光活性治疗剂。光活性治疗剂包括在暴露于特定波长的电磁辐射时可用于杀死被处理细胞的化合物。治疗相关的化合物吸收穿透组织的波长的电磁辐射。在优选的实施例中，化合物以无毒形式施用，该无毒形式能够在充分活化时产生对细胞或组织有毒的光化学作用。在其它优选的实施例中，这些化合物被癌组织保留并且容易从正常组织中清除。非限制性实例包括各种发色团和染料。
寡核苷酸
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种寡核苷酸。寡核苷酸由短核酸链组成，其通过干扰遗传信息的加工而起作用。在一些实施例中，用于ADC的寡核苷酸是未修饰的单链和/或双链DNA或RNA分子，而在其它实施例中，这些治疗性寡核苷酸是化学修饰的单链和/或双链DNA或RNA分子。在某些实施例中，ADC中使用的寡核苷酸相对较短(19至25个核苷酸)并且与细胞中存在的核酸靶标总库中的独特核酸序列杂交。一些重要的寡核苷酸技术包括反义寡核苷酸(包括RNA干扰(RNAi))、适体、CpG寡核苷酸和核酶。
反义寡核苷酸
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种反义寡核苷酸。反义寡核苷酸被设计成通过沃森-克里克杂交与RNA结合。在一些实施例中，反义寡核苷酸与编码缀合抗体的区域、结构域、部分或片段的核苷酸互补。在一些实施例中，反义寡核苷酸包含约5至约100个核苷酸、约10至约50个核苷酸、约12至约35个核苷酸和约18至约25个核苷酸。
一旦寡核苷酸与靶RNA结合，可以利用多种机制来抑制RNA的功能(Crooke ST.(1999).《生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)》，1489，30-42)。最佳表征的反义机制导致靶RNA被内源性细胞核酸酶(如RNase H或与RNA干扰机制相关的核酸酶)切割。然而，通过非催化机制(如剪接或翻译抑制的调节)抑制靶基因表达的寡核苷酸也可以是有效的和选择性的基因功能调节剂。
最近受到大量关注的另一种依赖于RNA酶的反义机制是RNAi(Fire等人(1998).《自然(Nature)》，391，806-811；Zamore PD.(2002).《科学》，296，1265-1269)。RNA干扰(RNAi)是一种转录后过程，其中双链RNA以序列特异性方式抑制基因表达。在一些实施例中，通过引入相对较长的双链RNA(dsRNA)实现RNAi效应，而在优选的实施例中，通过引入较短的双链RNA(例如小干扰RNA(siRNA)和/或微RNA(miRNA))实现该RNAi效应。在又一实施例中，RNAi也可以通过引入生成与靶基因互补的dsRNA的质粒来实现。在每个前述实施例中，双链RNA被设计成干扰细胞内特定靶序列的基因表达。通常，该机制涉及将dsRNA转化为将核糖核酸酶导向同源mRNA靶的短RNA(综述，Ruvkun，《科学》2294:797(2001))，其然后降解相应的内源mRNA，从而导致基因表达的调节。值得注意的是，已经报道dsRNA具有抗增殖特性，这使得也可以设想治疗应用(Aubel等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA)》88:906(1991))。例如，已经显示合成的dsRNA抑制小鼠中的肿瘤生长(Levy等人《美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)》，62:357-361(1969))，在白血病小鼠的治疗中具有活性(Zeleznick等人，《实验生物学与医学学会学报(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.)》130:126-128(1969))，并且抑制小鼠皮肤中化学诱导的肿瘤发生(Gelboin等人，《科学》167:205-207(1970))。因此，在优选的实施例中，本公开提供了反义寡核苷酸在ADC中用于治疗乳腺癌的用途。在其它实施例中，本公开提供了用于启动反义寡核苷酸治疗的组合物和方法，其中dsRNA在mRNA水平上干扰EGFR的靶细胞表达。如上文所用，dsRNA是指天然存在的RNA、部分纯化的RNA、重组产生的RNA、合成的RNA，以及通过包括非标准核苷酸、非核苷酸物质、核苷酸类似物(例如锁定核酸(LNA))、脱氧核糖核苷酸及其任何组合而不同于天然存在的RNA的改变的RNA。本公开的RNA仅需要与天然RNA足够相似，其具有介导本文所述的基于反义寡核苷酸的调节的能力。
适体
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种适体。适体是基于其结合其它分子的能力从随机库中选出的核酸分子。与抗体一样，适体可以以非常好的亲和力和特异性结合靶分子。在许多实施例中，适体呈现允许它们与靶蛋白相互作用的复杂的、序列依赖性的三维形状，导致类似于抗体-抗原相互作用的紧密结合的复合物，从而干扰所述蛋白的功能。适体与它们的靶蛋白紧密和特异性结合的特定能力强调了其作为靶向分子疗法的潜力。
CpG寡核苷酸
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种CpG寡核苷酸。已知细菌和病毒DNA是人类先天免疫和特异性免疫的强活化剂。这些免疫学特征与在细菌DNA中发现的未甲基化的CpG二核苷酸基序有关。由于这些基序在人中很罕见，人类免疫系统已经发展出将这些基序识别为感染的早期指征并随后引发免疫应答的能力。因此，含有这种CpG基序的寡核苷酸可用于引发抗肿瘤免疫应答。
核酶
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种核酶。核酶是长度为约40至155个核苷酸的催化性RNA分子。核酶识别和切割特定RNA分子的能力使其成为潜在的治疗候选物。代表性实例包括血管酶。
放射性核素药剂(放射性同位素)
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种放射性核素药剂。放射性核素药剂包含以能够经历放射性衰变的不稳定核为特征的药剂。成功的放射性核素治疗的基础取决于癌细胞对放射性核素的足够浓度和长期保留。要考虑的其它因素包括放射性核素半衰期、发射颗粒的能量和发射颗粒可以行进的最大范围。在优选的实施例中，治疗剂是选自由以下组成的组的放射性核素：111In、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、64Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au和211Pb。还优选的是基本上随螺旋发射颗粒衰变的放射性核素。例如，Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111 1、Sb-119、1-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192。有用的β颗粒发射核素的衰变能量优选地为Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213和Fm-255。有用的发射α颗粒的放射性核素的衰变能量优选地为2,000至10,000keV，更优选地3,000至8,000keV，最优选地4,000至7,000keV。其它可用的潜在放射性同位素包括11C、13N、150、75Br、198Au、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、201Tl、225Ac、76Br、169Yb等。
放射增敏剂
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种放射增敏剂。本文所用的术语“放射增敏剂”定义为以治疗有效量施用于动物以增加待放射增敏的细胞对电磁辐射的敏感性和/或促进可用电磁辐射治疗的疾病的治疗的分子，优选地低分子量分子。放射增敏剂是使癌细胞对放射治疗更敏感，同时通常对正常细胞的作用小得多的药剂。因此，放射增敏剂可以与放射性标记的抗体或ADC联合使用。与单独用放射性标记的抗体或抗体片段治疗相比，加入放射增敏剂可以导致增强的功效。放射增敏剂描述于D.M.Goldberg(编辑)，《用放射性标记的抗体进行癌症治疗(Cancer Therapy with Radiolabeled Antibodies)》，CRC出版社(1995)。放射增敏剂的实例包括吉西他滨、5-氟尿嘧啶、紫杉烷和顺铂。
放射增敏剂可以通过X射线的电磁辐射活化。X射线活化的放射增敏剂的代表性实例包括但不限于以下：甲硝唑(metronidazole)、米索硝唑(misonidazole)、去甲基米索硝唑、哌莫硝唑(pimonidazole)、依他硝唑(etanidazole)、尼莫拉唑(nimorazole)、丝裂霉素C、RSU 1069、SR 4233、E09、RB 6145、烟酰胺(nicotinamide)、5-溴脱氧尿苷(BUdR)、5-碘脱氧尿苷(IUdR)、溴脱氧胞苷(bromodeoxycytidine)、氟脱氧尿苷(fluorodeoxyuridine)(FUdR)、羟基脲、顺铂及其治疗有效的类似物和衍生物。替代地，放射增敏剂可以使用光动力疗法(PDT)活化。光动力放射增敏剂的代表性实例包括但不限于血卟啉(hematoporphyrin)衍生物、光卟啉(Photofrin(r))、苯并卟啉衍生物、NPe6、锡初卟啉(tinetioporphyrin)(SnET2)、pheoborbide a、细菌叶绿素a、萘菁(naphthalocyanines)、酞菁(phthalocyanines)、酞菁锌及其治疗有效的类似物和衍生物。
拓扑异构酶抑制剂
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种拓扑异构酶抑制剂。拓扑异构酶抑制剂是设计用于干扰拓扑异构酶(拓扑异构酶I和II)的作用的化疗剂，拓扑异构酶是在正常细胞周期期间通过催化DNA链的磷酸二酯主链的断裂和再连接来控制DNA结构变化的酶。DNA拓扑异构酶I抑制剂的代表性实例包括但不限于喜树碱及其衍生物伊立替康(CPT-11，Camptosar，辉瑞公司)和拓扑替康(Hycamtin，葛兰素史克制药公司)。DNA拓扑异构酶II抑制剂的代表性实例包括但不限于安吖啶、柔红霉素、多柔比星、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxins)、玫瑰树碱(ellipticines)、表柔比星、依托泊苷、雷佐生和替尼泊苷。
酪氨酸激酶抑制剂
本公开的接头可用于将抗体缀合至至少一种酪氨酸激酶抑制剂。酪氨酸激酶是细胞内的酶，其功能是将磷酸基团附接到氨基酸酪氨酸。通过阻断蛋白酪氨酸激酶的功能，可以抑制肿瘤的生长。可用于本公开的ADC的酪氨酸激酶的实例包括但不限于阿西替尼(Axitinib)、博舒替尼(Bosutinib)、西地尼布(Cediranib)、达沙替尼(Dasatinib)、埃罗替尼(Erlotinib)、吉非替尼(Gefitinib)、伊马替尼(Imatinib)、拉帕替尼(Lapatinib)、来他替尼(Lestaurtinib)、尼罗替尼、塞马替尼(Semaxanib)、舒尼替尼(Sunitinib)和凡德他尼(Vandetanib)。
其它药剂
可用于本公开的ADC中的其它药剂的实例包括但不限于相思子毒素(abrin)(例如相思子毒素A链)、α毒素、油桐蛋白(Aleurites fordii proteins)、鹅膏毒素(amatoxin)、巴豆毒素(crotin)、毒蛋白(curcin)、双黄质蛋白(dianthin proteins)、白喉毒素(diptheria toxin)(例如白喉毒素A链和非结合活性片段)、脱氧核糖核酸酶(Dnase)、白树毒素(gelonin)、米托洁林(mitogellin)、蒴莲根毒素A链、苦瓜抑制剂、新霉素(neomycin)、豹蛙酶(onconase)、酚霉素(phenomycin)、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌内毒素(Pseudomonas endotoxin)、假单胞菌外毒素(Pseudomonasexotoxin)(例如外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)))、局限曲菌素(restrictocin)、蓖麻毒素A链、核糖核酸酶(Rnase)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、皂草素、α-八叠球菌素、葡萄球菌肠毒素-A、破伤风毒素(tetanus toxin)、顺铂、卡铂和奥沙利铂(Eloxatin，赛诺菲·安万特集团)、蛋白酶体抑制剂(例如PS-341[硼替佐米或万珂(Velcade)])、HDAC抑制剂(伏立诺他(vorinostat)(Zolinza，默克公司))、贝利司他(belinostat)、恩替司他(entinostat)、莫西替司他(mocetinostat)和帕比司他(panobinostat))、COX-2抑制剂、取代的脲、热休克蛋白抑制剂(例如格尔德霉素(Geldanamycin)及其多种类似物)、肾上腺皮质抑制剂和单端孢霉烯族化合物(tricothecenes)。(参见，例如，WO 93/21232)。其它药剂还包括天冬酰胺酶(Espar，丹麦灵北公司)、羟基脲、左旋咪唑、米托坦(Lysodren，百时美施贵宝公司)和维甲酸(Renova，威朗制药公司)。
应当注意，可以在本公开的ADC中使用的上述药物部分的组不是排他性的，因为药物的某些实例可以在多于一种类别中找到，例如，安丝菌素既是有丝分裂抑制剂又是抗肿瘤抗生素。
上述药物部分的所有立体异构体被考虑用于本公开的化合物，即在D的手性碳处的R和S构型的任何组合。
“可检测部分”或“标记”是指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、放射性或化学手段检测的组合物。例如，有用的标记包括32P、35S、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，通常用于ELISA中的酶)、生物素-链霉抗生物素蛋白、dioxigenin、半抗原和可获得抗血清或单克隆抗体的蛋白质，或具有与靶标互补的序列的核酸分子。可检测部分通常生成可测量的信号，例如放射性信号、颜色信号或荧光信号，其可用于定量样品中结合的可检测部分的量。信号的定量可以通过例如闪烁计数、密度计、流动细胞分析、ELISA，或通过环状或随后消化的肽的质谱直接分析(可以测定一种或多种肽)来完成。本领域技术人员熟悉感兴趣的标记化合物的技术和检测手段。这些技术和方法是常规的并且是本领域公知的。
用于检测的探针是指(i)能够提供可检测信号的材料，(ii)能够与第一探针或第二探针相互作用以改变由第一探针或第二探针提供的可检测信号(如荧光共振能量转移(FRET))的材料，(iii)能够稳定与抗原或配体的相互作用或增加结合亲和力的材料，(iv)能够通过物理参数(如电荷、疏水性等)影响电迁移率或细胞侵入性作用的材料，或(v)能够调节配体亲和力、抗原-抗体结合或离子复合物形成的材料。
在一些实施例中，每种活性剂独立地选自：
(a)埃罗替尼、硼替佐米、氟维司群、舒尼替尼、来曲唑、甲磺酸伊马替尼、PTK787/ZK222584、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、亚叶酸、雷帕霉素、拉帕替尼、洛那法尼(lonafarnib)、索拉非尼、吉非替尼、AG1478、AG1571、噻替哌、环磷酰胺、白消安、英丙舒凡(improsulfan)、哌泊舒凡(piposulfan)、苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)、乌瑞替哌、乙烯亚胺、六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺、三羟甲基三聚氰胺、泡番荔枝辛、布拉它辛酮(bullatacinone)、喜树碱、拓扑替康、苔藓抑素、卡莉司汀、CC-1065、阿多来新、卡折来新、比折来新、念珠藻素1、念珠藻素8、多拉司他汀、多卡霉素、KW-2189、CB1-TM1、软珊瑚醇、水鬼蕉碱、匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)、海绵抑制素(spongistatin)、苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、美法仑、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥、卡莫司汀、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀、环己亚硝脲(lomustine)、尼莫司汀、雷莫司汀、卡利奇霉素、卡利奇霉素γ1、卡利奇霉素ω1、达内霉素、达内霉素A、氯膦酸盐、埃斯培拉霉素、新制癌菌素生色团、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素、安曲霉素(antrmycin)、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡拉霉素、癌霉素、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、detorubucin、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、吗啉基-多柔比星、氰基吗啉基-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星、脂质体多柔比星、脱氧多柔比星、表柔比星、依索比星(esorubicin)、麻西罗霉素、丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链霉黑素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星、5-氟尿嘧啶、二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙、氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯、氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦、亚叶酸、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、阿莫司汀、比生群、依达曲沙、地磷酰胺、秋水仙胺、地吖醌(diaziquone)、依氟鸟氨酸(elfornithine)、依利醋铵、乙环氧啶、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、氯尼达明(lonidainine)、美登素、安丝菌素、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌达醇、二胺硝吖啶、喷司他丁、苯来美特(phenamet)、吡柔比星、洛索蒽醌、2-乙基酰肼、丙卡巴肼、多糖-k、雷佐生、根霉素(rhizoxin)、西佐喃、锗螺胺、细交链孢菌酮酸、三亚胺醌、2,2',2”-三氯三乙胺、T-2毒素、疣孢菌素A、杆孢菌素A和蛇形菌素、尿烷、长春地辛、达卡巴嗪、甘露莫司汀、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、gacytosine、阿拉伯糖苷、环磷酰胺、噻替哌、紫杉醇、白蛋白工程化的紫杉醇纳米颗粒制剂、多西他赛、苯丁酸氮芥、吉西他滨、6-硫鸟嘌呤、巯嘌呤、顺铂、卡铂、长春碱、铂、依托泊苷、异环磷酰胺、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨、诺消灵、替尼泊苷、依达曲沙、柔毛霉素(daunomycin)、氨喋呤(aminopterin)、希罗达(xeloda)、伊班膦酸盐、CPT-11、拓扑异构酶抑制剂RFS 2000、二氟甲基鸟氨酸、视黄酸、卡培他滨或前述任一项的药学上可接受的盐、溶剂化物或酸；
(b)单核因子、淋巴因子、传统多肽激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、松弛素、前松弛素、糖蛋白激素、促卵泡激素、促甲状腺激素、黄体生成素、肝生长因子、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、苗勒氏管抑制物、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、血小板生成素、红细胞生成素、骨诱导因子、干扰素、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、集落刺激因子(“CSF”)、巨噬细胞-CSF、粒细胞-巨噬细胞-CSF、粒细胞-CSF、白细胞介素(“IL”)、IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、肿瘤坏死因子、TNF-α、TNF-β、多肽因子、LIF、试剂盒配体，或任何前述的组合；
(c)白喉毒素、肉毒杆菌毒素(botulium toxin)、破伤风毒素(tetanus toxin)、痢疾毒素(dysentery toxin)、霍乱毒素(cholera toxin)、鹅膏蕈碱(amanitin)、鹅膏蕈碱衍生物、α-鹅膏蕈碱、吡咯并苯并二氮杂卓、吡咯并苯并二氮杂卓衍生物、河豚毒素(tetrodotoxin)、短裸甲藻毒素(brevetoxin)、雪卡毒素(ciguatoxin)、蓖麻毒素(ricin)、AM毒素、澳瑞他汀(auristatin)、微管溶素(tubulysin)、格尔德霉素(geldanamycin)、美登木素生物碱(maytansinoid)、卡利奇霉素、道诺霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤、长春地辛(vindesine)、SG2285、多拉司他汀、多拉司他汀类似物、念珠藻素、喜树碱、喜树碱衍生物和代谢物、根霉素、根霉素衍生物、CC-1065、CC-1065类似物或衍生物、多卡霉素、烯二炔抗生素、埃斯培拉霉素、埃博霉素(epothilone)、氨佐萘特(azonafide)、普立肽(aplidine)、类毒素，或任何前述的组合；
(d)亲和配体，其中亲和配体是底物、抑制剂、刺激剂、神经递质、放射性同位素，或任何前述的组合；
(e)放射性标记、32P、35S、荧光染料、电子致密试剂、酶、生物素、链霉抗生物素蛋白、dioxigenin、半抗原、免疫原性蛋白、具有与靶标互补的序列的核酸分子，或任何前述的组合；
(f)免疫调节化合物、抗癌剂、抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂和抗寄生虫剂，或任何前述的组合；
(g)它莫西芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基它莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、克奥昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)或托瑞米芬(toremifene)；
(h)4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、依西美坦(exemestane)、来曲唑(letrozole)或阿那曲唑(anastrozole)；
(i)氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙立德(leuprolide)、戈舍瑞林(goserelin)或曲沙他滨(troxacitabine)；
(j)芳香酶抑制剂；
(k)蛋白激酶抑制剂；
(l)脂质激酶抑制剂；
(m)反义寡核苷酸；
(n)核酶；
(o)疫苗；以及
(p)抗血管生成剂。
在一些优选的实施例中，G包含选自以下的部分：
Figure BDA0004078574660000451
Figure BDA0004078574660000461
Figure BDA0004078574660000471
Figure BDA0004078574660000481
Figure BDA0004078574660000491
Figure BDA0004078574660000501
Figure BDA0004078574660000511
Figure BDA0004078574660000521
其中
Figure BDA0004078574660000522
是将Z'连接到Ar的连接基团Z'的片段，在这种情况下是取代的Ph基团。
缀合策略
式I化合物可以在一步或两步缀合方法中制备。
一步缀合
在一些实施例中，本公开涉及制备式I化合物的方法，其涉及抗体与接头之间的一步缀合。上述式(II)和(III)的化合物适于与抗体一步缀合。
例如，含有甲基苯基砜部分(MPS)的前体可以根据方案1中所示的步骤顺序进行缀合。步骤A涉及原位消除对甲苯基磺酰基，导致形成反应性中间体；在步骤B中，中间体与抗体的硫醇残基缀合。
方案1.
Figure BDA0004078574660000531
如方案2所示，通过用羟胺或还原剂处理，可以进一步稳定所得ADC：
方案2.
Figure BDA0004078574660000532
在一些实施例中，含MPS的前体包含在亚磺酸消除后产生活化的迈克尔受体的部分。此类前体的实例示于方案3中。
方案3.
Figure BDA0004078574660000541
在一些实施例中，前体包含在缀合反应中充当活化的迈克尔受体的部分。与活化的迈克尔受体的缀合反应的实例示于方案4中。
方案4.
Figure BDA0004078574660000542
在一些实施例中，用于一步缀合的前体含有马来酰亚胺。含硫醇的抗体与含马来酰亚胺的前体的缀合的实例示于方案5中。含马来酰亚胺基甲基环己烷-1-羧酸酯(Mal-mcc)接头的前体示于部分A中；具有直接结合至PEG间隔基的蜜亚胺(melimide)部分的前体示于部分B中。
方案5.
Figure BDA0004078574660000551
两步缀合
在一些实施例中，本公开涉及制备式I的化合物的制备方法，其涉及两步缀合。第一步包括抗体与接头的缀合，其中接头以反应性基团(如叠氮化物或炔烃)封端。在第二步中，含有抗体的前体与含有活性剂的前体发生反应，生成最终的ADC。
在一些实施例中，两步法的第一步涉及抗体与含有上文“一步缀合”部分中公开的任何反应性基团的前体的缀合。用于第一缀合步骤的示例性前体示于方案6中。
方案6.
Figure BDA0004078574660000561
在一些实施例中，缀合方法的第二步涉及使第一步中获得的含抗体的前体与含活性剂的前体反应。含活性剂的前体包含与第一步中获得的前体的反应性基团互补的反应性基团。例如，含抗体的前体用叠氮化物封端，含活性剂的前体用炔烃封端，反之亦然。含活性剂的前体的实例示于方案7中。
方案7.
Figure BDA0004078574660000562
Figure BDA0004078574660000571
抗B7-H3抗体
示例性抗B7-H3抗体包括本文表19至24中提及的抗体，或其任何片段、变体、多聚体形式或双特异性物。类似地，抗B7-H3抗体可以是与表19至24中所列抗体结合相同表位的抗体或其任何片段、变体、多聚体形式或双特异性变体。本公开的合适的抗B7-H3抗体包括完全人单克隆抗体，以及人源化单克隆抗体和嵌合抗体，或其任何片段、变体、多聚体形式或双特异性物。这些抗体表现出对人B7-H3的特异性，并且它们已经表现出调节，例如阻断、抑制、降低、拮抗、中和或以其它方式干扰B7-H3的至少一种生物学功能或活性。
当B7-H3在抗体存在下的功能活性水平与B7-H3不与本文所述抗体结合时的功能活性水平相比降低至少95％，例如96％、97％、98％、99％或100％时，认为抗体完全调节、阻断、抑制、降低、拮抗、中和或以其它方式干扰B7-H3的至少一种功能活性。当B7-H3在抗体存在下的功能活性水平与B7-H3不与本文所述抗体结合时的功能活性水平相比降低小于95％，例如10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％或90％时，认为抗体部分调节、阻断、抑制、降低、拮抗、中和或以其它方式干扰B7-H3的至少一种功能活性。
本文所述的每种抗B7-H3单克隆抗体或其任何片段、变体、多聚体形式或双特异性变体包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，如表20至24中所列的氨基酸和相应核酸序列所示。
定义
除非本文另有定义，否则本申请中使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。通常，与本文所述的化学、细胞和组织培养、分子生物学、细胞和癌症生物学、神经生物学、神经化学、病毒学、免疫学、微生物学、药理学、遗传学以及蛋白质和核酸化学相关使用的命名法和技术是本领域熟知和常用的那些。
除非另有说明，否则本公开的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行，并且如贯穿本说明书引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述。参见，例如《神经科学原理(Principles of Neural Science)》，纽约州纽约市McGraw-Hill Medical出版社(2000)；Motulsky，《直观生物统计学(Intuitive Biostatistics)》，牛津大学出版社(Oxford University Press,Inc.)(1995)；Lodish等人，《分子细胞生物学(MolecularCell Biology)》第4版，纽约W.H.Freeman&Co.出版社(2000)；Griffiths等人，《遗传分析导论(Introduction to Genetic Analysis)》第7版，纽约W.H.Freeman&Co.出版社(1999)；以及Gilbert等人，《发育生物学(Developmental Biology)》第6版，马塞诸塞州桑德兰Sinauer Associates出版社(2000)。
除非本文另有定义，否则本文所用的化学术语根据本领域的常规用法使用，如《McGraw-Hill化学术语词典》，Parker S.编辑，麦格劳希尔出版社，加利福尼亚州旧金山(1985)中所示。
本申请中提及的所有上述和任何其它出版物、专利和公开的专利申请通过引用具体并入本文。在冲突的情况下，以本说明书(包括其具体定义)为准。
术语“药剂”在本文中用于表示化学化合物(如有机或无机化合物、化学化合物的混合物)、生物大分子(如核酸、抗体，包括其部分以及人源化、嵌合和人抗体和单克隆抗体、蛋白质或其部分，例如肽、脂质、碳水化合物)，或由生物材料(如细菌、植物、真菌或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织)制成的提取物。药剂包括例如结构已知的药剂和结构未知的药剂。此类药剂抑制AR或促进AR降解的能力可以使得它们适合作为本公开的方法和组合物中的“治疗剂”。
“患者”、“受试者”或“个体”可以互换使用并且是指人或非人动物。这些术语包括哺乳动物，如人、灵长类、家畜动物(包括牛、猪等)、伴侣动物(例如，犬科动物、猫科动物等)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。
“治疗”病状或患者是指采取步骤以获得有益或期望的结果，包括临床结果。如本文所用，并且如本领域所熟知的，“治疗”是用于获得有益或期望的结果(包括临床结果)的方法。有益的或期望的临床结果可以包括但不限于缓解或改善一种或多种症状或病状、减轻疾病程度，稳定(即不恶化)疾病状态、预防疾病传播、延迟或减缓疾病进展、改善或减轻疾病状态，以及缓解(部分或全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”也可以指与未接受治疗的预期存活相比延长存活。
术语“预防”是本领域公认的，并且当与病状(如局部复发(例如，疼痛))、疾病(如癌症)、症候(如心力衰竭)或任何其它医学病状相关使用时，是本领域充分理解的，并且包括施用组合物，该组合物相对于未接受组合物的受试者降低受试者中医学病状的症状的频率或延迟其发作。因此，癌症的预防包括例如相对于未治疗的对照群体减少接受预防性治疗的患者群体中可检测的癌性生长的数量，和/或相对于未治疗的对照群体延迟治疗群体中可检测的癌性生长的出现，例如延迟统计学上和/或临床上显著的量。
可以使用本领域技术人员已知的多种方法中的一种向受试者“施用”或“给药”物质、化合物或药剂。例如，化合物或药剂可以静脉内、动脉内、皮内、肌内、腹膜内、皮下、眼部、舌下、口服(通过摄取)、鼻内(通过吸入)、脊柱内、脑内和透皮(通过吸收，例如通过皮肤管)施用。化合物或药剂还可以适当地通过可再充电的或可生物降解的聚合物装置或其它装置(例如，贴剂和泵或制剂)引入，这些装置提供该化合物或药剂的延长的、缓慢的或受控的释放。施用也可以例如进行一次、多次和/或在一个或多个延长的时期内进行。
向受试者施用物质、化合物或药剂的合适方法还将取决于例如受试者的年龄和/或身体状况以及化合物或药剂的化学和生物性质(例如，溶解度、可消化性、生物利用度、稳定性和毒性)。在一些实施例中，化合物或药剂口服施用，例如通过摄入施用于受试者。在一些实施例中，口服施用的化合物或药剂呈延长释放或缓慢释放制剂，或使用用于此类缓慢释放或延长释放的装置施用。
如本文所用，短语“联合施用”是指两种或更多种不同治疗剂的任何施用形式，使得当先前施用的治疗剂在体内仍有效时施用第二药剂(例如，两种药剂在患者体内同时有效，这可以包括两种药剂的协同作用)。例如，不同的治疗化合物可以在同一制剂中或在分开的制剂中同时或依次施用。因此，接受这种治疗的个体可以受益于不同治疗剂的联合效果。
药物或药剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是当施用于受试者时将具有预期治疗效果的药物或药剂的量。通过施用一个剂量不一定会产生完全的治疗效果，并且可以仅在施用一系列剂量后才会产生。因此，治疗有效量可以在一次或多次给药中施用。受试者所需的精确有效量将取决于例如受试者的体型、健康状况和年龄，以及所治疗的病状(如癌症或MDS)的性质和程度。技术人员可以通过常规实验容易地确定对于给定情况的有效量。
如本文所用，术语“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括其中事件或情况发生的情况以及其中事件或情况不发生的情况。例如，“任选地取代的烷基”是指烷基可以被取代以及其中烷基未被取代。
应当理解，本发明化合物上的取代基和取代模式可以由本领域普通技术人员选择以得到化学稳定的化合物，其可以通过本领域已知的技术以及下文所述的那些方法由容易获得的原料容易地合成。如果取代基本身被多于一个基团取代，应当理解这些多个基团可以在相同的碳上或在不同的碳上，只要得到稳定的结构。
如本文所用，术语“任选地取代的”是指用特定取代基代替给定结构中的一至六个氢原子，取代基包括但不限于：羟基、羟烷基、烷氧基、卤素、烷基、硝基、甲硅烷基、酰基、酰氧基、芳基、环烷基、杂环基、氨基、氨基烷基、氰基、卤代烷基、卤代烷氧基、-OCO-CH2-O-烷基、-OP(O)(O-烷基)2或-CH2-OP(O)(O-烷基)2。优选地，“任选地取代的”是指用上述取代基代替给定结构中的一至四个氢原子。更优选地，一至三个氢取代基被如上所述的取代基代替。应当理解，取代基可以被进一步取代。
如本文所用，术语“烷基”是指饱和脂族基团，包括但不限于C1-C10直链烷基或C1-C10支链烷基。优选地，“烷基”是指C1-C6直链烷基或C1-C6支链烷基。最优选地，“烷基”是指C1-C4直链烷基或C1-C4支链烷基。“烷基”的实例包括但不限于甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、1-戊基、2-戊基、3-戊基、新戊基、1-己基、2-己基、3-己基、1-庚基、2-庚基、3-庚基、4-庚基、1-辛基、2-辛基、3-辛基或4-辛基等。“烷基”基团可以任选地被取代。
术语“酰基”是本领域公认的，并且是指由通式烃基C(O)-，优选地烷基C(O)-表示的基团。
术语“酰基氨基”是本领域公认的，并且是指被酰基取代的氨基，并且可以例如由式烃基C(O)NH-表示。
术语“酰氧基”是本领域公认的，并且是指由通式烃基C(O)O-，优选地烷基C(O)O-表示的基团。
术语“烷氧基”是指具有与其附接的氧的烷基。代表性的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。
术语“烷氧基烷基”是指被烷氧基取代的烷基，并且可以由通式烷基-O-烷基表示。
术语“烷基”是指饱和脂族基团，包括直链烷基、支链烷基、环烷基(脂环族)、烷基取代的环烷基和环烷基取代的烷基。在优选的实施例中，直链或支链烷基在其主链中具有30个或更少的碳原子(例如，对于直链为C1-30，对于支链为C3-30)，并且更优选地20个或更少。
此外，在整个说明书、实例和权利要求书中使用的术语“烷基”旨在包括未取代的和取代的烷基，后者是指具有代替烃主链的一个或多个碳上的氢的取代基的烷基部分，包括卤代烷基，如三氟甲基和2,2,2-三氟乙基等。
当与化学部分(如酰基、酰氧基、烷基、烯基、炔基或烷氧基)结合使用时，术语“Cx-y”或“Cx-Cy”意在包括在链中含有x至y个碳的基团。C0烷基表示氢，其中基团在末端位置，如果在内部则为键。C1-6烷基例如在链中含有一至六个碳原子。
本文所用的术语“烷基氨基”是指被至少一个烷基取代的氨基。
本文所用的术语“烷硫基”是指被烷基取代的硫醇基，并且可以由通式烷基S-表示。
本文所用的术语“酰胺”是指基团
Figure BDA0004078574660000611
其中R9和R10各自独立地表示氢或烃基，或R9和R10与它们所附接的N原子一起构成在环结构中具有4至8个原子的杂环。
术语“胺”和“氨基”是本领域公认的，并且是指未取代的和取代的胺及其盐，例如，可以由以下表示的部分：
Figure BDA0004078574660000621
其中R9、R10和R10'各自独立地表示氢或烃基，或R9和R10与它们所附接的N原子一起构成在环结构中具有4至8个原子的杂环。
本文所用的术语“氨基烷基”是指被氨基取代的烷基。
本文所用的术语“芳烷基”是指被芳基取代的烷基。
本文所用的术语“芳基”包括取代或未取代的单环芳族基团，其中环的每个原子是碳。优选地，环是5至7元环，更优选地6元环。术语“芳基”还包括具有两个或更多个环的多环体系，其中两个或更多个碳为两个相邻环所共有，其中至少一个环是芳族的，例如，其它环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基。芳基包括苯、萘、菲、苯酚、苯胺等。
术语“氨基甲酸酯”是本领域公认的并且是指基团
Figure BDA0004078574660000622
其中R9和R10独立地表示氢或烃基。
本文所用的术语“碳环基烷基”是指被碳环基取代的烷基。
术语“碳环”包括5至7元单环和8至12元双环。双环碳环的每个环可以选自饱和环、不饱和环和芳族环。碳环包括双环分子，其中在两个环之间共享一个、两个或三个或更多个原子。术语“稠合碳环”是指双环碳环，其中每个环与另一个环共享两个相邻原子。稠合碳环的每个环可以选自饱和环、不饱和环和芳族环。在一个示例性实施例中，芳环，例如苯基，可以与饱和或不饱和环(例如环己烷、环戊烷或环己烯)稠合。当化合价允许时，饱和、不饱和和芳族双环的任何组合包括在碳环的定义中。示例性的“碳环”包括环戊烷、环己烷、二环[2.2.1]庚烷、1,5-环辛二烯、1,2,3,4-四氢化萘、二环[4.2.0]辛-3-烯、萘和金刚烷。示例性的稠合碳环包括十氢化萘、萘、1,2,3,4-四氢化萘、双环[4.2.0]辛烷、4,5,6,7-四氢-1H-茚和双环[4.1.0]庚-3-烯。“碳环”可以在能够携带氢原子的任何一个或多个位置被取代。
本文所用的术语“碳环基烷基”是指被碳环基取代的烷基。
术语“碳酸酯”是本领域公认的，并且是指基团-OCO2-。
本文所用的术语“羧基”是指由式-CO2H表示的基团。
本文所用的术语“酯”是指基团-C(O)OR9，其中R9表示烃基。
本文所用的术语“醚”是指通过氧与另一烃基连接的烃基。因此，烃基的醚取代基可以是烃基-O-。醚可以是对称的或不对称的。醚的实例包括但不限于杂环-O-杂环和芳基-O-杂环。醚包括“烷氧基烷基”，其可以由通式烷基-O-烷基表示。
本文所用的术语“卤代”和“卤素”是指卤素，并且包括氯、氟、溴和碘。
本文所用的术语“杂芳烷基”和“杂芳烷基”是指被杂芳基取代的烷基。
术语“杂芳基(heteroaryl)”和“杂芳基(hetaryl)”包括取代或未取代的芳族单环结构，优选地5至7元环，更优选地5至6元环，其环结构包括至少一个杂原子，优选地一至四个杂原子，更优选地一或两个杂原子。术语“杂芳基(heteroaryl)”和“杂芳基(hetaryl)”还包括具有两个或更多个环的多环体系，其中两个或更多个碳为两个相邻环所共有，其中至少一个环是杂芳族的，例如，其它环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基。杂芳基包括例如吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、唑、噻唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。
本文所用的术语“杂原子”是指除碳或氢以外的任何元素的原子。优选的杂原子是氮、氧和硫。
本文所用的术语“杂环基烷基”是指被杂环基团取代的烷基。
术语“杂环基”、“杂环”和“杂环的”是指取代或未取代的非芳族环结构，优选地3至10元环，更优选地3至7元环，其环结构包括至少一个杂原子，优选地一至四个杂原子，更优选地一或两个杂原子。术语“杂环基”和“杂环的”还包括具有两个或更多个环的多环体系，其中两个或更多个碳为两个相邻环所共有，其中至少一个环是杂环的，例如，其它环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基。杂环基包括例如哌啶、哌嗪、吡咯烷、吗啉、内酯、内酰胺等。
如本文所用，术语“烃基”是指通过碳原子键合的基团，其不具有＝O或＝S取代基，并且通常具有至少一个碳-氢键和主要碳主链，但可以任选地包括杂原子。因此，对于本申请的目的，基团(如甲基、乙氧基乙基、2-吡啶基和甚至三氟甲基)被认为是烃基，但取代基(如乙酰基(其在连接碳上具有＝O取代基)和乙氧基(其通过氧而不是碳连接))不是烃基。烃基包括但不限于芳基、杂芳基、碳环、杂环、烷基、烯基、炔基及其组合。
本文所用的术语“羟基烷基”是指被羟基取代的烷基。
当与化学部分(如酰基、酰氧基、烷基、烯基、炔基或烷氧基)结合使用时，术语“低级”意在包括其中在取代基中存在十个或更少，优选地六个或更少的原子的基团。例如，“低级烷基”是指含有十个或更少碳原子，优选地六个或更少碳原子的烷基。在某些实施例中，本文定义的酰基、酰氧基、烷基、烯基、炔基或烷氧基取代基分别是低级酰基、低级酰氧基、低级烷基、低级烯基、低级炔基或低级烷氧基，无论它们是单独出现还是与其它取代基组合出现，例如在叙述羟基烷基和芳烷基中(在这种情况下，例如，当计算烷基取代基中的碳原子时，不计算芳基中的原子)。
术语“多环基”、“多环”和“多环的”是指两个或更多个环(例如，环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基)，其中两个或更多个原子为两个相邻所共有，例如环是“稠环”。多环的每个环可以是取代的或未取代的。在某些实施例中，多环的每个环在环中含有3至10个原子，优选地5至7个原子。
术语“硫酸酯”是本领域公认的，并且是指基团-OSO3H，或其药学上可接受的盐。
术语“磺酰胺”是本领域公认的，并且是指由以下通式表示的基团：
Figure BDA0004078574660000641
其中R9和R10独立地表示氢或烃基。
术语“亚砜”是本领域公认的，并且是指基团-S(O)-。
术语“磺酸酯”是本领域公认的，并且是指基团SO3H，或其药学上可接受的盐。
术语“砜”是本领域公认的，并且是指基团-S(O)2-。
术语“取代的”是指具有代替主链的一个或多个碳上的氢的取代基的部分。应当理解，“取代”或“被……取代”包括隐含的条件，即这种取代与被取代的原子和取代基的允许化合价一致，并且该取代产生稳定的化合物，例如，其不会自发地经历转化，例如通过重排、环化、消除等。如本文所用，术语“取代的”预期包括有机化合物的所有可允许的取代基。在广义方面，可允许的取代基包括有机化合物的非环状和环状、支化和非支化、碳环和杂环、芳族和非芳族取代基。对于合适的有机化合物，可允许的取代基可以是一个或多个并且可以相同或不同。出于本发明的目的，如氮等杂原子可以具有氢取代基和/或本文所述的有机化合物的满足杂原子的化合价的任何可允许的取代基。取代基可以包括本文所述的任何取代基，例如卤素、羟基、羰基(如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、硫代羰基(如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、亚膦酸酯、氨基、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚磺酰氨基、磺酰基、杂环基、芳烷基或芳族或杂芳族部分。本领域技术人员应理解，如果合适，烃链上被取代的部分本身也可以被取代。
