CN115927165A - 脂肪酸合成代谢通路抑制剂在定型内胚层细胞分化中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了脂肪酸合成代谢通路抑制剂在定型内胚层细胞分化中的应用，还公开了用于哺乳动物多能干细胞体外定向分化成定型内胚层细胞的培养基及培养方法。所述培养基包含基础培养基和脂肪酸合成代谢通路的抑制剂；所述培养方法为使用上述培养基对哺乳动物多能干细胞进行培养，使其定向分化成定型内胚层细胞。本发明通过向基础培养基中添加脂肪酸合成代谢通路的抑制剂Firsocostat或C75，使哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的效率提高。本发明提供的分化方法，可重复性好且成本较低，提高了哺乳动物多能干细胞向定型内胚层分化的效率。这为研究胚胎早期发育、器官移植以及药物筛选等提供了低价高效的研究材料。

Description

脂肪酸合成代谢通路抑制剂在定型内胚层细胞分化中的应用

技术领域

本发明涉及干细胞和再生医学领域，特别涉及脂肪酸合成代谢通路抑制剂在定型内胚层细胞分化中的应用。

背景技术

多能性的胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)是从早期胚胎中分离出的一类的细胞，它具有自我更新以及多向分化的潜能。多能干细胞的体外分化体系为胚胎早期发育、疾病模型以及器官移植在内的再生医学领域的研究提供了重要的研究材料与技术支持。在体外培养过程中，多能干细胞能够诱导形成定型内胚层细胞进一步分化为胰腺、肝脏等细胞。体外分化成熟的细胞具有正常的功能，可以通过细胞移植为糖尿病等疾病的治疗提供了新的思路。因而为了获得所需的细胞，提高定型内胚层的分化效率尤为重要。

在胚胎干细胞分化过程中，细胞内脂肪酸代谢状态发生明显改变，这种代谢状态改变的出现甚至早于转录因子的表达波动。因而说明脂肪酸代谢对于胚胎干细胞分化具有重要作用。Firsocostat与C75分别通过抑制脂肪酸合成过程中关键蛋白脂肪酸合酶(FASN)和乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的酶活，从而降低细胞内脂肪酸合成的水平，并提高底物乙酰辅酶A的水平，从而对于细胞增殖以及细胞分化等过程产生重要影响。

目前，由多能干细胞向定型内胚层分化的培养体系已经较为成熟，通过向基础培养基中加入Activin A等生长因子便可以获得一定比例的内胚层细胞。但是，目前的生长因子主要是通过信号通路发挥促进分化的作用，并且此种培养方法耗时较长且效率较低。因此，建立一种高效且快速的培养方法来获得定型内胚层细胞对胚胎发育及再生医学的研究尤为重要。

发明内容

本发明目的在于提供脂肪酸合成代谢通路抑制剂在定型内胚层细胞分化中的应用。基于脂肪酸合成代谢通路抑制剂提高哺乳动物多能干细胞向定型内胚层细胞分化效率的作用，本发明的目的还在于提供用于哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养基和培养方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

在本发明的第一方面，提供脂肪酸合成代谢通路抑制剂在提高哺乳动物多能干细胞向定型内胚层细胞分化的效率中的应用。所述的脂肪酸合成代谢通路抑制剂优选为Firsocostat或C75。所述的Firsocostat的浓度优选为5～10nM；所述的C75的浓度优选为2.5～5μM。

在本发明的第二方面，提供一种用于哺乳动物多能干细胞向定型内胚层细胞分化的培养基，所述的培养基包含：基础培养基，脂肪酸合成代谢通路抑制剂。所述的脂肪酸合成代谢通路抑制剂优选为Firsocostat或C75。

进一步地，所述的培养基还包含：Activin A，Wnt3a蛋白。更进一步地，所述的培养基还包含无脂肪酸的牛血清白蛋白和双抗。

进一步地，所述的Firsocostat的浓度优选为5～10nM，所述的C75的浓度优选为2.5～5μM。所述的Activin A的浓度优选为100ng/mL，所述的Wnt3a蛋白的浓度优选为25ng/μL。所述的无脂肪酸的牛血清白蛋白的浓度优选为0.2％，所述的双抗的浓度优选为1％。

