CN115927350A - 一种草地贪夜蛾abcc2基因突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种草地贪夜蛾ABCC2基因突变体及其应用，属于昆虫细胞生物和生物技术领域。本发明草地贪夜蛾ABCC2基因突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该基因突变体可用于检测草地贪夜蛾的BtCry1Ac毒素抗性，检测方法为：检测草地贪夜蛾ABCC2基因的373bp位点碱基的突变情况，如果ABCC2基因的373bp位点为C则草地贪夜蛾对Bt Cry1Ac毒素敏感，如果ABCC2基因的373bp位点为G则草地贪夜蛾对Bt Cry1Ac毒素有抗性。本发明为鉴定草地贪夜蛾是否对Bt Cry1Ac毒素产生抗性提供了一种新的检测方法。

Description

一种草地贪夜蛾ABCC2基因突变体及其应用

技术领域

本发明属于昆虫细胞生物和生物技术领域，涉及草地贪夜蛾ABCC2基因突变体及其应用。

背景技术

苏云金芽孢杆菌(Bt)，作为一种对人畜安全、环境友好型的高效微生物杀虫剂在全球得到广泛应用。Bt毒素杀虫的过程中涉及到多种受体蛋白的参与，Bt毒素与昆虫中肠刷状缘膜上的Bt毒素特异性受体结合能力、特异结合位点的数目改变等是引起抗性的重要因素。ABCC2转运蛋白是一种重要Bt毒素受体，鳞翅目昆虫ABCC2转运蛋白基因不同情况的突变能引起昆虫对Bt毒素不同程度的抗性，研究SfABCC2转运蛋白介导的草地贪夜蛾对Bt毒素抗性研究具有重要的理论意义。ABCC2转运蛋白作为跨膜蛋白，其胞外区域是毒素结合重要位点区域，探究ABCC2转运蛋白胞外ECL区域可以较好解析Bt受体介导的抗性机制，为入侵害虫草地贪夜蛾的防控和治理提供重要参考。

发明内容

本发明通过对Bt Cry1Ac毒素敏感与抗性的草地贪夜蛾品系Cry1Ac毒素受体ABCC2基因进行测序分析，发现抗性品系ABCC2的开放阅读框第373bp位点与野生型ABCC2基因相比由C突变成了G。进一步研究发现ABCC2基因的373bp位点发生突变后草地贪夜蛾对BtCry1Ac毒素的抗性显著提高。通过检测草地贪夜蛾ABCC2基因的373bp位点是否存在突变可以判断其对Bt Cry1Ac毒素的敏感性。基于此，本发明的目的在于提供一种草地贪夜蛾ABCC2基因突变体及其应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种草地贪夜蛾ABCC2基因突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的ABCC2基因突变体编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其跨细胞膜结构图及突变位点如图1所示。

上述草地贪夜蛾ABCC2基因突变体在检测草地贪夜蛾Bt Cry1Ac毒素抗性中的应用。

扩增含草地贪夜蛾ABCC2基因373bp位点的核酸片段的引物在制备检测草地贪夜蛾Bt Cry1Ac毒素抗性的试剂盒中的应用。

一种检测草地贪夜蛾Bt Cry1Ac毒素抗性的方法，为检测草地贪夜蛾ABCC2基因的373bp位点碱基的突变情况，如果ABCC2基因的373bp位点为C则草地贪夜蛾对Bt Cry1Ac毒素敏感，如果ABCC2基因的373bp位点为G则草地贪夜蛾对Bt Cry1Ac毒素有抗性。

本发明的优点和有益效果：本发明为鉴定草地贪夜蛾是否对Bt Cry1Ac毒素产生抗性提供了一种新的检测方法。

附图说明

图1是ABCC2转运蛋白跨细胞膜结构图及ECL1区突变位点。ABCC2转运蛋白有两个大跨膜区域，第一大跨膜区域有6次跨膜结构，其中胞外区域ECL1、ECL2和ECL3分别在124-142AA、237-241AA和360-364AA氨基酸残基区；第二大跨膜区域也有6次跨膜结构，其中胞外区域ECL4、ECL5和ECL6分别在769-811AA、907-911AA和1017-1021AA氨基酸残基区。突变体突变氨基酸残基位置位于ABCC2转运蛋白跨细胞膜结构区域ECL1区域。