本文所用的术语“硫代烷基”是指被硫醇基团取代的烷基。
本文所用的术语“硫酯”是指基团-C(O)SR9或-SC(O)R9
其中R9表示烃基。
本文所用的术语“硫醚”等同于其中氧被硫替代的醚。
术语“脲”是本领域公认的，并且可以由以下通式表示：
Figure BDA0004078574660000651
其中R9和R10独立地表示氢或烃基。
本文所用的术语“调节”包括抑制或压制功能或活性(如细胞增殖)以及增强功能或活性。
“药学上可接受的盐”或“盐”在本文中用于指适用于患者的治疗或与患者的治疗相容的酸加成盐或碱加成盐。
本文所用的术语“药学上可接受的酸加成盐”意指由式I表示的任何碱化合物的任何无毒有机或无机盐。形成合适的盐的示例性无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸，以及金属盐，如正磷酸一氢钠和硫酸氢钾。形成合适的盐的示例性有机酸包括单羧酸、二羧酸和三羧酸，如乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸和水杨酸，以及磺酸，如对甲苯磺酸和甲磺酸。可以形成单酸盐或二酸盐，并且这些盐可以以水合、溶剂化或基本上无水的形式存在。通常，式I化合物的酸加成盐更易溶于水和各种亲水性有机溶剂中，并且与其游离碱形式相比通常表现出更高的熔点。适当盐的选择是本领域技术人员已知的。其它非药学上可接受的盐(例如，草酸盐)可用于(例如)分离实验室使用的式I化合物或用于随后转化成药学上可接受的酸加成盐。
本文所用的术语“药学上可接受的碱加成盐”意指由式I表示的任何酸化合物或其任何中间体的任何无毒有机或无机碱加成盐。形成合适盐的示例性无机碱包括氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁或氢氧化钡。形成合适盐的示例性有机碱包括脂族、脂环族或芳族有机胺，如甲胺、三甲胺和甲基吡啶或氨。适当盐的选择是本领域技术人员已知的。
可用于本公开的方法和组合物中的许多化合物在其结构中具有至少一个立体中心。该立体中心可以以R或S构型存在，所述R和S符号与《理论化学与应用化学(PureAppl.Chem.)》中描述的规则一致地使用(1976)，45，11-30。本公开涵盖化合物、盐、前药或其混合物(包括立体异构体的所有可能的混合物)的所有立体异构形式，如对映异构体和非对映异构体形式。参见，例如，WO 01/062726。
在某些实施例中，本公开的化合物可以是外消旋的。在某些实施例中，本公开的化合物可以富含一种对映异构体。例如，本公开的化合物可以具有大于约30％ee、40％ee、50％ee、60％ee、70％ee、80％ee、90％ee、95％ee、96％ee、97％ee、98％ee、99％ee或更大ee。
如本领域通常理解的，没有立体化学绘制的单键不表示化合物的立体化学。式I化合物提供了没有指明立体化学的化合物的实例。
在某些实施例中，可以富集本公开的组合物或化合物以主要提供化合物的一种对映异构体。对映异构体富集的组合物或化合物可以包含例如至少60mol％的一种对映异构体，或更优选地至少75、90、95或甚至99mol％。在某些实施例中，富含一种对映异构体的化合物基本上不含另一种对映异构体，其中基本上不含意指与例如在组合物或化合物混合物中的另一种对映异构体的量相比，所讨论的物质构成小于10％，或小于5％，或小于4％，或小于3％，或小于2％，或小于1％。例如，如果组合物或化合物含有98克的第一对映异构体和2克的第二对映异构体，则认为其含有98mol％的第一对映异构体和仅2mol％的第二对映异构体。
此外，含有烯基的某些化合物可以作为Z(zusammen)或E(entgegen)异构体存在。在每种情况下，本公开包括混合物和单独的单个异构体。
一些化合物也可以以互变异构形式存在。尽管未在本文所述的式中明确指出，但这些形式旨在包括在本公开的范围内。
“前药”或“药学上可接受的前药”是指在施用后在宿主中代谢(例如水解或氧化)以形成本公开的化合物(例如，式I的化合物)的化合物。前药的典型实例包括在活性化合物的官能部分上具有生物不稳定或可裂解(保护)基团的化合物。前药包括可被氧化、还原、胺化、脱胺、羟基化、脱羟基化、水解、脱氢、烷基化、脱烷基化、酰化、脱酰化、磷酸化或脱磷酸化以产生活性化合物的化合物。使用酯或氨基磷酸酯作为生物不稳定或可裂解(保护)基团的前药的实例公开于美国专利6,875,751、7,585,851和7,964,580中，其公开内容通过引用并入本文。本公开的前药被代谢以产生式I的化合物。本公开在其范围内包括本文所述的化合物的前药。选择和制备合适的前药的常规方法描述于例如《前药的设计(Design ofProdrugs)》，编辑H.Bundgaard，爱思唯尔出版社(Elsevier)，1985。
本文所用的术语“溶解度对数”、“LogS”或“logS”在本领域中用于定量化合物的水溶解度。化合物的水溶解度显著影响其吸收和分布特性。低溶解度常常伴随着差的吸收。LogS值是以mol/升为单位测量的溶解度的单位剥离对数(以10为底)。
制备抗体的一般方法
本领域已知的各种方法可用于产生针对给定靶标(例如，B7-H3)、肿瘤相关抗原或其它靶标，或针对其衍生物、片段、类似物、同源物或直向同源物的多克隆或单克隆抗体。(参见，例如，《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》，Harlow E和LaneD，1988，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约冷泉港，其通过引用并入本文)。
抗体可以通过众所周知的技术纯化，如使用蛋白A或蛋白G的亲和层析，其主要提供免疫血清的IgG部分。随后，或替代地，可以将作为所寻求的免疫球蛋白的靶标的特异性抗原或其表位固定在柱上，以通过免疫亲和层析纯化免疫特异性抗体。例如，D.Wilkinson(《科学家(The Scientist)》，由科学家公司(Scientist,Inc.)出版，宾夕法尼亚州费城，第14卷，第8期(2000年4月17日)，第25至28也)讨论了免疫球蛋白的纯化。
在一些实施例中，本公开的抗体是单克隆抗体。例如，通过使用本文提供的实例中所述的方法生成单克隆抗体。也可以生成抗体，例如通过用在其表面表达高水平的给定靶标的细胞转染子的组合免疫BALB/c小鼠。然后筛选由骨髓瘤/B细胞融合产生的杂交瘤对所选靶标的反应性。
例如，使用杂交瘤方法制备单克隆抗体，如Kohler和Milstein，《自然》，256:495(1975)中描述的那些方法。在杂交瘤方法中，通常用免疫剂免疫小鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物以激发产生或能够产生将与免疫剂特异性结合的抗体的淋巴细胞。替代地，可以在体外免疫淋巴细胞。
免疫剂通常包括蛋白抗原、其片段或其融合蛋白。通常，如果需要人来源的细胞，则使用外周血淋巴细胞，或者如果需要非人哺乳动物来源的细胞，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂(如聚乙二醇)将淋巴细胞与永生化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，《单克隆抗体：原理和实践(Monoclonal Antibodies:Principles andPractice)》，学术出版社(Academic Press)，(1986)第59至103页)。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可以在合适的培养基中培养，该培养基优选地含有一种或多种抑制未融合的永生化细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(“HAT培养基”)，这些物质阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。
优选的永生化细胞系是有效融合、支持所选抗体生产型细胞稳定高水平表达抗体并且对培养基(如HAT培养基)敏感的那些细胞系。更优选的永生化细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，其可以从例如加利福尼亚州圣地亚哥的索尔克研究所细胞分配中心(Salk InstituteCell Distribution Center,San Diego,California)和弗吉尼亚州马纳萨斯的美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)获得。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已被描述用于生产单克隆抗体。(参见Kozbor，《免疫学杂志(J.Immunol.)》，133:3001(1984)；Brodeur等人，《单克隆抗体生产技术和应用(Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications)》，马塞尔·德克尔出版社(Marcel Dekker,Inc.)，纽约，(1987)第51至63页))。
然后可以测定培养杂交瘤细胞的培养基中针对抗原的单克隆抗体的存在。优选地，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定(如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来确定。此类技术和测定是本领域已知的。单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过Munson和Pollard，《分析生物化学(Anal.Biochem.)》，107:220(1980)的斯卡查德分析(Scatchard analysis)来确定。此外，在单克隆抗体的治疗应用中，重要的是鉴定对靶抗原具有高度特异性和高结合亲和力的抗体。
在鉴定了所需的杂交瘤细胞后，可通过有限稀释方法亚克隆克隆，并通过标准方法培养。(参见Goding，《单克隆抗体：原理和实践》，学术出版社，(1986)第59至103页)。用于此目的的合适培养基包括，例如，达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco's ModifiedEagle's Medium)和RPMI-1640培养基。替代地，杂交瘤细胞可以作为腹水在哺乳动物体内生长。
亚克隆分泌的单克隆抗体可以通过常规免疫球蛋白纯化方法从培养基或腹水中分离或纯化，例如蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
单克隆抗体也可以通过重组DNA方法制备，如美国专利第4,816,567号中描述的那些方法。使用常规方法(例如，通过使用能够特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)可以容易地分离和测序编码本公开的单克隆抗体的DNA。本公开的杂交瘤细胞用作此类DNA的优选来源。一旦分离，可以将DNA置于表达载体中，然后将其转染到宿主细胞，如猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，这些细胞不另外产生免疫球蛋白，从而在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。也可以对DNA进行修饰，例如通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列替代同源鼠序列(参见美国专利第4,816,567；Morrison，《自然》368，812-13(1994))或通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接到免疫球蛋白编码序列上。这种非免疫球蛋白多肽可以取代本公开的抗体的恒定结构域，或可以取代本公开的抗体的一个抗原结合位点的可变结构域以产生嵌合二价抗体。
本公开的单克隆抗体包括人源化抗体或人抗体。这些抗体适合施用于人而不会引起人对所施用免疫球蛋白的免疫应答。抗体的人源化形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)，其主要由人免疫球蛋白的序列组成，并含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化例如通过遵循Winter及其同事的方法进行(Jones等人，《自然》，321:522-525(1986)；Riechmann等人，《自然》，332:323-327(1988)；Verhoeyen等人，《科学》，239:1534-1536(1988))，通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列。(也参见美国专利第5,225,539号)。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基代替。人源化抗体还包含例如既不存在于受体抗体中也不存在于导入的CDR或框架序列中的残基。通常，人源化抗体包括基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，并且所有或基本上所有的框架区是人免疫球蛋白共有序列的框架区。人源化抗体最佳地还包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区(Fc)的至少一部分(Jones等人，1986；Riechmann等人，1988；和Presta，《结构生物学评论(Curr.Op.Struct.Biol.)》，2:593-596(1992))。
完全人抗体是其中轻链和重链的完整序列(包括CDR)来自人基因的抗体分子。此类抗体在本文中称为“人抗体”或“完全人抗体”。单克隆抗体可以通过使用三源杂交瘤技术制备；人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor等人，1983《今日免疫学(Immunol Today)》4:72)；以及EBV杂交瘤技术以产生单克隆抗体(参见Cole等人，1985《单克隆抗体和癌症疗法(MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY)》，Alan R.Liss,Inc.，第77至96页)。可以使用单克隆抗体，并且可以通过使用人杂交瘤产生单克隆抗体(参见Cote等人，1983《美国国家科学院院刊》80:2026-2030)或通过在体外用EB病毒转化人B细胞(参见Cole等人，1985《单克隆抗体和癌症疗法》，Alan R.Liss,Inc.，第77至96页)。
另外，还可以使用其它技术(包括噬菌体展示文库)产生人抗体。(参见Hoogenboom和Winter，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》，227:381(1991)；Marks等人，《分子生物学杂志》222:581(1991))。类似地，人抗体可以通过将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物(例如，其中内源免疫球蛋白基因已经部分或完全失活的小鼠)中来制备。在攻击后，观察到人抗体的产生，其在所有方面都与在人中看到的非常相似，包括基因重排、装配和抗体库。该方法描述于例如美国专利第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,661,016号和Marks等人，《生物技术(Bio/Technology)》10，779-783(1992)；Lonberg等人，《自然》368 856-859(1994)；Morrison，《自然》368，812-13(1994)；Fishwild等人，《自然生物技术(Nature Biotechnology)》14，845-51(1996)；Neuberger，《自然生物技术》14，826(1996)；和Lonberg和Huszar，《国际免疫学评论(Intern.Rev.Immunol.)》13 65-93(1995)。
另外，可以使用转基因非人动物产生人抗体，该转基因非人动物经修饰以产生完全人抗体，而不是响应抗原攻击的动物内源性抗体。(参见PCT公开WO94/02602)。非人宿主中编码免疫球蛋白重链和轻链的内源基因已经丧失能力，编码人免疫球蛋白重链和轻链的活性基因座被插入宿主基因组中。例如，使用含有必需的人DNA片段的酵母人工染色体掺入人基因。然后通过杂交含有少于修饰的完全互补的中间转基因动物，获得提供所有所需修饰的动物作为后代。这种非人动物的实例是称为XenomouseTM的小鼠，如PCT公开WO 96/33735和WO 96/34096中所公开的。该动物产生分泌完全人免疫球蛋白的B细胞。抗体可以在用感兴趣的免疫原免疫后直接从动物获得，例如多克隆抗体的制剂，或者可替代地从来源于动物的永生化B细胞获得，如产生单克隆抗体的杂交瘤。另外，编码具有人可变区的免疫球蛋白的基因可以被回收和表达以直接获得抗体，或者可以被进一步修饰以获得抗体的类似物，例如单链Fv(scFv)分子。
在美国专利第5,939,598号中公开了一种产生缺乏内源性免疫球蛋白重链表达的非人宿主(例如小鼠)的方法的实例。其可以通过一种方法获得，该方法包括从胚胎干细胞中的至少一个内源性重链基因座缺失J区段基因以防止该基因座的重排并且防止重排的免疫球蛋白重链基因座的转录物的形成，该缺失是通过含有编码可选择标记的基因的靶向载体实现的；以及从胚胎干细胞产生转基因小鼠，其体细胞和生殖细胞含有编码选择标记的基因。
在美国专利第5,916,771号中公开了一种产生感兴趣的抗体(如人抗体)的方法。该方法包括将含有编码重链的核苷酸序列的表达载体导入培养的一种哺乳动物宿主细胞中，将含有编码轻链的核苷酸序列的表达载体导入另一种哺乳动物宿主细胞中，并融合这两种细胞以形成杂交细胞。杂交细胞表达含有重链和轻链的抗体。
在对该方法的进一步改进中，用于鉴定免疫原上临床相关表位的方法和选择以高亲和力特异性结合相关表位的抗体的相关方法公开于美国公开U.S.2003/009212中。
抗体可以由含有编码上述单链抗体的DNA片段的载体表达。
这些可以包括载体、脂质体、裸DNA、佐剂辅助的DNA、基因枪、导管等。载体包括如WO 93/64701中所述的化学缀合物，其具有靶向部分(例如，细胞表面受体的配体)和核酸结合部分(例如，聚赖氨酸)、病毒载体(例如，DNA或RNA病毒载体)、如美国专利第7,186,697号中所述的含有靶部分(例如，靶细胞特异性抗体)和核酸结合部分(例如，鱼精蛋白)的融合蛋白、质粒、噬菌体等。载体可以是染色体的、非染色体的或合成的。
优选的载体包括病毒载体、融合蛋白和化学缀合物。逆转录病毒载体包括莫洛尼鼠白血病病毒。DNA病毒载体是优选的。这些载体包括痘病毒载体(如正痘病毒或禽痘病毒载体)、疱疹病毒载体(如单纯疱疹病毒I型(HSV)载体(参见Geller,A.I.等人，《神经化学杂志(J.Neurochem)》，64:487(1995)；Lim,F.等人，《DNA克隆：哺乳动物系统(DNA Cloning:Mammalian Systems)》，D.Glover编辑，(牛津大学出版社，英国牛津)(1995)；Geller,A.I.等人，《美国国家科学院院刊(Proc Natl.Acad.Sci.:U.S.A.)》90:7603(1993)；Geller,A.I.等人，《美国国家科学院院刊(Proc Natl.Acad.Sci USA)》87:1149(1990)、腺病毒载体(参见LeGal LaSalle等人，《科学》，259:988(1993)；Davidson等人，《自然遗传学(Nat.Genet)》3:219(1993)；Yang等人，《病毒学杂志(J.Virol.)》69:2004(1995)和腺伴随病毒载体(参见Kaplitt,M.G.等人，《自然遗传学(Nat.Genet.)》8:148(1994)。
痘病毒载体将基因导入细胞质。禽痘病毒载体仅导致核酸的短期表达。腺病毒载体、腺伴随病毒载体和单纯疱疹病毒(HSV)载体优选用于将核酸导入神经细胞。腺病毒载体导致比腺伴随病毒(约4个月)更短期的表达(约2个月)，而腺伴随病毒又比HSV载体更短。特定载体的选择将取决于靶细胞和所治疗的病状。引入可以通过标准技术，例如感染、转染、转导或转化。基因转移模式的实例包括例如裸DNA、CaPO4沉淀、DEAE葡聚糖、电穿孔、原生质体融合、脂质转染、细胞显微注射和病毒载体。
载体可用于靶向基本上任何所需的靶细胞。例如，立体定位注射可用于将载体(例如，腺病毒、HSV)引导至所需位置。另外，可以使用微型泵输注系统(如同步输注系统)通过脑室内(icv)输注来递送颗粒。一种基于整体流动(bulk flow)的方法，称为对流(convection)，也被证明在将大分子递送至大脑的扩展区域方面是有效的，并且可以用于将载体递送至靶细胞。(参见Bobo等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》91:2076-2080(1994)；Morrison等人，《美国生理学杂志(Am.J.Physiol.)》266:292-305(1994))。可以使用的其它方法，包括导管、静脉内、肠胃外、腹膜内和皮下注射，以及口服或其它合适的给药途径。
双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的抗体。在这种情况下，结合特异性之一是针对靶标(如B7-H3)或其任何片段。第二结合靶标是任何其它抗原，并且有利地是细胞表面蛋白或受体或受体亚基。
许多制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，双特异性抗体的重组生产是基于两种免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中这两种重链具有不同的特异性(Milstein和Cuello，《自然》，305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分类，这些杂交瘤(四杂交瘤(quadromas))产生十种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常通过亲和层析步骤完成。在1993年5月13日公开的WO 93/08829和Traunecker等人，《欧洲分子生物学学报(EMBO J.)》，10:3655-3659(1991)中公开了类似的方法。
本公开的双特异性和/或单价抗体可以使用多种本领域公认的技术中的任一种来制备，包括在2011年8月16日提交的申请WO 2012/023053中公开的那些，其内容通过引用整体并入本文。WO 2012/023053中描述的方法生成在结构上与人免疫球蛋白相同的双特异性抗体。这种类型的分子由两个拷贝的独特重链多肽组成，第一个轻链可变区与恒定κ结构域融合，第二个轻链可变区与恒定λ结构域融合。每个结合位点表现出不同的抗原特异性，重链和轻链都对其有贡献。轻链可变区可以属于λ或κ家族，并且优选地分别与λ和κ恒定结构域融合。为了避免非天然多肽连接的生成，这是优选的。然而，对于第一特异性，通过将κ轻链可变结构域与恒定κ结构域融合，对于第二特异性，通过将λ轻链可变结构域与恒定κ结构域融合，也有可能获得本公开的双特异性抗体。WO 2012/023053中描述的双特异性抗体被称为IgGκλ抗体或“κλ体”，一种新的完全人双特异性IgG形式。这种κλ-体形式允许双特异性抗体的亲和纯化，该双特异性抗体与标准IgG分子无区别，具有与标准单克隆抗体无区别的特征，因此与先前的形式相比是有利的。
该方法的基本步骤是鉴定具有不同抗原特异性的两个抗体Fv区(每个由可变轻链和可变重链结构域组成)，它们共享相同的重链可变结构域。已经描述了许多用于生成单克隆抗体及其片段的方法。(参见，例如，《抗体：实验手册》，Harlow E和Lane D，1988，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约冷泉港，其通过引用并入本文)。完全人抗体是其中轻链和重链的序列(包括CDR 1和2)均来自人基因的抗体分子。CDR3区可以是人源的或通过合成方法设计的。这些抗体在本文中称为“人抗体”或“完全人抗体”。人单克隆抗体可以通过使用三源杂交瘤技术制备；人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor等人，1983《今日免疫学》4:72)；以及EBV杂交瘤技术以产生人单克隆抗体(参见Cole等人，1985《单克隆抗体和癌症疗法(MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY)》，AlanR.Liss,Inc.，第77至96页)。可以使用人单克隆抗体，并且可以通过使用人杂交瘤产生人单克隆抗体(参见Cote等人，1983《美国国家科学院院刊》80:2026-2030)或通过在体外用EB病毒转化人B细胞(参见Cole等人，1985《单克隆抗体和癌症疗法》，Alan R.Liss,Inc.，第77至96页)。
例如，通过用靶抗原或其免疫原性片段、衍生物或变体免疫动物来生成单克隆抗体。替代地，用含有编码靶抗原的核酸分子的载体转染的细胞免疫动物，使得靶抗原被表达并与转染细胞的表面结合。用于产生异种非人动物的合适技术是本领域公知的。例如，参见美国专利第6,075,181号和第6,150,584号，其全文通过引用并入本文。
替代地，通过筛选含有与靶抗原结合的抗体或抗原结合结构域序列的文库获得抗体。该文库例如在噬菌体中制备为与噬菌体外壳蛋白融合的蛋白质或肽，噬菌体外壳蛋白在组装的噬菌体颗粒和含在噬菌体颗粒内的编码DNA序列的表面上表达(即“噬菌体展示文库”)。
然后筛选由骨髓瘤/B细胞融合产生的杂交瘤对靶抗原的反应性。例如，使用杂交瘤方法制备单克隆抗体，如Kohler和Milstein，《自然》，256:495(1975)中描述的那些方法。在杂交瘤方法中，通常用免疫剂免疫小鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物以激发产生或能够产生将与免疫剂特异性结合的抗体的淋巴细胞。替代地，可以在体外免疫淋巴细胞。
虽然并非完全不可能，但对具有相同重链可变区但针对不同抗原的不同抗体的偶然鉴定是极不可能的。实际上，在大多数情况下，重链在很大程度上有助于抗原结合表面，并且在序列上也是最易变的。特别地，重链上的CDR3是在序列、长度和结构上最多样化的CDR。因此，对不同抗原具有特异性的两种抗体几乎总是携带不同的重链可变区。
美国专利第9,926,382号中公开的方法克服了这种限制，并且通过使用抗体文库极大地促进了具有相同重链可变结构域的抗体的分离，其中重链可变结构域对于所有文库成员是相同的，因此多样性限于轻链可变结构域。此类文库描述于例如美国专利第8,921,281号和申请WO 2011/084255中，其各自通过引用整体并入本文。然而，由于轻链可变结构域与重链可变结构域联合表达，两个结构域都有助于抗原结合。为了进一步促进该过程，含有相同重链可变结构域和多种λ可变轻链或κ可变轻链的抗体文库可平行用于体外选择抗不同抗原的抗体。该方法能够鉴定具有共同重链的两种抗体，但一种携带λ轻链可变结构域而另一种携带κ轻链可变结构域，这两种抗体可用作产生本公开的全免疫球蛋白形式的双特异性抗体的构件块。本公开的双特异性抗体可以是不同同种型的，并且可以修饰它们的Fc部分以改变与不同Fc受体的结合特性，并且以这种方式修饰抗体的效应子功能以及它的药代动力学特性。已经描述了用于修饰Fc部分的多种方法，并且这些方法可应用于本公开的抗体。(参见例如Strohl，WR《生物技术当前述评(Curr Opin Biotechnol)》2009(6):685-91；美国专利第6,528,624号；2009年1月9日提交的PCT/US2009/0191199)。本公开的方法还可用于生成缺乏Fc部分的F(ab’)2形式的双特异性抗体和抗体混合物。
共同重链和两条不同轻链共表达到单个细胞中以允许本公开的双特异性抗体的组装。如果所有的多肽以相同的水平表达，同样良好地组装形成免疫球蛋白分子，则单特异性(相同的轻链)和双特异性(两种不同的轻链)的比例应为50％。然而，不同的轻链可能以不同的水平表达和/或不以相同的效率组装。因此，调节不同多肽的相对表达的方法用于补偿它们固有的表达特征或与共同重链组装的不同倾向。这种调节可以通过启动子强度，使用以不同效率为特征的内部核糖体进入位点(IRES)或可以在转录或翻译水平上起作用以及对mRNA稳定性起作用的其它类型的调节元件来实现。不同强度的不同启动子可以包括CMV(即时早期巨细胞病毒启动子)；EF1-1α(人延伸因子1α-亚基启动子)；Ubc(人泛素C启动子)；SV40(猿猴病毒40启动子)。还描述了来自哺乳动物和病毒来源的不同IRES。(参见例如，Hellen CU和Sarnow P.，《基因与发育(Genes Dev)》2001 15:1593-612)。这些IRES可以在它们的长度和核糖体募集效率方面大不相同。此外，有可能通过引入IRES的多个拷贝来进一步调节活性(Stephen等人，2000《美国国家科学院院刊》97:1536-1541)。表达的调节也可以通过细胞的多次连续转染来实现，以增加表达一条或另一条轻链的各个基因的拷贝数，从而改变它们的相对表达。本文提供的实例证明了控制不同链的相对表达对于最大化双特异性抗体的组装和总产量是至关重要的。
重链和两条轻链的共表达在细胞培养上清液中生成三种不同抗体的混合物：两种单特异性二价抗体和一种双特异性二价抗体。后者必须从混合物中纯化以获得感兴趣的分子。本文描述的方法通过使用与κ或λ轻链恒定结构域特异性相互作用的亲和层析介质，如CaptureSelect Fabκ和CaptureSelect Fabλ亲和基质(BAC BV，荷兰)，促进了该纯化程序。这种多步亲和层析纯化方法是有效的并且通常适用于本公开的抗体。这与必须针对每种双特异性抗体进行开发和优化的特定纯化方法形成鲜明对比，该双特异性抗体来自表达抗体混合物的四杂交瘤或其它细胞系。实际上，如果混合物中不同抗体的生化特征相似，则使用标准层析技术(如离子交换层析)进行分离可能具有挑战性或根本不可能。
其它合适的纯化方法包括US2013/0317200中公开的那些，其内容通过引用整体并入本文。
在产生双特异性抗体的其它实施例中，具有所需结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)可以与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。融合优选地与免疫球蛋白重链恒定结构域融合，该恒定结构域包含铰链区、CH2区和CH3区的至少一部分。优选第一重链恒定区(CH1)含有存在于至少一个融合体中的轻链结合所必需的位点。将编码免疫球蛋白重链融合体和免疫球蛋白轻链(如果需要)的DNA插入到单独的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物体中。关于生成双特异性抗体的进一步细节，参见例如Suresh等人，《酶学方法(Methods in Enzymology)》，121:210(1986)。
根据WO 96/27011中描述的另一种方法，可以改造一对抗体分子之间的界面以最大化从重组细胞培养物中回收的异源二聚体的百分比。优选的界面包括抗体恒定结构域的CH3区的至少一部分。在该方法中，来自第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链被更大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)代替。通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)代替较大的氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生与较大的侧链大小相同或相似的补偿性“空腔”。这提供了一种提高异源二聚体产量超过其它不需要的终产物(如同源二聚体)的机制。
文献中已经描述了从抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可以使用化学键制备双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作选择性固定酶的药剂。
还描述了直接从重组细胞培养物中制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，已经使用亮氨酸拉链产生了双特异性抗体。Kostelny等人，《免疫学杂志》148(5):1547-1553(1992)。通过基因融合将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽连接到两种不同抗体的Fab’部分。抗体同源二聚体在铰链区还原形成单体，然后再氧化形成抗体异源二聚体。该方法也可用于产生抗体同源二聚体。Hollinger等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》90:6444-6448(1993)描述的“双体抗体”提供了制备双特异性抗体片段的另一种机制。该片段包含通过接头与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)，该接头太短而不能在同一链上的两个结构域之间配对。因此，一个片段的VH和VL结构域被迫与另一个片段的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见，Gruber等人，《免疫学杂志》152:5368(1994)。
考虑了具有两个以上化合价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等人，《免疫学杂志》147:60(1991)。
示例性双特异性抗体可以结合两种不同的表位，其中至少一种起源于本公开的蛋白质抗原。替代地，免疫球蛋白分子的抗抗原臂可以与结合白细胞上的触发分子(如T细胞受体分子(例如，CD2、CD3、CD28或B7))或IgG的Fc受体(FcγR)(如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16))的臂组合，以便将细胞防御机制集中于表达特定抗原的细胞。双特异性抗体也可用于将细胞毒性剂导向表达特定抗原的细胞。这些抗体具有抗原结合臂和结合细胞毒性剂或放射性核素螯合剂(如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA)的臂。另一种感兴趣的双特异性抗体结合本文所述的蛋白抗原并进一步结合组织因子(TF)。
异源缀合物抗体也在本公开的范围内。异源缀合物抗体由两个共价连接的抗体组成。例如，已经提出此类抗体将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(参见美国专利第4,676,980号)，并且用于治疗HIV感染(参见WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089)。预期可以使用合成蛋白质化学(包括涉及交联剂的那些)在体外制备抗体。例如，可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于此目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇盐和甲基-4-巯基丁酰亚胺盐以及例如在美国专利第4,676,980号中公开的那些。
可能需要在效应子功能方面修饰本公开的抗体，以便增强例如抗体在治疗癌症和/或与异常B7-H3表达和/或活性相关的其它疾病和病症中的有效性。例如，可以将半胱氨酸残基引入Fc区，从而允许在该区形成链间二硫键。如此生成的同源二聚抗体可能具有改善的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。(参见Caron等人，《实验医学杂志(J.Exp Med.)》，176:1191-1195(1992)和Shopes，《免疫学杂志》，148:2918-2922(1992))。替代地，可以改造具有双Fc区的抗体，从而具有增强的补体裂解和ADCC能力。(参见Stevenson等人，《抗癌药物设计》，3:219-230(1989))。
缀合抗体
本公开还涉及缀合抗体，在本文中也称为免疫缀合物，其包含缀合至如毒素等细胞毒性剂(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物)的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施例中，毒素是微管抑制剂或其衍生物。在一些实施例中，毒素是多拉司他汀或其衍生物。在一些实施例中，毒素是澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、AFP、MMAF、MMAE、MMAD、DMAF或DMAE。在一些实施例中，毒素是美登木素生物碱或美登木素生物碱衍生物。在一些实施例中，毒素是DM1或DM4。在一些实施例中，毒素是核酸损伤毒素。在一些实施例中，毒素是多卡霉素或其衍生物。在一些实施例中，毒素是卡利奇霉素或其衍生物。在一些实施例中，药剂是吡咯并苯并二氮杂卓或其衍生物。在一些实施例中，药剂是依喜替康(exatecane)或其衍生物。
可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思子毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、毒蛋白、巴豆酸、肥皂草抑制剂、白树毒素、米托洁林、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族化合物。多种放射性核素可用于制备放射性缀合的抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
抗体和细胞毒性剂的缀合物可以使用多种双功能蛋白-偶联剂制备，如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亚氨基四氢噻吩(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如己二亚氨酸二甲酯HCL)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双-(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双-(对重氮联苯酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒素免疫毒素可以如Vitetta等人，《科学》238:1098(1987)中所述制备。碳-14标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸缀合至抗体的示例性螯合剂。(参见WO94/11026)。
本领域普通技术人员将认识到，多种可能的部分可以与本公开的所得抗体偶联。(参见，例如，《缀合疫苗(Conjugate Vaccines)》，《对微生物学和免疫学的贡献(Contributions to Microbiology and Immunology)》，J.M.Cruse和R.E.Lewis，Jr(编辑)，Carger出版社，纽约，(1989)，其全部内容通过引用并入本文)。
只要抗体和其它部分保持它们各自的活性，偶联可以通过结合两个分子的任何化学反应来完成。该连接可以包括许多化学机制，例如共价结合、亲和结合、插入、配位结合和络合。然而，优选的结合是共价结合。共价结合可以通过现有侧链的直接缩合或通过引入外部桥接分子来实现。许多二价或多价连接剂可用于将蛋白质分子(如本公开的抗体)偶联至其它分子。例如，代表性的偶联剂可以包括有机化合物，如硫酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醛、重氮苯和六亚甲基二胺。该列举并非意在穷举本领域已知的各种偶联剂，而是更常见的偶联剂的示例。(参见Killen和Lindstrom，《免疫学杂志(Jour.Immun.)》133:1335-2549(1984)；Jansen等人，《免疫学评论(Immunological Reviews)》62:185-216(1982)；和Vitetta等人，《科学》238:1098(1987)。
合适的接头描述于文献中。(参见，例如，Ramakrishnan,S.等人，《癌症研究》44:201-208(1984)描述了MBS(M-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)的用途。还参见美国专利第5,030,719号，其描述了通过寡肽接头与抗体偶联的卤代乙酰肼衍生物的用途。特别优选的接头包括：(i)EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；(ii)SMPT(4-琥珀酰亚胺氧羰基-α-甲基-(2-吡啶基-二硫代)-甲苯(皮尔斯化学公司(PierceChem.Co.)，目录号(21558G)；(iii)SPDP(琥珀酰亚胺基-6[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰氨基]己酸酯(皮尔斯化学公司，目录号21651G)；(iv)Sulfo-LC-SPDP(磺基琥珀酰亚胺基6[3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺]己酸酯(皮尔斯化学公司，目录号2165-G)；和(v)sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺：皮尔斯化学公司，目录号24510)与EDC缀合。
上述接头含有具有不同属性的组分，从而产生具有不同理化性质的缀合物。例如，烷基羧酸酯的sulfo-NHS酯比芳族羧酸酯的sulfo-NHS酯更稳定。含NHS-酯的接头比sulfo-NHS酯溶解性差。此外，接头SMPT含有空间位阻二硫键，并且可以形成具有增加的稳定性的缀合物。二硫键通常不如其它键稳定，因为二硫键在体外被裂解，导致可利用的缀合物更少。特别地，Sulfo-NHS可以增强碳二亚胺偶联的稳定性。碳二亚胺偶联(如EDC)当与sulfo-NHS结合使用时，形成比单独的碳二亚胺偶联反应更耐水解的酯。
本文公开的抗体也可以配制成免疫脂质体。含有抗体的脂质体可以通过任何合适的方法制备，如Epstein等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，82:3688(1985)；Hwang等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl Acad.Sci.USA)》，77:4030(1980)；和美国专利第4,485,045号和第4,544,545号中描述的。美国专利第5,013,556号公开了循环时间延长的脂质体。
特别有用的脂质体可以通过反相蒸发方法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物生成。将脂质体挤出通过限定孔径的过滤器，得到具有所需直径的脂质体。本公开的抗体的Fab'片段可以通过二硫化物交换反应与如Martin等人，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》，257:286-288(1982)中描述的脂质体缀合。
抗B7-H3抗体的用途