具体地，所述哺乳动物多能干细胞包括：人多能干细胞、灵长类动物多能干细胞、小鼠多能干细胞、大鼠多能干细胞、犬多能干细胞、猫多能干细胞、猪多能干细胞、牛多能干细胞和马多能干细胞中的一种。

在本发明的第三方面，提供一种哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养方法，所述的方法包括如下步骤：采用所述的培养基对哺乳动物多能干细胞进行培养，以使分化成定型内胚层细胞。

进一步地，所述的方法包括如下步骤：

将哺乳动物多能干细胞使用干细胞维持培养基培养3～7天，消化并重新接种于包被有基质胶的孔板内，采用干细胞维持培养基培养1～2天；

待细胞密度达到75～85％，换上所述的培养基进行培养，获得定型内胚层细胞。

上述技术方案中，所述的干细胞维持培养基具体可以为mTeSR^TM 1或E8+1％双抗，基质胶以1：100稀释比例包被于板孔内，在其他实施方式中也可适当调整添加比例。

上述技术方案中，对于24孔板，按1×10⁵每孔的密度将细胞接种于包被有基质胶的24孔板内；在其他实施方式中，对于不同的培养皿，应适当调整接种的细胞数。

本发明的Firsocostat的CAS编号为1434635-54-7；C75的CAS编号为218137-86-1。

本发明至少具有如下技术效果或优点：

本发明提供的脂肪酸合成代谢通路抑制剂在定型内胚层细胞分化中的应用，通过向基本培养基中添加脂肪酸合成代谢通路抑制剂Firsocostat或C75，以提高哺乳动物多能干细胞向定型内胚层细胞的分化效率；具体地：

(1)培养基中加入Firsocostat或C75，使多能干细胞分化第3或4天时即可达到较高的分化效率，可以缩短分化时间。

(2)本发明提供的培养基以高效稳定的方式将哺乳动物多能干细胞分化为定型内胚层细胞。这为体外进行胚胎早期发育以及再生医学的研究、药物筛选等提供了高效率的研究材料，这将极大地促进临床细胞疗法的研究与应用，有着很好的应用前景。

附图说明

图1为实施例1和对比例1对比显示Firsocostat对人胚胎干细胞内胚层分化标志性基因表达影响的定量PCR结果；

图2为实施例1和对比例1对比显示Firsocostat对人胚胎干细胞内胚层分化阳性率影响的流式结果；

图3为实施例2和对比例2对比显示C75对人胚胎干细胞内胚层分化标志性基因表达影响的定量PCR结果；

图4为实施例2和对比例2对比显示C75对人胚胎干细胞内胚层分化阳性率影响的流式结果；

图5为实施例2和对比例2对比显示C75对人胚胎干细胞内胚层分化标志性基因表达影响的免疫荧光结果；

图6为本发明的哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养方法的流程模式图。

具体实施方式

为了更加清楚的展现本发明的优点和各种效果，下面将结合具体实施方式和实施例阐述本发明。对于本领域技术人员来讲，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

本说明书中使用的术语，除非另有说明，皆应理解为本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。

下面将结合实施例、对比例以及实验数据对本申请的一种用于哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养基和培养方法进行详细说明。

实施例1

1、一种人多能干细胞分化为定型内胚层细胞的培养基

该培养基以DMEM/F12为基础培养基，还包括以下组分：100ng/mL Activin A，25ng/μLWnt3a，0.2％无脂肪酸的牛血清白蛋白，1％双抗，5或10nM的Firsocostat(FIRSO)。

2、一种人多能干细胞分化为定型内胚层细胞的培养方法，使用上述培养基进行培养，具体包括以下步骤：

(1)人胚胎干细胞HUES8(Cowan CA,Klimanskaya I,McMahon J,Atienza J,Witmyer J,Zucker JP,Wang S,Morton CC,McMahon AP,Powers D,Melton DA.Derivationof embryonic stem-cell lines from human blastocysts.N Engl J Med.2004Mar 25；350(13):1353-6.doi:10.1056/NEJMsr040330.)使用mTeSR^TM 1+1％双抗作为干细胞维持培养基并在1：100稀释比例的基质胶(Matrigel，BD Bioscience)上进行培养。