图2是野生型pIE2-SfABCC2-EGFP质粒图谱。

图3是1.5μg/mL Cry1Ac毒素处理表达野生型和突变体ABCC2的Sf9细胞病变的显微镜观察图。其中，A：瞬时转染野生型pIE2-SfABCC2-EGFP质粒，绿色荧光标签蛋白细胞数为细胞总数；B：1.5μg/mL Cry1Ac毒素处理瞬时表达野生型ABCC2转运蛋白的Sf9细胞病变观察；C：瞬时转染突变体SfABCC2-MUC373G-EGFP质粒，绿色荧光标签蛋白细胞数为细胞总数；D：1.5μg/mL Cry1Ac毒素处理瞬时表达突变体ABCC2转运蛋白的Sf9细胞病变观察。

图4是1.5μg/mL Cry1Ac毒素处理表达野生型和突变体ABCC2的Sf9细胞病变率统计结果图。

图5是1.5μg/mL Cry1Ac毒素处理表达野生型和突变体ABCC2的Hi5细胞病变的显微镜观察图。其中，A：瞬时转染野生型pIE2-SfABCC2-EGFP质粒，绿色荧光标签蛋白细胞数为细胞总数；B：1.5μg/mL Cry1Ac毒素处理瞬时表达野生型ABCC2转运蛋白的Hi5细胞病变观察；C：瞬时转染突变体SfABCC2-MUC373G-EGFP质粒，绿色荧光标签蛋白细胞数为细胞总数；D：1.5μg/mL Cry1Ac毒素处理瞬时表达突变体ABCC2转运蛋白的Hi5细胞病变观察。

图6是1.5μg/mL Cry1Ac毒素处理表达野生型和突变体ABCC2的Hi5细胞病变率统计结果图。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

下面将结合实施例及实验数据对本申请的效果进行详细说明。如无特殊提及，以下方案中提到的分子克隆方法、蛋白表达纯化方法、细胞培养方法及各种检测方法等均为传统实验方法，可通过查询文献获得；用到的相关试剂可从对应试剂商处购买获得。

实施例1

1、构建pIE2-SfABCC2-EGFP野生型质粒

草地贪夜蛾Cry1Ac毒素受体基因ABCC2开放阅读框核酸序列长度4038bp，编码一种由1345氨基酸组成的蛋白，将草地贪夜蛾毒素受体基因ABCC2构建到昆虫细胞系表达载体pIE2-GFP-N1(pIE2-GFP-N1的构建见申请人在先专利申请《一种昆虫细胞表达系统载体重组质粒及其制备方法与应用》(公开号CN114540388A))，获得带有Opie2启动子、Corzak序列、ABCC2目的基因、EGFP荧光标签、KanR标签等特征的融合质粒pIE2-SfABCC2-EGFP，其质粒图谱如图2所示，具体构建过程如下。

(1)设计野生型质粒同源重组法克隆引物，引物如下：

SFABCC2-FUFP：5’-AGATCTCGAGCTCAAGCTTCGGCCACCATGGACAAAGAGAATAAAAATACCG-3’，

SFABCC2-FURP：5’-GGTGGCGACCGGTGGATCACCTCCGCCACCGCCTCCAGCGGTTTTGGCATCACTTTC-3’，

PIE2-EGFP-FUFP：5’-GATCCACCGGTCGCCACC-3’，

PIE2-EGFP-FURP：5’-CGAAGCTTGAGCTCGAGATCT-3’。

(2)昆虫组织总RNA的提取

将活体状态良好的昆虫低温冷冻5min，解剖约3条昆虫幼虫解剖取出中肠组织，用PBS缓冲液洗净中肠并置于无RNA酶的洁净EP管中，加入1mL Trizol溶液低温下用匀浆器充分研磨组织，时间不宜太久，研磨完成待用。置于冷冻高速离心机4℃低温离心，转速12000×g下离心5min，用移液器取上清液至另一个洁净EP管中，弃去沉淀。向有上清液的EP管中加入200μL的三氯甲烷(氯仿)，用移液器轻轻混匀，混合液冰浴10～15min。再次置于冷冻高速离心机4℃低温离心，转速12000×g离心15min，EP管中液体会出现分层现象，小心仔细吸取上层水相置于另一洁净EP管中，不可吸取中层或下层(弃去)。在所取的水相EP中混入500μL的异丙醇，上下颠倒轻轻混匀，室温静置10min。置于冷冻高速离心机4℃低温离心，转速12000×g离心10min，弃掉上清液，EP管底部有白色RNA沉淀。加入1000μL的75％冷乙醇，轻轻震荡混匀RNA沉淀，可能发现白色沉淀不溶于乙醇，但切忌用移液器吹散，此过程的作用是在除去残留的异丙醇。冷冻高速离心机低温离心4℃、8000×g离心5min，弃掉上清液，RNA白色沉淀重新出现在管底。将EP管盖子打开室温干燥5～10min挥发残留的乙醇，但不可过度干燥。向EP管中加入20～50μL无RNase的水溶解管底RNA沉淀，取少许样品测RNA浓度，RNA溶液备用或置于-80℃保存。