应当理解，根据本公开的治疗实体的施用将与合适的载体、赋形剂和其它药剂一起施用，该载体、赋形剂和其它药剂被掺入到制剂中以提供改善的转移、递送、耐受性等。许多合适的制剂可以在所有药物化学家已知的配方中找到：《雷明顿药物科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)》(第15版，马克出版公司(Mack Publishing Company)，宾夕法尼亚州伊斯顿(1975))，特别是其中Blaug，Seymour的第87章。这些制剂包括例如粉末、糊剂、软膏、胶冻、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(如LipofectinTM)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳液、乳液碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含碳蜡的半固体混合物。前述混合物中的任一种在根据本公开的治疗和疗法中可以是合适的，条件是制剂中的活性成分不被制剂灭活，并且该制剂与施用途径在生理上相容和可耐受。另见Baldrick P.《药物赋形剂开发：临床前指导的需要(Pharmaceutical excipientdevelopment:the need for preclinical guidance)》《调节毒理学和药理学(Regul.Toxicol Pharmacol.)》32(2):210-8(2000)，Wang W.《冻干和固体蛋白药物的开发(Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals)》《国际药剂学杂志(Int.J.Pharm.)》203(1-2):1-60(2000)，Charman WN《脂质、亲脂性药物和口服给药——一些新兴概念(Lipids,lipophilic drugs,and oral drug delivery-someemerging concepts)》《药学科学杂志(J Pharm Sci.)》89(8):967-78(2000)，Powell等人《肠胃外制剂的赋形剂概要(Compendium of excipients for parenteralformulations)》《医药科学与技术PDA杂志(PDAJ Pharm Sci Technol.)》52:238-311(1998)和其中关于药物化学家熟知的制剂、赋形剂和载体的其它信息的引文。
包括本公开的缀合物的本公开的治疗制剂用于治疗或减轻与癌症相关的症状，该癌症例如但不限于白血病、淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、神经胶质瘤、肺癌和支气管癌、结肠直肠癌、胰腺癌、食道癌、肝癌、膀胱癌、肾癌和肾盂癌、口腔和咽癌、子宫体癌和/或黑素瘤。本公开还提供了治疗或减轻与癌症相关的症状的方法。治疗方案可以包括例如使用标准方法鉴定受试者，例如患有癌症(或处于发展癌症的风险中)的人类患者。
包括识别B7-H3和任选的第二靶标的本公开的缀合物的本公开的治疗制剂可用于治疗或减轻与自身免疫性疾病和/或炎性疾病相关的症状，例如B细胞介导的自身免疫性疾病和/或炎性疾病，包括作为非限制性实例的系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、瓦尔登斯特伦氏高丙种球蛋白血症、舍格伦综合征、多发性硬化(MS)和/或狼疮性肾炎。
可以结合用于诊断或治疗特定免疫相关病症的任何合适的方法来确定治疗的有效性。免疫相关病症的一种或多种症状的减轻表明缀合物赋予了临床益处。
针对靶标(如B7-H3)、肿瘤相关抗原或其它抗原的缀合物可用于与这些靶标的定位和/或定量相关的方法中，例如用于测量这些靶标在适当生理样品中的水平，用于诊断方法，用于蛋白质成像等)。例如，含有抗体衍生的抗原结合结构域的对这些靶标或其衍生物、片段、类似物或同源物中的任何一种具有特异性的缀合物，可以用作药理学活性化合物(下文称为“治疗剂”)。
本公开的缀合物可用于使用标准技术(如免疫亲和、层析或免疫沉淀)分离特定靶标。本公开的缀合物可在诊断上用于监测组织中的蛋白质水平，作为临床试验程序的一部分，例如用于确定给定治疗方案的功效。可以通过将抗体偶联(即，物理连接)至可检测物质来促进检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪氨荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白，合适的放射性材料的实例包括125I、131I、35S或3H。
本公开的缀合物可用作治疗剂。这种药剂通常用于治疗或预防受试者中与给定靶标的异常表达或活化相关的疾病或病理。将缀合物制剂，优选地对其靶抗原具有高特异性和高亲和力的缀合物制剂施用于受试者，并且通常由于其与靶的结合而产生效果。施用缀合物可以消除或抑制或干扰靶标的信号传导功能。施用缀合物可以消除或抑制或干扰靶标与其天然结合的内源配体的结合。
本公开的缀合物的治疗有效量一般涉及实现治疗目标所需的量。如上所述，这可以是抗体与其靶抗原之间的结合相互作用，其在某些情况下干扰靶标的功能和/或与抗体缀合的活性剂的作用。需要施用的量还将取决于抗体对其特异性抗原的结合亲和力和/或活性剂的效力，并且还将取决于所施用的抗体从其所施用的其它受试者的自由体积中耗尽的速率。作为非限制性实例，本公开的缀合物的治疗有效剂量的常见范围可以为约0.1mg/kg体重至约50mg/kg体重。常见的给药频率可以在例如每天两次至每周一次的范围内。
本公开的缀合物可以以药物组合物的形式施用以治疗多种疾病和病症。例如，在制备这种组合物中涉及的原理和考虑，以及在组分的选择中的指导提供于《雷明顿:药学科学与实践(Remington:The Science And Practice Of Pharmacy)》第19版(AlfonsoR.Gennaro等人，编辑)Mack出版公司，宾夕法尼亚州伊斯顿1995：《药物吸收增强：概念、可能性、局限性和趋势(Drug Absorption Enhancement:Concepts,Possibilities,Limitations,And Trends)》，哈伍德学术出版社(Harwood Academic Publishers)，宾西法尼亚州兰霍恩，1994；以及《肽和蛋白质药物递送(Peptide And Protein Drug Delivery)》(《肠外科学进展(Advances In Parenteral Sciences)》，第4卷)，1991，M.Dekker，纽约。
根据所治疗的特定适应症的需要，制剂还可以含有多于一种的活性化合物，优选地具有互补活性且不会相互产生不利影响的活性化合物。替代地，或另外，组合物可以包含增强其功能的药剂，例如细胞毒性剂、细胞因子、化疗剂或生长抑制剂。这些分子适当地以对预期目的有效的量组合存在。
活性成分也可以包埋在微胶囊中，微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备，例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳液中。
用于体内施用的制剂优选是无菌的。这可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成型制品形式，例如膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和利普安组成的可注射微球))，和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子超过100天，但某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。
根据本公开的缀合物可用作检测样品中给定靶标(或其蛋白质片段)的存在的药剂。在一些实施例中，缀合物含有可检测标记。抗体可以是多克隆的，或更优选地是单克隆的。可以使用完整抗体或其片段(例如，Fab、scFv或F(ab)2)。术语“生物样品”旨在包括从受试者分离的组织、细胞和生物流体，以及存在于受试者内的组织、细胞和流体。因此，术语“生物样品”的使用包括血液和血液的部分或组分，包括血清、血浆或淋巴。即，本公开的检测方法可用于体外以及体内检测生物样品中的分析物mRNA、蛋白质或基因组DNA。例如，用于检测分析物mRNA的体外技术包括Northern杂交和原位杂交。用于检测分析物蛋白质的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光。用于检测分析物基因组DNA的体外技术包括Southern杂交。进行免疫测定的程序描述于例如在《ELISA：理论和实践：分子生物学方法(ELISA:Theory and Practice:Methods in Molecular Biology)》，第42卷，J.R.Crowther(编辑)Human出版社，新泽西州托托瓦，1995；《免疫测定(Immunoassay)》，E.Diamandis和T.Christopoulus，学术出版社，加利福尼亚州圣地亚哥，1996；和《酶免疫分析的实践与理论(Practice and Theory of Enzyme Immunoassays)》，P.Tijssen，埃尔塞维尔科学出版公司(Elsevier Science Publishers)，阿姆斯特丹，1985。此外，用于检测分析物蛋白质的体内技术包括将标记的抗分析物缀合物引入受试者。例如，抗体可以用放射性标记物标记，其在受试者中的存在和位置可以通过标准成像技术进行检测。
药物组合物
抗体-药物缀合物可用于将活性剂转移至受试者的靶细胞以使用任何合适的制备组合物的方法治疗受试者。在一些方面，本公开涉及一种包含如本文所述的抗体-药物缀合物的组合物(例如，药物组合物)。
本公开的组合物和方法可用于治疗有需要的个体。在某些实施例中，个体是哺乳动物，如人或非人哺乳动物。当向动物(如人)施用时，组合物或化合物优选地以药物组合物的形式施用，该药物组合物包含例如本公开的化合物和药学上可接受的载体。药学上可接受的载体是本领域熟知的，并且包括例如水溶液，如水或生理缓冲盐水或其它溶剂或媒介物(如乙二醇、甘油、如橄榄油等油)，或可注射的有机酯。在优选的实施例中，当此类药物组合物用于人体施用时，特别是用于侵入性施用途径(即，绕过通过上皮屏障的转运或扩散的途径，如注射或植入)时，水溶液是无热原的或基本上无热原的。可以选择赋形剂，例如，以实现药剂的延迟释放或选择性地靶向一种或多种细胞、组织或器官。药物组合物可以是剂量单位形式，如用于重构的冻干剂、粉末、溶液、注射剂等。
药学上可接受的载体可以含有生理上可接受的药剂，其用于例如稳定、增加溶解度或增加化合物(如本公开的化合物)的吸收。这些生理上可接受的药剂包括，例如，碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)、抗氧化剂(如抗坏血酸或谷胱甘肽)、螯合剂、低分子量蛋白质或其它稳定剂或赋形剂。药学上可接受的载体(包括生理上可接受的药剂)的选择取决于例如组合物的施用途径。制剂或药物组合物可以是自乳化药物递送系统或自微乳化药物递送系统。药物组合物(制剂)还可以是脂质体或其它聚合物基质，其可以在其中掺入例如本公开的化合物。例如，包含磷脂或其它脂质的脂质体是无毒的、生理上可接受的和可代谢的载体，其制备和施用相对简单。
本文所用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适用于与人和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
药物组合物(制剂)可以通过多种施用途径中的任一种施用于受试者。例如，化合物可以简单地溶解或悬浮在无菌水中。合适的施用途径和适用于其的组合物的细节可见于，例如，美国专利第6,110,973号、第5,763,493号、第5,731,000号、第5,541,231号、第5,427,798号、第5,358,970号和第4,172,896号以及其中引用的专利中。
制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域中任何合适的方法制备。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于所治疗的宿主、特定的施用模式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常将是产生治疗效果的化合物的量。通常，在100％中，该量将在活性成分的约1％至约99％，优选地约5％至约70％，最优选地约10％至约30％的范围内。
制备这些制剂或组合物的方法包括使活性化合物(如本公开的化合物)与载体和任选的一种或多种辅助成分结合的步骤。通常，通过将本公开的化合物与液体载体或细分散的固体载体或两者均匀且紧密地结合，然后如果需要，使产物成型来制备制剂。
本文所用的短语“肠胃外施用”和“肠胃外施用”是指除肠内和局部施用(通常通过注射)之外的施用模式，并且包括但不限于静脉内、眼内(如玻璃体内)、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。适于肠胃外施用的药物组合物包含一种或多种活性化合物与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳液，或可以在临用前重构成无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末的组合，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质或悬浮剂或增稠剂。
可用于本公开的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。例如，通过使用包衣材料如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。
这些组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保防止微生物的作用。也可能需要在组合物中包括等渗剂，如糖、氯化钠等。另外，可注射药物形式的延长吸收可以通过包括延迟吸收的药剂(如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
在一些情况下，为了延长药物的作用，需要减缓药物从皮下或肌内注射的吸收。这可以通过使用水溶性差的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。药物的吸收速率则取决于其溶出速率，而溶出速率又可取决于晶体大小和晶型。替代地，通过将药物溶解或悬浮在油媒介物中来实现胃肠外施用形式的延迟吸收。
通过在生物可降解聚合物(如聚丙交酯-聚乙交酯)中形成主题化合物的微囊化基质来制备可注射储库形式。根据药物与聚合物的比例和所用特定聚合物的性质，可以控制药物释放速率。其它生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。可注射储库制剂也可以通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。
为了在本公开的方法中使用，活性化合物可以本身或作为药物组合物给予，药物组合物含有例如0.1至99.5％(更优选地，0.5至90％)的活性成分与药学上可接受的载体的组合。
引入方法也可以由可再充电的或生物可降解的装置提供。近年来，已经开发了各种缓释聚合物装置并在体内进行了测试，用于药物(包括蛋白质生物药物)的受控递送。多种生物相容性聚合物(包括水凝胶)，包括生物可降解和不可降解的聚合物，可用于形成植入物，用于在特定靶位点缓释化合物。
药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以便获得对于特定患者、组合物和施用模式有效实现所需治疗反应而对患者无毒的活性成分的量。
所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括所使用的特定化合物或化合物的组合或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所使用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所使用的特定化合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、体重、病状、总体健康状况和既往病史以及医学领域公知的类似因素。
具有本领域普通技术的医师或兽医可以容易地确定和开出所需药物组合物的治疗有效量。例如，医师或兽医可以以低于实现所需治疗效果所需的水平开始药物组合物或化合物的剂量以达到所需治疗效果，并逐渐增加剂量直至实现所需效果。“治疗有效量”是指足以引起所需治疗效果的化合物的浓度。通常理解，化合物的有效量将根据受试者的体重、性别、年龄和病史而变化。影响有效量的其它因素可以包括但不限于患者病状的严重程度、所治疗的病症、化合物的稳定性，以及(若需要)与本公开的化合物一起施用的另一种类型的治疗剂。可以通过多次施用药剂来递送更大的总剂量。确定功效和剂量的许多方法是本领域技术人员已知的(Isselbacher等人，(1996)《哈里森内科原理(Harrison'sPrinciples of Internal Medicine)》第13版，1814-1882，其通过引用并入本文)。
通常，用于本公开的组合物和方法中的活性化合物的合适日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物的量。这种有效剂量通常取决于上述因素。
接受这种治疗的患者可以是有需要的任何动物，包括灵长类动物，特别是人；和其它哺乳动物，如马、牛、猪、绵羊、猫和狗；家禽；和一般宠物。
在某些实施例中，本公开的化合物可以单独使用或与另一种类型的治疗剂联合施用。
润湿剂、乳化剂和润滑剂，如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中。
药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
组合物可以制备成可注射的形式，作为液体溶液或悬浮液。也可以制备适合于注射的固体形式，例如，作为乳液，或具有包封在脂质体中的抗体-药物缀合物。抗体-药物缀合物可以与药学上可接受的载体组合，该载体包括不诱导产生对接受载体的受试者有害的抗体的任何载体。合适的载体通常包括代谢缓慢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集体等。
组合物还可以含有稀释剂，例如水、盐水、甘油和乙醇。辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等也可以存在于其中。组合物可以通过注射进行肠胃外施用，其中这种注射可以是皮下注射或肌内注射。在一些实施例中，可以将组合物施用到肿瘤中。可以将组合物插入(例如，注射)肿瘤中。其它制剂适用于其它施用形式，如栓剂或口服施用。口服组合物可以以溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊或缓释制剂的形式施用。
组合物可以以与剂量和制剂相容的方式施用。组合物优选地包含治疗有效量的抗体-药物缀合物。剂量可以根据待治疗的受试者、受试者的健康和身体状况、期望的保护程度和其它相关因素而变化。活性成分(例如，抗体-药物缀合物)的确切量可能取决于医师的判断。例如，可以将治疗有效量的抗体-药物缀合物或含有其的组合物施用于患有癌症或肿瘤的患者以治疗癌症或肿瘤。
根据本公开的抗体-药物缀合物或含有其的组合物可以以其药学上可接受的盐的形式施用。在一些实施例中，根据本公开的抗体-药物缀合物或含有其的组合物可以与药学上可接受的载体、药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的添加剂一起施用。药学上可接受的盐、赋形剂和添加剂的有效量和类型可以使用标准方法测量(参见，例如，《雷明顿药物科学》，麦克出版公司，宾夕法尼亚州伊斯顿，第18版，1990)。
在一些实施例中，本公开涉及一种治疗受试者中的癌症的方法，其包含向受试者施用包含如本文所述的抗体-药物缀合物的药物组合物。在优选的实施例中，受试者是哺乳动物。例如，受试者可以选自啮齿动物、兔类动物、猫科动物、犬科动物、猪科动物、绵羊、牛科动物、马科动物和灵长类动物。在某些优选的实施例中，受试者是人。
本公开的缀合物(在本文中也称为“活性化合物”)及其衍生物、片段、类似物和同系物可以掺入适于施用的药物组合物中。此类组合物通常包含缀合物和药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。合适的载体描述于最新版的《雷明顿药物科学》(本领域的标准参考文献)中，其通过引用并入本文。这种载体或稀释剂的优选实例包括但不限于水、盐水、林格氏液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水性媒介物，如不挥发性油。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域熟知的。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则预期其在组合物中的用途。补充活性化合物也可以掺入组合物中。
本公开的药物组合物被配制为与其预期的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外施用，例如静脉内、皮内和皮下施用。用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及张力调节剂，如氯化钠或葡萄糖。pH可以用酸或碱来调节，例如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性的)或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(巴斯夫公司(BASF)，新泽西州帕西帕尼)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的，并且应该是易于注射的流体。它在生产和储存条件下必须是稳定的，并且必须防止如细菌和真菌等微生物的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。可以例如通过使用包衣(如卵磷脂)，在分散体的情况下通过维持所需的粒度和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等，可以实现防止微生物的作用。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇)、山梨醇、氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
无菌可注射溶液可以通过将所需量的活性化合物根据需要与上文列举的成分中的一种或组合并入适当溶剂中，接着过滤灭菌来制备。通常，通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和来自以上列举的那些的所需其它成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其从先前无菌的过滤溶液中产生活性成分粉末加上任何额外的所需成分。
在某些实施例中，活性化合物与保护化合物免于从身体快速消除的载体一起制备，如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这种制剂的方法对本领域技术人员来说是显而易见的。这些材料也可以从阿尔扎公司(Alza Corporation)和Nova制药公司商购获得。脂质体悬浮液(包括用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向感染细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据合适的方法制备，例如，如美国专利第4,522,811号中所述。
为了易于施用和剂量的均匀性，特别有利的是以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物。本文所用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗的受试者的单位剂量的物理离散单位；每个单位含有经计算可产生所需治疗效果的预定量的活性化合物以及所需的药物载体。本公开的剂量单位形式的规格由活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗效果以及混配此类活性化合物用于治疗个体的领域中固有的限制来规定且直接取决于这些独特特征和待实现的特定治疗效果。
药物组合物可以与施用说明书一起包括在容器、包装或分配器中。
在一些方面，本公开提供了药物组合物，其包含如本文所述的抗体药物缀合物，任选地还包含治疗有效量的化疗剂。
在一些方面，本公开提供了治疗癌症的方法，其包含施用本公开的抗体-药物缀合物或其药物组合物。在一些此类实施例中，癌症选自白血病、淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、神经胶质瘤、肺癌、支气管癌、结肠直肠癌、胰腺癌、食道癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、肾盂癌、口腔癌、咽癌、子宫体癌或黑素瘤。
在一些方面，本公开提供了治疗自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，其包含施用本公开的抗体药物缀合物或其药物组合物。在一些实施例中，自身免疫性疾病或炎性疾病选自B细胞介导的自身免疫性疾病或炎性疾病，例如系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、瓦尔登斯特伦氏高丙种球蛋白血症、舍格伦综合征、多发性硬化(MS)或狼疮性肾炎。
在下文中，将通过实例详细描述本公开的配置，但以下实例仅用于帮助理解本公开。本公开的范围不限于此。此外，除非另有具体描述，否则说明书中描述的试剂、溶剂和原料可以容易地从商业供应商获得。
示例
下表列出了以下实例中使用的缩写：
Figure BDA0004078574660000871
Figure BDA0004078574660000881
实例
实例1.MPS衍生物的合成
实例1.1.MPS-D1的制备
Figure BDA0004078574660000882
化合物MPS-D1a的制备
在室温下在N2气氛下向4-乙酰基苯甲酸(9g，54.82mmol)于EtOH(50mL)中的溶液中添加哌啶盐酸盐(6.66g，54.82mmol)、多聚甲醛(4.95g，164.5mmol)和浓缩的HCl(0.6mL)。将混合物在100℃下搅拌16小时并冷却至室温，向其中滴加丙酮(90mL)。将混合物在0℃下搅拌1小时。将固体过滤并用二乙基醚(30mL×2)洗涤，得到化合物MPS-D1a(6.11g，38％)。
1H NMR(400Hz,DMSO-d6)δ8.08(s,4H),5.73(s,1H),3.65(t,J＝7.2Hz,2H),3.35(t,J＝7.2Hz,2H),3.31(m,6H),1.74(s,4H)。
化合物MPS-D1b的制备
在室温下向MPS-D1a(6.11g，20.52mmol)于EtOH(40mL)和MeOH(26mL)中的溶液中添加4-甲氧基苯硫酚(2.55g，20.52mmol)和哌啶(0.3mL，3.08mmol)。将混合物在100℃下搅拌16小时，冷却至0℃并再搅拌1小时。将固体过滤并用乙醚(30mL×2)洗涤，得到化合物MPS-D1b(5.56g，90％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ8.04-7.99(m,4H),7.27(d,J＝8.4Hz,2H),7.15(d,J＝7.6Hz,2H),3.39-3.36(m,2H),3.25-3.21(m,2H),2.27(s,3H)。
化合物MPS-D1的制备
在0℃下在N2气氛下向MPS-D1b(5.56g，18.51mmol)于MeOH(90mL)和蒸馏水(90mL)中的溶液中添加过硫酸氢钾制剂(25.03g，40.72mmol)。在室温下搅拌14小时后，将混合物用蒸馏水(100mL)和氯仿(150mL×3)淬灭。将有机层用盐水(200mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，得到化合物MPS-D1(5.29g，86％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ8.04-7.99(m,4H),7.81(d,J＝8.4Hz,2H),7.46(d,J＝8.4Hz,2H),3.63(t,J＝7.2Hz,2H),3.41(t,J＝7.2Hz,2H),2.44(s,3H)。ESI-MS m/z:333(M+)。
实例1.2.BCN-PNP的制备
Figure BDA0004078574660000891
在室温下在N2气氛下将(1R,8S,9S)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇(800mg，5.3mmol)溶解于DCM(125mL)中。向其中添加吡啶(1.22mL，15.9mmol)和氯甲酸4-硝基苯酯(1.75g，8.74mmol)。在相同温度下搅拌混合物4小时后，通过添加饱和NH4Cl溶液(100mL)淬灭反应并用EA(100mL×4)萃取。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。将残余物通过柱色谱法(Hex:EA＝10:1)纯化，得到呈白色固体的化合物BCN-PNP(1.34g，84％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.29(d,J＝9Hz,2H),7.39(d,J＝9Hz,2H),4.41(d,J＝8.4Hz,2H),2.36-2.24(m,6H),1.62-1.55(m,2H),1.53-1.49(m,1H),1.07(t,J＝10.2Hz,2H)。
实例1.3.MPS-D1-1的制备
Figure BDA0004078574660000901
在室温下在N2气氛下向化合物MPS-D1(500mg，1.50mmol)于DMF(8mL)中的溶液中添加炔丙胺(106μL，1.65mmol)。将反应冷却至0℃并向其中添加PyBop(1.17g，2.26mmol)和DIPEA(524μL，3.01mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时并用EA(30mL×2)和蒸馏水(20mL)稀释。萃取有机层，用盐水(50mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物MPS-D1-1(510mg，92％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ9.11(t,J＝5.2Hz,1H),7.98-7.89(m,4H),7.79(d,J＝8.0Hz,2H),7.43(d,J＝8.4Hz,2H),4.05-4.03(m,2H),3.60(t,J＝7.6Hz,2H),3.39(t,J＝7.2Hz,2H),3.12(s,1H),2.38(s,3H)。
实例1.4.L-2和L-2a的制备
Figure BDA0004078574660000902
化合物L-2通过与《聚合物科学杂志(Journal of Polymer Science)》，《A部分：聚合物化学(Part A:Polymer Chemistry)》，2012，50(19)，3986-3995中描述的类似合成路线合成，该文献通过引用并入本文。
化合物L-2-1的制备
产率30％
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ7.80(d,J＝8.4Hz,2H),7.34(d,J＝8.4Hz,2H),4.16(t,J＝4.8Hz,2H),3.74-3.58(m,14H),2.45(s,3H)。
化合物L-2-2的制备
产率68％
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ3.74-3.61(m,14H),3.40(t,J＝4.8Hz,2H),2.45(t,J＝6.0Hz,2H)。
化合物L-2-3的制备
产率63％
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ4.21(d,J＝2.4Hz,2H),3.72-3.67(m,14H),3.39(t,J＝5.2Hz,2H),2.43(t,J＝2.4Hz,1H)。
化合物L-2的制备
产率76％
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ4.20(d,J＝2.4Hz,2H),3.71-3.61(m,12H),3.51(t,J＝4.8Hz,2H),2.87(t,J＝5.6Hz,2H),2.43(t,J＝2.4Hz,1H)。
化合物L-2a的制备
在0℃下在N2气氛下向化合物L-2-2(3.0g，13.7mmol)于丙酮(100mL)中的溶液用琼斯试剂(20mL)处理并搅拌4小时。将反应混合物过滤并减压浓缩。将残余物用DCM(50mL×2)和蒸馏水(15mL)萃取。将有机层用盐水(50mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物L-2a(2.8g，88％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ4.22-4.14(m,2H),3.80-3.64(m,10H),3.42(t,J＝4.4Hz,2H)。
实例1.5.L-3的制备
Figure BDA0004078574660000911
化合物L-3-1的制备
在N2气氛下向六甘醇(5.0g，17.71mmol)于无水DCM(178mL)中的溶液中添加KI(294mg，1.77mmol)和Ag2O(4.92g，19.48mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。反应完成后，将混合物通过
Figure BDA0004078574660000912
过滤并用DCM(100mL)洗涤。将滤液减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物L-3-1(5.98g，73％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ7.80(d,J＝8.4Hz,2H),7.35(d,J＝8.4Hz,2H),4.16(t,J＝4.8Hz,2H),3.71-3.58(m,22H),2.88(br,1H),2.45(s,3H)。
化合物L-3-2的制备
在N2气氛下向化合物L-3-1(5.98g，13.7mmol)于DMF(30mL)中的溶液中添加NaN3(1.34g，20.55mmol)。将混合物在110℃下搅拌1小时并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物L-3-2(4.1g，97％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ3.72-3.60(m,22H),3.39(t,J＝4.8Hz,2H),2.78(br,1H)。
化合物L-3-3的制备
在室温下向L-3-2(1.0g，3.25mmol)于EtOH(5mL)中的搅拌溶液中添加5％Pd/C(1.04g，0.49mmol)。将氢气鼓泡通过反应混合物4小时。将混合物通过
Figure BDA0004078574660000921
过滤以除去Pd/C，并减压浓缩。将残余物溶于DCM(25mL)后，向其中添加BOC2O(852.1mg，3.9mmol)。将混合物在室温下搅拌3小时。将混合物减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化以产生化合物L-3-3(330mg，28％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ5.19(brs,1H),3.73(t,J＝4.8Hz,2H),3.67(s,12H),3.63-3.60(m,6H),3.54(t,J＝5.2Hz,2H),3.34-3.27(m,1H),1.44(s,9H)。
ESI-MS m/z:382(M++1)。
化合物L-3-4的制备
在N2气氛下将化合物L-3-2(1.9g，6.18mmol)溶解于DCM(20mL)中。向其中添加三乙胺(2.0mL，14.22mmol)和p-TsCl(2.4g，12.36mmol)，并将混合物在室温下搅拌过夜。反应完成后，将混合物减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物L-3-4(2.58g，91％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ7.80(d,J＝8.4Hz,2H),7.35(d,J＝8.4Hz,2H),4.16(t,J＝4.8Hz,2H),3.70-3.61(m,16H),3.56(s,1H),3.39(t,J＝4.8Hz,2H),2.45(s,3H)。
ESI-MS m/z:462(M++1)。
化合物L-3-5的制备
在N2气氛下将L-2(1.1g，3.4mmol)于无水THF(30mL)中的均匀溶液用NaOH(60％于矿物油中的分散体，135mg，3.4mmol)处理并冷却至0℃。在0℃下搅拌混合物20分钟后，向其中添加L-3-4(1.56g，3.4mmol)。使反应升温至室温并搅拌过夜。使反应冷却，用MeOH(5mL)淬灭并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物L-3-5(1.91g，93％)。
ESI-MS m/z:610(M++1)。
化合物L-3的制备
在0℃下在N2气氛下向化合物L-3-5(906.7mg，1.49mmol)于EA(4mL)和乙醚(4mL)中的溶液中缓慢添加5％HCI溶液(8mL)和三苯基膦(390mg，1.49mmol)。将混合物在0℃下搅拌过夜。将混合物用DCM(10mL)稀释。用DCM(10mL×3)萃取水层。在高真空下浓缩水相，得到化合物L-3(495mg，54％)。
ESI-MS m/z:584(M++1)。
实例1.6.L-4的制备
Figure BDA0004078574660000931
化合物L-4-1的制备
在-20℃下在N2气氛下向KOtBu(943mg，8.41mmol)于无水THF(50mL)中的溶液中添加四甘醇(4.35mL，25.22mmol)，随后添加炔丙基溴(1.0g，8.41mL)。使反应物升温至室温并搅拌17小时。通过添加MeOH(1mL)和H2O(50mL)淬灭反应，同时在冰浴中冷却并用EA(100mL)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物L-4-1(1.46g，75％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.26-4.20(m,2H),3.78-3.60(m,16H),2.42-2.40(m,1H)。
化合物L-4-2的制备
向在冰浴中冷却的CBr4(1.43g，4.31mmol)于无水DCM(20mL)中的溶液中添加三苯基膦(1.13g，4.31mmol)，然后添加L-4-1(500mg，2.15mmol)。使混合物升温至室温并搅拌18小时。将反应物用水(50mL)稀释并用DCM(100mL)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物L-4-2(410mg，65％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ4.21(s,2H),3.82(t,J＝6.4Hz,2H),3.74-3.64(m,12H),3.45(t,J＝6.4Hz,2H),2.45-2.42(m,1H)。
化合物L-4的制备
在室温下在N2气氛下向化合物L-4-2(300mg，1.02mmol)于DMF(10mL)中的溶液中添加N,N-二甲基乙二胺(555μL，5.08mmol)。将混合物在室温下搅拌5小时。反应完成后，将混合物减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物L-4(218mg，71％)。
ESI-MS m/z:303(M+1)。
实例1.7.L-5的制备
Figure BDA0004078574660000941
化合物L-5-1的制备
在室温下在N2气氛下向2,4-二溴丁酸甲酯(10g，38.47mmol)于无水THF(100mL)中的均匀溶液中滴加硫代乙酸(2.75mL，38.47mmol，1.0当量)和DIPEA(8.5mL，48.9mmol，1.3当量)于无水THF(50mL)中的混合物1.5小时。在-20℃下在N2气氛下搅拌4小时后，将混合物浓缩，用水(100mL)稀释并用EA(200mL×3)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法(Hex:EA＝12:1)纯化，得到呈白色固体的化合物L-5-1(9.67g，98％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ4.38(t,J＝7.6Hz,1H),3.46-3.39(m,2H),2.56-2.47(m,1H),2.36(s,3H),2.32-2.23(m,1H)。
化合物L-5-2的制备
在室温下在N2气氛下向L-5-1(9.67g，37.90mmol)于AcOH(80mL)中的溶液中添加35％过氧化氢(40mL)。将混合物搅拌过夜，然后浓缩，用水(20mL)稀释，用NaHCO3中和并用EA/Hex(1/1，30mL×2)洗涤。将水层减压浓缩。将残余物通过柱色谱法(DCM:MeOH:AcOH＝8:1:0.01至5:1:0.01)纯化，得到呈白色固体的化合物L-5-2(7.0g，71％)。
1H NMR(600MHz,D2O)δ4.11(dd,J＝5.4,4.8Hz,1H),3.82(s,3H),3.65-3.62(m,1H),3.52-3.47(m,1H),2.62-2.48(m,2H)。
化合物L-5-3的制备
在N2气氛下向L-5-2(7.0g，26.81mmol)于DMF(20mL)中的溶液中添加NaN3(4.5g，69.71mmol，2.6当量)，并将混合物在室温下搅拌过夜。反应完成后，将混合物减压浓缩。将残余物通过柱色谱法(DCM:MeOH:AcOH＝7:1:0.01至5:1:0.01)纯化，得到呈白色固体的化合物L-5-3(5.4g，90％)。
1H NMR(600MHz,D2O)δ3.82(dd,J＝4.2,6.0Hz,1H),3.63(s,3H),3.36-3.26(m,2H),2.29-2.02(m,2H)。
化合物L-5-4的制备
在50mL圆底烧瓶中添加L-5-3(500mg，2.24mmol)、10mL MeOH、5％Pd/C(715mg，0.34mmol，0.15当量)和Boc2O(538mg，2.46mmol，1.1当量)。吸出空气后，将混合物在室温下在H2下搅拌15小时。将催化剂通过
Figure BDA0004078574660000951
过滤，并用MeOH(20mL×2)洗涤
Figure BDA0004078574660000952
通过旋转蒸发器除去溶剂，并将残余物通过柱色谱法(DCM:MeOH:AcOH＝7:1:0.01至5:1:0.01)纯化，得到呈白色固体的化合物L-5-4(450.2mg，68％)。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ6.79(s,1H),4.13(brs,1H),3.55(s,3H),2.88-2.80(m,2H),1.96-1.88(m,2H),1.3 6(s,9H)。
化合物L-5-5的制备
在室温下在N2下将L-5-4(100mg，0.34mmol)于THF/水(4mL/8mL)中的均匀溶液用LiOH(21.2mg，0.50mmol，1.5当量)处理并搅拌8小时。将反应混合物用2N HCl溶液中和并减压浓缩。将化合物L-5-5直接用于下一步骤而无需进一步纯化。
ESI-MS m/z:284(M++1)。
化合物L-5-6的制备
将L-5-5(0.34mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(77.4mg，0.67mmol，2.0当量)和EDCI-HCl(260.7mg，1.36mmol，4.0当量)于DMF(2mL)中的均匀溶液在室温下在N2气氛下搅拌过夜。将混合物用L-3(210.8mg，0.34mmol，1.0当量)、DIPEA(177.6uL，1.02mmol，3.0当量)处理并搅拌过夜。将反应物减压浓缩。将残余物通过柱色谱法(DCM:MeOH:AcOH＝12:1:0.01至5:1:0.01)纯化，得到呈黄色油状物的化合物L-5-6(159.1mg，55％)。
ESI-MS m/z:850(M++1)。
化合物L-5的制备
在室温下在N2气氛下将L-5-6(100mg 0.12mmol)于1,4-二噁烷(2mL)中的均匀溶液用c-HCl(500uL)处理并搅拌30分钟。将反应混合物减压浓缩，得到呈黄色油状物的化合物L-5(92mg，99％)。
ESI-MS m/z:749(M++1)。
实例1.8.L-6的制备
Figure BDA0004078574660000961
化合物L-6-1的制备