(2)步骤(1)中的人胚胎干细胞培养至细胞密度约为孔板底面积80％-90％时，用DPBS洗去死细胞，然后用Accutase在37℃细胞培养箱中孵育约3分钟直至显微镜下观察细胞呈圆球状，加入DMEM/F12培养基终止消化并吹打重悬，1000rpm离心3min，然后用mTeSR^TM1+1％双抗重悬细胞沉淀，计数后按1×10⁵每孔的密度将细胞接种于包被有基质胶的24孔板内。

(3)步骤(2)中的细胞培养1～2天至细胞密度达到孔板底面积80％左右时，换上上述新鲜配制的培养基开始进行定型内胚层分化，记为分化D0。

(4)每隔24小时更换新鲜的上述培养基，D3时即可获得定型内胚层细胞。

对比例1

该对比例1中，除分化培养基中不添加Firsocostat外，其他步骤均同实施例1。

实施例2

1、一种人多能干细胞分化为定型内胚层细胞的培养基

该培养基以DMEM/F12为基础培养基，还包括以下组分：100ng/mL Activin A，25ng/μLWnt3a，0.2％无脂肪酸的牛血清白蛋白，1％双抗，2.5或5μM的C75。

2、一种人多能干细胞分化为定型内胚层细胞的培养方法，使用上述培养基进行培养，具体包括以下步骤：

(1)人胚胎干细胞HUES8使用mTeSR^TM 1+1％双抗作为干细胞维持培养基并在1：100稀释比例的基质胶(Matrigel，BD Bioscience)上进行培养。

(2)步骤(1)中的人胚胎干细胞培养至细胞密度约为孔板底面积80％-90％时，用DPBS洗去死细胞，然后用Accutase在37℃细胞培养箱中孵育约3分钟直至显微镜下观察细胞呈圆球状，加入DMEM/F12培养基终止消化并吹打重悬，1000rpm离心3min，然后用mTeSR^TM1+1％双抗重悬细胞沉淀，计数后按1×10⁵每孔的密度将细胞接种于包被有基质胶的24孔板内。

(3)步骤(2)中的细胞培养1～2天至细胞密度达到孔板底面积80％左右时，换上上述新鲜配制的培养基开始进行定型内胚层分化，记为分化D0。

(4)每隔24小时更换新鲜的上述培养基，D3时即可获得定型内胚层细胞。

对比例2

该对比例2中，除分化培养基中不添加C75外，其他步骤均同实施例2。

实验例1

对各实施例和各对比例中得到的定型内胚层细胞的标志基因的mRNA水平或分化效率进行检测。

一、检测方法为：

1、通过实时荧光定量PCR检测得到的定型内胚层细胞的标志基因的mRNA水平：

(1)细胞收集

将上述D3时分化获得的定型内胚层细胞用DPBS洗去死细胞，之后加入TrypLE于37℃细胞培养箱孵育1min。用DMEM/F12培养基轻轻吹打细胞终止消化，并将细胞收集于1.5mLEP管中，4℃、3000rpm离心3min，吸去上清获得细胞沉淀。

(2)细胞总RNA提取

采用美基生物总RNA小量抽提试剂盒(双柱型)进行细胞的RNA提取，具体操作步骤如下：

取适量Buffer RL加入细胞沉淀并用移液器充分吹打，将上述液体转移至gDNA过滤柱中，14000g离心2min；丢弃gDNA过滤柱，加入等倍体积的70％乙醇并用移液器吹匀；将上述液体转移至RNA纯化柱，12000g离心1min，弃滤液；将RNA纯化柱装回收集管中，并在RNA纯化柱中加入500μL Buffer RW1，12000g离心1min，弃滤液；将RNA纯化柱装回收集管中，并在RNA纯化柱中加入500μL Buffer RW2，12000g离心1min，弃滤液；将RNA纯化柱装回收集管中，并在RNA纯化柱中加入500μL Buffer RW2，12000g离心1min，弃滤液；将RNA纯化柱装回收集管中，12000g离心2min，将RNA纯化柱转移至新的1.5mL EP管中，在纯化柱中央加入30μL RNase-Free Water，室温静置2min；12000g离心1min，弃去过滤柱，检测RNA浓度及质量，于-80℃保存。上述步骤均在冰上进行。