(3)草地贪夜蛾幼虫cDNA的合成

gDNA消除反应，参考TaKaRa PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser指导手册，基因组DNA去除体系：gDNA Eraser 1.0μL，5×gDNA Eraser buffer 2.0μL，总RNA量约1μg/mL，补足RNase Free water至总体系10.0μL，整个体系置于42℃水浴，反应30min，反应物备用或4℃保存。

RNA逆转录获得cDNA：取上述总反应体系10.0μL，加入5×PrimeScript Buffer24.0μL，PrimeScript RT Enzyme MiPⅠ1.0μL，RT Primer MiP 4.0μL以及RNase Free water1.0μL，使得总反应体系为20μL。将反应体系置于37℃水浴，反应15min；随后85℃水浴，反应5秒，使酶灭活；反应完成获得的cDNA备用或分装至洁净的PCR管置于-20℃保存。

(4)同源重组法无缝克隆获得pIE2-SfABCC2-EGFP野生型质粒

根据pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit说明书总结如下：

目的基因的扩增：以SFABCC2-FUFP和SFABCC2-FURP为引物，以草地贪夜蛾cDNA为模板扩增目的基因，获得目的基因片段(退火温度为58℃),将扩增的目的基因利用胶回收试剂盒Gel EPtraction Kit，(Omega Bio-tek,Inc.,GA,USA)纯化后备用。

载体线性化：利用引物PIE2-EGFP-FUFP和PIE2-EGFP-FURP扩增载体，从而获得线性化载体，扩增pIE2-GFP-N1质粒载体(全长4709bp)线性化载体获得4678bp片段(退火温度为60℃)，将线性划载体利用胶回收试剂盒Gel EPtraction Kit，(Omega Bio-tek,Inc.,GA,USA)纯化后备用。

同源重组：将获得的线性化载体和带有线性化载体重复序列的目的基因纯化后按照同源重组无缝克隆试剂盒连接，转化至感受态，挑取阳性克隆获得重组质粒pIE2-SfABCC2-EGFP，具体步骤可以参照

-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit(北京全式金生物科技有限公司)试剂盒步骤详情。

2、构建突变体SfABCC2-MU^C373G-EGFP质粒

(1)设计质粒点突变引物，引物如下：

SFABCC2-C375G-FP：5’-CCATTGCTGTTCTCTGAGCTCCTGTCC-3’，

SFABCC2-C375G-RP：5’-GAGAGAACAGCAATGGCTGAGCTGTC-3’。

(2)以野生型pIE2-SfABCC2-EGFP为模板，扩增目的基因，其中模板浓度要求1-10ng，取浓度10μM的SFABCC2-C375G-FP和SFABCC2-C375G-RP引物各1μL，取2×TransStartFastPfu Fly PCR SuperMiP 25μL，补足Nuclease-free Water至总体系50μL。

(3)PCR反应程序：94℃预变性2min；94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸1min20s，上述步骤循环25次；72℃后延伸10min。

(4)取PCR产物检测目的基因大小是否正确，验证之后取1μL的DMT酶37℃孵育消化1小时。

(5)转化至DMT感受态细胞，取10μL消化反应产物于100μL DMT感受态细胞混匀，冰浴30min，42℃热激50s，随后轻轻转移至冰上，冰浴5min，加入500μL LB培养基，200rpm、37℃培养1小时，取200μL涂布至带有Kan抗性固体LB平板，37℃培养箱倒置过夜培养。待长出克隆斑后提质粒测序鉴定突变体是否构建成功，构建成功的质粒命名为SfABCC2-MU^C373G-EGFP。