在室温下在N2气氛下将Boc-L-丝氨酸甲酯(5.0g，22.8mmol)于DCM(30mL)中的均匀溶液用吡啶(8mL)、对甲苯磺酰氯(5.22g，27.4mmol，1.2当量)处理并搅拌过夜。通过添加水(50mL)淬灭反应并用EA(100mL×3)萃取。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法(Hex:EA＝9:1至2:1)纯化，得到呈白色固体的化合物L-6-1(7.0g，82％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.76(d,J＝8.4Hz,2H),7.35(d,J＝7.8Hz,2H),5.29(S,1H),4.53-4.47(m,1H),4.39(dd,J＝2.4,7.8Hz,1H),4.29(d,J＝7.2,2.4Hz,1H),3.69(s,3H),2.45(s,3H)。
化合物L-6-2的制备
在室温下在N2气氛下将CsCO3(1.05g，3.21mmol，0.6当量)于DMF(12mL)中的悬浮液用硫代乙酸(498uL，6.96mmol，1.3当量)和L-6-1(2.0g，5.36mmol)的DMF(8mL)溶液处理并搅拌过夜。将混合物通过添加水(50mL)淬灭并用EA(100mL×3)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法(Hex:EA＝5:1)纯化，得到呈白色固体的化合物L-6-2(1.4g，95％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ5.24(s,1H),4.53-4.49(m,1H),3.75(s,3H),2.45(s,3H),4.41-4.31(m,2H)。
化合物L-6-3的制备
在室温下在N2气氛下向L-6-2(1.2g，4.33mmol)于AcOH(10mL)中的溶液中添加35％过氧化氢(4mL)。将混合物搅拌7小时，然后减压浓缩。将残余物用水(5mL)稀释并使用饱和NaHCO3水溶液在0℃下碱化至pH 9。添加Boc2O(1.4g，6.49mmol，1.5当量)并将所得混合物搅拌过夜。将混合物用2N HCl在0℃下中和并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法(DCM:MeOH:AcOH＝8:1:0.01至5:1:0.01)纯化，得到呈白色固体的化合物L-6-3(521.5mg，42％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.96(d,J＝7.2Hz,1H),4.20(q,J＝6.8,4.8Hz,1H),3.58(s,3H),2.84(dd,J＝14,6.4Hz,1H),2.76(dd,J＝9.2,4.4Hz,1H),1.37(s,9H)。
化合物L-6-4的制备
在室温下在N2气氛下将L-6-3(71mg，0.25mmol)于THF/H2O(2.0mL/4.0mL)中的均匀溶液用LiOH(17.3mg，0.41，1.5当量)处理并搅拌3小时。将混合物在0℃下用2N HCl中和并减压浓缩，得到呈白色固体的化合物L-6-4(67mg，99％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.40(d,J＝7.2Hz,1H),3.96(q,J＝6.4,5.6Hz,1H),2.88-2.78(n,2H),1.36(s,9H)。
化合物L-6-5的制备
在室温下在N2气氛下将L-6-4(35mg，0.13mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(22.4mg，0.19mmol，1.5当量)和EDCI-HCl(50mg，0.26mmol，2.0当量)溶解于DMF(2mL)中。将混合物搅拌过夜后，将化合物L-6-5直接用于下一步骤而无需进一步纯化。
ESI-MS m/z:367(M++1)。
化合物L-6-6的制备
在室温下在N2气氛下向L-6-5(0.13mmol)于DMF(2mL)中的搅拌溶液中添加L-2(0.19mmol，1.5当量)和EDCI-HCl(50mg，0.26mmol，2.0当量)。将混合物在室温下搅拌过夜。将所得混合物减压浓缩后，将残余物通过柱色谱法(DCM:MeOH:AcOH＝12:1:0.01至5:1:0.01)纯化，得到呈黄色油状物的化合物L-6-6(34.8mg，64％)。
ESI-MS m/z:483(M++1)。
化合物L-6的制备
在室温下在N2气氛下将c-HCl(300uL)添加至L-6-6(29.6mg 0.061mmol)于1,4-二噁烷(1.2mL)中的搅拌溶液中并将混合物搅拌30分钟。将混合物减压浓缩，得到呈黄色油状物的化合物L-6(25.4mg，99％)。
ESI-MS m/z:382(M++1)。
实例1.9.MPS-D1-10的制备
Figure BDA0004078574660000981
化合物L-1-1的制备
在室温下在N2气氛下将11-叠氮基-3,6,9-三氧杂十一烷-1-胺(奥德里奇(Aldrich)，CAS 134179-38-7，5.0g，22.9mmol)于1,4-二噁烷(100mL)和H2O(25mL)中的澄清溶液用NaHCO3(3.8g，45.8mmol，2.0当量)和BOC2O(6.0g，27.5mmol，1.2当量)处理，然后搅拌6小时。将反应用水(50mL)淬灭并用DCM(100mL×3)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法(1％至3％MeOH的DCM溶液)纯化，得到呈无色油状物的化合物L-1-1(7.2g，99％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.03(brs,1H),3.72-3.60(m,10H),3.98-3.52(m,1H),3.43-3.36(m,1H),3.35-3.24(m,1H),1.26(s,9H)。
ESI-MS m/z:319(M++1)。
化合物L-1的制备
在室温下在N2气氛下将L-1-1(7.2g，22.6mmol)于THF(30mL)、乙醚(15mL)和H2O(15mL)中的澄清溶液用三苯基膦(6.5g，24.9mmol，1.1当量)处理，然后搅拌过夜。将反应混合物用水(10mL)稀释并用DCM(60mL×3)萃取。将水层减压浓缩，得到呈无色油状物的化合物L-1-1(6.3g，95％)。
ESI-MS m/z:293(M++1)
通过与实例2的化合物MPS-D1-1的制备方法类似的方式合成化合物MPS-D1-10a。
化合物MPS-D1-10a的制备
产率71％，浅黄色油状物
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.99-7.93(m,4H),7.83(d,J＝8.0Hz,2H),7.39(d,J＝8.0Hz,2H),7.30(brs,1H),5.01(brs,1H),3.74-3.46(m,26H),3.34-3.26(m,2H),2.46(s,3H),1.43(s,9H)；ESI-MS m/z:695(M++1)。
通过与实例1.8中的化合物L-6的制备方法类似的方式合成化合物MPS-D1-10b。
化合物MPS-D1-10b的制备
产率99％，浅黄色油状物。
1H NMR(400MHz,DMSO-D6)δ8.74(t,J＝8.0Hz,1H),7.98(dd,J＝12,8.4Hz,2H),7.82(d,J＝8.4Hz,2H),7.46(d,J＝8.0Hz,2H),3.68-3.36(m,24H),3.01–2.94(m,2H),2.22(s,3H)；ESI-MS m/z:595(M++1)。
化合物MPS-D1-10的制备
在室温下在N2气氛下将MPS-D1-10b(63mg，0.10mmol)和BCN-PNP(31.5mg，0.10mmol，1.0当量)于无水DMF(2.0mL)中的均匀溶液用DIPEA(52uL，0.3mmol，3当量)和HBTU(57mg，0.15mmol，1.5当量)处理并搅拌2小时。将反应用H2O(20mL)淬灭并用EA(30mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过制备型TLC纯化，得到化合物MPS-D1-10(57mg，74％)。ESI-MS m/z:771(M++1)。
实例1.10.L-11的制备
Figure BDA0004078574660000991
化合物L-11-1的制备
在N2气氛下向六甘醇(5.0g，17.71mmol)于无水DCM(178mL)中的溶液中添加KI(294mg，1.77mmol)、Ag2O(4.92g，19.48mmol)和p-TsCl(3.7g，19.48mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。反应完成后，将混合物通过
Figure BDA0004078574660000992
过滤并用DCM(100mL)洗涤
Figure BDA0004078574660001001
塞。将滤液减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物L-11-1(5.98g，73％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ7.80(d,J＝8.4Hz,2H),7.35(d,J＝8.4Hz,2H),4.16(t,J＝4.8Hz,2H),3.71-3.58(m,22H),2.88(br,1H),2.45(s,3H)。
化合物L-11-2的制备
在N2气氛下向化合物L-11-1(5.98g，13.7mmol)于DMF(30mL)中的溶液中添加NaN3(1.34g，20.55mmol)。将混合物在110℃下搅拌1小时并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物L-11-2(4.1g，97％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ3.72-3.60(m,22H),3.39(t,J＝4.8Hz,2H),2.78(br,1H)。
化合物L-11-2a的制备
在N2气氛下将化合物L-11-2(1.9g，6.18mmol)溶解于DCM(20mL)中，并向其中添加三乙胺(2.0mL，14.22mmol)和p-TsCl(2.4g，12.36mmol)，并将混合物在室温下搅拌过夜。反应完成后，将混合物减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物L-11-2a(2.58g，91％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ7.80(d,J＝8.4Hz,2H),7.35(d,J＝8.4Hz,2H),4.16(t,J＝4.8Hz,2H),3.70-3.61(m,16H),3.56(s,1H),3.39(t,J＝4.8Hz,2H),2.45(s,3H)。
ESI-MS m/z:462(M++1)。
化合物L-11-3的制备
在H2气氛下向化合物L-11-2(1.0g，3.25mmol)于EtOH(5mL)中的溶液中添加5％Pd/C(1.04g，0.49mmol)。将混合物在室温下搅拌4小时。将混合物通过
Figure BDA0004078574660001002
过滤以除去Pd/C，并减压浓缩。将残余物溶解于DCM(25mL)中。添加BOC2O(852.1mg，3.9mmol)，并将所得混合物在室温下搅拌3小时。将混合物减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化以产生化合物L-11-3(330mg，28％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ5.19(brs,1H),3.73(t,J＝4.8Hz,2H),3.67(s,12H),3.63-3.60(m,6H),3.54(t,J＝5.2Hz,2H),3.34-3.27(m,1H),1.44(s,9H)。
ESI-MS m/z:382(M++1)。
化合物L-11-4的制备
在N2气氛下在0℃下将化合物L-11-3(450mg，1.18mmol)于无水THF(10mL)中的均匀溶液用NaH(60％于矿物油中的分散体，47.2mg，1.18mmol)处理。在将混合物在0℃下搅拌20分钟之后，向其中添加L-11-2a(544.5mg，1.18mmol)。使反应升温至室温并搅拌过夜。使反应冷却，用MeOH(5mL)淬灭并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物L-11-4(582.9mg，74％)。
化合物L-11的制备
在0℃下在N2气氛下向化合物L-11-4(582.9mg，0.87mmol)于DCM(3mL)中的溶液中添加4M-HCl(于1,4-二噁烷中，1mL)。将混合物在室温下搅拌2小时。浓缩混合物，得到化合物L-11(527.6mg，定量)。
ESI-MS m/z:571(M++1)。
下表2列出了通过与实例2中所述类似的合成途径合成的化合物。
表2
Figure BDA0004078574660001011
Figure BDA0004078574660001021
实例2.马来酰亚胺和POS衍生物的合成
实例2.1.Mal-1的制备
Figure BDA0004078574660001031
化合物L-4通过与《药物化学杂志(Journal of Medicinal Chemistry)》，52(19)，5816-5825；2009中所述的类似合成途径合成，其通过引用并入本文。
化合物Mal-1a的制备
产率55％
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ4.21(d,J＝2.0Hz,2H),3.72-3.60(m,24H),2.79(brs,1H),2.43(t,J＝2.4Hz,1H)。
化合物Mal-1的制备
ESI-MS m/z:400(M+)
实例2.2.Mal-2的制备
Figure BDA0004078574660001032
在室温下在N2气氛下将N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-甲酸酯(85.5mg，0.26mmol)和L-2(75.3mg，0.28mmol)于无水DCM中的均匀溶液用DIPEA(44.5uL，0.26mmol，1当量)处理并搅拌至室温45分钟。将反应物用DCM(32mL)稀释并用1N HCI(30mL)、盐水(30mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化，得到呈白色胶状物的标题化合物L-5(70.8mg，61％，混合物9mg)。
ESI-MS m/z:451(M+1)
实例2.3.Mal-3的制备
Figure BDA0004078574660001033
化合物Mal-3-1的制备
在N2气氛下，在0℃下向BOC2O(9.6g，44.0mmol)于THF(50mL)中的溶液中添加2,2'-二氨基-N-甲基二乙胺(10.3g，88.0mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时。将混合物用H2O(100mL)和DCM(150mL×2)淬灭。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱纯化，得到化合物Mal-3-1(3.3g，35％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ5.04(brs,1H),3.26-3.16(m,2H),2.78(t,J＝6.0Hz,2H),2.47(t,J＝6.0Hz,2H),2.43(t,J＝6.0Hz,2H),2.22(s,3H),1.45(s,9H)。
化合物Mal-3-2的制备
在室温下在N2气氛下向Mal-3-1(500mg，2.3mmol)于AcOH(3.0mL)中的溶液中添加马来酸酐(248mg，2.53mmol)。将混合物在室温下搅拌3小时。减压浓缩混合物，在室温下将残余物溶解于乙酸酐(5.0mL)中。将NaOAc(95.7mg，1.17mmol)添加反应混合物中并在75℃下搅拌5小时。将混合物减压浓缩。将残余物通过柱纯化，得到化合物Mal-3-2(415mg，60％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ6.70(s,2H),3.63(t,J＝6.4Hz,2H),3.18-3.10(m,2H),2.57(t,J＝6.4Hz,2H),2.48(t,J＝6.0Hz,2H),2.24(s,3H),1.44(s,9H)。
ESI-MS m/z:298(M+)。
化合物Mal-3-3的制备
在0℃下向化合物Mal-3-2(370mg，1.24mmol)于DCM(4.0mL)中的溶液中添加TFA(3.0mL)。使反应温热至室温并搅拌2.5小时。将混合物减压浓缩并将其直接用于下一步骤而无需进一步纯化(387mg，定量)。
ESI-MS m/z:198(M+)。
化合物Mal-3的制备
在室温下在N2气氛下向化合物Mal-3-3(50mg，0.16mmol)和BCN-PNP(50.6mg，0.16mmol)于DMF(3.0mL)中的溶液中添加DIPEA(57uL，0.32mmol)。将混合物搅拌2.5小时，并添加EA(50mL×2)和H2O(30mL)。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物Mal-3(13.2mg，22％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ6.70(s,2H),5.12(brs,1H),4.14(d,J＝8.0Hz,2H),3.63(t,J＝6.0Hz,2H),3.24-3.18(m,2H),2.58(t,J＝6.4Hz,2H),2.50(t,J＝6.0Hz,2H),2.30-2.20(m,9H),1.28-1.22(m,3H),0.98-0.94(m,1H)。
ESI-MS m/z:374(M+)。
实例2.4.POS-1的制备
Figure BDA0004078574660001051
化合物POS-1-1的制备
在N2气氛下向4-氢苯甲酸乙酯(20g，120.35mmol)于EtOH(60mL)中的溶液中添加NH2NH2·H2O(88mL，1805.4mmol)。将混合物在回流下搅拌过夜。将混合物冷却至室温，并减压浓缩，然后用EtOH研磨，从而得到化合物POS-1-1(17.54g，9.6％)。
1H NMR(400Hz,DMSO-d6)δ9.50(s,1H),7.68(d,J＝8.4Hz,2H),6.78(d,J＝8.8Hz,2H),4.37(s,2H)。ESI-MS m/z:431(M++1)。
化合物POS-1-2的制备
在N2气氛下向化合物POS-1-1(17.54g，115.28mmol)于EtOH(200mL)和DMF(100mL)中的溶液中添加CS2(45mL，749.32mmol)和KOH(6.5g，115.28mmol)。在85℃下搅拌18小时后，通过添加1M HCl溶液将反应混合物调节至pH 4并用蒸馏水(500mL)和EA(500mL2)稀释。将有机层用H2O(500mL)和盐水(500mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物进行醚/Hex研磨，得到化合物POS-1-2(20.7g，93％)。
1H NMR(400Hz,DMSO-d6)δ10.44(s,1H),7.72(d,J＝8.4Hz,2H),6.94(d,J＝8.0Hz,2H)。ESI-MS m/z:195(M++1)。
化合物POS-1-3的制备
在0℃下向化合物POS-1-2(5g，25.75mmol)于THF(100mL)中的溶液中滴加Et3N(4.3mL，30.9mmol)和MeI(1.76mL，28.33mmol)。在0℃下搅拌10分钟后，使混合物升温至室温，搅拌2小时。将混合物用H2O(150mL)稀释并用EA(100mL×2)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物进行醚研磨，得到化合物POS-1-3(5.15g，96％)。
1H NMR(400Hz,DMSO-d6)δ7.80(d,J＝8.4Hz,2H),6.94(d,J＝8.4Hz,2H),2.74(s,3H)。ESI-MS m/z:209(M++1)。
化合物POS-1-4的制备
在0℃下在N2气氛下向化合物POS-1-3(3.2g，15.37mmol)于EtOH(150mL)中的溶液中添加70％m-CPBA(11.4g，46.11mmol)。在室温下搅拌5小时后，进一步添加70％m-CPBA(11.4g，46.11mmol)。然后将混合物在室温下搅拌过夜并用H2O(500mL)、饱和NaHCO3(300mL)淬灭并用EA(500mL×2)萃取。将有机层用盐水(300mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物进行Hex/EA＝1:1(100mL)研磨，得到化合物POS-1-4(3.2g，89％)。
1H NMR(400Hz,DMSO-d6)δ7.95(d,J＝8.8Hz,2H),7.01(d,J＝8.8Hz,2H),3.69(4s,3H)。ESI-MS m/z:241(M++1)。
化合物POS-1的制备
向POS-1-4(310mg，1.29mmol)和L-8-1(660mg，2.84mmol)于THF(8mL)和DMF(0.8mL)中的溶液中添加PPh3(667mg，2.58mmol)。将混合物冷却至0℃并向其中添加DEAD(1.17mL，2.58mmol)，并将混合物在0℃下搅拌3小时。将混合物用水(15mL)稀释并用EA(15mL×2)萃取。将得到的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，得到化合物POS-1(205mg，30％)。
ESI-MS m/z:455(M++1)。
实例2.5.Int-3的制备
Figure BDA0004078574660001061
化合物Int-3-a的制备
在室温下在N2气氛下将Int-TG(18.5g，45.0mmol)、4-羟基苯甲醛(5.0g，40.9mmol)分子筛(10.0g)于ACN(150mL)中的溶液用Ag2O(38.0g，0.164mol)处理并搅拌3小时。将反应混合物通过硅藻土垫过滤并将滤液减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物Int-3-a(16.0g，86％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.93(s,1H),7.86(d,J＝6.8Hz,2H)。7.11(d,J＝6.8Hz,2H),5.52-5.47(m,2H),5.18-5.14(m,2H),4.24-4.11(m,3H),2.19(s,3H),2.07(s,6H),2.02(s,3H)。
化合物Int-3-b的制备
在0℃下在N2气氛下将Int-3-a(540mg，1.19mmol)于无水THF(15mL)中的溶液用NaBH4(113mg，2.98mmol)处理并在0℃下搅拌10分钟。在室温下搅拌4小时后，将反应物用H2O和EA稀释。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法(EA:HEX＝1:1)纯化，得到化合物Int-3-b(430mg，79％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.30(d,J＝8.8Hz,2H),6.99(d,J＝8.8Hz,2H)。5.51-5.54(m,2H),5.11(dd,J＝10.8Hz,1H),5.03(d,J＝8.0Hz,1H),4.65(d,J＝5.6 2H)4.25-4.04(m,3H),2.19(s,3H),2.07(s,3H),2.06(s,3H),2.01(s,3H)。
化合物Int-3的制备
将Int-3-b(1.0g，2.2mmol)于无水DMF(6.0ml)中的溶液在室温下在N2气氛下用双(五氟苯基碳酸酯)(1.3g，3.3mmol)处理并搅拌3小时。将反应混合物用EA(20mL×2)、H2O(30mL)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将反应混合物通过柱色谱法纯化，得到Int-3(1.4g，98％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.384(d,J＝8.8Hz,2H),7.039(d,J＝8.4Hz,2H),5.529-5.465(m,2H),5.280(s,2H),5.141-5.068(m,2H),4.262-4.070(m,4H),2.195(s,3H),2.078(s,3H),2.073(s,3H),2.025(s,3H)。
实例2.6.Int-4的制备
Figure BDA0004078574660001071
通过与实例2.5中所述类似的方法合成化合物Int-4。
产率72％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.93(s,1H),7.86(d,J＝6.8Hz,2H)。7.11(d,J＝6.8Hz,2H),5.52-5.47(m,2H),5.18-5.14(m,2H),4.24-4.11(m,3H),2.19(s,3H),2.07(s,6H),2.02(s,3H)。
实例2.7.Int-5的制备
Figure BDA0004078574660001072
化合物Int-5-1的制备
在0℃下在N2气氛下向4-羟基苯甲酸(5.0g，36.2mmol)于甲醇(150mL)中的溶液中添加亚硫酰氯(26.3mL，362mmol)。将反应混合物在室温下搅拌4小时。将反应用NaHCO3水溶液淬灭并用EtOAc萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物Int-5-1(4.87g，89％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ7.87(d,J＝8.8Hz,2H),6.82(d,J＝9.2Hz,2H),3.85(s,3H)
ESI-MS m/z:153(M++1)。
化合物Int-5-2的制备
在0℃下在N2气氛下向化合物Int-5-1(1.0g，6.57mmol)于DCM(22.0mL)中的溶液中添加DIPEA(2.3mL，13.4mmol)和MOM-Cl(0.55mL，7.23mmol)。将反应混合物在室温下搅拌6小时。将反应用水淬灭并用EtOAc萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物Int-5-2(1.14g，88％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ8.01-7.97(m,2H),7.07-7.04(m,2H),5.23(s,2H),3.89(s,3H),3.48(s,3H)
化合物Int-5的制备
在0℃下在N2气氛下向化合物Int-5-2(1.14g，5.81mmol)于甲醇/H2O/1,4-二噁烷(16.0mL/8.0mL/16.0mL)中的溶液中添加氢氧化锂一水合物(975mg，23.2mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5小时。将反应用2N HCl淬灭并用EtOAc萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将化合物Int-5用于下一步骤而无需进一步纯化。
(995mg，94％)
1H NMR(400Hz,MeOH-D4)δ7.96(d,J＝8.8Hz,2H),7.08(d,J＝8.8Hz,2H),5.25(s,2H),3.55(s,3H)
实例3.OHPAS-接头衍生物的合成
实例3.1.Int-TG的制备
Figure BDA0004078574660001081
在0℃下在N2气氛下将β-D-半乳糖五乙酸酯(Alfa，CAS 4163-60-4，5.0g，12.81mmol)溶解于33％HBr的AcOH(20mL)溶液中。将混合物温热至室温。在室温下搅拌4小时后，将混合物减压浓缩，然后添加EA(1000mL)和饱和的碳酸氢钠(1000mL)。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化以提供化合物Int-TG(5.2g，99％)。
实例3.1.2Int-TG2的制备
Figure BDA0004078574660001091
通过与实例3.1.1中所述类似的方法合成化合物Int-TG2。
产率80％
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.654(d,J＝4.0Hz,1H),5.627(t,J＝10.0Hz,1H),5.252(dd,J＝10.4Hz,9.6Hz,1H),4.865(dd,J＝10.0Hz,4.0Hz,1H),4.593(d,J＝10.4Hz,1H),3.777(s,3H),2.113(s,3H),2.071(s,3H),2.065(s,3H)
实例3.1.3Int-TG3的制备
Figure BDA0004078574660001092
化合物Int-TG3-1的制备
在室温下在N2气氛下向β-D-半乳糖五乙酸酯(1g，2.56mmol)于THF(10mL)中的溶液中添加3-(二甲基氨基)1-丙胺(1.61mL，12.8mmol)。在相同温度下搅拌3小时后，将反应物用EA(250ml×3)、H2O(200ml)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。制备化合物Int-TG3-1(891mg，100％)，其不经进一步纯化即使用。
ESI-MS m/z:371(M++Na)。
化合物Int-TG3的制备
在0℃下在N2气氛下向Int-TG3-1(891mg，2.56mmol)于DCM(10mL)中的溶液中添加三氯乙氰(2.57mL，25.6mmol)和DBU(0.3mL，2.05mmol)。在室温下搅拌30分钟后，将反应物用DCM(250ml×3)、H2O(200ml)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物Int-TG3(880mg，70％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.70(s,1H),6.61(d,J＝3.6Hz,1H),5.57(dd,J＝2.8,0.8Hz,1H),5.55-5.35(m,2H),4.44(t,J＝7.6Hz,1H),4.19-4.06(m,2H),2.17(s,3H),2.04(s,3H),2.03(s,3H),2.02(s,3H)。
ESI-MS m/z:515(M++Na)。
实例3.1.3Int-TG4的制备
Figure BDA0004078574660001101
化合物Int-TG4-1的制备
在0℃下在N2气氛下向4-羟基苯甲酸(5.0g，36.2mmol)于甲醇(150mL)中的溶液中添加亚硫酰氯(26.3mL，362mmol)。将反应混合物在室温下搅拌4小时。将反应用NaHCO3水溶液淬灭并用EtOAc萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物Int-TG4-1(4.87g，89％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ7.87(d,J＝8.8Hz,2H),6.82(d,J＝9.2Hz,2H),3.85(s,3H)
EI-MS m/z:153(M++1)。
化合物Int-TG4-2的制备
在0℃下在N2气氛下向化合物Int-TG4-1(1.0g，6.57mmol)于DCM(22.0mL)中的溶液中添加DIPEA(2.3mL，13.4mmol)和MOM-Cl(0.55mL，7.23mmol)。将反应混合物在室温下搅拌6小时。将反应用水淬灭并用EtOAc萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物Int-TG4-2(1.14g，88％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ8.01-7.97(m,2H),7.07-7.04(m,2H),5.23(s,2H),3.89(s,3H),3.48(s,3H)
化合物Int-TG4的制备
在0℃下在N2气氛下向化合物Int-TG4-2(1.14g，5.81mmol)于甲醇/H2O/1,4-二噁烷(16.0mL/8.0mL/16.0mL)中的溶液中添加氢氧化锂一水合物(975mg，23.2mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5小时。将反应用2N HCl淬灭并用EtOAc萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将化合物Int-TG4用于下一步骤而无需进一步纯化。(995mg，94％)
1H NMR(400Hz,MeOH-D4)δ7.96(d,J＝8.8Hz,2H),7.08(d,J＝8.8Hz,2H),5.25(s,2H),3.55(s,3H)
实例3.2.OHPAS-D1、OHPAS-D1a和OHPAS-D2的制备
Figure BDA0004078574660001111
化合物OHPAS-D1a-1的制备
在0℃下在N2气氛下向L-1-1(2g，6.282mmol)于DMF(25mL)中的溶液中添加氢化钠(301mg，12.56mmol，60％)。10分钟后，在相同温度下在N2气氛下添加碘甲烷(3.9mL，62.82mmol)。在室温下在N2气氛下将反应物搅拌3小时。反应完成后，将反应混合物用2NHCI(10mL)淬灭并用EA(500mL×3)萃取。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将化合物OHPAS-D1a-1(黄色油状物)直接用于下一步骤而无需进一步纯化。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.70–3.62(m,12H),3.4(t,J＝5.2Hz,4H),2.91(s,3H),1.46(s,9H)。ESI-MS m/z:333(M+1)
化合物OHPAS-D1a-2的制备
在0℃下在N2气氛下向化合物OHPAS-D1a-1(3.3g，6.282mmol)于DCM(70mL)中的溶液中添加4N HCI的二噁烷溶液(25ml)。在0℃下在N2气氛下将反应物搅拌1小时。反应完成后，将反应混合物减压浓缩。将化合物OHPAS-D1a-2直接用于下一步骤而无需进一步纯化。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.92(t,J＝4.8Hz,2H),3.73–3.69(m,10H),3.45(t,J＝5.2Hz,2H),3.22–3.16(m,2H),2.77(t,J＝5.6Hz,3H),2.35(brs,1H)。ESI-MS m/z:233(M+1)
化合物OHPAS-D1-1的制备
在室温下在N2气氛下向3-甲酰基-4-羟基苯甲酸(5g，43.06mmol)于DMF(100mL)中的溶液中添加苄基溴(5.1mL，43.06mmol)和NaHCO3(2.53g，43.06mmol)。在室温下在N2气氛下将混合物搅拌过夜。将反应物用EA(200mL×2)和蒸馏水(100mL)萃取。将得到的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物OHPAS-D1-1(2.56g，39％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ11.41(s,1H),9.95(s,1H),8.34(d,J＝2.0Hz,1H),8.23(dd,J＝6.4Hz,2.4Hz,1H),7.46-7.35(m,5H),7.04(d,J＝9.2Hz,1H),5.37(s,2H)。
化合物OHPAS-D1-2的制备
在室温下在N2气氛下向化合物Int-TG-1(1.0g，3.90mmol)和化合物Int-TG(1.6g，3.90mmol)于无水ACN(30mL)中的溶液中添加分子筛(8g)和Ag2O(3.62g，15.61mmol)。将混合物在室温下搅拌1小时，然后通过
Figure BDA0004078574660001121
过滤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物OHPAS-D1-2(2.1g，92％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ10.34(s,1H),8.55(d,J＝2.0Hz,1H),8.26(dd,J＝6.8,2.0Hz,1H),7.45-7.35(m,5H),7.17(d,J＝8.8Hz,1H),5.63-5.60(m,1H),5.50(d,J＝3.6Hz,1H),5.37(s,2H),5.23(d,J＝8.0Hz,1H),5.16(dd,J＝7.2,3.6Hz,1H)4.24-4.10(m,4H),2.20(s,3H),2.10-2.03(m,9H)。
化合物OHPAS-D1-3的制备
在0℃下在N2气氛下向化合物OHPAS-D1-2(2.1g，3.58mmol)于DCM(30mL)中的溶液中添加m-CPBA(2.65g，10.74mmol)。在0℃下搅拌7小时后，将混合物通过添加饱和碳酸氢钠(40mL×2)淬灭。分离混合物，有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物溶解于DCM(5mL)中，在0℃下在N2气氛下添加水合肼(261μL，5.37mmol)。在0℃下搅拌1小时后，添加EA(30mL×2)和1M HCI水溶液(10mL)。将得到的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，得到化合物OHPAS-D1-3(1.1g，55％)。
ESI-MS m/z:574(M++Na)
化合物OHPAS-D1-4的制备
在0℃下在N2气氛下向化合物OHPAS-D1-3(280mg，0.49mmol)于DCM(5mL)中的溶液中添加TBDMS-OTf(224μL，0.97mmol)和Et3N(207μL，1.46mmol)。将混合物在室温下搅拌1.5小时，然后通过添加柠檬酸(20ml)猝灭。将有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物OHPAS-D1-4(246.3mg，68％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ7.67(d,J＝8.4Hz,1H),7.57(s,1H),7.44-7.34(m,5H),7.02(d,J＝8.4Hz,1H),5.49-5.44(m,2H),5.30(s,2H),5.19(d,J＝7.6Hz,1H),5.10(dd,J＝6.8,3.2Hz,1H)4.20-4.11(m,2H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),2.19(s,3H),2.04(s,3H),2.01(d,J＝6.0Hz,6H),1.02(s,9H),0.20(d,J＝15.6Hz,6H)。
化合物OHPAS-D1-5的制备
在室温下在H2下向化合物OHPAS-D1-4(283.2mg，0.41mmol)于EA(5mL)中的溶液中添加Pd/C(5％，87.5mg，0.04mmol)。将混合物搅拌1小时并通过
Figure BDA0004078574660001131
过滤，然后减压浓缩。将化合物OHPAS-D1-5直接用于下一步骤而无需进一步纯化(246mg，定量)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ7.67(d,J＝8.8Hz,1H),7.57(s,1H),7.05(d,J＝8.4Hz,1H),5.49-5.45(m,2H),5.22(d,J＝7.6Hz,1H),5.12(dd,J＝7.2,3.6Hz,1H)4.20-4.06(m,4H),2.19(s,3H),2.05(s,3H),2.02(d,J＝7.6Hz,6H),1.01(s,9H),0.21(d,J＝15.2Hz,6H)。
化合物OHPAS-D1的制备
在室温下在N2气氛下向化合物OHPAS-D1-5(243.2mg，0.41mmol)和11-叠氮基-3,6,9-三氧杂十一烷-1-胺(奥德里奇，CAS 134179-38-7，89.5mg，0.41mmol)于DMF(5mL)中的溶液中添加PyBOP(275mg，0.53mmol)和DIPEA(176uL，1.02mmol)。在室温下在N2气氛下将混合物搅拌2小时。将反应物用EA(30mL×2)和蒸馏水(10mL)萃取。将得到的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物OHPAS-D1(272.8mg，84％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ7.34(s,1H),7.31(d,J＝9.2Hz,1H),7.02(d,J＝8.0Hz,1H),6.73(s,1H),5.48-5.44(m,2H),5.19(d,J＝7.6Hz,1H),5.10(dd,J＝6.4,3.6Hz,1H),4.20-4.10(m,2H),4.06(t,J＝6.4Hz,2H),3.66(s,14H),3.38(t,J＝4.4Hz,2H),2.19(s,3H),2.02(t,J＝8.4Hz,9H),1.00(s,9H),0.20(d,J＝14.4Hz,6H)。
ESI-MS m/z:799(M++1)。
通过与化合物OHPAS-D1的制备方法类似的方式合成化合物OHPAS-D1a和OHPAS-D2。
化合物OHPAS-D1a的制备
产率：83％；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.00–6.96(m,2H),6.90(s,1H),5.48–5.43(m,2H),5.16(d,J＝8.0Hz,1H),5.10(dd,J＝3.2,10.4Hz,1H),4.20–4.11(m,2H),4.05(t,J＝7.2Hz,1H),3.76–3.49(m,14H),3.46–3.39(m,2H),3.10–3.04(m,3H),2.19(s,3H),2.04(s,3H),2.03(s,3H),2.01(s,3H),0.99(s,9H),0.21(s,3H),0.17(s,3H)。ESI-MS m/z:813(M+1)
化合物OHPAS-D2的制备
产率：81％，ESI-MS m/z:1152(M+1)。
实例3.3.OHPAS-D3、OHPAS-D3a和OHPAS-D4的制备
Figure BDA0004078574660001141
化合物OHPAS-D3-1的制备
在室温下在N2气氛下向4-羟基苯甲醛(1g，8.19mmol)于DCM(3mL)中的溶液中添加Et3N(2.28mL，16.38mmol)。经由气球引入SO2F2气体，并将混合物在室温下搅拌2小时。然后将混合物用DCM(30mL×3)和盐水(30mL)洗涤，将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物OHPAS-D3-1(790mg，63％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ10.06(s,1H),8.05(d,J＝8.0Hz,2H),7.55(d,J＝8.8Hz,2H)。
化合物OHPAS-D3-2的制备
向化合物OHPAS-D1(100mg，0.13mmol)和化合物OHPAS-D3-1(26mg，0.13mmol)于无水ACN(3mL)中的溶液中添加DBU(4μL，25μmol)。将混合物在室温下搅拌1小时并用蒸馏水(10mL)和EA(10mL×2)洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物OHPAS-D3-2(103mg，94％)。
ESI-MS m/z:869(M+)。
化合物OHPAS-D3-3的制备
在0℃下在N2气氛下向化合物OHPAS-D3-2(103mg，0.12mmol)于THF(8mL)中的溶液中添加NaBH4(9mg，0.24mmol)。在室温下搅拌2小时后，添加蒸馏水(10mL)和EA(10mL×2)。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，得到化合物OHPAS-D3-3(101mg，98％)。