(3)反转录获得cDNA

采用Abclonal反转录试剂盒制备cDNA，具体操作步骤如下：

在EP管中加入4μL Abclonal的5×qRT SuperMix、1μg上述获得的RNA，加入RNase-Free Water将体积补充至20μL，混匀后用掌上离心机离心至液体均聚集于管底，于Bio-rad的PCR仪中进行反转录反应。反转录条件为25℃5min；42℃20min；85℃5sec，结束后于-20℃保存。

(4)实时荧光定量PCR

在384孔板中每孔加入20ng上述cDNA、5μL Bimake 2×SYBR Green qPCR MasterMix、0.5μL 5μM前向引物、0.5μL 5μM反向引物，加入RNase-Free Water将体积补充至10μL；使用Bio-rad的CFX384定量PCR仪进行扩增，反应条件为：95℃5min，95℃15s，60℃30s，重复39个循环。实验结果使用△△CT方法对比管家基因GAPDH进行分析。

本实验中用到的引物序列如下：

GAPDH前向引物AATGAAGGGGTCATTGATGG(如SEQ ID NO.1所示)，反向引物AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA(如SEQ ID NO.2所示)；

FOXA2前向引物GGAGCAGCTACTATGCAGAGC(如SEQ ID NO.3所示)，反向引物CGTGTTCATGCCGTTCATCC(如SEQ ID NO.4所示)；

SOX17前向引物GCATGACTCCGGTGTGAATCT(如SEQ ID NO.5所示)，反向引物TCACACGTCAGGATAGTTGCAGT(如SEQ ID NO.6所示)；

CXCR4前向引物TACACCGAGGAAATGGGCTCA(如SEQ ID NO.7所示)，反向引物AGATGATGGAGTAGATGGTGGG(如SEQ ID NO.8所示)。

2、通过流式细胞术检测人胚胎干细胞向定型内胚层分化的效率：

将上述分化获得的定型内胚层细胞用DPBS洗去死细胞，之后加入TrypLE于37℃细胞培养箱孵育1min。用DPBS+2％FBS轻轻吹打细胞终止消化，并将细胞均分并收集于两个1.5mL EP管中，4℃、3000rpm离心3min，吸去上清。按1：200的稀释比例用DPBS+2％FBS稀释CXCR4-APC、SOX17-FITC和APC-Isotype(阴性对照组)抗体，分别取200μL稀释后的抗体分别将细胞沉淀吹散并混匀，置于冰上避光孵育30min。4℃、3000rpm离心3min，弃去上清，用DPBS+2％FBS重悬细胞，4℃、3000rpm离心3min，弃去上清。最后用冰冷的DPBS重悬细胞并转移至流式管中，通过流式细胞仪检测CXCR4的阳性率。本实验中使用的抗体为Anti-CXCR4(555976，1：200，BD Biosciences)、Anti-SOX17(AF1924，1：200，R&D)。

3、通过免疫荧光检测人胚胎干细胞向定型内胚层分化的效率：

将上述分化获得的定型内胚层细胞用DPBS洗去死细胞，每孔加入适量4％PFA，室温孵育15min，DPBS洗一次；每孔加入适量封闭液(8.7mL DPBS+1mL驴血清+0.3mL10％Triton-X100)，室温孵育30min；弃去封闭液，加入适量封闭液稀释过的一抗，室温孵育2h，DPBS洗三次，每次5min；弃去DPBS，加入适量封闭液稀释过的二抗，室温避光孵育2h，DPBS洗三次，每次5min；弃去DPBS，加入适量DPBS稀释DAPI，室温避光孵育10min，DPBS洗一次；最后用DPBS浸泡细胞，置于倒置荧光显微镜下进行荧光观察并采集图片。本实验中使用的一抗为Anti-FOXA2(ET1703-76，1:200，HuaBio)；Anti-OCT4(sc-5279，1：200，SANTA CRUZ)。本实验中使用的荧光二抗为DoαMs TRITC(1:200，Jackson ImmunoResearch)；DoαRb 488(1:200，Jackson ImmunoResearch)；核染料：DAPI(罗氏，USA)。