2、野生型和突变体质粒转染至昆虫细胞

(1)取生长状态良好的SF9或Hi5细胞接种到洁净的48孔细胞板中，用含有8.0％胎牛血清的Grace’s培养基(Grace’s Insect cell culture medium)在28.0℃恒温培养箱过夜培养，待密度为60％～80％便可用于细胞转染。

(2)用作转染的pIE2-SfABCC2-EGFP野生型质粒和SfABCC2-MUC373G-EGFP突变体质粒需用质粒抽提试剂盒无菌提取，抽提后其浓度在200ng/μL以上、且纯度(OD260/OD280)在1.75～1.85之间为宜。

(3)准备无血清Grace’s培养基，1000μL、200μL、10μL移液器和相应大小的替补头，1.5mL洁净的EP管，酒精灯和酒精棉置于生物安全柜中，紫外灭菌约30min。

(4)取25μL无血清Grace’s培养基到无菌1.5mL EP管中，加入1.0μL的FuGENE HD，同时混入0.25μg质粒(转染试剂体积与质粒质量比的范围建议在3.0：1.0～6.0：1.0之间为宜)。

(5)将加入到1.5mL的EP管中的混合液轻轻混匀，生物安全柜中静置20min，在上述混合液体系中补入95μL无血清Grace’s，使得总体积为120μL。

(6)弃去48孔板中培养基，用无血清Grace’s培养基清洗三次，将步骤(5)中的反应液加入到清洗的48孔板中混匀。

(7)转染的48孔板置于28.0℃细胞恒温培养箱孵育3～5h，弃去48孔板中反应液，加入120μL含有8.0％胎牛血清的Grace’s培养基。

(8)换培养基后，将48孔细胞培养板置于28.0℃细胞恒温培养箱培养24～48h。

3、野生型和突变体质粒转染介导SF9或Hi5细胞毒力测定

(1)在转染质粒48h后，把48孔板从培养箱中拿出，以用于后续的毒素处理实验。

(2)用PBS液采用两倍稀释法对Cry1Ac毒素进行稀释，稀释过程中一定要加量准确并均匀混合，配制成浓度为1.5μg/mL毒素。

(3)把48孔板中的培养基吸出来，Pucks液洗3次，然后每孔加入150μL 1.5μg/mL的毒素溶液。

(4)在加入毒素1h后，使用无目镜倒置显微镜进行拍照。

(5)毒素处理转染的SF9或Hi5细胞处理1h，在荧光倒置显微镜拍照记录，白光下记录病变数(细胞肿胀、膨大、变圆即为病变)，荧光下记录绿色荧光标签蛋白细胞数为细胞总数，计算病变率，即细胞病变率＝病变数/细胞总数×100％。

(6)设置三次重复，统计病变率。

(7)由图3-6可知，在1.5μg/mL的Cry1Ac毒素处理下，SfABCC2-MU^C373G-EGFP突变体介导SF9细胞和Hi5细胞病变率分别为10.67％和5.33％，pIE2-SfABCC2-EGFP野生型介导SF9细胞和Hi5细胞病变率分别为81.33％和87.67％。ABCC2转运蛋白基因位于ECL1区域第373个碱基突变引起昆虫对Bt Cry1Ac毒素抗性。

应理解，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种草地贪夜蛾ABCC2基因突变体，其特征在于：所述的基因突变体编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的草地贪夜蛾ABCC2基因突变体，其特征在于：所述的基因突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.权利要求1或2所述的草地贪夜蛾ABCC2基因突变体在检测草地贪夜蛾Bt Cry1Ac毒素抗性中的应用。

4.一种引物在制备检测草地贪夜蛾Bt Cry1Ac毒素抗性的试剂盒中的应用，其特征在于：所述的引物能够扩增含草地贪夜蛾ABCC2基因373bp位点的核酸片段。

5.一种检测草地贪夜蛾Bt Cry1Ac毒素抗性的方法，其特征在于：所述的方法为检测草地贪夜蛾ABCC2基因的373bp位点碱基的突变情况，如果ABCC2基因的373bp位点为C则草地贪夜蛾对Bt Cry1Ac毒素敏感，如果ABCC2基因的373bp位点为G则草地贪夜蛾对Bt Cry1Ac毒素有抗性。

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