ESI-MS m/z:871(M+)。
化合物OHPAS-D3的制备
在0℃下在N2气氛下向化合物OHPAS-D3-3(320.5mg，0.0.37mmol)于DCM(3ml)中的溶液中添加1M PBr3的DCM溶液(165ul，0.19mmol)。搅拌2小时后，通过添加饱和碳酸氢钠(8mL×2)淬灭混合物。用盐水洗涤有机层，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化以产生化合物OHPAS-D3(202.6mg，59％)。
ESI-MS m/z:934(M+)。
化合物OHPAS-D4的制备
在室温下在氮气氛下向化合物OHPAS-D3-3(47mg，54μmol)于DMF(2mL)中的溶液中添加二(4-硝基苯基)碳酸酯(25mg，81μmol)和DIPEA(14μL，81μmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。然后添加蒸馏水(10mL)和EA(10mL×2)，将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物OHPAS-D3-4(53mg，94％)。
ESI-MS m/z:1036(M+)。
通过制备化合物OHPAS-D3或OHPAS-D4的类似合成路线制备化合物OHPAS-D3a和OHPAS-D4a。
化合物OHPAS-D3a-1的制备
产率80％；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.04(s,1H),8.00(d,J＝8.8Hz,2H),7.57(d,J＝8.4Hz,2H),7.44–7.27(m,3H),5.57–5.51(m,1H),5.47(d,J＝3.2Hz,1H),5.14–5.10(m,2H),4.27–4.09(m,3H),3.76–3.53(m,14H),3.42–3.36(m,2H),3.12–3.04(m,3H),2.19(s,3H),2.07(s,3H),2.06(s,3H),2.02(s,3H)。ESI-MS m/z:883(M+1)
化合物OHPAS-D3a-2的制备
产率81％；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.47–7.42(m,2H),7.40–7.31(m,3H),7.24–7.21(m,2H),5.54–5.45(m,2H),5.11–5.07(m,2H),4.74–4.70(m,2H),4.25–4.21(m,1H),4.17–4.12(m,1H),4.06(t,J＝7.2Hz,1H),3.74–3.44(m,12H),3.37(t,J＝4.8Hz,2H),3.07–3.04(s,3H),2.20(s,3H),2.06(s,6H),2.02(s,3H)。ESI-MS m/z:885(M+1)。
化合物OHPAS-D3a的制备
产率90％；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.48–7.41(m,2H),7.35(d,J＝8.4Hz,2H),7.29–7.21(m,2H),5.59–5.55(m,1H),5.47(d,J＝3.2Hz,1H),5.13–5.09(m,2H),4.26–4.22(m,1H),4.18–4.08(m,2H),3.80–3.48(m,12H),3.37(t,J＝5.2Hz,2H),3.12–3.06(s,3H),2.19(s,3H),2.07(s,3H),2.06(s,3H),2.02(s,3H)。ESI-MS m/z:948(M+1)
化合物OHPAS-D4a的制备
产率94％；ESI-MS m/z:1036(M+1)
实例3.4.OHPAS-D5的制备
Figure BDA0004078574660001161
化合物OHPAS-D5-1的制备
在-78℃下在N2气氛下向化合物OHPAS-D3-1(5g，24.49mmol)于MeOH(40mL)和THF(245mL)中的溶液中添加NaBH4(1.85g，48.98mmol)。在0℃下搅拌1小时后，通过添加2N HCI(5mL)淬灭反应混合物并用H2O(250mL)和EA(250mL×3)萃取。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化以提供化合物OHPAS-D5-1(5.01g，99％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.50-7.46(m,2H),7.34-7.31(m,2H),4.75(d,J＝5.6Hz,2H),1.90(t,J＝5.6Hz,1H)。
化合物OHPAS-D5-2的制备
在0℃下在N2气氛下向化合物OHPAS-D5-1(2g，9.7mmol)于乙醚(32mL)中的溶液中添加1.0M PBr3的DCM溶液(3.88mL，3.88mmol)。搅拌2小时后，添加乙醚(100mL)和NaHCO3(100mL×3)进行萃取。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化以提供化合物OHPAS-D5-2(2.35g，90％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.52-7.49(m,2H),7.34-7.31(m,2H),4.49(s,2H)。
化合物OHPAS-D5-3的制备
向4-羟基异苯二醛(112mg，0.746mmol，CAS No:3328-70-9)和氢化钠(45mg，1.12mmol，60％)于DMF(5mL)中的溶液在0℃下在N2气氛下添加OHPAS–D5-2(280mg，0.97mmol)的DMF溶液(2mL)。在室温下在N2气氛下搅拌4小时后，通过添加H2O(10mL)淬灭反应混合物并用H2O(100mL)和EA(100mL×2)萃取。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化以提供呈白色固体的化合物OHPAS-D5-3(180mg，71％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.54(s,1H),9.98(s,1H),8.38(d,J＝2.4Hz,1H),8.14(dd,J＝2.0,8.8Hz,1H),7.60(d,J＝9.2Hz,2H),7.43(d,J＝8.8Hz,2H),7.19(d,J＝8.8Hz,1H),5.33(s,2H)。
化合物OHPAS-D5的制备
在-78℃下在N2气氛下向化合物OHPAS-D5-3(1g，2.96mmol)于THF(8mL)中的溶液中添加硼氢化钠(391mg，10.35mmol)的MeOH溶液(1.5mL)和THF溶液(1mL)。将反应混合物在0℃下在N2气氛下搅拌1小时。反应完成后，将混合物用2N HCI(2mL)淬灭并用H2O(100mL)和EA(100mL×3)萃取。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化以提供呈白色固体的化合物OHPAS-D5(850mg，85％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.55(d,J＝8.8Hz,2H),7.39–7.37(m,3H),7.30–7.28(m,1H),6.89(d,J＝8.4Hz,1H),5.16(s,2H),4.76(d,J＝6.0Hz,2H),4.65(d,J＝5.6Hz,2H)。
实例3.5.OHPAS-D6的制备
Figure BDA0004078574660001181
化合物OHPAS-D6-1的制备
在室温下在N2气氛下向2,6-二甲氧基-4-羟基苯甲醛(0.5g，2.74mmol)于DCM(8mL)中的溶液中添加Et3N(3.8mL，27.4mmol)。经由气球引入SO2F2气体，并将混合物在室温下搅拌2小时。然后将混合物用DCM(30mL×3)和盐水(30mL)洗涤，将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物OHPAS-D6-1(728mg，99％)。
产率99％
ESI-MS m/z:265(M+)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ10.41(s,1H),6.54(s,2H),3.91(s,6H)。
化合物OHPAS-D6-2的制备
在室温下向化合物OHPAS-D6-1(101mg，0.38mmol)和化合物OHPAS-D1(254mg，0.32mmol)于乙腈(6mL)中的溶液中添加BEMP(19μl，0.064mmol)。2小时后，将反应混合物用柠檬酸水溶液(8mL)稀释，并用EtOAc(2×8mL)萃取。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化以产生化合物OHPAS-D6-2(295mg，99％)。ESI-MS m/z:929(M+)。
通过与实例3.3中所述类似的合成路线合成化合物OHPAS-D6。
化合物OHPAS-D6-3的制备
产率96％；ESI-MS m/z:931(M+)。
化合物OHPAS-D6的制备
产率75％；ESI-MS m/z:750(M+)。
实例3.6.OHPAS-D7的制备
Figure BDA0004078574660001191
化合物OHPAS-D7-1的制备
在0℃下向化合物OHPAS-D1-3(3g，5.22mmol)于EA(240mL)中的溶液中添加Pd/C(300mg，10wt％)，并在室温下搅拌混合物3小时，同时注入H2气体。反应完成后，将混合物通过
Figure BDA0004078574660001192
过滤，然后减压浓缩。将化合物OHPAS-D7-1直接用于下一反应而无需进一步纯化(2.84g，100％，米色泡沫)。
ET-MS m/z:507.2(M+1+Na)
通过与实例3.2中制备化合物OHPAS-D1类似的方法制备OHPAS-D7-2。
化合物OHPAS-D7-2的制备
产率84％，白色固体；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.38–7.34(m,2H),7.00(d,J＝8.0Hz,1H),6.82(d,J＝5.2Hz,1H),6.10(brs,1H),5.49-5.45(m,2H),5.14(dd,J＝3.6,10.4Hz,1H),4.99(d,J＝7.6Hz,1H),4.27-4.08(m,3H),3.74-3.63(m,14H),3.37(t,J＝5.2Hz,2H),2.20(s,3H),2.12(s,3H),2.08(s,3H),2.03(s,3H)。ET-MS m/z:685.3(M+1)。
通过与实例3.3中制备化合物OHPAS-D3-2类似的方法制备OHPAS-D7-3。
化合物OHPAS-D7-3的制备
产率81％，白色固体；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.80(d,J＝2.0Hz,1H),7.76(dd,J＝2.4,8.8Hz,1H),7.50(d,J＝8.4Hz,2H)7.43–7.40(m,2H),7.37(d,J＝2.0Hz,1H),7.29–7.25(m,2H),7.08(d,J＝4.8Hz,1H),6.90(d,J＝8.4Hz,1H),5.60–5.56(m,1H),5.47(d,J＝3.2Hz,1H),5.17–5.10(m,4H),4.74(d,J＝6.4Hz,2H),4.64(d,J＝6.0Hz,2H),4.26–4.08(m,3H),3.71–3.58(m,14H),3.34(t,J＝4.8Hz,2H),2.41(t,J＝6.4Hz,1H),2.18(s,3H),2.08(s,3H),2.07(s,3H),2.01(s,3H),1.77(t,J＝6.0Hz,1H)。ET-MS m/z:1007.2(M+1)。
化合物OHPAS-D7-4的制备
在0℃下在N2气氛下向化合物OHPAS-D7-3(150mg，0.15mmol)于CH2Cl2(3mL)中的溶液中添加甲磺酰氯(150mg，0.15mmol)。将反应混合物在室温下在N2气氛下搅拌24小时。反应完成后，将混合物用H2O(50mL)淬灭并用CH2Cl2(50mL×3)萃取。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，产生呈米色泡沫的化合物OHPAS-D7-4(214mg，100％)，将其直接用于下一步骤而无需进一步纯化。
化合物OHPAS-D7-5的制备
在室温下在N2气氛下向化合物OHPAS-D7-4(214mg，0.15mmol)于ACN(3mL)中的溶液中添加硫代乙酸钾(43mg，0.37mmol)。在室温下在N2气氛下搅拌3小时后，将混合物用H2O(50mL)淬灭并用EA(50mL×3)萃取。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化以提供呈淡黄色泡沫的化合物OHPAS-D7(147mg，88％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.87(d,J＝2.0Hz,1H),7.78(dd,J＝2.0,8.4Hz,1H),7.51(d,J＝8.4Hz,2H),7.43-7.41(m,2H),7.31-7.27(m,2H),7.15(dd,J＝2.0,8.0Hz,1H),7.07-7.06(m,1H),6.79(d,J＝8.4Hz,1H),5.61-5.56(m,1H),5.47(d,J＝3.2Hz,1H),5.17(d,J＝8.0Hz,1H),5.14-5.10(m,3H),4.26-4.09(m,5H),4.05(s,2H),3.66-3.59(m,14H),3.34(t,J＝5.6Hz,2H),2.34(s,3H),2.32(s,3H),2.18(s,3H),2.08(s,3H),2.07(s,3H),2.01(s,3H)。ET-MS m/z:1123.2(M+1)。
化合物OHPAS-D7-6的制备
在0℃下在N2气氛下向化合物OHPAS-D7-5(100mg，0.089mmol)于ACN(2mL)中的溶液中添加N-氯琥珀酰亚胺(90mg，0.676mmol)和2N HCl(356uL，0.712mmol)。在0℃下在N2气氛下搅拌1小时后，在室温下向其中添加二甲硫醚(19.6uL，0.267mmol)。将反应混合物在相同温度下进一步搅拌5分钟。添加H2O(20mL)和EA(20mL×3)以进行萃取，并且将获得的有机层经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，产生呈白色泡沫的化合物OHPAS-D7(140mg，100％)，将其直接用于下一步骤而无需进一步纯化。
ET-MS m/z:1173.9(M+1)。
化合物OHPAS-D7的制备
在室温下在N2气氛下向化合物OHPAS-D7-6(140mg，0.089mmol)于ACN(2mL)中的溶液中添加氟化氢钾(41.7mg，0.534mmol)的H2O溶液(0.2mL)。在室温下搅拌2小时后，通过制备型HPLC纯化混合物以提供呈白色泡沫的化合物OHPAS-D7(42mg，41％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.86(d,J＝2.0Hz,1H),7.78(dd,J＝2.0,8.4Hz,1H),7.53–7.43(m,6H),7.29(d,J＝8.8Hz,1H),7.13–7.11(m,1H),7.05(d,J＝9.2Hz,1H),5.61–5.56(m,1H),5.48(d,J＝2.4Hz,1H),5.20(s,2H),5.17(d,J＝8.0Hz,1H),5.12(dd,J＝3.2,10.4Hz,1H),4.78(d,J＝3.6Hz,2H),4.26–4.09(m,3H),3.70–3.60(m,14H),3.5(t,J＝5.2Hz,2H),2.18(s,3H),2.08(s,3H),2.07(s,3H),2.01(s,3H)。ET-MS m/z:1139.1(M+1)。
实例3.7.OHPAS-D9和OHPAS-D10的制备
Figure BDA0004078574660001211
化合物OHPAS-D9-1的制备
在室温下在N2气氛下将化合物OHPAS-D1-5(1.0g，0.26mmol)和L-1(586mg，2.0mmol，1.2当量)于DMF(10mL)中的均匀溶液用PyBOP(1.13g，2.17mmol，1.3当量)、DIPEA(873uL，5.01mmol，3.0当量)处理并搅拌4小时。将反应用水(20mL)淬灭并用EA(30mL×2)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法(Hex:EA＝1:1至1:3)纯化，得到呈白色泡沫固体的化合物OHPAS-D9-1(1.05g，72％)。
ESI-MS m/z:874(M++1)。
化合物OHPAS-D9-2的制备
在室温下在N2气氛下将化合物OHPAS-D9-1(500mg，0.57mmol)和化合物OHPAS-D3-1(140mg，0.69mmol，1.2当量)于无水ACN(10mL)中的均匀溶液用BEMP(66.3μL，0.23mmol，0.4当量)处理并搅拌4小时。将反应用水(20mL)淬灭并用EA(30mL×2)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法(4％MeOH的DCM溶液)纯化，得到呈白色泡沫固体的化合物OHPAS-D9-2(495mg，85％)。
ESI-MS m/z:869(M++1)。
化合物OHPAS-D9-3的制备
在0℃下在N2气氛下将化合物OHPAS-D9-2(495mg，0.52mmol)于无水THF(5.0mL)中的溶液用NaBH4(39.7mg，1.05mmol，2.0当量)处理并搅拌2小时。将反应用水(20mL)淬灭并用EA(30mL×2)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法(2％至3％MeOH的DCM溶液)纯化，得到呈白色泡沫固体的化合物OHPAS-D9-3(418mg，91％)。
ESI-MS m/z:945(M++1)。
化合物OHPAS-D9-4的制备
在0℃下在N2气氛下将化合物OHPAS-D9-3(214.2mg，0.23mmol)于无水THF(5.0mL)中的溶液用甲磺酰氯(24.6uL，0.32mmol，1.4当量)和TEA(79.2uL，0.57mmol，1.5当量)处理并在室温下搅拌过夜。将反应用水(10mL)淬灭并用DCM(20mL×2)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法(100％DCM至5％MeOH的DCM溶液)纯化，得到呈白色泡沫固体的化合物OHPAS-D9-4(164mg，70％)。
ESI-MS m/z:1024(M++1)。
化合物OHPAS-D9的制备
在室温下在N2气氛下将化合物OHPAS-D9-4(164mg，0.16mmol)于无水THF(10mL)中的溶液中用LiBr(69.6mg，0.80mmol，5.0当量)处理并搅拌3小时。将反应物用水(10mL)稀释并用DCM(20mL×2)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法(3％至5％MeOH的DCM溶液)纯化，得到呈白色泡沫固体的化合物OHPAS-D9(161mg，99％)。
ESI-MS m/z:1008(M++1)。
通过与化合物OHPAS-D9的制备方法类似的方式合成化合物OHPAS-D10。
化合物OHPAS-D10-1的制备
产率72％，无色油状物
ESI-MS m/z:1226(M++1)。
化合物OHPAS-D10-2的制备
产率82％，无色油状物
ESI-MS m/z:1296(M++1)。
化合物OHPAS-D10-3的制备
产率75％，无色油状物
ESI-MS m/z:1298(M++1)。
化合物OHPAS-D10-4的制备
产率82％，无色油状物
ESI-MS m/z:1376(M++1)。
化合物OHPAS-D10的制备
产率82％，无色油状物
ESI-MS m/z:1361(M++1)。
实例3.8.OHPAS-D11的制备
Figure BDA0004078574660001231
通过与实例3.3中化合物OHPAS-D3-1的制备方法类似的方式合成化合物OHPAS-D11。
化合物OHPAS-D11的制备
产率81％，白色泡沫固体
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ7.88(s,1H),7.68(d,J＝8.8Hz,1H),7.30(d,J＝8.8Hz,1H),7.05(brs,1H),5.62-5.56(m,1H),5.48(d,J＝2.8Hz 1H),5.17(d,J＝8.0Hz,1H),5.12(dd,J＝7.2,3.2Hz,1H),4.26-4.08(m,3H),3.72-3.60(m,14H),3.36(t,J＝4.8Hz,2H),2.20(s,3H),2.08(s,6H),2.02(s,3H)；ESI-MS m/z:767(M++1)。
实例3.9.OHPAS-D12和OHPAS-D13的制备
Figure BDA0004078574660001241
通过与实例3.2中所述类似的方法合成化合物OHPAS-D12。
化合物OHPAS-D12-1
产率65％
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.32(s,1H),8.54(d,J＝2.4Hz,1H),8.28(dd,J＝8.8Hz,1H),7.45–7.35(m,5H),7.16(d,J＝8.8Hz,1H),5.39–5.34(m,6H),4.28–4.26(m,1H),3.72(s,3H),2.11–2.06(m,9H)。
化合物OHPAS-D12-2
产率63％
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.66(d,J＝2Hz,1H),7.60(dd,J＝8.4Hz,1H),7.43–7.31(m,5H),7.00(d,J＝8.4Hz,1H),6.13(s,1H),5.41–5.28(m,5H),5.12(d,J＝7.2Hz,1H),4.23(d,J＝9.2Hz,1H),3.76(s,3H),2.09(s,3H),2.06(d,J＝3.6Hz,6H)。
化合物OHPAS-D12-3
产率70％
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.60(dd,J＝2.0,2.0Hz,1H),7.43(d,J＝0.8Hz,1H),7.48–7.32(m,5H),7.01(d,J＝8.4Hz,1H),5.40–5.26(m,6H),4.18(d,J＝9.2Hz,1H),3.72(s,3H),2.09-2.04(m,9H)。0.99(s,9H),0.18(d,J＝12.8Hz,1H)。
化合物OHPAS-D12-4
产量定量
ESI-MS m/z:607(M++Na)
化合物OHPAS-D13-1
产率96％
1H NMR(400Hz,DMSO-d6)δ9.73(brs,1H),7.44(d,J＝2.0Hz,1H),7.37(dd,J＝2.4,6.4Hz,1H),7.08(d,J＝8.4Hz,1H),5.61(d,J＝7.6Hz,2H),5.45(t,J＝9.6Hz,1H),5.15–5.02(m,2H),4.67(d,J＝10Hz,1H)3.63(s,3H),2.04-1.98(m,9H)。
ESI-MS m/z:785(M++1)
化合物OHPAS-D13-2
产率78％
ESI-MS m/z:685(M++1)
化合物OHPAS-D12
产率85％
ESI-MS m/z:785(M++1)
化合物OHPAS-D12a
产率70％
ESI-MS m/z:559(M++1)
实例4.药物衍生物的合成
实例4.1.1Q-1和Q-2的制备
Figure BDA0004078574660001261
通过与实例3.3中制备化合物OHPAS-D3-1类似的方法由β-和α-鹅膏蕈碱制备Q-1-1和Q-2-1。
化合物Q-1-1的制备
产率89％；ESI-MS m/z:1002(M+1)。
化合物Q-2-1的制备
产率88％；ESI-MS m/z:1003(M+1)。
通过与实例3.3中制备化合物OHPAS-D3-2类似的方法制备Q-1-2和Q-2-2。
化合物Q-1-2的制备
产率62％；ESI-MS m/z:1666(M+1)。
化合物Q-2-2的制备
产率41％；ESI-MS m/z:1667(M+1)。
化合物Q-1的制备
在0℃下在N2气氛下向化合物Q-1-2(50mg，0.30μmol)于MeOH(4mL)中的溶液中添加K2CO3(21mg，1.5μmol)。搅拌0.5小时后，将所得残余物用DMSO(0.5mL)稀释并通过制备型HPLC纯化，得到呈浅黄色固体的化合物Q-1(10.5mg，19％)。
ESI-MS m/z:1498(M+1)。
化合物Q-2的制备
2步产率61％；ESI-MS m/z:1499(M+1)。
实例4.1.2.Q-1a的制备
通过与实例4.1.1中所述类似的合成路线合成化合物Q-1a。
Figure BDA0004078574660001271
化合物Q-1a的制备
产率83％；ESI-MS m/z:756(M/2+1)。
实例4.2.Q-3的制备
Figure BDA0004078574660001272
化合物Q-3-1的制备
在室温下向β-鹅膏蕈碱(40mg，43.5μmol)于DMF(3mL)中的溶液中添加N,N-二甲基乙二胺(10μl，47.83μmol)和TBTU(46mg，0.11mmol)和TEA(18μl，0.13mmol)。在40℃加热下搅拌过夜后，通过制备型HPLC分离并纯化混合物，得到化合物Q-3-1(28mg，65％)。
ESI-MS m/z:991(M+1)
化合物Q-3-2的制备
在N2气氛下向化合物Q-3-1(20mg，20.2μmol)和OHPAS-D3(30mg，24.2μmol)于DMF(2mL)中的溶液中滴加DIPEA(11μL，60.6mmol)。在室温下搅拌过夜后，分离混合物并通过制备型HPLC纯化，得到化合物Q-3-2(34mg，产率65％)，ESI-MS m/z:992(M/2+1)。
通过与实例4.1.1中所述类似的合成途径合成化合物Q-3。
化合物Q-3的制备
产率71％；ESI-MS m/z:838(M/2+1)
实例4.3.Q-4和Q-4a的制备
Figure BDA0004078574660001281
化合物Q-4-1的制备
在室温下在N2气氛下向化合物OHPAS-D4(65mg，0.063mmol)和MMAF-OMe(52mg，0.069mmol)于DMF(1mL)中的溶液中添加HOBt(2mg，0.013mmol)、DIPEA(12μL，0.069mmol)和吡啶(330μL)。在搅拌过夜后，用1N HCl将混合物调节至具有2至3的pH，用EA(8mL×2)萃取。将有机层用蒸馏水(8mL)和盐水(12mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物进行柱色谱法，得到化合物Q-4-1(73mg，71％)。
ESI-MS m/z:1644(M+1)。
通过与实例4.2中所述类似的合成途径合成化合物Q-4。
化合物Q-4的制备
产率69％；ESI-MS m/z:1462(M+1)。
通过与上述类似的合成路线合成化合物Q-4a。
化合物Q-4-1a的制备
产率99％；ESI-MS m/z:828(M/2+1)。
化合物Q-4a的制备
产率46％；ESI-MS m/z:738(M/2+1)。
实例4.4.Q-5的制备
Figure BDA0004078574660001291
通过与实例3.5中所述类似的合成途径合成Q-5-1和Q-5-2。
化合物Q-5-1的制备
产率98％
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.37(brs,1H)8.02(d,J＝8.8Hz,1H),7.75(d,J＝8.4Hz,1H),7.61(t,J＝7.2,1H),7.51(t,J＝8.0Hz,1H),4.32(brs,1H),4.18(t,J＝8.8,1H),4.05(m,1H),3.93(dd,J＝11.2,2.8Hz,1H),3.52(t,J＝10.8Hz,1H),1.61(s,9H)。ESI-MS m/z:438.2(M+1+Na)。
化合物Q-5-2的制备
产率79％
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.09(brs,1H)7.77(m,3H),7.57(t,J＝7.2Hz,1H),7.46(t,J＝7.6Hz,1H),7.32(m,1H),6.78(m,1H),5.56(m,1H),5.46(d,J＝2.8Hz,1H),5.22(d,J＝7.6Hz,1H),5.12(dd,J＝10.4,3.2Hz,1H),4.30(brs,1H),4.25–4.02(m,5H),3.93(m,1H),3.60(m,15H),3.31(m,2H),2.17(s,3H),2.04(s,3H),1.95(s,6H),1.56(s,9H)。ESI-MSm/z:1080.6(M+1)。
化合物Q-5的制备
在0℃下在N2气氛下将化合物Q-5-2(50mg，0.046mmol)溶解于4N HCI的1,4-二噁烷溶液(1mL)中。在室温下搅拌4小时后，将混合物用DCM(5mL)稀释并浓缩。将化合物Q-5直接用于下一步骤而无需进一步纯化(47mg，99％)。
ESI-MS m/z:980.5(M+1)。
实例4.5.Q-6的制备
Figure BDA0004078574660001301
化合物Q-6a的制备
化合物Q-6a通过如文献[参见《分子药剂学(Mol.Pharmaceutics)》2015，12，1813-1835]中所述的类似合成途径合成
化合物Q-6-1的制备
化合物Q-6-1通过如文献[参见《德国应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed.)》2010，49，7336-7339和WO2015110935A1]中所述的类似合成途径合成
化合物Q-6-2的制备
在0℃下在N2气氛下向化合物Q-6a(80mg，0.239mmol)和化合物Q-6-1(118mg，0.239mmol)于DCM(10mL)中的溶液中添加分子筛和BF3·OEt2(14.8μL，0.12mmol)。搅拌2小时后，将混合物通过
Figure BDA0004078574660001311
过滤并用DCM(50mL)洗涤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到呈白色泡沫的化合物Q-6-2(105mg，66％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.12(d,J＝8.0Hz,1H),7.89(brs,1H),7.63(d,J＝8.0Hz,1H),7.50(m,1H),7.35(m,1H),5.70(m,1H),5.51(s,1H),5.33(m,1H),5.20(m,1H),4.23(m,3H),4.11(m,2H),3.93(m,2H),3.42(t,J＝10.8Hz,1H),2.18(s,3H),2.08(s,3H),2.04(s,3H),2.00(s,3H),1.55(s,9H)。ESI-MS m/z:564.4(M+1)。
化合物Q-6-3的制备
将化合物Q-6-2(100mg，0.15mmol)溶解于DCM(2mL)中，然后在0℃下在N2气氛下添加4N HCI的1,4-二噁烷溶液(1mL)。搅拌4小时后，将反应物减压浓缩。将反应混合物在室温下在N2下搅拌4小时。将化合物Q-6-2直接用于下一步骤而无需进一步纯化(90mg，99％)。
ESI-MS m/z:564.2(M+1)。
化合物Q-6-4的制备
在室温下在N2气氛下向化合物Q-6-3(90mg，0.149mmol)于THF(5mL)中的溶液中添加戊二酸酐(18.8μL，0.164mmol)、Et3N(52μL，0.373mmol)和4-DMAP(2mg，0.015mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时，并通过制备型HPLC纯化，得到呈白色固体的化合物Q-6-4(30mg，30％)。
化合物Q-6-5的制备
在0℃下在N2气氛下向化合物Q-6-4(30mg，0.043mmol)和化合物Q-5(51mg，0.05mmol)于DMF(3mL)中的溶液中添加EDC·HCl(27.2mg，0.142mmol)。在搅拌11小时之后，将混合物通过制备型HPLC纯化，得到呈浅棕色固体的化合物Q-6-5(20mg，28％)。
ESI-MS m/z:821.7(M+1/2)。
化合物Q-6的制备
在0℃下在N2气氛下向化合物Q-6-5(10mg，0.006mmol)于MeOH(1.5mL)中的溶液中添加NaOMe 25％的MeOH(11μL，0.048mmol)溶液。将反应混合物在室温下在N2气氛下搅拌1小时并通过添加5％TFA的ACN溶液调节至pH 7。将混合物通过制备型-HPLC纯化，得到呈浅黄色固体的化合物Q-6(5mg，63％)。
ESI-MS m/z:1305.3(M+1)。
实例4.6.Q-7的制备
Figure BDA0004078574660001321
化合物Q-7a的制备
在室温下向PNU-159682(52mg，0.081mmol)于MeOH(5ml)/蒸馏水(3mL)中的溶液中添加NaIO4(18mg，0.081mmol)。搅拌2小时后，将混合物减压浓缩，得到粗化合物Q-7a(51mg，99％)。ESI-MS m/z:628(M+1)。
化合物Q-7b的制备
在室温下向化合物Q-7a(51mg，0.081mmol)于无水DCM(5mL)中的溶液中添加2-(二甲基氨基)乙胺(6.1μl，0.089mmol)和TEA(34μl，0.243mmol)、TBTU(52mg，0.162mmol)。搅拌1小时后，将混合物用DCM(2×8mL)稀释。将有机层用H2O(8mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化以产生化合物Q-7b(38mg，67％)。
ESI-MS m/z:698(M++1)。
通过与实例4.2中制备化合物Q-3-2类似的方法制备Q-7。
化合物Q-7-1的制备
产率38％；ESI-MS m/z:1551(M+1)。
化合物Q-7的制备
产率54％；ESI-MS m/z:1383(M+1)。
实例4.7.Q-8的制备
Figure BDA0004078574660001331
通过与实例4.6中所述类似的合成途径合成化合物Q-8。
化合物Q-8-1的制备
产率42％；ESI-MS m/z:837(M/2+1)。
化合物Q-8的制备
产率81％；ESI-MS m/z:746(M/2+1)。
实例4.8.苯并二氮杂卓单体衍生物的制备
实例4.8.1吡咯并苯并二氮杂卓单体(下文称为“PBD-单体”)的制备
Figure BDA0004078574660001341
通过以类似于EP20071813614中描述的方法进行反应得到PBD单体。
实例4.8.2吲哚啉并-苯并二氮杂卓单体(下文称为“IBD-单体”)的制备
Figure BDA0004078574660001342
通过在WO2010091150中描述的类似合成方法中进行反应得到IBD单体。
实例4.8.3MCBI-单体的制备
Figure BDA0004078574660001343
通过在US5985908中描述的类似合成方法中进行反应获得IBD单体。
实例4.8.4四氢异喹啉并-苯并二氮杂卓单体(下文称为“TBD-单体”)的制备
Figure BDA0004078574660001344
化合物M-1-1的制备
在N2气氛下向(s)-(-)-1,2,3,4,-四氢异喹啉-3-羧酸(5.0g，28.22mmol)于MeOH(140mL)中的溶液中滴加SOCl2(2.30mL，31.04mmol)至0℃。在40℃下搅拌21小时后，将混合物减压浓缩。添加乙醚(50mL)得到沉淀，将其用乙醚过滤得到化合物M-1-1(6.42g，产率99％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.02(s,2H),7.27(s,4H),4.60-4.56(m,1H),4.39-4.29(m,2H),3.82(s,3H),3.19-3.12(m,2H)；ESI-MS m/z:192(M++1)。
化合物M-1-2的制备
在0℃下向化合物Int-1(9.07g，28.22mmol)于无水THF(50ml)中的溶液中添加化合物M-1-1(6.42g，28.22mmol)的THF溶液(100mL)和TEA溶液(7.9mL，56.43mmol)。在室温下搅拌2小时后，将反应物用蒸馏水(500mL)稀释并用EA(800mL)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物M-1-2(12.01g，90％)。ESI-MS m/z:477(M++1)。
化合物M-1-3的制备
在-78℃下在N2气氛下向化合物M-1-2(4g，8.39mmol)于无水DCM(18mL)和甲苯(52mL)中的溶液中滴加DIBAL(16.8mL，16.79mmol，1.0M于甲苯中)。在-78℃下搅拌4小时后，在-78℃下用MeOH(0.4mL)和2N HCI(25mL)淬灭反应。将混合物用水(100mL)稀释并用EA(500mL)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物M-1-3(3.07g，82％)。ESI-MS m/z:447(M++1)。
化合物M-1-4的制备
在室温下向化合物M-1-3(3g，6.72mmol)于THF(130mL)和蒸馏水(86mL)中的溶液中添加Na2S2O4·2H2O(11.3g，53.76mmol)。搅拌5小时后，通过使用甲苯作为共溶剂将反应减压浓缩四次，从而除去水。然后，将所得黄色固体溶解于无水MeOH(220mL)中，并向其中添加乙酰氯(4.8mL，67.19mmol)。搅拌15分钟后，通过添加饱和NaHCO3溶液将反应混合物调节至pH 7并用蒸馏水(100mL)稀释并用EA(250mL×2)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物M-1-4(2.48g，93％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.55(s,1H),7.45-7.27(m,10H),6.84(s,1H),5.24-5.15(m,2H),5.00(d,J＝15.2,1H),4.56(d,J＝15.6,1H),3.97(s,3H),3.93-3.92(m,1H),3.31-3.12(m,2H)。ESI-MS m/z:399(M++1)。
化合物M-1的制备
在0℃下向化合物M-1-4(1g，2.51mmol)于无水DCM(10mL)中的溶液中添加甲磺酸(5mL)的DCM溶液(10mL)。在0℃下搅拌3小时后，将混合物用NaHCO3溶液、水(100mL)淬灭并用EA(400mL)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物M-1(703mg，91％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.54(s,1H),7.48(d,J＝4.8Hz,1H),7.37-7.26(m,4H),6.88(s,1H),6.03(s,1H),5.00(d,J＝15.6Hz,1H),4.56(d,J＝15.6Hz,1H),3.98(s,3H),3.95-3.90(m,1H),3.30-3.13(m,2H)。ESI-MS m/z:309(M++1)。
实例4.8.5带有C2-芳基取代基的PBD化合物的制备
Figure BDA0004078574660001361
化合物M-2-1的制备
在室温下在N2气氛下向反式-4-羟基-L-脯氨酸(30g，230mmol)和NaHCO3(43g，570mmol，2.5当量)于H2O/甲苯(500mL/120mL)中的搅拌溶液中添加Cbz-Cl(37.4mL，260mmol，1.15当量)。添加后，将混合物在该温度下搅拌过夜。将混合物用EA(500mL×3)萃取。将有机层用水(500mL×2)洗涤并经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，得到呈浅棕色油状物的化合物M-2-1(57.5g，95％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.7(brs,1H),7.40-7.28(m,5H),5.18-5.02(m,2H),4.31-4.24(m,2H),3.51-3.35(m,2H),2.23-2.10(m,1H),2.00-1.87(m,1H)；ESI-MS m/z:266(M++1)。
化合物M-2-2的制备
在0℃下在N2气氛下将化合物M-2-1(57.5g，220mmol)于MeOH(400mL)中的棕色溶液用亚硫酰氯(45.3mL，610mmol，2.8当量)处理。使反应混合物升温至室温并搅拌过夜。将混合物减压浓缩，得到呈浅棕色油状物的化合物M-2-2(60.5g，定量)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.38-7.28(m,5H),5.23-5.09(m,2H),4.56-4.47(m,2H),3.80(s,1H),3.76-3.66(m,2H),3.58-3.52(m,1H)2.38-2.26(m,1H),2.16-2.08(m,1H)；ESI-MS m/z:270(M++1)。
化合物M-2-3的制备
在0℃下在N2气氛下将化合物M-2-2(60.5g，220mmol)于无水THF(500mL)中的棕色溶液用LiBH4(3.9g，180mmol，0.8当量)处理并搅拌30分钟。然后将混合物在室温下再搅拌2天。将混合物用水(200mL)和2N HCI(100mL)淬灭。通过旋转蒸发器除去有机溶剂。将残余物用EA(500mL×3)萃取，然后将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，得到呈浅棕色油状物的化合物M-2-3(54.6g，98％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.39-7.30(m,5H),5.21-5.12(m,2H),4.66(d,J＝7.2Hz,1H),4.39(s,1H),4.21(q,J＝7.6,7.2Hz,1H),3.76(t,J＝9.6Hz,2H),3.66-3.58(m,1H),3.50(dd,J＝8.0,4.0Hz,1H),2.10-2.23(m,1H),1.78-1.64(m,1H)；ESI-MS m/z:252(M++1)。
化合物M-2-4的制备
在室温下在N2气氛下将M-2-3(53g，210mmol)于无水DCM(500mL)中的棕色溶液用叔丁基二甲基甲硅烷基氯(25.4g，170mmol，0.8当量)、TEA(30mL，210mmol，1.0当量)和DBU(6.3mL，42.2mmol，0.2当量)处理。添加后，将混合物搅拌过夜。将反应混合物先后用NH4Cl(300mL)和盐水(300mL)洗涤，然后将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法(Hex:EA＝1:1)纯化，得到呈浅棕色油状物的化合物M-2-4(48.2g，63％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.38-7.28(m,5H),5.20-5.08(m,2H),4.50(s,1H),4.12-4.00(m,1H),3.97(dd,J＝6.4,4.0Hz,1H),3.71(dd,J＝5.6,4.8Hz,1H),3.66-3.58(m,1H),3.52-3.48(m,1H),2.28-2.18(m,1H),2.02-1.92(m,1H),0.10 -0.08(m,6H)；ESI-MS m/z:366(M++1)。
化合物M-2-5的制备
在N2气氛下将钯/碳，5％Pd/C(1.3g，1.23mmol，0.03当量)添加至M-2-4(15g，41.0mmol)于EA(50mL)中的搅拌溶液中。通过在室温下使氢气鼓泡通过溶液来冲洗烧瓶。将混合物在相同温度下搅拌5小时。将混合物用EA(30mL)稀释，通过