二、检测结果及分析

1、实施例1和对比例1

检测实施例1和对比例1中细胞的定型内胚层标志性基因的mRNA和蛋白表达情况，具体结果见图1-2。

图1为实施例1和对比例1中细胞定型内胚层标志性基因FOXA2、SOX17、CXCR4的mRNA表达情况，其中“FIRSO-0nM”为对比例1。结果显示，与对比例的1倍相比，实施例1中加入5、10nM的Firsocostat后使FOXA2表达量增加了1.4、1.4倍，SOX17的表达量增加了1.2、1.4倍，CXCR4的表达量增加了1.6、1.8倍。

图2为实施例1和对比例1中定型内胚层标志性基因SOX17和CXCR4双阳性细胞比例的流式结果。与对比例“FIRSO-0nM”的45％阳性率相比，实施例1随着Firsocostat的加入，SOX17和CXCR4双阳性细胞的比例以浓度依赖的方式明显提高，在Firsocostat加入浓度为10nM时，实施例中细胞双阳性的比例提高了20％。

图1和图2的结果均显示Firsocostat的加入可以明显促进定型内胚层的分化，并且具有浓度依赖性。

2、实施例2和对比例2

检测实施例2和对比例2中细胞的定型内胚层标志性基因的mRNA和蛋白表达情况，具体结果见图3-5。

图3为实施例2和对比例2中细胞定型内胚层标志性基因FOXA2、SOX17、CXCR4的mRNA表达情况，其中“C75-0μM”为对比例2。结果显示，与对比例的1倍相比，实施例2中加入2.5、5μM的C75后使FOXA2表达量增加了1.2、1.2倍，SOX17的表达量增加了1.2、1.5倍，CXCR4的表达量增加了1.4、1.5倍。

图4为实施例2和对比例2中定型内胚层标志性基因SOX17和CXCR4双阳性细胞比例的流式结果。与对比例“C75-0μM”的45％阳性率相比，实施例2随着C75的加入，SOX17和CXCR4双阳性细胞的比例以浓度依赖的方式明显提高，在C75加入浓度为5nM时，实施例中细胞双阳性的比例提高了15％。

图5为实施例2和对比例2中定型内胚层标志性基因FOXA2和多能性标志性基因OCT4阳性细胞比例的免疫荧光结果。结果显示，与对比例2相比，在分化过程中加入C75以后，多能性基OCT4的阳性率明显下降，定型内胚层标志性基因FOXA2的阳性率明显增加。

图3-5的结果均显示C75的加入可以明显促进定型内胚层的分化，并且具有浓度依赖性。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.脂肪酸合成代谢通路抑制剂在提高哺乳动物多能干细胞向定型内胚层细胞分化的效率中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的脂肪酸合成代谢通路抑制剂为Firsocostat或C75。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的Firsocostat的浓度为5～10nM；所述的C75的浓度为2.5～5μM。

4.一种用于哺乳动物多能干细胞向定型内胚层细胞分化的培养基，其特征在于，所述的培养基包含：基础培养基，脂肪酸合成代谢通路抑制剂。

5.根据权利要求4所述的用于哺乳动物多能干细胞向定型内胚层细胞分化的培养基，其特征在于，所述的脂肪酸合成代谢通路抑制剂为Firsocostat或C75。

6.根据权利要求5所述的用于哺乳动物多能干细胞向定型内胚层细胞分化的培养基，其特征在于，所述的Firsocostat的浓度为5～10nM；所述的C75的浓度为2.5～5μM。

7.根据权利要求4-6任一项所述的用于哺乳动物多能干细胞向定型内胚层细胞分化的培养基，其特征在于，所述的培养基还包含：Activin A，Wnt3a。

8.根据权利要求7所述的用于哺乳动物多能干细胞向定型内胚层细胞分化的培养基，其特征在于，所述的Activin A的浓度为100ng/mL，所述的Wnt3a的浓度为25ng/μL。

9.一种哺乳动物多能干细胞向定型内胚层细胞分化的培养方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：采用权利要求4-8任一项所述的培养基对哺乳动物多能干细胞进行培养，使其定向分化成定型内胚层细胞。

10.根据权利要求9所述的哺乳动物多能干细胞向定型内胚层细胞分化的培养方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：将哺乳动物多能干细胞使用干细胞维持培养基培养，待细胞密度达到75～85％，换上权利4-8任一项所述的培养基进行培养，获得定型内胚层细胞。

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