Figure BDA0004078574660001381
过滤，将
Figure BDA0004078574660001382
塞用EA(50mL×2)洗涤。将滤液减压浓缩，得到呈浅棕色油状物的化合物M-2-5(9.5g，定量)。
1H NMR 400MHz,CDCl3)δ4.41(brs,1H),3.60-3.44(m,3H),3.12(dd,J＝7.2Hz,4.8Hz,1H),2.89(d,J＝12Hz,1H),1.84-1.79(m,1H),1.74-1.67(m,1H),0.89(s,9H),0.06(s,6H)；ESI-MS m/z:232(M++1)。
化合物M-2-6的制备
在0℃下在N2气氛下将化合物M-2-5(11.9g，51.42mmol)和Int-2(14.4g，56.6mmol，1.1当量)于无水THF(400ml)中的棕色溶液用DIPEA(26.9mL，154.3mmol，3.0当量)处理并搅拌5小时。将反应混合物用蒸馏水(50mL)稀释并用EA(150mL×2)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法(Hex:EA＝2:1至2:1)纯化，得到呈黄色固体的化合物M-2-6(20g，8.3％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.95(s,1H),6.87(s,1H),4.60-4.51(m,1H),4.49-4.41(m,1H),4.24-4.08(m,1H),3.91(s,3H),3.80-3.68(m,1H),3.37(dd,J＝7.6Hz,4.0Hz,1H),3.14(d,J＝10.4Hz,1H),2.35(s,3H),2.18-2.08(m,1H),0.91(s,9H),0.1(s 6H)；ESI-MSm/z:469(M++1)。
化合物M-2-7的制备
在N2气氛下将钯/碳，5％Pd/C(9.1g，4.27mmol，0.1当量)添加至M-2-6(20g，42.68mmol)于EA(213mL)中的搅拌溶液中。通过在室温下使氢气鼓泡通过溶液来冲洗烧瓶。搅拌8小时后，将混合物用EA(50mL)稀释，通过
Figure BDA0004078574660001383
过滤，将
Figure BDA0004078574660001384
塞用EA(50mL×2)洗涤。将滤液减压浓缩，得到呈黄色固体的化合物M-2-7(18.5g，99％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.81(s,1H),6.44(s,1H),5.79(brs,1H),4.58-4.50(m,1H),4.42-4.36(m,1H),4.10(brs,1H),3.79(s,3H),3.59(dd,J＝8.4Hz,2.8Hz,1H),3.50(d,J＝11.2Hz,1H),2.30-2.24(m,1H),2.06-2.01(m,1H),0.89(s,9H),0.05(d,J＝1.6Hz,6H)；ESI-MS m/z:439(M++1)。
化合物M-2-8的制备
在0℃下在N2气氛下将M-2-7(18.5g，42.18mmol)于无水DCM(210mL)中的黄色溶液用氯甲酸2,2,2-三氯乙酯(6.4mL，46.4mmol，1.1当量)和吡啶(6.9mL，87.4mmol，2.0当量)处理，然后搅拌3小时。将混合物用CuSO4溶液(50mL)和盐水(100mL×2)洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法(Hex:EA＝2:1)纯化，得到呈棕色固体的化合物M-2-8(21.2g，82％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.87(brs,1H),7.86(s,1H),6.89(s,1H),4.84(d,J＝12.8Hz,1H),4.71(d,J＝10.8Hz,1H),4.61(brs,1H),4.45(s,1H),4.20(brs,1H),3.78(s,3H),3.70-3.62(m,1H),3.57(s,2H),2.32(s,4H),2.11-2.02(m,1H),1.80(s,1H),0.90(s,9H),0.05(s,6H)；ESI-MS m/z:615(M++1)。
化合物M-2-9的制备
在-78℃下在N2气氛下将草酰氯(21mL，24.4mmol，1.5当量)于无水DCM(50mL)中的均匀溶液用DMSO(3.5mL，48.9mmol，3.0当量)的无水DCM溶液(20mL)处理并搅拌1小时。将M-2-8(10g，0.33mmol)于无水DCM(100mL)中的溶液滴加至反应混合物中并搅拌2小时。将反应混合物用TEA(22.7mL，162.9mmol，10当量)处理并在室温下搅拌1小时。将混合物用NH4Cl溶液(30mL)和DCM(100mL×2)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法(Hex:EA＝4:1至1:1)纯化，得到呈棕色固体的化合物M-2-9(8.2g，83％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.68(brs,1H),7.91(s,1H),6.86(s,1H),5.12(brs,1H),4.80(s,2H),4.13(brs,1H),4.04(d,J＝17.2Hz,1H),3.98 -3.86(m,1H),3.80(s,3H),3.76-3.62(m,1H),2.84-2.72(m,2H),2.54(d,J＝17.2Hz,1H),2.32(s,3H),2.08-1.98(m,1H),0.88(s,9H),0.21(s,6H)；ESI-MS m/z:612(M++1)。
化合物M-2-10的制备
在-10℃下在N2气氛下将M-2-9(2.0g，3.27mmol)和2,6-二甲基吡啶(4.6mL，12当量)于无水DCM(100mL)中的黄色溶液用三氟甲磺酸酐(5.5mL，32.68mmol，10当量)处理并搅拌6小时。使反应混合物升温至室温并再搅拌1小时。将混合物用蒸馏水(50mL)稀释并用DCM(100mL×2)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法(Hex:EA＝4:1)纯化，得到呈黄色油状物的化合物M-2-10(502mg，21％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.78(brs,1H),7.97(s,1H),6.85(s,1H),6.80(s,1H),4.86-4.72(m,3H),4.20-4.32(m,1H),3.80(s,3H),3.76-3.68(m,1H),3.20–3.00(m,2H),2.33(s,3H),0.89(s,9H),0.06(d,J＝10.6Hz 6H)；ESI-MS m/z:745(M++1)。
化合物M-2-11的制备
在室温下在N2气氛下将M-2-10(500mg，0.67mmol)于甲苯(4.0mL)、H2O(0.6mL)和乙醇(4.0mL)中的黄色溶液用4,4,5,5-四甲基-2-苯基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(164.6mg，0.81mmol，1.2当量)、Pd(TPP)4(77.5mg，0.067mmol，0.1当量)和TEA(234.2uL，1.68mmol，2.5当量)处理，然后搅拌3小时。将混合物用蒸馏水(100mL)稀释并用EA(100mL)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法(Hex:EA＝3:1)纯化，得到呈黄色固体的化合物M-2-11(343mg，76％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.76(brs,1H),7.96(s,1H),7.38-7.28(m,5H),6.98(s,1H),6.93(s,1H),4.78-4.68(m,3H),4.16-4.04(m,2H),3.92-3.84(m,1H),3.79(s,3H),3.24-3.12(m,1H),3.08-2.90(m,1H),2.34(s,3H),0.85(s,9H),0.05(s,6H)；ESI-MS m/z:673(M++1)。
化合物M-2-12的制备
在室温下在N2气氛下将M-2-11(340mg，0.505mmol)于THF(4.0mL)和H2O(2.0mL)中的黄色溶液用乙酸(8.0mL)处理并搅拌20小时。将混合物用蒸馏水(10mL)稀释并用EA(20mL×2)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法(Hex:EA＝2:1)纯化，得到呈黄色固体的化合物M-2-12(250mg，89％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.86(brs,1H),7.87(s,1H),7.36-7.28(m,5H),7.00(s,1H),6.85(s,1H),4.93(brs,1H),4.75(s,2H),4.16-4.10(m,3H),3.82(s,3H),3.64(s,1H),3.33(t,J＝13.6,5.6Hz,1H),2.77(d,J＝17.2Hz,1H)2.34(s,3H)；ESI-MS m/z:558(M++1)。
化合物M-2-13的制备
在-78℃下在N2气氛下将草酰氯(58uL，0.67mmol，1.5当量)于无水DCM(1.0mL)中的均匀溶液用DMSO(80uL，1.12mmol，3.0当量)的无水DCM溶液(1.0mL)处理并搅拌15分钟。将M-2-12(250mg，0.45mmol)于无水DCM(3.0mL)中的溶液滴加至反应混合物中并搅拌3小时，随后添加TEA(500uL，3.58mmol，8.0当量)并在室温下再搅拌30分钟。将反应混合物用蒸馏水(5.0mL)稀释并用EA(15mL×2)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法(Hex:EA＝3:1)纯化，得到呈黄色固体的化合物M-2-13(202mg，81％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45(s,1H),7.38(s,5H),7.12(s,1H),5.84(brs,1H),5.18(d,J＝10.6Hz,1H),4.31(d,J＝12.8Hz,1H),4.18-4.06(m,3H),3.84(s,3H),3.72(s,1H),3.43(t,J＝10.0Hz,1H),3.12(d,J＝18.0Hz,1H),2.32(s,3H)；ESI-MS m/z:556(M++1)
化合物M-2的制备
在室温下在N2气氛下将M-2-13(175mg，0.31mmol)于MeOH(16mL)和H2O(3.0mL)中的黄色溶液用K2CO3(109mg，0.79mmol，2.5当量)处理并搅拌2小时。将混合物用水(5mL)稀释并用EA(10mL×2)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法(Hex:EA＝2:1)纯化，得到呈黄色固体的化合物M-2(135mg，85％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.49(s,1H),7.37(s,5H),6.94(s,1H),5.93(brs,1H),5.88-5.82(m,1H),5.14(d,J＝11.6Hz,1H),4.32(d,J＝10.8Hz,1H),4.18-4.00(m,2H),3.97(s,3H),3.41(t,J＝9.6Hz,1H),3.10(d,J＝16.0Hz,1H)；ESI-MS m/z:514(M++1)
通过制备化合物M-2的类似方法制备M-2a。
化合物M-2-11a的制备
产率59％，为黄色泡沫固体；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.78(brs,1H),7.95(s,1H),7.22(d,J＝8.4Hz,2H),6.97(s,1H),6.85(d,J＝8.4Hz,1H),6.81(s,1H),4.87–4.69(m,3H),4.09–4.02(m,1H),3.93–3.88(m,1H),3.80(d,J＝8.0Hz,6H),3.20–3.12(m,1H),3.05-2.97(m,1H),2.34(s,3H),0.85(s,9H),0.60(d,J＝8.4Hz,6H)；ESI-MS m/z:703(M++1)。
化合物M-2-12a的制备
产率79％，呈黄色泡沫固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.85(brs,1H),7.85(s,1H),7.2(d,J＝8.8Hz,2H),7.00(s,1H),6.85(d,J＝7.2Hz,1H),6.72(s,1H),4.95–4.87(m,1H),4.74(d,J＝2.8Hz,2H),4.04–3.84(m,3H),3.81(d,J＝3.6Hz,6H),3.34–3.24(m,1H),2.72(dd,J＝13.2,3.2Hz,1H),2.34(s,3H)；ESI-MS m/z:588(M++1)。
化合物M-2-13a的制备
产率80％，呈黄色泡沫固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.37(s,2H),7.32(d,J＝8.0Hz,2H),7.11(s,1H),6.90(d,J＝9.2Hz,2H),5.86–5.81(m,1H),5.18(d,J＝12Hz,1H),4.30(d,J＝11.6Hz,1H),4.10-4.05(m,1H),3.90(s,3H),3.83(s,3H),3.73(d,J＝4.8Hz,1H),3.44–3.35(m,1H),3.12–3.05(m,1H),2.37(s,3H)；ESI-MS m/z:586(M++1)
化合物M-2a的制备
产率75％，呈黄色泡沫固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.37(s,1H),7.31(d,J＝8.8Hz,2H),7.30(s,1H),6.94(s,1H),6.89(d,J＝8.8Hz,2H),5.93(s,1H),5.84(dd,J＝5.2,4.4Hz,1H),5.14(d,J＝11.6Hz,1H),4.32(d,J＝12Hz,1H),4.07-3.99(m,1H),3.97(s,3H),3.83(s,1H),3.64(d,J＝4.4Hz,1H),3.43-3.34(m,1H),3.10-3.03(m,1H)；ESI-MS m/z:544(M++1)
实例4.8.6化合物M-3的制备
Figure BDA0004078574660001421
化合物M-3-1的制备
向(S)-2-氨基-3-(4-羟基-3,5-二碘苯基)丙酸(8.0g，18.48mmol)于浓HCl水溶液(90mL)中的溶液中添加1,2-二甲氧基乙烷(7.5mL)和多聚甲醛(37％wt于H2O中，92.38mmol)。将混合物剧烈搅拌并缓慢加热至72℃。将反应混合物在72℃下搅拌过夜。然后将悬浮液在冰浴中冷却并通过过滤收集固体，用1,2-二甲氧基乙烷(3×10mL)彻底洗涤并在真空下干燥，得到化合物M-3-1(2.49g，产率28％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.02(brs,1H),9.69(s,1H),7.73(s,1H),4.31(dd,J＝6.8Hz,4.4Hz,1H),4.05(q,J＝18.8Hz,16Hz,2H),3.21(dd,J＝12Hz,4.8Hz,1H),3.12-3.02(m,1H)；ESI-MS m/z:446(M++1)。
化合物M-3-2的制备
在室温下在H2气氛下将M-3-1(1.4g，3.1mmol)、TEA(1.4mL，10.38mmol)和5％Pd/C(335mg，0.16mmol)于EtOH/H2O(40mL/mL)中的混合物搅拌3小时。将混合物通过
Figure BDA0004078574660001422
过滤并将滤液浓缩。将所得残余物用水稀释并将沉淀物过滤。将固体用冷水洗涤并在高真空下干燥，得到化合物M-3-2(337.3mg，60％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.55(brs,1H),9.69(s,1H),6.98(d,J＝9.0Hz,1H),6.64(d,J＝8.4Hz,1H),6.57(s,1H),4.06(s,2H),3.46(dd,J＝6.0Hz,4.8Hz,1H),3.46(dd,J＝11.6Hz,5.2Hz,1H),2.82–2.75(m,1H)；ESI-MS m/z:194(M++1)。
化合物M-3-3的制备
在N2气氛下向M-3-2(337.3mg，1.74mmol)于MeOH(5.0mL)中的溶液中滴加SOCl2(380uL，5.24mmol)至0℃。回流2小时后，将反应混合物减压浓缩，并直接用于下一步骤而无需进一步纯化(406mg，产率96％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.83(brs,2H),9.56(s,1H),7.05(d,J＝8.0Hz,1H),6.70(d,J＝8.0Hz,1H),6.63(s,1H),4.53-4.49(m,1H),4.28-4.22(m,2H),3.81(s,1H),3.18(dd,J＝11.6Hz,5.2Hz,1H),3.04-2.97(m,1H)；ESI-MS m/z:208(M++1)。
化合物M-3-4的制备
在0℃下向化合物Int-1(640.9mg，1.86mmol)于无水THF(4.0mL)中的溶液中添加化合物M-3-3(350mg，1.43mmol)的DMF溶液(5.0mL)，然后添加DIPEA(750uL，4.3mmol)。在室温下搅拌2小时后，将混合物用蒸馏水(10mL)和EA(2×50mL)稀释。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物M-3-4(616mg，87％)；ESI-MSm/z:493(M++1)。
化合物M-3-5的制备
在0℃下将叔丁基二甲基甲硅烷基氯(188.5mg，1.25mmol)添加至M-3-4(616mg，1.25mmol)和咪唑(102.2mg，1.50mmol)于无水DCM(6.0mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应用2N HCI(5mL)和盐水(10mL)淬灭并用DCM(10mL×2)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物M-3-5(655.2mg，86％)。ESI-MS m/z:607(M++1)。
化合物M-3-6的制备
在-78℃下在N2气氛下向化合物M-3-5(309mg，0.51mmol)于无水DCM(1.5mL)和甲苯(3.5mL)中的溶液中滴加DIBAL(990uL，0.99mmol，1.0M于甲苯中)。搅拌1.5小时后，在-78℃下用MeOH(0.4mL)和2N HCI(15mL)淬灭反应，然后用H2O(20mL)和EA(30mL×2)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物M-3-6(280.4mg，95％)；ESI-MS m/z:577(M++1)。
化合物M-3-7的制备
在室温下向化合物M-3-6(280.4mg，0.49mmol)于THF(6.0mL)和蒸馏水(86mL)中的溶液中添加Na2S2O4(677.2mg，3.89mmol)。搅拌5小时后，通过使用甲苯作为共溶剂将混合物减压浓缩四次，从而除去水。将获得的黄色固体溶解于无水MeOH(12mL)中。向其中添加乙酰氯(345.6uL，4.86mmol)。搅拌15分钟后，将反应混合物过滤并将滤液搅拌1小时。通过添加饱和NaHCO3溶液将反应混合物调节至pH 7，并用蒸馏水(10mL)和EA(2×50mL)稀释。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物M-3-7(107.7mg，42％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.55(s,1H),7.48-7.31(m,6H),7.16(d,J＝8.4Hz,1H),6.94(s,1H),6.82-6.76(m,2H),5.28-5.15(m,2H),4.93(d,J＝15.6Hz,1H),4.46(d,J＝15.6Hz,1H),3.97(s,3H),3.92-3.86(m,1H),3.18(dd,J＝9.6Hz,5.6Hz,1H),3.10-3.02(m,1H),0.99(s,9H),0.21(s,6H)；ESI-MS m/z:529(M++1)。
化合物M-3的制备
在N2气氛下向化合物M-3-7(53.4mg，0.1mmol)于EtOH(6.0mL)中的溶液中添加5％Pd/C(107.5mg，0.05mmol)。然后将1,4-环己二烯(764.4uL，8.08mmol)添加反应混合物中。搅拌3小时后，将混合物通过
Figure BDA0004078574660001441
过滤以除去Pd/C，并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物M-3(30.3mg，68％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.54(s,1H),7.47(d,J＝5.2Hz,1H),7.20(d,J＝8.82Hz,1H),6.87(s,1H),6.84-6.75(m,2H),5.98(s,1H),4.93(d,J＝15.6Hz,1H),4.47(d,J＝15.2Hz,1H),3.98(s,3H),3.94-3.85(m,1H),3.19(dd,J＝11.2Hz,5.2Hz,1H),3.12-3.02(m,1H),0.99(s,9H),0.21(s,6H)；ESI-MS m/z:439(M++1)。
实例4.8.7化合物Int-1的制备
Figure BDA0004078574660001442
化合物Int-1-1的制备
在0℃下在N2气氛下向香草酸(50.0g，0.30mol)于MeOH(700mL)中的溶液中滴加SOCl2(207mL，2.85mol)。在室温下搅拌15小时后，用饱和NaHCO3水溶液将反应调节至pH为7至8，然后用蒸馏水(100mL)和EA(400mL)稀释。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物Int-1-1(54.2g，定量)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.64(dd,J＝6.4,1.6Hz,1H),7.55(s,1H),6.94(d,J＝8.4Hz,1H),6.05(s,1H),3.95(s,3H),3.89(s,3H)。
化合物Int-1-2的制备
在N2气氛下向化合物Int-1-1(54.2g，0.30mol)于DMF(200mL)中的溶液中添加K2CO3(61.6g，0.45mol)和苄基溴(39.0mL，0.33mol)。在100℃下搅拌6小时后，将混合物冷却至室温并用蒸馏水(100mL)和EA(400mL)稀释。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物Int-1-2(79.8g，98％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.60(dd,J＝6.4,2.0Hz,1H),7.56(d,J＝2.0Hz,1H),7.44-7.31(m,5H),6.89(d,J＝8.4Hz,1H),5.22(s,2H),3.94(s,3H),3.88(s,3H)。
化合物Int-1-3的制备
在N2气氛下将化合物Int-1-2(79.8g，0.29mol)溶解于乙酸酐(550mL)中，然后冷却至0℃。分批添加硝酸铜(II)半-(五水合物)(75.0g，0.32mol)。在0℃下搅拌6小时后，用冰水(800mL)淬灭反应。将固体过滤并用蒸馏水(100mL)和己烷(400mL)洗涤，得到化合物Int-1-3(85.5g，92％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.52(s,1H),7.45-7.35(m,5H),7.08(s,1H),5.22(s,2H),3.98(s,3H),3.91(s,3H)。
化合物Int-1-4的制备
向化合物Int-1-3(85.5g，0.27mol)于THF(800mL)和MeOH(300mL)中的溶液中添加2N NaOH(404mL，0.81mol)。在65℃下搅拌5小时后，将反应冷却至室温并通过添加2N HCl溶液调节至pH 2，然后用蒸馏水(100mL)和EA(300mL×2)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。收集残余固体并用己烷洗涤，得到化合物Int-1-4(79.2g，97％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.69(s,1H),7.47-7.35(m,5H),7.03(s,1H),5.24(s,2H),3.91(s,3H)。
化合物Int-1的制备
在0℃下在N2气氛下向化合物Int-1-4(100mg，0.33mmol)于无水THF(500μL)和无水DCM(1.5mL)中的溶液中缓慢滴加草酰氯(42.4μL)并添加1滴DMF。搅拌30分钟后，将反应混合物减压浓缩。将化合物Int-1直接用于下一步骤而无需进一步纯化。
化合物Int-1-5的制备
在0℃下在N2气氛下向化合物Int-1-3(5.0g，15.8mmol)于DCM(300mL)中的溶液缓慢滴加甲磺酸(50mL)于DCM(100mL)中的溶液并搅拌2小时。将反应混合物用NaHCO3溶液淬灭并用H2O(100mL)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物Int-1-5(2.54g，71％)
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.48(s,1H),7.14(s,1H),6.05(s,1H),4.02(s,3H),3.89(s,3H)。
化合物Int-1-6的制备
在N2气氛下将Int-1-5(2.0，8.8mmol)于1,4-二噁烷(28ml)中的溶液用6N NaOH溶液(4.4ml，26.4mmol)处理并在40℃下搅拌4小时。使反应混合物冷却至0℃，并用2N HCl酸化。将混合物用EA/H2O萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩并真空干燥，得到白色固体Int-1-6(2.0g，定量)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.60(s,1H),7.305(s,1H),7.24(s,1H),3.89(s,3H)
化合物Int-2的制备
在N2气氛下将Int-1-6(1.8 7g，8.77mmol)于乙酸酐(1.0ml，10.5mmol)中的溶液用TEA(1.8ml，13.1mmol)、DMAP(0.2g，1.75mmol)处理，并在室温下搅拌3.5小时。将反应混合物用EA/H2O萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩并真空干燥，得到白色固体Int-2(2.2g棕色固体，49％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.981(s,1H),7.451(s,1H),3.933(s,3H),2.294(s,3H)。
实例4.8.8化合物M-4的制备
Figure BDA0004078574660001461
化合物M-4-1的制备
向噻吩基丙氨酸(500mg，2.92mmol)于蒸馏水(5.0mL)中的溶液中滴加浓缩的HCl(206uL)并在0℃下在N2气氛下搅拌，然后向其中添加甲醛(37％，261uL，3.5mmol)。将混合物回流过夜。反应完成后，将混合物减压浓缩。将残余物悬浮于IPA(3.0mL)中并向其中添加4M HCI(在1,4-二噁烷中，1.0mL)。搅拌2小时后，过滤固体，用IPA(5mL)、乙醚(20mL)洗涤，得到化合物M-4-1(495.7mg，77％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.95(brs,1H),7.48(d,J＝5.2Hz,1H),6.94(d,J＝5.2Hz,1H),4.48-4.44(m,1H),4.28(d,J＝15.6Hz,1H),4.18(d,J＝16.0Hz,1H),3.39(dd,J＝11.6,5.2Hz,1H),3.17-3.10(m,1H)。ESI-MS m/z:184(M++1)。
化合物M-4-2的制备
在N2气氛下将化合物M-4-1(495.7mg，2.25mmol)溶解于MeOH(10.0mL)中，然后冷却至0℃。在0℃下滴加SOCl2(491.3uL，6.76mmol)。然后将反应混合物回流3小时。反应完成后，将混合物减压浓缩。将残余物用乙醚(5mL×2)洗涤，得到化合物M-4-2(521.5mg，99％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.22(brs,2H),7.49(d,J＝5.2Hz,1H),6.94(d,J＝5.2Hz,1H),4.65-4.61(m,1H),4.30(d,J＝15.6Hz,1H),4.19(d,J＝15.6Hz,1H),3.80(s,3H),3.60(dd,J＝11.6,5.2Hz,1H),3.21-3.14,(m,1H)。ESI-MS m/z:198(M++1)。
化合物M-4-3的制备
在0℃下向化合物Int-1(856.5mg，2.66mmol)于无水THF(3.0ml)中的溶液中添加化合物M-4-2(518.5mg，2.22mmol)溶解于DMF(3.0mL)、DIPEA(772.8uL，4.44mmol)中。然后将反应混合物在室温下搅拌过夜。反应完成后。将蒸馏水(20mL)和EA(50mL×2)添加反应混合物中。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物M-4-3(888.5mg，89％)。
ESI-MS m/z:483(M++1)。
化合物M-4-4的制备
在-78℃下在N2气氛下向化合物M-4-3(880mg，1.82mmol)于无水DCM(5.0mL)和甲苯(15.0mL)中的溶液中滴加DIBAL(3.6mL，3.6mmol，1.0M于甲苯中)。将反应混合物在-78℃下搅拌3小时。在-78℃下用MeOH(5mL)、2N HCI(20.0mL)淬灭反应。然后将蒸馏水(20mL)和EA(50mL×2)添加反应混合物中。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物M-4-4(701.9mg，85％)。
ESI-MS m/z:453(M++1)。
化合物M-4-5的制备
在室温下向化合物M-4-4(700mg，1.55mmol)于THF(15.0mL)和蒸馏水(3.0mL)中的溶液中添加Na2S2O4(2.2g，12.4mmol)4小时。反应完成后。用MeOH(5mL)淬灭反应。然后将反应混合物减压浓缩。将残余物悬浮在甲苯(20mL)中并蒸发以帮助除去任何残留的水。所得白色固体通过在高真空下放置过夜进一步完全干燥。将残余物悬浮于无水MeOH(10mL)中，随后添加乙酰氯(1.1mL，15.5mmol)。15分钟后，过滤浑浊溶液并用无水MeOH(5mL×2)洗涤固体。将滤液搅拌2小时。反应完成。将反应混合物用NaHCO3溶液(pH约为7)淬灭。之后将蒸馏水(20mL)和EA(50mL×2)添加反应混合物中。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物M-4-5(701.9mg，85％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.55(d,J＝5.6Hz,1H),7.47(m,5H),7.22(d,J＝5.2Hz,1H),6.95(d,J＝5.2Hz,1H),6.85(s,1H),5.26-5.14(m,2H),4.98(d,J＝16.4Hz,1H),4.44(d,J＝16.8Hz,1H),4.08-4.02(m,1H),3.98(s,3H),3.32-3.26(m,1H)。
ESI-MS m/z:453(M++1)。
化合物M-4的制备
向化合物M-4-5(60mg，0.15mmol)于无水DCM(3mL)中的溶液中且在0℃下冷却。然后添加甲磺酸(700uL)的DCM溶液(2.0mL)并在0℃下搅拌2小时。反应完成后。用NaHCO3溶液(pH约为7)淬灭反应。然后将蒸馏水(5mL)和EA(20mL×2)添加反应混合物中。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物M-4(38.3mg，82％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.58(d,J＝5.6Hz,1H),7.54(s,1H),7.23(d,J＝5.2Hz,1H),6.95(d,J＝5.2Hz,1H),6.89(s,1H),6.06(s,1H),5.30(s,1H),4.99(d,J＝16.4Hz,1H),4.44(d,J＝16.4Hz,1H),4.10-4.04(m,1H),3.99(s,3H),3.32-3.26(m,1H)。
ESI-MS m/z:315(M+1)。
化合物M-4-6的制备
在0℃下在N2气氛下向M-4-2(1g，4.28mmol)于20ml无水THF中的溶液用1M LAH于THF中的溶液(5.31ml，5.31mmol)处理并搅拌15小时。将反应混合物用水(5.3ml)、15％NaOH(5.3ml)、H2O(16.0mL)淬灭并搅拌30分钟。将无机固体过滤并用EA洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，得到呈红色固体的化合物M-4-6(652mg，3.85mmol，90％)，其不经进一步纯化即使用。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.08(d,J＝4.8,1H),6.73(d,J＝5.2Hz,1H),4.01–3.88(m,2H),3.80(dd,J＝11.2Hz,1H),3.55(dd,J＝8.4Hz,1H),3.13–3.07(m,1H),2.78–2.74(m,1H),2.60–2.51(m,1H)；ET-MS m/z:170.0(M+1)。
化合物M-4-7的制备
在0℃下在N2气氛下将M-4-6(700mg，4.14mmol)于无水DCM(20ml)中的溶液用咪唑(844mg，12.41mmol)、TBDMS-Cl(686mg，4.55mmol)处理并在室温下搅拌4小时。将反应混合物用H2O(100mL)、DCM(100mL×3)萃取。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物M-4-7(792mg，67％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.07(d,J＝5.2Hz,1H),6.75(d,J＝5.2Hz,1H),4.04–3.92(m,2H),3.77(dd,J＝9.6Hz,1H),3.65(dd,J＝9.6Hz,1H),3.05–3.00(m,1H),2.75–2.71(m,1H),2.65–2.59(m,1H)；ET-MS m/z:284.1(M+1)。
化合物M-4-8的制备
在0℃下在N2气氛下将Int-2(536mg，1.96mmol)和M-4-7(666mg，2.35mmol)于无水DMF(1.8ml)中的溶液用DIPEA(0.85ml，4.89mmol)处理并在室温下搅拌3小时。将反应混合物用EA/H2O萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将反应混合物通过柱色谱法(EA/HEX:1/1)纯化，得到黄色固体M-4-8(758.5mg 76％)；EI-MS m/z:521(M++1)。
化合物M-4a的制备
在0℃下在N2气氛下将M-4-8(200mg，0.384mmol)于MeOH(4.5ml)中的溶液中用K2CO3(63.7mg，0.461mmol)处理并搅拌20分钟。将反应混合物用EA/H2O萃取。将有机层用无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩并真空干燥，得到黄色固体M-4a(189.8mg定量)；EI-MS m/z:479(M++1)。
下表3列出了通过与实例4.8.7中所述类似的合成路线合成的单体衍生物。
表3
Figure BDA0004078574660001491
Figure BDA0004078574660001501
实例4.8.9M-10和M-10a的制备
Figure BDA0004078574660001502
化合物M-10-1的制备
在室温下在N2气氛下向化合物MCBI-单体(330mg，0.907mmol)于DCM(15.0mL)中的溶液中添加Et3N(0.510mL，3.63mmol)。通过气球引入SO2F2气体，并将混合物在室温下搅拌45分钟。将混合物用DCM萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物M-10-1(306mg，76％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ8.20-7.82(m,1H),7.93(d,J＝9.6Hz,1H),7.16(dd,J＝9.2,2.4Hz,1H),6.94(d,J＝2.0Hz,1H),4.31(brs,1H),4.18-4.11(m,1H),4.01-3.89(m,2H),3.95(s,3H),3.50(t,J＝11.2Hz,1H),1.60(s,9H)
ESI-MS m/z:468(M++Na)。
化合物M-10-2的制备
在0℃下在N2气氛下向化合物M-10-1(150mg，0.336mmol)于DMF(1.50mL)中的溶液中添加OHPAS-D1a(247mg，0.353mmol)和BEMP(84μL，0.302mmol)。将反应混合物在室温下搅拌40分钟。将反应用水淬灭并用EtOAc萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物M-10-2(344mg，91％)。
ESI-MS m/z:1124(M+)。
化合物M-10的制备
在室温下在N2气氛下向化合物M-10-2(140mg，0.124mmol)于DCM(6.0mL)中的溶液中添加氯化氢于1,4-二噁烷(2.0mL)中的4.0M溶液。搅拌1.5小时后，将反应混合物用DCM稀释并减压浓缩。将化合物M-10用于下一步骤而无需进一步纯化。(128mg，97％)
ESI-MS m/z:1024(M+)。
化合物M-10-3的制备
在0℃下在N2气氛下向化合物M-10-1(30.2mg，0.068mmol)于DMF(0.30mL)中的溶液中添加OHPAS-D13(37.8mg，0.068mmol)、BEMP(23.5μL，0.081mmol)和K2CO3(9.35mg，0.068mmol)。在室温下搅拌2小时后，通过制备型HPLC纯化反应混合物，得到化合物M-10-3(10mg，15％)。
ESI-MS m/z:984(M+)。
化合物M-10-4的制备
在0℃下在N2气氛下向化合物M-10-3(32.1mg，0.033mmol)于吡啶(0.65mL)中的溶液中添加乙酸酐(24.7μL，0.261mmol)和DMAP(0.40mg，0.033mmol)。在室温下搅拌1小时后，通过制备型HPLC纯化反应混合物，得到化合物M-10-4(35.0mg，97％)。
ESI-MS m/z:1110(M+)。
化合物M-10a的制备
在0℃下在N2气氛下向化合物M-10-4(19.8mg，0.018mmol)于DCM(0.50mL)中的溶液中添加氯化氢于1,4-二噁烷中的4.0M溶液(0.20mL)。在室温下搅拌1.5小时后，将反应混合物用DCM稀释并减压浓缩。将化合物M-10a用于下一步骤而无需进一步纯化。(14.5mg，78％)
ESI-MS m/z:1010(M+)。
实例4.8.10M-11的制备
Figure BDA0004078574660001521
化合物M-11-1的制备
在-20℃下在N2气氛下向甲醇钠的0.5M甲醇溶液(52.8mL，26.4mmol)中添加3,4,5-三甲氧基苯甲醛(650mg，3.31mmol)和叠氮乙酸甲酯(3.81g，33.1mmol，CAS No.1816-92-8)于MeOH(5.30mL)中的溶液。将反应混合物在0℃下搅拌6小时。添加冷水后，通过过滤收集所得沉淀。将固体用水洗涤并在真空中干燥，得到呈黄色固体的化合物M-11-1(640mg，66％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ7.10(s,2H),6.85(s,1H),3.92(s,3H),3.90(s,6H),3.89(s,3H)
化合物M-11-2的制备
在室温下在N2气氛下向化合物M-11-1(100mg，0.341mmol)于对二甲苯(3.40mL)中的溶液中。将反应混合物在180℃下搅拌30分钟。将反应混合物在室温下冷却并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物M-11-2(92.0mg，定量)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ7.10(d,J＝2.4Hz,1H),6.82(s,1H),4.08(s,3H),3.93(d,J＝1.2Hz,6H),3.90(s,3H)
ESI-MS m/z:266(M++1)。
化合物M-11的制备
在0℃下在N2气氛下向化合物M-11-2(1.0g，3.77mmol)于甲醇/H2O/1,4-二噁烷(10.0mL/5.00mL/10.0mL)中的溶液中添加氢氧化锂一水合物(316mg，7.54mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5小时。用HCl淬灭反应后，通过过滤收集所得沉淀。将固体用水洗涤并在真空中干燥，得到呈白色固体的化合物M-11(830mg，88％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ7.24(d,J＝2.4Hz,1H),6.84(s,1H),4.09(s,3H),3.94(s,3H),3.91(s,3H)
ESI-MS m/z:252(M++1)。
实例4.8.11M-12的制备
Figure BDA0004078574660001531
化合物M-12-1的制备
在N2气氛下向异香兰素(5.0g，32.9mmol)于1.6N NaOH溶液(41.1mL)中的溶液中添加1,2-二溴乙烷(17.1mL，197mmol)。将混合物回流过夜。反应完成后，将混合物在室温下冷却。将反应混合物用DCM萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物M-12-1(5.60g，66％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ9.85(s,1H),7.53-7.50(m,1H),7.42(d,J＝1.6Hz,1H),7.01(d,J＝8.0Hz,1H),4.40(t,J＝6.4Hz,2H),3.97(s,3H),3.70(t,J＝6.8Hz,2H)
ESI-MS m/z:260(M++1)。
通过与实例4.8.10中化合物M-11-1和M-11-2的制备方法类似的方式合成化合物 M-12-2和M-12-3。
化合物M-12-2
产率18％
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ7.56(d,J＝2.0Hz,1H),7.39(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),6.90 (d,J＝8.4Hz,1H),6.86(s,1H),4.38(t,J＝7.2Hz,2H),3.91(s,3H),3.90(s,3H),3.69(t,J ＝6.8Hz,2H)
化合物M-12-3
产率73％
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ7.14(s,1H),7.11-7.10(m,1H),6.86(s,1H),4.35(t,J＝6.8Hz,2H),3.93(s,3H),3.92(s,3H),3.69(t,J＝6.8Hz,2H)
ESI-MS m/z:329(M++1)。
化合物M-12-4的制备
在N2气氛下向化合物M-12-3(100mg，0.305mmol)于DMF(2.50mL)中的溶液中添加二甲胺(0.77mL，1.53mmol)和碳酸钾(42.2mg，0.305mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。将反应用水淬灭并用EtOAc萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物M-12-4(90.0mg，定量)。
ESI-MS m/z:293(M++1)。
化合物M-12的制备
在0℃下在N2气氛下将化合物M-12-4(45.0mg，0.154mmol)于甲醇(1.0mL)中的溶液用2N NaOH溶液(0.92mL，1.85mmol)处理，并搅拌过夜。通过制备型HPLC纯化混合物，得到化合物M-12(53mg，定量)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ11.6(s,1H),7.24(s,1H),6.97(d,J＝2.0Hz,1H),6.92(s,1H),4.24(t,J＝4.8Hz,2H),3.82(s,3H),3.48-3.44(m,2H),2.86(s,6H)
ESI-MS m/z:279(M++1)。
下表4列出了通过与实例4.8.9中所述类似的合成路线合成的单体衍生物。
表4
Figure BDA0004078574660001541
实例4.8.12M-19的制备
Figure BDA0004078574660001551
化合物M-19-1的制备
在室温下在N2气氛下向化合物M-18(90mg，0.411mmol)于DMF(2mL)中的溶液中添加DIPEA(0.193mL，1.13mmol)和苄基溴(0.079mL，0.658mmol)。在室温下在N2气氛下将反应物搅拌4小时。反应完成后，将反应混合物用EA(50mL×3)、H2O(50mL)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物M-19-1(99mg，78％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ9.06(s,1H),7.77(d,J＝8.8Hz,1H),7.47–7.36(m,5H),7.27(s,1H),6.84(d,J＝8.8Hz,1H),5.40(s,2H),2.82(s,3H)。
ESI-MS m/z:310(M++1)。
化合物M-19-2的制备
在室温下在N2气氛下向化合物M-19-1(5mg，0.411mmol)于无水DMF(2mL)中的溶液中添加Int-TG(66.5mg，0.162mmol)、氧化银(56.3mg，0.243mmol)和分子筛(200mg)。在同温下搅拌18小时后，将反应物通过
Figure BDA0004078574660001553
过滤，然后减压浓缩。通过制备型HPLC纯化反应混合物，得到化合物M-19-2(3.2mg，31％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.95(s,1H),7.81(d,J＝8.8Hz,1H),7.47–7.33(m,5H),7.24(d,J＝2.4Hz,1H),6.94(d,J＝8.8Hz,1H),5.61(dd,J＝10.4,8.0Hz,1H),5.49(d,J＝3.2Hz,1H),5.39(s,2H),5.34(d,J＝8.0Hz,1H),5.17(dd,J＝10.4,3.6Hz,1H),4.31–4.05(m,3H),2.71(s,3H),2.22(s,3H),2.07(s,3H),2.04(s,3H),2.03(s,3H)。
ESI-MS m/z:662(M++Na)。
化合物M-19的制备
在室温下在H2下向化合物M-19-2(3.2mg，0.005mmol)于MeOH(1mL)中的溶液中添加Pd/C(5％，1mg，0.0005mmol)。将混合物搅拌1小时，通过
Figure BDA0004078574660001554
过滤，然后减压浓缩。将化合物M-19直接用于下一步骤而无需进一步纯化(2.7mg，100％)。
ESI-MS m/z:572(M++Na)。
下表5列出了通过与实例4.8.12中所述类似的合成路线合成的单体衍生物。
表5
Figure BDA0004078574660001552
Figure BDA0004078574660001561
实例4.8.13M-22的制备
Figure BDA0004078574660001562
化合物M-22-1的制备
在0℃下在N2气氛下向MCBI-单体(100mg，0.274mmol)于无水DCM(5.5mL)中的溶液中添加氯化氢溶液(3mL，4.0M于二噁烷中)。在室温下搅拌3小时后，将反应混合物减压浓缩。制备化合物M-22-1(82mg，100％)，其不经进一步纯化即使用。
ESI-MS m/z:264(M++1)。
化合物M-22的制备
在室温下在N2气氛下向M-22-1(7.0mg，0.023mmol)于DMF(1mL)中的溶液中添加化合物M-11(8.6mg，0.035mmol)和EDCI(13.2mg，0.069mmol)。在相同温度下搅拌2小时后，通过制备型HPLC纯化反应混合物，得到化合物M-22(6.5mg，58％)。
1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δ8.09(d,J＝9.2Hz,1H),7.60(brs,1H),7.06–6.98(m,4H),4.65(d,J＝4.8Hz,2H),4.10–4.07(m,1H),4.05(s,3H),3.97(dd,J＝11.2,3.2Hz,1H),3.93(s,3H),3.89(s,3H),3.88(s,3H),3.64(dd,J＝11.2,9.2Hz,1H)。
ESI-MS m/z:496(M+)。
下表6列出了通过与实例4.8.13中所述类似的合成路线合成的衍生物。
表6
Figure BDA0004078574660001571
Figure BDA0004078574660001581
实例4.8.14M-29的制备
Figure BDA0004078574660001582
化合物M-29-1的制备
在N2气氛下向2-氨基-5-硝基吡啶(5.0g，35.9mmol)于乙醇(72.0mL)中的溶液中添加溴丙酮酸乙酯(6.31mL，50.3mmol)。将混合物回流过夜。反应完成后，将混合物在室温下冷却。添加冷水后，通过过滤收集所得沉淀。将固体用水洗涤并在真空中干燥，得到呈棕色固体的化合物M-29-1(6.28g，74％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ9.30-9.29(m,1H),8.38(s,1H),8.05(dd,J＝10,2.4Hz,1H),7.81(d,J＝10Hz,1H),4.53-4.47(m,2H),1.44(t,J＝7.2Hz,3H)
ESI-MS m/z:236(M++1)。
化合物M-29-2的制备
将化合物M-29-1(2.0g，8.50mmol)于甲醇(20.0mL)中的悬浮液冷却至0℃，且滴加盐酸(6.4mL)，随后以小份添加锌(2.22g，34.0mmol)。将反应混合物搅拌30分钟。接着，添加甲醇(14mL)，并用浓氨淬灭反应。过滤悬浮液并用甲醇洗涤残余物。将合并的滤液浓缩并将残余物悬浮于氯仿(70mL)、水(30mL)和浓氨(30mL，30％溶液)的混合物中。搅拌混合物直到其变得澄清。分离各层，水层用氯仿萃取一次。将合并的有机层用饱和氯化钠水溶液洗涤，用MgSO4干燥，过滤并减压浓缩。将化合物M-29-2用于下一步骤而无需进一步纯化。(1.12g，64％)
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ8.01(s,1H),7.54-7.51(m,2H),6.86(dd,J＝9.6,2.4Hz,1H),4.45(m,2H),3.53(s,2H),1.47(t,J＝6.8Hz,3H)
化合物M-29-3的制备
向M-29-2(1.12g，5.46mmol)于DMA(18mL)中的溶液中添加化合物Int-TG4(995mg，5.46mmol)和EDC·HCl(1.26g，6.55mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。随后，浓缩反应混合物。将残余物溶于水和CH2Cl2中，分离各层。将有机层用水洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物M-29-3(927mg，46％)。
1H NMR(400Hz,CDCl3)δ9.33-9.32(m,1H),8.45(d,J＝0.8Hz,1H),7.97-7.93(m,2H),7.61-7.52(m,2H),7.18-7.15(m,2H),5.28(s,1H),4.62(s,1H),4.44-4.38(m,2H),3.48(s,3H),1.41(t,J＝6.8Hz,3H)
化合物M-29的制备
向M-29-3(300mg，0.812mmol)于1,4-二噁烷/H2O(1.5mL/1.5mL)中的溶液中添加2N NaOH(3.0mL)。将所得混合物在70℃下搅拌1小时。将混合物在70℃下搅拌1小时。接着，将混合物冷却至室温，添加水，并将混合物用4M盐酸溶液酸化。过滤所得悬浮液，且干燥残余物，得到呈黄棕色固体的化合物M-29(242mg，87％)。
1H NMR(400Hz,DMSO)δ10.37(s,1H),9.47(s,1H),7.99(d,J＝8.4Hz,2H),7.67(t,J＝14Hz,2H),7.17(d,J＝8.4Hz,2H),5.26(s,2H),3.38(s,3H)
ESI-MS m/z:342(M++1)。
实例4.8.15M-30的制备
Figure BDA0004078574660001601
通过与实例4.8.13中所述类似的方法合成化合物M-30。
产率23％；ESI-MS m/z:588(M++1)。
实例4.9.苯并二氮杂卓二聚体衍生物的制备
实例4.9.1L-1的制备
Figure BDA0004078574660001602
化合物L-1-1的制备
在-78℃下在N2气氛下向5-羟基间苯二甲酸二甲酯(5g，23.79mmol)于无水THF(300mL)中的溶液中滴加LAH(3.6g，95.15mmol)。将反应混合物在室温下搅拌17小时。反应完成后，添加15％NaOH溶液(4mL)、H2O(8mL)和EA(100mL)，然后将反应混合物搅拌1小时。将混合物过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物L-1-1(3.02g，82％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.21(s,1H),6.66(s,1H),6.58(s,2H),5.07(t,J＝6.0Hz,2H),4.38(d,J＝4.6Hz,4H)。
化合物L-1-2的制备
在N2气氛下将化合物L-1-1(2g，12.97mmol)的溶液溶解于HBr(5.0mL，33％在AcOH中)。在60℃下搅拌18小时后，通过添加NaHCO3溶液(pH约为8)淬灭反应。然后向反应混合物中添加蒸馏水(50mL)和EA(100mL×2)。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物L-1-2(2.9g，80％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.99(s,1H),6.81(s,2H),4.85(s,1H),4.41(s,2H)。
化合物L-1的制备
在室温下在N2气氛下向化合物L-1-2(100mg，0.36mmol)于无水DCM(3mL)中的溶液中添加咪唑(27mg，0.39mmol)和TBDMS-Cl(59mg，0.39mmol)。搅拌16小时后，将蒸馏水(50mL)和EA(100mL)添加反应混合物中。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物L-1(110mg，79％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.00(s,1H),6.80(s,2H),4.41(s,4H),0.99(s,9H),0.21(s,6H)。
实例4.9.2L-7的制备
Figure BDA0004078574660001611
化合物L-7-1的制备
在0℃下在N2气氛下向3,5-吡啶二羧酸(1.0g，5.98mmol)于无水THF(50mL)中的溶液中添加三氟化硼四氢呋喃复合物(30.0mL，30.0mmol，1M THF)。使反应升温至室温并搅拌18小时。将混合物用2N HCl淬灭直至pH 2，并用蒸馏水(20mL)和EA(50mL×2)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过制备型TLC纯化，得到化合物L-7-1(363mg，48％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.38(s,2H),7.99(s,1H),5.59(t,J＝4.0Hz,2H),4.61(d,J＝5.2Hz,2H)。
通过与实例4.9.1中所述类似的合成路线合成化合物L-7。
化合物L-7的制备
产率65％；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.56(s,2H),7.77(s,1H),4.47(s,2H)。
实例4.9.3L-8的制备
Figure BDA0004078574660001612
化合物L-8-1的制备
在室温下在N2气氛下将4-氯吡啶-盐酸盐(1.0g，6.67mmol)和二乙醇胺(1.05g，10.00mmol)于H2O(12mL)中的溶液用NaOH(1.07g，26.67mmol)处理并使用微波反应器加热至110℃持续1小时。反应用蒸馏水(18mL)/甲醇(10mL)淬灭后，用EA(200mL)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物L-8-1(160mg，13％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.10(d,J＝5.6Hz,2H),6.83(d,J＝6.0Hz,2H),4.91(brs,2H),3.57(s,8H)。ESI-MS m/z:183(M++1)。
通过与实例4.9.1中所述类似的合成途径合成化合物L-8。
化合物L-8的制备
产率70％；ESI-MS m/z:309(M++1)。
实例4.9.4L-9的制备
Figure BDA0004078574660001621
通过与实例3.5中化合物OHPAS-D6-1的制备方法类似的方式合成化合物L-9。
产率73％；1H NMR(400Hz,CDCl3)δ7.47(s,1H),7.32(s,2H),4.46(s,4H)。
实例4.9.5L-10的制备
Figure BDA0004078574660001622
通过与实例4.9.1中化合物L-1-2的制备方法类似的方式合成化合物L-10。
ESI-MS m/z:245(M++1)。
实例4.9.6二聚体衍生物的制备
Figure BDA0004078574660001623
在N2气氛下向化合物M-1(31mg，0.10mmol)和化合物L-1(20mg，0.05mmol)于DMF(1.0mL)中的溶液中添加K2CO3(14mg，0.10mmol)。在室温下搅拌7小时后，将反应混合物通过制备型HPLC(柱：Innoval ODS-2 10um，
Figure BDA0004078574660001624
50×250mm；流速：40mL/分钟，A缓冲液0.1％甲酸/水/B缓冲液0.1％甲酸/ACN，方法梯度，溶剂A：溶剂B 80:20至20:80，45分钟，波长214nm)纯化，得到化合物D-3(13mg，30％)。
ESI-MS m/z:734(M++1)。
实例4.9.7二聚体衍生物的制备
Figure BDA0004078574660001631
通过与实例4.9.6的化合物D-1的合成类似的方式合成化合物D-14。
化合物D-14-1
产率32％，白色固体。ESI-MS m/z:494(M++1)。
化合物D-14
产率7％，白色固体。ESI-MS m/z:725(M++1)
下表7列出了通过与实例4.9.6或4.9.7中所述类似的合成途径合成的二聚体衍生物。
表7
Figure BDA0004078574660001632
Figure BDA0004078574660001641
实例4.9.8二聚体衍生物的制备
Figure BDA0004078574660001651
化合物D-101-1的制备
在室温下在N2气氛下向化合物M-1(100mg，0.32mmol)和1,3,5-三(溴甲基)苯(57mg，0.16mmol)于DMF(1mL)中的溶液中添加K2CO3(45mg，0.32mmol)。搅拌4小时后，添加EA(100mL)、H2O(50mL)和2N HCI水溶液(5mL)进行萃取，所得有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物D-101-1(54mg，42％)。
ESI-MS m/z:812(M+)。
化合物D-101的制备
在室温下在N2气氛下将化合物D-101-1(50mg，0.01mmol)溶解于二甲胺(1mL)中。搅拌1小时后，将混合物通过制备型HPLC(柱：Innoval ODS-2 10um，
Figure BDA0004078574660001652
50×250mm；流速：40mL/分钟，A缓冲液0.1％甲酸/水/B缓冲液0.1％甲酸/ACN，方法梯度，溶剂A：溶剂B80:20至20:80，45分钟，波长214nm)纯化，得到化合物D-101(2.2mg，17％)。
ESI-MS m/z:776(M++1)。
实例4.9.9二聚体衍生物的制备
Figure BDA0004078574660001661
化合物D-111-1的制备
在室温下在N2气氛下将化合物M-4(10mg，0.032mmol)和1,3,5-三(溴甲基)苯(11.35mg，0.032mmol，1.0当量)在DMF(1mL)中的黄色溶液用K2CO3(4.4mg，0.032mmol，1.0当量)处理并搅拌5小时。将反应混合物通过制备型HPLC(柱：Innoval ODS-2 10um，
Figure BDA0004078574660001662
21.2×250mm；流速：15mL/分钟，A缓冲液0.1％甲酸/水/B缓冲液0.1％甲酸/ACN，方法梯度，溶剂A：溶剂B 95:5至5:95，1小时，波长214nm)纯化，得到呈白色固体的化合物D-111-1(20.9mg，22％)。
ESI-MS m/z:591(M++1)。
化合物D-111-2的制备
在室温下在N2气氛下将化合物D-111-1(20mg，0.034mmol)和M-2(18.4mg，0.034mmol)于DMF(1mL)中的均匀溶液用K2CO3(4.7mg，0.034mmol)处理并搅拌5小时。将反应混合物用1M二甲胺的THF溶液(0.5mL)处理并搅拌30分钟。将反应混合物通过制备型HPLC(柱：Innoval ODS-2 10um，
Figure BDA0004078574660001663
21.2×250mm；流速：15mL/分钟，A缓冲液0.1％甲酸/水/B缓冲液0.1％甲酸/ACN，方法梯度，溶剂A：溶剂B 95:5至5:95，1小时，波长214nm)纯化，得到呈白色固体的化合物D-111-2(3.4mg，9.8％)。
ESI-MS m/z:1018(M++1)。
化合物D-111的制备
在室温下在N2气氛下将化合物D-111-2(3.4mg，0.003mmol)和10％Cd/Pb(100mg)于THF(0.5mL)中的溶液用1N NH4OAc(300μL)处理并搅拌3天。将反应混合物通过制备型HPLC(柱：Innoval ODS-2 10um，
Figure BDA0004078574660001664
21.2×250mm；流速：15mL/分钟，A缓冲液0.1％甲酸/水/B缓冲液0.1％甲酸/ACN，方法梯度，溶剂A：溶剂B95:5至5:95，1小时，波长214nm)纯化，得到呈白色固体的化合物D-111(0.8mg，29％)。ESI-MS m/z:824(M++1)。
下表8列出了通过与实例4.9.8或4.9.9中所述类似的合成途径合成的二聚体衍生物。
表8
Figure BDA0004078574660001671
Figure BDA0004078574660001681
实例4.9.10D-112的制备
Figure BDA0004078574660001682
化合物D-112-1的制备
在室温下在N2气氛下将1,3,5-三(溴甲基)苯(3.9g，11.0mmol)、化合物Int-2(4.96g，21.9mmol)于DMF(10.0mL)中的溶液用K2CO3(44.2mg，0.32mmol，1.0当量)处理并搅拌6小时。将反应混合物用二甲胺(5.0mL)处理并搅拌30分钟。将反应混合物用蒸馏水(50mL)和DCM(100mL×2)稀释。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物D-112-1(2.74g g，41％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.50(s,2H),7.41(d,J＝12.0Hz,3H),7.08(s,2H),5.20(s,4H),3.97(s,6H),3.91(s,6H),3.47(s,2H),2.25(s 6H)；ESI-MS m/z:614(M++1)。
化合物D-112-2的制备
向化合物D-112-1(2.74g，4.46mol)于THF(75mL)和H2O(50mL)中的溶液添加LiOH(937mg，22.33mol)。搅拌5小时后。将反应混合物减压浓缩。将残余物冷却至0℃并通过添加2N HCl溶液调节至pH 2，然后将固体过滤并用H2O(30mL)、EA(100mL)洗涤，得到化合物D-112-2(2.5g，96％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.71(s,2H),7.60(d,J＝17.6Hz,3H),7.32(s,2H),5.30(s,4H),3.91(s,6H),2.67(s,6H)；ESI-MS m/z:586(M++1)。
化合物D-112-3的制备
在室温下在N2气氛下将化合物D-112-2(1.5g，2.56mmol)、化合物M-4a(1.52g，5.38mmol)于DMF(50.0ml)中的溶液用PyBop(3.5g，6.40mmol)、DIPEA(2.2mL，12.8mmol)处理并搅拌2小时。将反应混合物用蒸馏水(100mL)和EA(100mL×2)稀释。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物D-112-3(2.7g，94％)；ESI-MS m/z:1116(M+)。
化合物D-112-4的制备
在室温下在H2下将化合物D-112-3(2.7g，2.42mmol)于EA(50.0ml)中的溶液用5％Pd/C(5.1g，2.42mmol)处理并搅拌1小时。将反应混合物通过
Figure BDA0004078574660001691
过滤，然后减压浓缩，得到化合物D-112-4(1.87g，93％)；ESI-MS m/z:1056(M+)。
化合物D-112-5的制备
在室温下在N2气氛下将化合物D-112-4(100mg，0.095mmol)、Int-3(189mg，0.28mmol)于无水THF(3.0ml)中的溶液用HOBT(13.0mg，0.095mmol)、DIPEA(36uL，0.208mmol)处理并搅拌44小时。将反应混合物用蒸馏水(10mL)和EA(20mL×2)萃取，并将有机层用饱和NH4Cl(50mL)洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物D-112-5(76mg，40％)；ESI-MS m/z:2017(M+)。
化合物D-112-6的制备
在0℃下在N2气氛下将化合物D-112-5(116.7mg，0.06mmol)于ACN(2.0mL)、H2O(800uL)中的溶液用TFA/ACN(1.0mL)处理并搅拌2小时。将残余物通过制备型HPLC纯化，得到化合物D-112-6(83.3mg，80％)；ESI-MS m/z:1788(M+)。
化合物D-2的制备
在0℃下在N2气氛下将化合物D-112-6(83.3mg，0.046mmol)于无水DCM(3.0ml)中的溶液用戴斯-马丁高碘烷(45.4mg，0.11mmol)处理并搅拌4小时。将反应混合物用蒸馏水(10mL)和EA(30mL×2)稀释。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化，得到化合物D-112(59.3mg，71％)；ESI-MS m/z:1784(M+)。
下表9列出了通过与实例4.9.10中所述类似的合成途径合成的二聚体衍生物。
表9
Figure BDA0004078574660001701
实例4.10.
实例4.10.1 T-Int-1的制备
Figure BDA0004078574660001711
化合物T-Int-1-1的制备
在室温下在N2气氛下向化合物D-7(10mg，0.01mmol)和化合物OHPAS-D1(11mg，0.01mmol)于ACN(1mL)中的溶液中添加BEMP(0.8mg，0.003mmol)。在室温下搅拌1小时后，将反应混合物通过HPLC纯化，得到化合物T-Int-1-1(12mg，63％)。ESI-MS m/z:1382(M+1)。
化合物T-Int-1的制备
在N2气氛下向化合物T-Int-1-1(10mg，0.007mmol)于MeOH(1.0mL)中的溶液中添加K2CO3(5mg，0.036mmol)。在室温下搅拌2小时后，将混合物通过HPLC纯化，得到化合物T-Int-1(7.4mg，85％)。ESI-MS m/z:1214(M+1)。
下表10列出了通过与实例4.10.1中所述类似的合成途径合成的二聚体衍生物。
表10
Figure BDA0004078574660001721
Figure BDA0004078574660001731
实例4.10.2 T-Int-101的制备
Figure BDA0004078574660001741
化合物T-Int-101-1的制备
在室温下在N2气氛下向化合物D-101(8.0mg，0.01mmol)和化合物OHPAS-D3(11.5mg，0.01mmol)于DMF(1mL)中的溶液中添加DIPEA(5.4μL，0.03mmol)。在室温下搅拌6小时后，将反应混合物通过HPLC纯化，得到化合物T-Int-101-1(11.9mg，71％)。ESI-MS m/z:1630(M+1)。
化合物T-Int-101的制备
在N2气氛下向化合物T-Int-101-1(11.9mg，0.01mmol)于MeOH(1mL)中的溶液中添加K2CO3(5mg，0.04mmol)。在室温下搅拌1小时后，将反应混合物通过HPLC(柱：Innoval ODS-2 10um，
Figure BDA0004078574660001742
50×250mm；流速：15mL/分钟，A缓冲液0.1％甲酸/水/B缓冲液0.1％甲酸/ACN，方法梯度，溶剂A：溶剂B 80:20至20:80，45分钟，波长214nm)纯化，得到化合物T-Int-101(6.4mg，60％)。ESI-MS m/z:1462(M+1)。
实例4.10.3T-Int-102、T-Int-104和T-Int-105的制备
Figure BDA0004078574660001751
通过与化合物T-Int-101的制备方法类似的方式合成T-Int-102-2和T-Int-103-2。
化合物T-Int-102-1的制备
产率70％，呈白色固体。
ESI-MS m/z:1704(M++1)。
化合物T-Int-102-2的制备
产率81％，白色固体
ESI-MS m/z:1536(M++1)。
化合物T-Int-103-1的制备
产率84％，黄色固体
ESI-MS m/z:2057(M++1),1029(M/2++1)。
化合物T-Int-103-2的制备
产率84％，无色油状物
ESI-MS m/z:1889(M++1),945(M/2++1)。
化合物T-Int-102-3的制备
在0℃下在N2气氛下将化合物T-Int-102-2(56mg，0.036mmol)于无水DCM(1.0mL)中的均匀溶液用TFA(0.2mL)的DCM溶液(1mL)处理并搅拌2小时。将反应混合物通过制备型HPLC(柱：Innoval ODS-2 10um，
Figure BDA0004078574660001761
21.2×250mm；流速：15mL/分钟，A缓冲液0.1％甲酸/水/B缓冲液0.1％甲酸/ACN，方法梯度，溶剂A：溶剂B 95:5至5:95，1小时，波长214nm)纯化，得到呈乳白色固体的化合物T-Int-102-3(44.4mg，82％)。
ESI-MS m/z:1436(M++1)。
通过与化合物T-Int-102-3的制备方法类似的方式合成T-Int-103-3。
化合物T-Int-103-3的制备
产率74％，乳白色固体
ESI-MS m/z:1789(M++1),895(M/2++1)。
化合物T-Int-102的制备
在室温下在N2气氛下将化合物T-Int-102-3(50mg，0.035mmol)和BCN-PNP(11mg，0.035mmol，1.0当量)于DMF(3.0mL)中的均匀溶液用DIPEA(11uL，0.068mmol，2.0当量)处理并搅拌2小时。将混合物通过制备型HPLC(柱：Innoval ODS-210um，
Figure BDA0004078574660001762
21.2×250mm；流速：15mL/分钟，A缓冲液0.1％甲酸/水/B缓冲液0.1％甲酸/ACN，方法梯度，溶剂A：溶剂B95:5至5:95，1小时，波长214nm)纯化，得到呈米色固体的化合物T-Int-102(22mg，39％)。
ESI-MS m/z:1612(M++1)。
化合物T-Int-104-1的制备
在室温下在N2气氛下将T-Int-103-3(20mg，0.014mmol)和L-6-5(5.1mg，0.014mmol，1.0当量)于DMF(2.0mL)中的均匀溶液用DIPEA(7.3uL，0.042mmol，3.0当量)处理并搅拌2小时。将混合物通过制备型HPLC(柱：Innoval ODS-2 10um，
Figure BDA0004078574660001763
Figure BDA0004078574660001764
21.2×250mm；流速：15mL/分钟，A缓冲液0.1％甲酸/水/B缓冲液0.1％甲酸/ACN，方法梯度，溶剂A：溶剂B95:5至5:95，1小时，波长214nm)纯化，得到呈黄色固体的化合物T-Int-104-1(19.9mg，85％)。
ESI-MS m/z:1687(M++1),844(M/2++1)。
化合物T-Int-104的制备
通过与化合物T-Int-102-3的制备方法类似的方式合成T-Int-104。
产率72％，乳白色固体
ESI-MS m/z:1789(M++1),895(M/2++1)。
通过与化合物T-Int-104的制备方法类似的方式合成T-Int-105。
化合物T-Int-105-1的制备
产率75％，乳白色固体
ESI-MS m/z:2040(M++1),1010(M/2++1)。
化合物T-Int-105的制备
产率60％，乳白色固体
ESI-MS m/z:1940(M++1),970(M/2++1)。
下表11列出了通过与实例4.10.1中所述类似的合成途径合成的二聚体衍生物。
表11
Figure BDA0004078574660001771
Figure BDA0004078574660001781
Figure BDA0004078574660001791
Figure BDA0004078574660001801
实例4.11.
实例4.11.1T-1的制备
Figure BDA0004078574660001802
向T-Int-1(2.3mg，0.002mmol)于DMSO(2mL)中的溶液中添加(BimC4A)3，其制备为具有5mmol的浓度。然后，将制备成浓度为100mmol的CuBr以189μL的量添加其中。然后，将混合物搅拌2分钟。将化合物MPS-D1-2(3.7mg，0.007mmol)溶解于DMSO(674μL)中并添加其中，随后搅拌10分钟。反应完成后，分离混合溶液并通过制备型HPLC纯化，得到化合物T-1(1.0mg，32％)。
ESI-MS m/z:1868(M++1)。
下表12列出了通过与实例4.11.1中所述类似的合成途径合成的二聚体衍生物。
表12
Figure BDA0004078574660001803
Figure BDA0004078574660001811
Figure BDA0004078574660001821
Figure BDA0004078574660001831
Figure BDA0004078574660001841
Figure BDA0004078574660001851
Figure BDA0004078574660001861
Figure BDA0004078574660001871
Figure BDA0004078574660001881
Figure BDA0004078574660001891
Figure BDA0004078574660001901
Figure BDA0004078574660001911
Figure BDA0004078574660001921
实例4.11.2A4、A5、A6和A7的制备
Figure BDA0004078574660001931
化合物A-1、A-2和A-3的制备
每种物质通过用类似于韩国专利特许公开第10-2015-0137015号的实例2和3中所述的方法制备而获得。
通过实例3.2或实例4.1.1中制备化合物OHPAS-D1或Q-1的类似合成路线制备化合物A-4、A-5、A-6和A-7。
化合物A-4的制备
ESI-MS m/z:1426(M+1)。
化合物A-5的制备
产率75％，ESI-MS m/z:1457(M+1)。
化合物A-6的制备
产率63％，ESI-MS m/z:1272(M+1)。
化合物A-5的制备
产率89％，ESI-MS m/z:1303(M+1)。
下表9列出了通过与实例4.11.1中所述类似的合成途径合成的二聚体衍生物。
表9
Figure BDA0004078574660001941
实例4.11.3T-88的制备
Figure BDA0004078574660001942
通过如WO2015/095227A2中所述的类似合成路线合成化合物T-88，该文献通过引用并入本文。
化合物T-88-2的制备
在0℃下在N2气氛下向T-88-1(320mg，0.84mmol)于DMF(5mL)中的溶液中添加L-2a(280mg，0.85mmol)。在室温下在N2气氛下将反应搅拌1小时。反应完成后，减压除去DMF。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物T-88-2(310mg，62％)。
ESI-MS m/z:595(M++1)。
化合物T-88-3的制备
在N2气氛下向T-88-2(70mg，0.12mmol)于DMF(3mL)中的溶液中添加双(4-硝基苯基)碳酸酯(54mg，0.18mmol)，然后添加DIPEA(41μL，0.24mmol)。将混合物在室温下搅拌3小时。反应完成后，将混合物用盐水(50mL)和EA(50mL)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物T-88-3(44mg，49％)。
ESI-MS m/z:760(M++1)。
化合物T-88-4的制备
在室温下在氮气气氛下向T-88-3(40mg，0.05mmol)的溶液中溶解DMF(1mL)。添加MMAF-OMe(43mg，0.06mmol)和HOBt(1.4mg，0.01mmol)，然后添加吡啶(0.33mL)和DIPEA(10μL，0.06mmol)。将混合物在室温下搅拌22小时。反应完成后，将混合物用EA(100mL)、蒸馏水(300mL)、盐水(100mL)和1N盐酸水溶液(20mL)萃取。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化，得到化合物T-88-4(47mg，65％)。
ESI-MS m/z:1367(M++1)。
化合物T-88-5的制备
在0℃下在N2气氛下向化合物T-88-4(40mg，0.03mmol)于甲醇(1mL)中的溶液中添加溶解于水(0.5mL)中的LiOH.H2O(10mg，0.23mmol)。将混合物在0℃下搅拌2小时。反应完成后，将得到的残余物用2N盐酸水溶液(2mL)稀释，并通过制备型HPLC纯化，得到化合物T-88-5(29.5mg，75％)。
ESI-MS m/z:1353(M++1)。
化合物T-88的制备
在室温下在氮气气氛下添加化合物T-88-5(3.0mg，2.20μmol)和Mal-1(1.85mg，4.60μmol)于DMSO(1.5mL)和H2O(0.1mL)中的均匀溶液，和(BimC4A)3(5.67mg，6.90μmol)，CuBr(3.32mg，23.10μmol)并搅拌10分钟。将反应混合物通过制备型HPLC色谱法纯化，得到标题化合物T-88(3.0mg，77％)。
ESI-MS m/z:877(M/2+1)。
实例4.11.4 T-89的制备
Figure BDA0004078574660001961
在室温下将化合物T-42(2.4mg，0.0013mmol)于0.1％甲酸的H2O溶液(1.0mL)中的溶液用NaHSO3处理并搅拌6小时。将反应混合物冷冻干燥，得到化合物T-89(2.7mg，定量)。
实例4.11.5 T-200的制备
Figure BDA0004078574660001962
化合物T-200a的制备
在室温下在N2气氛下向M-10(35mg，0.033mmol)于DMF(0.3mL)中的溶液中添加化合物M-17(8.7mg，0.04mmol)和EDCI(19mg，0.099mmol)。在相同温度下搅拌1小时后，将反应混合物通过制备型HPLC纯化，得到化合物T-200a(29mg，69％)。
ESI-MS m/z:1225(M+)。
化合物T-200b的制备
在0℃下在N2气氛下向T-200a(4mg，0.0032mmol)于MeOH(0.5mL)中的溶液中添加碳酸钾(4.5mg，0.032mmol)。在相同温度下搅拌1小时后，将反应混合物通过制备型HPLC纯化，得到化合物T-200b(2.8mg，82％)。
ESI-MS m/z:1057(M+)。
化合物T-200的制备
在室温下在N2氮气氛下将化合物T-200b(6.3mg，0.006mmol)、Mal-1(4.8mg，0.012mmol)于DMSO(2mL)中的溶液用CuBr(5.1mg，0.036mmol)处理并搅拌1小时。将反应混合物通过制备型HPLC纯化，得到化合物T-200(5.3mg，61％)。
ESI-MS m/z:1456(M+)。
下表14列出了通过与实例4.11.5中所述类似的合成路线合成的单体衍生物。
表14
Figure BDA0004078574660001971
Figure BDA0004078574660001981
Figure BDA0004078574660001991
实例4.11.6 T-212的制备
Figure BDA0004078574660001992
化合物T-212-1的制备
在室温下在N2气氛下向M-10(70mg，0.0660mmol)于DMF(1.2mL)中的溶液中添加化合物M-29(22.5mg，0.0660mmol)和EDCI(37.9mg，0.198mmol)。在相同温度下搅拌1小时后，将反应混合物通过制备型HPLC纯化，得到化合物T-212-1(48.3mg，54％)。
ESI-MS m/z:1347(M+)
化合物T-212-2的制备
在0℃下在N2气氛下向T-212-1(48.3mg，0.0358mmol)于DCM(2.0mL)中的溶液中添加HCl的4N 1,4-二噁烷溶液(0.7mL)。在相同温度下搅拌1小时后，将反应混合物通过制备型HPLC纯化，得到化合物T-212-2(43.5mg，93％)。
ESI-MS m/z:1303(M+)。
化合物T-212-3的制备
在室温下在N2气氛下向化合物T-212-2(43.5mg，0.0334mmol)于无水ACN(1.0mL)中的溶液中添加βGal-Br(192mg，0.468mmol)、氧化银(171mg，0.73mmol)和分子筛(90mg)。在同温下搅拌过夜后，将反应物通过
Figure BDA0004078574660002002
过滤，然后减压浓缩。将反应混合物通过制备型HPLC纯化，得到化合物T-212-3(33.1mg，61％)。
ESI-MS m/z:1635(M++1)。
化合物T-212-4的制备
在0℃下在N2气氛下向T-212-3(33.1mg，0.0203mmol)于甲醇(2.0mL)中的溶液中添加碳酸钾(28.1mg，0.203mmol)。在相同温度下搅拌1小时后，将反应混合物通过制备型HPLC纯化，得到化合物T-212-4(21.2mg，81％)。
ESI-MS m/z:1297(M+)。
化合物T-212的制备
在室温下在N2氮气氛下将化合物T-212-4(5.0mg，0.00385mmol)、Mal-1(3.08mg，0.00771mmol)于DMSO(2mL)中的溶液用CuBr(3.3mg，0.0231mmol)处理并搅拌1小时。将反应混合物通过制备型HPLC纯化，得到化合物T-212(5.4mg，82％)。
ESI-MS m/z:1697(M+)。
下表15列出了通过与实例4.11.6中所述类似的合成路线合成的单体衍生物。
表15
Figure BDA0004078574660002001
Figure BDA0004078574660002011
实例5.用于缀合的抗体的还原/氧化：
用约20至50倍过量的TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐或DTT(二硫苏糖醇)在具有1mMEDTA的4mM Tris pH 7.3中在37℃下还原半胱氨酸工程化的单克隆抗体1小时。将还原的硫单抗稀释并装载到PBS中的PD-10柱上。用10mM PBS pH 7.3洗脱柱。洗脱的还原的硫单抗通过空气氧化重新建立。通过测定来自溶液在280nm处的吸光度的降低的抗体浓度和通过与DTNB(奥德里奇，CAS No D8130)反应并测定在412nm处的吸光度的硫醇浓度来检查硫醇/Ab值。
实例6.用于制备ADC的一步缀合方法
实例6.1.
Figure BDA0004078574660002021
根据表15A-E中概述的缀合程序合成抗体药物缀合物(ADC)。表15A示出了用于缀合方法1和2；表15B示出了缀合方法2、3和4；表15C示出了缀合方法5和6；表15D示出了缀合方法3和4；表15E示出了缀合方法3和4。ADC的体外数据示于表15F至J中。
缀合方法1：MPS缀合方案。(NaBH4)
还原和再氧化反应后，将抗体溶解于PBS。将实例4.11.1中获得的化合物T-47(3.80μL，3.0mmol，作为接头-毒素中间体)在DMSO中的溶液用还原的、再氧化的抗体(45μL，0.053mmol)处理，并在室温下温和搅拌3小时。将硼氢化钠(3.80μL，300mmol)添加到反应混合物的溶液中并在37℃下孵育1小时以阻断可逆的解缀合反应。通过PD-10柱装载并洗脱缀合混合物以除去过量的药物-接头中间体和其它杂质。
缀合方法2：MPS缀合方案。(NH2OH)
还原和再氧化反应后，将抗体溶解于PBS。将实例4.11.1中获得的化合物T-11(8.86μL，3.0mmol，作为接头-毒素中间体)在DMSO中的溶液用还原的、再氧化的抗体(70μL，0.053mmol)处理并在室温下温和搅拌3小时。将羟胺(8.86μL，1,500mmol)添加到反应混合物的溶液中并在37℃下孵育8小时以阻断可逆的解缀合反应。通过PD-10柱装载并洗脱缀合混合物以除去过量的药物-接头中间体和其它杂质。
实例6.2.
Figure BDA0004078574660002022
缀合方法3：马来酰亚胺缀合方案。
还原和再氧化反应后，将抗体溶解于PBS。将实例4.11.1中获得的化合物T-48(5.04μL，3.0mmol，作为接头-毒素中间体)在DMSO中的溶液用还原的、再氧化的抗体(36μL，0.12mmol)处理并在40℃下温和搅拌1小时。通过PD-10柱装载并洗脱缀合混合物以除去过量的药物-接头中间体和其它杂质。通过HIC分析缀合抗体的DAR(药物与抗体比率)。
缀合方法4：马来酰亚胺缀合方案。(水解)
马来酰亚胺缀合后，将抗体药物缀合物在硼酸盐缓冲液(pH9.2)中在37℃下孵育16小时以水解马来酰亚胺环。并且通过viva-spin柱(通用电气医疗集团(GE Healthcare))用PBS(pH7.3)更换硼酸盐缓冲液。
实例7.用于制备ADC的两步缀合方法
Figure BDA0004078574660002031
缀合方法5：MPS-N3+BCN-药物。(NaBH4)
在还原和再氧化反应之后，将实例2(表2)中获得的化合物MPS-D1-11用于进行与抗体的工程化半胱氨酸的硫醇基团的第一步缀合反应。将PBS中的抗体用DMSO中的每种化合物(6.62uL，3.0mmol)处理。3小时后，将硼氢化钠(6.62ul，300mmol)添加到缀合溶液中，在室温下阻断可逆的解缀合反应1小时。通过PD-10柱纯化第一次缀合的抗体。对于第二次缀合，在不存在Cu(I)催化剂的情况下，使实例4.10.2中获得的具有待促进环加成的官能团(如N3)的T-Int-102(13.24uL，3.0mmol)与T-Int-102-D1-11AB2.1缀合抗体(7.4uL，0.117mmol)接触并在37℃下孵育。大约24小时后，通过PD-10柱纯化抗体药物缀合物，并通过离心超滤浓缩。通过HIC分析缀合抗体的DAR(药物与抗体比率)。
缀合方法6：MPS-BCN+N3-药物。(NaBH4)
在还原和再氧化反应之后，将实例1.9中获得的化合物MPS-D1-10用于进行与抗体的工程化半胱氨酸的硫醇基团的第一步缀合反应。将PBS中的抗体用DMSO中的每种化合物(6.62uL，3.0mmol)处理。3小时后，将硼氢化钠(6.62ul，300mmol)添加到缀合溶液中，在室温下阻断可逆的解缀合反应1小时。并通过PD-10柱纯化第一次缀合的抗体。对于第二次缀合，在不存在Cu(I)催化剂的情况下，使实例4.6中获得的具有待促进环加成的官能团(如BCN)的Q-7(13.24uL，3.0mmol)与Q-7AB2.1缀合抗体(7.4uL，0.117mmol)接触并在37℃下孵育。大约24小时后，通过PD-10柱纯化抗体药物缀合物，并通过离心超滤浓缩。通过HIC分析缀合抗体的DAR(药物与抗体比率)。
表15A
Figure BDA0004078574660002041
Figure BDA0004078574660002051
表15B
Figure BDA0004078574660002052
Figure BDA0004078574660002061
表15C
Figure BDA0004078574660002062
表15D
Figure BDA0004078574660002063
Figure BDA0004078574660002071
表15E
Figure BDA0004078574660002072
Figure BDA0004078574660002081
表15F
Figure BDA0004078574660002082
表15G
Figure BDA0004078574660002091
表15H
Figure BDA0004078574660002092
表15I
Figure BDA0004078574660002101
表15J
Figure BDA0004078574660002102
表16.抗体-药物缀合物(ADC)：参考表12或表15
Figure BDA0004078574660002103
Figure BDA0004078574660002111
Figure BDA0004078574660002121
Figure BDA0004078574660002131
实例8.抗体药物缀合物的纯化
将混合物通过离心超滤浓缩，并将缀合物用HIC NPR柱(TOSOH#0007656TSKgel苯基-5PW，21.5×150mm，13μm)纯化，并用0.8ml/分钟的40至100％B的线性梯度洗脱(B缓冲液为1.5M硫酸铵在50mM磷酸钠中的溶液(pH 7.0)；B缓冲液为20％乙腈在50mM磷酸钠中的溶液(pH 7.0))。通过HIC分析缀合抗体的DAR(药物与抗体比率)。
实例9.蛋白质-药物缀合物的体外分析
将HEK293(B7-H3过表达)、NCI-N87、JIMT-1、Calu-6、NCI-H460、A549、HCT-116、DU-145、NCI-H23和NCI-H358癌细胞以每孔2,000至8,000个细胞的密度接种在96孔板中的100μL培养基中，并培养24小时。通过从50nM至0.0003nM的1:4系列稀释处理ADC，并且通过从50nM至0.0007nM的1:4系列稀释处理抗体药物缀合物T-DM1。将化合物在DMSO中的系列稀释液以每孔5μL添加到24孔板的一式三份孔中。各板上的三个孔接受5μL的DMSO，不含化合物作为对照。每孔DMSO的最终浓度为0.5％。将板在37℃下在潮湿的含5％CO2的空气气氛中孵育6天。通过MTT测定法确定细胞活力。将溶解于PBS缓冲液(5mg/mL)中的0.2mL的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)染料添加至板的各孔中。将活细胞中线粒体氧化还原酶还原MTT染料形成的formazans溶解于DMSO中，并使用550nm处的吸光度测量。使用S形剂量-反应非线性回归曲线拟合(GraphPad软件公司)生成IC50，结果示于下面的图1至9和表17至27中。
表17.抗体-药物缀合物(B7-H3过表达HEK293)的细胞毒性
Figure BDA0004078574660002132
Figure BDA0004078574660002141
表18.抗体-药物缀合物(Calu-6)的细胞毒性
ADCs DAR Calu-6(IC50nM)
T-21-AB2.1 1.12 0.111
T-17-AB2.1 0.56 0.143
T-21-AB6.1 1.12 0.801
T-55-AB9.1 0.98 0.589
T-1-AB1.1 1.20 >100
T-8-AB1.1 1.20 8,384
T-11-AB9.1 0.66 0.009
T-11-AB1.1 1.58 0.005
T-11-AB9.2 0.58 0.012
表19.抗体-药物缀合物(JIMT-1)的细胞毒性
ADCs DAR JIMT-1(IC50nM)
T-11-AB2.1 0.62 0.063
T-1-AB2.1 0.78 >100
T-47-AB2.1 1.43 0.1～1.0
T-6-AB2.1 1.08 0.079
T-71-AB2.1 0.90 0.001
T-2-AB2.1 1.36 0.009
T-30-AB2.1 0.39 >100
T-21-AB2.1 1.12 0.095
T-22-AB2.1 1.33 0.023
T-28-AB2.1 1.45 0.020
T-20-AB2.1 0.97 0.002
T-23-AB2.1 0.95 0.011
T-25-AB2.1 1.03 0.043
T-24-AB2.1 0.50 0.047
T-57-AB2.1 1.73 0.040
T-13-AB2.1 0.69 0.015
T-19-AB2.1 1.10 0.604
T-31-AB2.1 1.40 0.278
T-15-AB2.1 0.82 0.044
T-17-AB2.1 0.56 0.126
T-21-AB6.1 1.12 0.219
表20.抗体-药物缀合物(NCI-H23)的细胞毒性
Figure BDA0004078574660002142
Figure BDA0004078574660002151
表21.抗体-药物缀合物(HCT-116)的细胞毒性
ADCs DAR HCT-116(IC50nM)
T-11-AB2.1 0.62 0.052
T-1-AB2.1 0.78 >100
T-47-AB2.1 1.43 >100
T-6-AB2.1 1.08 0.557
T-2-AB2.1 1.36 0.014
T-30-AB2.1 0.39 >100
T-21-AB2.1 1.12 0.264
T-23-AB2.1 0.95 0.048
T-21-AB6.1 1.12 3.374
T-6-AB9.2 1.01 4.865
T-21-AB9.2 1.03 0.599
T-Int-102-D1-5 AB2.1 1.52 0.023
T-Int-113 AB2.1 1.40 0.012
表22.抗体-药物缀合物(NCI-H460)的细胞毒性
ADCs DAR NCI-H460(IC50nM)
T-11-AB2.1 0.62 0.268
T-21-AB2.1 1.12 0.2～2.0
T-23-AB2.1 0.95 0.157
T-17-AB2.1 0.56 0.513
T-21-AB6.1 1.12 2～20
T-6-AB9.2 1.01 1～10
T-Int-102-D1-5 AB2.1 1.52 0.103
T-Int-113 AB2.1 1.40 0.046
表23.抗体-药物缀合物(NCI-N87)的细胞毒性
ADCs DAR NCI-N87(IC50nM)
T-11-AB2.1 0.62 0.222
T-1-AB2.1 0.78 >100
T-47-AB2.1 1.43 >100
T-6-AB2.1 1.08 4.641
T-2-AB2.1 1.36 0.014
T-30-AB2.1 0.39 >100
T-8-AB1.1 1.20 0.567
T-11-AB9.1 0.66 0.760
T-11-AB9.2 0.58 0.116
T-Int-102-D3-2 AB2.1 0.26 0.045
Q-7-AB2.1 0.43 3.626
表24.纯化的抗体-药物缀合物的细胞毒性(IC50，nM)
Figure BDA0004078574660002152
Figure BDA0004078574660002161
表25.抗体-药物缀合物(CCRF-CEM)的细胞毒性
ADCs DAR CCRF-CEM(IC50nM)
T-101 AB2.1 2.0 2.837±0.115
T-102 AB2.1 2.0 32.35±0.520
T-103 AB2.1 2.0 1.759±0.381
T-104 AB2.1 2.0 11.42±1.978
T-105 AB2.1 2.0 4.563±0.707
T-106 AB2.1 2.0 45.05±3.124
T-107 AB2.1 2.0 7.610±0.512
T-108 AB2.1 2.0 197.2±41.11
T-109 AB2.1 2.0 8.932±1.144
T-110 AB2.1 2.0 76.31±10.95
T-111 AB2.1 2.0 62.09±0.430
T-201 AB2.1 2.0 5.848±0.520
T-207 AB2.1 2.0 3.726±0.072
T-208 AB2.1 2.0 3.356±0.057
T-209 AB2.1 2.0 3.497±0.101
T-210 AB2.1 2.0 24.45±2.639
T-211 AB2.1 2.0 3.688±0.065
T-212 AB2.1 2.0 1.200±0.239
T-213 AB2.1 2.0 3.457±0.030
T-214 AB2.1 2.0 333.4±80.82
T-215 AB2.1 2.0 1013±43.49
表26.抗体-药物缀合物(Raji)的细胞毒性
Figure BDA0004078574660002162
Figure BDA0004078574660002171
表27.抗体-药物缀合物(CHO-K1)的细胞毒性
ADCs DAR CHO-K1(IC50nM)
T-101 AB2.1 2.0 34.1±7.37
T-102 AB2.1 2.0 150～500
T-103 AB2.1 2.0 9.47±0.61
T-104 AB2.1 2.0 100～500
T-207 AB2.1 2.0 14.49±0.11
T-208 AB2.1 2.0 8.935±0.683
T-209 AB2.1 2.0 12.09±0.176
T-210 AB2.1 2.0 51.36±1.08
T-211 AB2.1 2.0 15.72±0.29
T-212 AB2.1 2.0 6.293±0.566
T-213 AB2.1 2.0 16.95±0.685
实例10.体内功效
以20mg规模反应制备T-20-AB2.1、T-23-AB2.1、T-Int-102-D1-5 AB2.1和T-Int0112-AB2.1。通过HIC柱纯化后，将最终样品浓缩至5至10mg/ml蛋白质。
通过小鼠中的肿瘤异种移植研究测量T-20-AB2.1和T-23-AB2.1的体内功效。雌性BALB/c nu/nu分别在右侧皮下注射5×106的JIMT-1细胞在PBS中的悬浮液。当肿瘤达到大约150mm3时，将小鼠随机分成研究组。静脉内注射T-DM1(5mg/kg)和T-20-AB2.1和T-23-AB2.1缀合物(0.3mg/kg，QW×4)。所有处理组由每组6至10只动物组成，使用卡尺测量每周两次监测肿瘤大小。肿瘤质量计算为体积＝(宽度×宽度×长度)/2。本公开的缀合物在观察期内，即从实验开始起的80天内导致肿瘤消退。对照缀合物T-DM1的活性低于我们的缀合物。这些结果示于图10和图11中。
HCT-116、NCI-H23和NCI-H460模型以类似于T-Int-102-D1-5 AB2.1和T-Int-112-AB2.1的方法进行。
缀合物使得肿瘤从实验开始后的60至90天内消退。这些结果如图12至17所示。
这些体内实验由CACT(癌症治疗进展中心，Asan医疗中心，项目代码：HI15C0972)和Biotoxtech进行
实例11.抗B7-H3单克隆抗体的生成
Ymax-ABL文库(Y-Biologics生物技术公司)通过三个连续的生物淘选技术和额外的亲和力成熟技术发现了B7-H3特异性抗体。
在筛选了具有不同碱基序列以及对B7-H3特异的约140个scFv抗体命中后，将它们转化为完整的人IgG形式，并使用Ymax-tEXPRESS系统(Y-Biologics生物技术公司)生产。
通过DNA序列分析和体外表征测定选择B7-H3特异性抗体，并以硫单抗IgG(IgG_A1C)的形式产生(表28、29、30和31)。
表28：使用完全人抗体噬菌体文库技术生成的抗B7-H3抗体的列表
Figure BDA0004078574660002181
包括所选抗体的重链和轻链CDR序列的抗体，以及包括它们的重链可变区和轻链可变区示于表29和30中。
表29：抗B7-H3抗体的CDR序列
Figure BDA0004078574660002182
Figure BDA0004078574660002191
Figure BDA0004078574660002201
表30：抗B7-H3抗体的可变序列
Figure BDA0004078574660002202
Figure BDA0004078574660002211
方法：使用Ymax-ABL文库的生物淘选
用具有多种约3×10E10的人scFv噬菌体文库(Y-Biologics生物技术公司)感染大肠杆菌(E.coli)细胞，然后在30℃下培养16小时。培养后，离心培养液，用PEG浓缩所得上清液，然后溶于PBS缓冲液中，得到人scFv噬菌体展示。将文库噬菌体装入用人B7-H3蛋白包被的免疫试管(新诺生物技术公司(Sino biological Inc.)或Y-Biologics生物技术公司)中，然后在室温下反应2小时。用1×PBS/T和1×PBS洗涤后，仅洗脱特异性结合抗原的scFv-噬菌体。
将洗脱的噬菌体再次感染到大肠杆菌细胞中并扩增(淘选过程)以获得阳性噬菌体库。以与所述相同的方式使用在第一淘选过程中扩增的噬菌体进行第二和第三淘选过程，除了仅将PBST洗涤步骤的次数增加至25次之外。在第三次淘选过程中，与抗原结合的噬菌体数量(产量)增加。
进行聚噬菌体ELISA(酶联免疫测定)以研究分别在每轮淘选过程中获得的阳性聚scFv-噬菌体抗体库的抗原特异性。将第一次至第三次淘选过程后冷冻的细胞储备液添加到含有5ml 2×YTCM、2％葡萄糖和5mM MgCl2的培养基中至OD600为0.1，然后在37℃下培养2至3小时(OD600＝0.5至0.7)。将细胞用M1辅助噬菌体感染并在含有2×YTCMK、5mM MgCl2和1mM IPTG的培养基中在30℃下培养16小时。将所得细胞培养物离心(4,500rpm，15分钟，4℃)，并将上清液转移至新管(第一次至第三次淘选的聚scFv-噬菌体)。将抗原以100ng/孔的密度在96孔免疫板(NUNC 439454)上用包被缓冲液在4℃下包被16小时，并使用溶于PBS的4％脱脂乳封闭每个孔。每个孔用0.2ml PBS/T洗涤，向每个孔中添加100μl第一次至第三次淘选的聚scFv-噬菌体，然后在室温下反应2小时。然后，每个孔用0.2ml PBS/T洗涤4次，并将用4％脱脂乳/PBS以1:2000(v/v)稀释的第二抗体抗M13-HRP(Amersham 27-9421-01)添加到每个孔中，并在室温下反应1小时。用PBS/T洗涤后，将OPD片剂(Sigma 8787-TAB)溶解在PC缓冲液中的溶液以100μl/孔的浓度添加到孔中以诱导显色10分钟。然后，用分光光度计(美谷分子仪器公司(Molecular Device))在490nm处测量吸光度。ELISA显示对B7-H3抗原的结合亲和力在第三次淘选的聚scFv-噬菌体中富集。
将从具有高结合亲和力的多克隆噬菌体抗体组(第三次淘选)获得的菌落在1ml96深孔板(Bioneer 90030)中在37℃下培养16小时。将由此生长的100至200μl细胞添加到含有2×YTCM、2％葡萄糖和5mM MgCl2的培养基中至OD600为0.1，并添加到含有1ml 2×YTCM、2％葡萄糖和5mM MgCl2的培养基中，然后在37℃下在96深孔板中培养2至3小时至OD600为0.5至0.7。用MOI为1:20的M1辅助噬菌体感染细胞并在含有2×YTCMK、5mM MgCl2、1mM IPTG的培养基中在30℃下培养16小时。将抗原B7-H3以100ng/孔的密度在96孔免疫板上在4℃下包被16小时，并使用溶于PBS的4％脱脂乳封闭每个孔。将用0.2ml PBS/T洗涤并培养16小时的每个单克隆scFv-噬菌体(100个scFv-噬菌体)以100μl的剂量添加到每个孔中并在室温下反应2小时。然后，每个孔用0.2ml PBS/T洗涤4次，并用4％脱脂乳/PBS稀释第二抗体抗M13-HRP至1/2000(v/v)并在室温下反应1小时。用0.2ml PBS/T洗涤后，进行显色并在490nm处测量吸光度。作为对每种抗原具有高结合亲和力的单噬菌体克隆，获得了总共几十个B7-H3的单噬菌体克隆。
方法：通过DNA序列分析进行选择
使用DNA纯化试剂盒(德国凯杰公司(Qiagen))对所选择的单个克隆进行DNA制备以获得DNA，并且通过(Solgent公司)进行DNA的序列分析。基于序列分析的结果鉴定所选抗体的VH和VL的CDR区，并使用Ig BLAST程序(《核酸研究》，2013，41，W34-40)研究这些抗体与种系抗体组之间的相似性(同一性)。获得九种B7-H3特异性噬菌体抗体，并总结于表18、19和20中。
方法：B7-H3特异性抗体的构建和生产
对选择的抗体克隆的重链和轻链进行PCR(iCycler iQ，伯乐公司(BIO-RAD))。结果，获得重链和轻链，用限制性内切酶(消化)载体(pNATVH和pNATVL)和两条链。用DNA凝胶提取试剂盒(凯杰公司)洗脱DNA。连接如下进行：混合1μl(10ng)载体、15μl(100至200ng)重链或轻链、2μl 10×连接缓冲液、1μl连接酶(1U/μl)和蒸馏水，使混合物在室温下静置1至2小时，将所得混合物注射到感受态细胞(XL1-blue)中，将细胞置于冰上5分钟并使细胞在42℃下热激90秒。热激后，向细胞中添加1ml培养基，然后使细胞在37℃下生长1小时，铺在LBAmp板上并在37℃下孵育16小时。将获得的菌落接种到5ml LB Amp培养基中，在37℃下培养16小时，并使用DNA制备试剂盒(Nuclogen)进行DNA制备。通过(Solgent)对获得的DNA进行序列分析。通过定点诱变方法构建了所选抗体克隆的每种硫单抗IgG。通过序列分析证实了包括对应于所选克隆的噬菌体抗体序列的硫单抗的转化的完整IgG克隆构建体(表21和22)。为了转染到HEK 293F细胞中，将转化为完整IgG或硫单抗IgG的各个克隆的重链(pNATVH)和轻链(pNATVL)在100ml LB Amp培养基中生长，并使用Midi制备试剂盒(凯杰公司)获得DNA。
将克隆的pNATVH和pNATVL载体以6:4的比例共转染到HEK293F细胞中，并在第7天收集上清液，通过离心和0.22μm顶部滤器除去细胞和碎片，收集上清液并进行蛋白A亲和层析以纯化IgG抗体。在纯化过程中，使用甘氨酸缓冲液分离抗体，并改变缓冲液使得最终的重悬缓冲液是PBS。通过BCA和纳米液滴定量纯化的抗体，并且在还原和非还原条件下将每种抗体以5ug的剂量加载到凝胶上，并且通过SDS-PAGE分析以确定纯化的蛋白质的纯度和迁移率。在非还原条件下以150kDa或更大的分子量检测所有选择的抗体，并且产生SC0041或SC0041.01作为对照抗体(表33和34)。
表31：使用Ymax-tEXPRESS系统生成的抗B7-H3抗体的硫单抗重链序列
Figure BDA0004078574660002231
Figure BDA0004078574660002241
Figure BDA0004078574660002251
Figure BDA0004078574660002261
Figure BDA0004078574660002271
表32：使用Ymax-tEXPRESS系统生成的抗B7-H3抗体的硫单抗轻链序列
Figure BDA0004078574660002272
Figure BDA0004078574660002281
Figure BDA0004078574660002291
表33：对照抗B7-H3抗体的重链序列
Figure BDA0004078574660002292
Figure BDA0004078574660002301
表34：对照抗B7-H3抗体的轻链序列
Figure BDA0004078574660002302
Figure BDA0004078574660002311
表35.抗B7-H3抗体和硫单抗的概述
Figure BDA0004078574660002312
实例12：抗B7-H3单克隆抗体的体外结合亲和力
通过基于BLI的OCTET或基于SPR的Biacore测定纯化的抗B7-H3单克隆抗体的结合亲和力。所选择的抗B7-H3 mAb通过OCTET的结合动力学如表36所示。此外，与人、食蟹猴和小鼠B7-H3抗原结合的抗体的结合动力学如表37所示。
表36：抗B7-H3抗体的OCTET动力学
Figure BDA0004078574660002321
方法：OCTET结合动力学
使用ForteBio Octet QKe仪器测量人B7-H3与抗B7-H3抗体的结合动力学。OctetQKe系统基于BLI(生物层干涉测量法)，这是一种无标记生物传感器技术，可以实时测量分子相互作用，用于动力学分析。
将AHC(抗hIgG捕获)生物传感器(ForteBio公司，18－5060)在1X动力学缓冲液(Fortebio公司)中平衡10分钟，并将人B7-H3(Y-Biologics生物技术公司)在1X动力学缓冲液中制备成2倍连续稀释液(0.94nM至30nM)。将B7-H3抗体配体以10μg/ml加载到AHC生物传感器上，直到实现1.5纳米的光学位移。加载后，将生物传感器基线化并在限定浓度的人B7-H3中结合10分钟，然后在缓冲液中解离10分钟。整个实验在30℃下进行，其中96孔黑色平底聚丙烯微孔板(格瑞纳生物科技公司(Greiner Bio-One)零件号655209)以1,000rpm的速度摇动。所有溶液的最终体积为每孔200μl。
通过减去仅暴露于运行缓冲液的对照传感器来校正所有测量的基线漂移。通过使用空白传感器进行非特异性结合试验以检查是否存在抗B7-H3抗体与传感器表面的结合。
使用Octet数据分析软件9.0进行数据分析和曲线拟合。处理获得的数据以确定重叠拟合和KD、Kon和Koff值。从分析物孔中减去参考孔的缓冲液伪影。然后对数据进行y轴对准、步间校正和Savitzky-Golay滤波。然后使用具有全局拟合的1:1模型拟合使处理的数据拟合用于缔合和解离的曲线。用GraphPad Prism 8分析基线校正的结合曲线。
表37：抗B7-H3抗体与人、食蟹猴和小鼠B7-H3结合的Biacore动力学
固定化配体 分析物 Ka(M-1s-1) Kd(s-1) KD(M)
SC0041 人4IgB7-H3 1.19E+06 6.17E-04 5.18E-10
人2IgB7-H3 5.15E+05 1.07E-01 2.08E-07
Cyno B7-H3 8.71E+05 2.42E-04 2.78E-10
小鼠B7-H3 6.00E+05 2.94E-02 4.90E-08
SA2107 人4IgB7-H3 4.46E+05 1.99E-04 4.46E-10
人2IgB7-H3 2.06E+05 5.15E-03 2.50E-08
Cyno B7-H3 4.81E+05 4.42E-04 9.19E-10
小鼠B7-H3 4.08E+05 1.93E-02 4.73E-08
SA2107.01 人4IgB7-H3 4.42E+05 4.70E-04 1.06E-09
人2IgB7-H3 2.17E+05 4.69E-03 2.16E-08
Cyno B7-H3 4.80E+05 5.04E-04 1.05E-09
小鼠B7-H3 4.20E+05 1.78E-02 4.24E-08
方法：Biacore结合动力学
使用Biacore 8K(通用电气生命科学部(GE Life science))仪器测量几种B7-H3变体(分析物)与各种mAb(配体)结合的结合动力学。将抗体捕获到固定化的抗人Fc抗体(通用电气生命科学部)上。在活性细胞和参考细胞上使用标准胺偶联方法将抗Fc抗体固定到CM5传感器芯片上大约7,000RU。对于结合动力学测量，HBS—EP+用于运行缓冲液(10mMHepes，pH7.4，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％聚山梨醇酯20)。将抗B7-H3抗体在运行缓冲液中稀释至0.5ug/mL并仅在活性细胞上注射110秒。捕获配体后，分析各种B7-H3抗原120秒，以30ul//分钟的流速监测解离600秒。将3M MgCl2溶液以30ul/分钟的速率注射到活性细胞和参考细胞上30秒用于再生。对于动力学分析，使5点2倍稀释的分析物流过捕获的配体，范围为20nM人4IgB7-H3(Y-Biologics生物技术公司)、320nM人2Ig B7-H3(百普赛斯(Acrobiosystems))、40nM食蟹猴B7-H3(新诺生物技术公司)和160nM小鼠B7-H3(新诺生物技术公司)。通过使用Biacore Insight评估软件(通用电气生命科学部)将数据拟合至1∶1结合模型来计算动力学信息，以确定ka(缔合常数)、kd(解离常数)和KD(平衡解离常数)。
通过引用并入
本文提及的所有出版物和专利通过引用整体并入本文，如同每个单独的出版物或专利被具体地和单独地指明通过引用并入。在冲突的情况下，以本申请(包括本文中的任何定义)为准。
等同物
虽然已经讨论了本公开的具体实施例，但是上述说明是说明性的而非限制性的。在阅读本说明书和以下权利要求书后，本公开的许多变化对于本领域技术人员将变得显而易见。本公开的全部范围应当通过参考权利要求及其等同物的全部范围和说明书以及这些变化来确定。

Claims (26)

1.一种由式I表示的抗体缀合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
Ab-(G)n
式I
其中：
Ab是抗B7-H3抗体或其抗原结合片段，其包含可变重链互补决定区1(CDRH1)、可变重链互补决定区2(CDRH2)、可变重链互补决定区3(CDRH3)、可变轻链互补决定区1(CDRL1)、可变轻链互补决定区2(CDRL2)和可变轻链互补决定区3(CDRL3)；其中，
CDRH1包含SEQ ID NO:1、7、13、19、25、31、37或43的氨基酸序列；
CDRH2包含SEQ ID NO:2、8、14、20、26、32、38或44的氨基酸序列；
CDRH3包含SEQ ID NO:3、9、15、21、27、33、39或45的氨基酸序列；
CDRL1包含SEQ ID NO:4、10、16、22、28、34、40或46的氨基酸序列，
CDRL2包含SEQ ID NO:5、11、17、23、29、35、41或47的氨基酸序列；
CDRL3包含SEQ ID NO:6、12、18、24、30、36、42或48的氨基酸序列；
每个G独立地是包含一种或多种活性剂和接头的化学部分，其中所述接头将Ab连接至所述活性剂；以及
n是1至20的整数。
2.根据权利要求1所述的抗体缀合物，其中Ab进一步包含可变重链和可变轻链的组合，所述可变重链包含SEQ ID NO:49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79或81的氨基酸序列，所述可变轻链包含SEQ ID NO:50、52、54、56、58、60、62、64、83、85、87、89、91、93、95或97的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体缀合物，其中Ab进一步包含选自以下的可变重链序列和可变轻链序列的组合：
(a)包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的可变轻链；
(b)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的可变轻链；
(c)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的可变轻链；
(d)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的可变轻链；
(e)包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的可变轻链；以及
(f)包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的可变轻链；
(g)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的可变轻链；
(h)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的可变轻链；
(i)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的可变轻链；
(j)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的可变轻链；
(k)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的可变轻链；
(l)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的可变轻链；
(m)包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的可变轻链；
(n)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的可变轻链；
(o)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的可变轻链；
(p)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的可变轻链；以及
(q)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的可变轻链。
4.根据权利要求1所述的抗体缀合物，其中所述抗B7-H3抗体是AB1、AB2、AB3、AB4、AB5、AB6、AB7或AB8。
5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体缀合物，其中所述B7-H3是人B7-H3。
6.根据权利要求1所述的抗体缀合物，其中Ab是单克隆抗体、结构域抗体(dAb)、单链抗体(scAb)、Fab片段、F(ab')2片段、单链可变片段(scFv)、scFv-Fc片段、单结构域重链抗体、单结构域轻链抗体、变体抗体或多聚体抗体。
7.根据前述权利要求中任一项所述的抗体缀合物，其中Ab是兔、小鼠、嵌合、人源化或完全人单克隆抗体。
8.根据前述权利要求中任一项所述的抗体缀合物，其中Ab是IgG同种型。
9.根据前述权利要求中任一项所述的抗体缀合物，其中Ab是IgG1同种型。
10.根据前述权利要求中任一项所述的抗体缀合物，其中Ab和所述活性剂之间的所述连接是可切割的。
11.根据前述权利要求中任一项所述的抗体缀合物，其中G由式II表示：
Figure FDA0004078574640000031
其中：
每个Q独立地是通过杂原子，优选地O或N连接至L'的活性剂；
Z'是连接基团；
L'是通过选自O、S和N，优选地O或N的杂原子连接至SO2的间隔基部分，并且经选择使得L'与SO2之间的键的裂解促进L'与Q之间的键的裂解以释放活性剂；
X是-O-、-C(Rb)2-或-N(Rc)-，优选地-O-；
Ar表示环，如芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基，优选地芳基或杂芳基；
Y'是-(CRb 2)yN(Ra)-、-(CRb 2)yO-或-(CRb 2)yS-，其位置使得如果y是1，则N、O或S原子附接至TG；
X和Y'位于Ar的相邻原子上；
TG是触发基团，当活化时，其生成能够与SO2反应以置换(Q)q-(L')w并形成包括X-SO2和Ar的中间原子的5至6元环的N、O或S原子；
q是具有1至约20，优选地1至约10的值的整数；
w、x和y各自独立地是具有0或1的值的整数；
每个Ra和Rc独立地是氢或低级烷基；并且
每个Rb独立地是氢或低级烷基；或
两个Rb与它们所附接的原子一起形成3至5元环，优选地3至4元环；
条件是当w是0时，q是1。
12.根据前述权利要求中任一项所述的抗体缀合物，其中Ab-(G)n由式(III)的化合物
Figure FDA0004078574640000041
或其盐表示，其中：
A是
Figure FDA0004078574640000042
Figure FDA0004078574640000043
M是N、CR30或C(-L-Q)；
每个L独立地选自间隔基部分；
每个Q是活性剂；
X选自-Cl、-Br和-I；
J是Ab；
R30和R31各自独立地选自吸电子基团、氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、碳环基、杂环基和卤代烷基；
R42和R43各自独立地选自-OH、烷氧基、-NR44R45、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、碳环基和杂环基，其中R44和R45与它们所附接的氮原子一起可以形成任选地与芳基或杂芳基环稠合的5至8元环；
R32、R44和R45各自独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、碳环基、杂环基和卤代烷基；并且
n是1至4。
13.根据权利要求11或12所述的抗体缀合物，其中Z'选自
Figure FDA0004078574640000051
Figure FDA0004078574640000061
Figure FDA0004078574640000071
以及
Figure FDA0004078574640000072
其中
Rza是H或甲基；
Rzb是-OH、＝O或＝NHOH；
Figure FDA0004078574640000073
单键或双键；
a”表示式(II)的Z'与Ar之间的键；
b”表示Z'与Ab之间的键；以及
Z"选自
Figure FDA0004078574640000074
沿任一方向取向。
14.根据前述权利要求中任一项所述的抗体缀合物，其中G包含选自以下的部分：
Figure FDA0004078574640000075
其中
Q是活性剂，并且
Figure FDA0004078574640000076
是将Z'连接至Ar的Z'的片段。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的抗体缀合物，其中G包含选自以下的部分：
Figure FDA0004078574640000081
Figure FDA0004078574640000091
Figure FDA0004078574640000101
Figure FDA0004078574640000111
Figure FDA0004078574640000121
Figure FDA0004078574640000131
Figure FDA0004078574640000141
以及
Figure FDA0004078574640000142
其中
Figure FDA0004078574640000143
是将Z'连接至Ar的Z'的片段。
16.根据前述权利要求中任一项所述的抗体缀合物，其中所述活性剂选自化疗剂和毒素。
17.根据前述权利要求中任一项所述的抗体缀合物，其中所述活性剂是化疗剂。
18.根据前述权利要求中任一项所述的抗体缀合物，其中所述活性剂是免疫调节化合物、抗癌剂、抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂或其组合。
19.根据权利要求1至16中任一项所述的抗体缀合物，其中所述活性剂选自：
(a)埃罗替尼、硼替佐米、氟维司群、舒尼替尼、来曲唑、甲磺酸伊马替尼、PTK787/ZK222584、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、亚叶酸、雷帕霉素、拉帕替尼、洛那法尼、索拉非尼、吉非替尼、AG1478、AG1571、噻替哌、环磷酰胺、白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、苯佐替哌、卡波醌、美妥替哌、乌瑞替哌、乙烯亚胺、六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺、三羟甲基三聚氰胺、泡番荔枝辛、布拉它辛酮、喜树碱、拓扑替康、苔藓抑素、卡莉司汀、CC-1065、阿多来新、卡折来新、比折来新、念珠藻素1、念珠藻素8、多拉司他汀、多卡霉素、KW-2189、CB1-TM1、软珊瑚醇、水鬼蕉碱、匍枝珊瑚醇、海绵抑制素、苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥、卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、环己亚硝脲、尼莫司汀、雷莫司汀、卡利奇霉素、卡利奇霉素γ1、卡利奇霉素ω1、达内霉素、达内霉素A、氯膦酸盐、埃斯培拉霉素、新制癌菌素生色团、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡拉霉素、癌霉素、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、detorubucin、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、吗啉基-多柔比星、氰基吗啉基-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星、脂质体多柔比星、脱氧多柔比星、表柔比星、依索比星、麻西罗霉素、丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链霉黑素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星、5-氟尿嘧啶、二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙、氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯、氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦、亚叶酸、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、阿莫司汀、比生群、依达曲沙、地磷酰胺、秋水仙胺、地吖醌、依氟鸟氨酸、依利醋铵、乙环氧啶、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、氯尼达明、美登素、安丝菌素、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌达醇、二胺硝吖啶、喷司他丁、苯来美特、吡柔比星、洛索蒽醌、2-乙基酰肼、丙卡巴肼、多糖-k、雷佐生、根霉素、西佐喃、锗螺胺、细交链孢菌酮酸、三亚胺醌、2,2',2”-三氯三乙胺、T-2毒素、疣孢菌素A、杆孢菌素A和蛇形菌素、尿烷、长春地辛、达卡巴嗪、甘露莫司汀、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、gacytosine、阿拉伯糖苷、环磷酰胺、噻替哌、紫杉醇、白蛋白工程化的紫杉醇纳米颗粒制剂、多西他赛、苯丁酸氮芥、吉西他滨、6-硫鸟嘌呤、巯嘌呤、顺铂、卡铂、长春碱、铂、依托泊苷、异环磷酰胺、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨、诺消灵、替尼泊苷、依达曲沙、柔毛霉素、氨喋呤、希罗达、伊班膦酸盐、CPT-11、拓扑异构酶抑制剂RFS 2000、二氟甲基鸟氨酸、视黄酸、卡培他滨或前述任一项的药学上可接受的盐、溶剂化物或酸；
(b)单核因子、淋巴因子、传统多肽激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、松弛素、前松弛素、糖蛋白激素、促卵泡激素、促甲状腺激素、黄体生成素、肝生长因子成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、苗勒氏管抑制物、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、血小板生成素、红细胞生成素、骨诱导因子、干扰素、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、集落刺激因子(“CSF”)、巨噬细胞-CSF、粒细胞-巨噬细胞-CSF、粒细胞-CSF、白细胞介素(“IL”)、IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、肿瘤坏死因子、TNF-α、TNF-β、多肽因子、LIF、试剂盒配体或任何前述的组合；
(c)白喉毒素、肉毒杆菌毒素、破伤风毒素、痢疾毒素、霍乱毒素、鹅膏蕈碱、鹅膏蕈碱衍生物、α-鹅膏蕈碱、吡咯并苯并二氮杂卓、吡咯并苯并二氮杂卓衍生物、河豚毒素、短裸甲藻毒素、雪卡毒素、蓖麻毒素、AM毒素、澳瑞他汀、微管溶素、格尔德霉素、美登木素生物碱、卡利奇霉素、道诺霉素、多柔比星、甲氨蝶呤、依沙替康、依沙替康衍生物、长春地辛、SG2285、多拉司他汀、多拉司他汀类似物、念珠藻素、喜树碱、喜树碱衍生物和代谢物、根霉素、根霉素衍生物、CC-1065、CC-1065类似物或衍生物、多卡霉素、烯二炔抗生素、埃斯培拉霉素、埃博霉素、氨佐萘特、普立肽、类毒素或任何前述的组合；
(d)亲和配体，其中亲和配体是底物、抑制剂、刺激剂、神经递质、放射性同位素，或任何前述的组合；
(e)放射性标记、32P、35S、荧光染料、电子致密试剂、酶、生物素、链霉抗生物素蛋白、dioxigenin、半抗原、免疫原性蛋白、具有与靶标互补的序列的核酸分子，或任何前述的组合；
(f)免疫调节化合物、抗癌剂、抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂和抗寄生虫剂，或任何前述的组合；
(g)它莫西芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基它莫昔芬、曲沃昔芬、克奥昔芬、LY117018、奥那司酮或托瑞米芬；
(h)4(5)-咪唑、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮、依西美坦、来曲唑或阿那曲唑；
(i)氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙立德、戈舍瑞林或曲沙他滨；
(j)芳香酶抑制剂；
(k)蛋白激酶抑制剂；
(l)脂质激酶抑制剂；
(m)反义寡核苷酸；
(n)核酶；
(o)疫苗；以及
(p)抗血管生成剂。
20.根据权利要求1至16中任一项所述的抗体缀合物，其中所述活性剂选自表3至5中所列的化合物、澳瑞他汀F、PNU、α-鹅膏蕈碱、Q-α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、CBI吲哚、CBI二聚体、(CA4-CA4)、(CA4-SN38)、Phenpanstatin、依沙替康、dPBD、Q-dPBD、dTBD、Q-dTBD、adTBD、adTBD DMBA、dTBD烷基胺、dThBD、dThBD、Q-dThBD NaSO3、dImBD、Q-dFuBD和ImBD-TBD。
21.一种药物组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的抗体缀合物。
22.根据权利要求21所述的药物组合物，其进一步包含治疗有效量的化疗剂。
23.一种治疗癌症的方法，其包含向有需要的受试者施用根据权利要求1至20中任一项所述的抗体缀合物或根据权利要求21或22所述的药物组合物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述癌症选自白血病、淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、神经胶质瘤、肺癌、支气管癌、结肠直肠癌、胰腺癌、食道癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、肾盂癌、口腔癌、咽癌、子宫体癌或黑素瘤。
25.一种治疗自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，其包含向有需要的受试者施用根据权利要求1至20中任一项所述的抗体缀合物或根据权利要求21或22所述的药物组合物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述自身免疫性疾病或炎性疾病选自B细胞介导的自身免疫性疾病或炎性疾病，例如系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、瓦尔登斯特伦氏高丙种球蛋白血症、舍格伦综合征、多发性硬化(MS)或狼疮性肾炎。
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