CN115927147A

CN115927147A - 一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法及其应用

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Publication number: CN115927147A
Application number: CN202211279728.3A
Authority: CN
Inventors: 艾连中; 熊智强; 夏永军; 王光强; 宋馨; 张汇
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2022-10-19
Filing date: 2022-10-19
Publication date: 2023-04-07

Abstract

本发明涉及一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法及其应用，一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法，通过构建产番茄红素的重组乳酸菌，从而提高乳酸乳球菌抗氧化活性，构建产番茄红素的重组乳酸菌方法为构建番茄红素异源合成质粒，敲除乳酸乳球菌中乳酸脱氢酶(ldh)基因或过表达不同来源菌株中的MVA途径基因，得到重组乳酸乳球菌，从而实现乳酸乳球菌异源合成番茄红素。与现有技术相比，本发明通过构建一株产番茄红素的重组乳酸菌，测定自身和在脱脂乳中的抗氧化活性，发现重组乳酸乳球菌的抗氧化活性比出发菌株提高了1倍以上，且DPPH、ABTS和·OH自由基清除能力等显著增强，有望开发成为一种抗氧化的益生菌产品或发酵剂。

Description

一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法及其应用。

背景技术

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是活细胞进行有氧代谢的正常产物，当机体受到外界环境因子的应激时会产生过量ROS，如超氧阴离子自由基、羟自由基和过氧化氢等，使细胞内DNA、蛋白质、脂质等大分子发生变性，导致细胞损伤、功能丧失，引起细胞凋亡和坏死。因此，氧化与抗氧化的平衡对于维持机体正常生理功能的发挥和健康至关重要。

乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)属于乳酸菌中重要的成员之一，最早是从植物中分离出来^[1]。作为目前研究最为广泛的乳酸菌模式菌株，随着2001年完成对乳酸乳球菌全基因组测序，已成为大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌之后最受关注的外源基因表达宿主，是目前最为完善的乳酸菌基因克隆和表达系统^[2]。乳酸乳球菌作为发酵剂在奶酪和其它发酵食品中广泛使用，但在工业发酵生产中必然遭受ROS氧化胁迫，使其发酵活力降低。且乳酸乳球菌中没有高效的过氧化氢酶(CAT)来清除自由基和过氧化氢，因此会对菌体造成损害。常见的解决办法是表达抗氧化酶或合成活性肽，如过表达SOD或CAT，导入谷胱甘肽(GSH)生物合成途径导入等策略，但此类方法对于乳酸乳球菌抗氧化活性总体提高较低。因此，提高乳酸乳球菌的抗氧化活性有着重要的应用价值。

番茄红素是一种C₄₀类异戊二烯化合物，具有很强的抗氧化性和提高免疫力等功效，已广泛应用于食品和化妆品等行业^[3]。番茄红素是目前自然界中已知的最强抗氧化剂之一，番茄红素的抗氧化作用是β-胡萝卜素的两倍以上，是维生素E的100倍。

[1]吕懿超,李香澳,王凯博,等.乳酸菌作为生物保护菌的抑菌机理及其在食品中应用的研究进展[J].食品科学,2021(19):281-290.

[2]Xiong Z Q,Wei Y Y,Kong L H,et al.Short communication:An inducibleCRISPR/dCas9 gene repression system in Lactococcus lactis[J].Journal of DairyScience,2019,103(1):161-165.

[3]Liang X,Ma C,Yan X,et al.Advances in research on bioactivity,metabolism,stability and delivery systems of lycopene[J].Trends in FoodScience&Technology,2019,93:185-196.

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法及其应用，本发明将番茄红素合成基因在乳酸乳球菌中异源表达，通过敲除乳酸脱氢酶(ldh)基因和培养条件优化，实现了乳酸乳球菌合成番茄红素，使乳酸乳球菌工程菌抗氧化活性比对照菌株显著提高。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法，将crtE、crtB和crtI三个异源酶基因导入重组乳酸菌中，实现重组乳酸菌异源合成番茄红素，从而提高重组乳酸菌抗氧化活性；

所述crtE异源酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述crtB异源酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述crtI异源酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，将pGZQ01质粒导入重组乳酸菌中，实现乳酸乳球菌异源合成番茄红素，从而提高乳酸乳球菌抗氧化活性，

所述pGZQ01质粒中含有crtE、crtB和crtI三个异源酶基因，pGZQ01质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

乳酸菌以内源IPP和DMAPP合成FPP为前体，通过crtE、crtB和crtI三个异源酶连续催化合成番茄红素。结合KEGG代谢途径分析发现乳酸菌具有完整MVA途径，但缺乏crtE、crtB和crtI三个酶基因，所以不能合成番茄红素，而pGZQ01质粒携带这3个酶基因。

进一步地，所述重组乳酸菌来源于敲除乳酸脱氢酶(ldh)基因的乳酸乳球菌，所述乳酸脱氢酶(ldh)基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

上述更进一步地，所述乳酸乳球菌为NZ9000。

进一步地，所述重组乳酸菌来源于敲除乳酸脱氢酶(ldh)基因且过表达MVA途径基因的乳酸乳球菌。

上述更进一步地，所述MVA途径基因为乳酸乳球菌NZ9000、嗜热链球菌S-3或植物乳杆菌AR113中的MVA途径基因。

上述更进一步地，所述过表达MVA途径的基因为嗜热链球菌3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(mvaA)基因，所述嗜热链球菌3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(mvaA)基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

进一步地，将重组乳酸菌在培养基中培养，培养基中加入乙酸。

进一步地，培养温度为30℃，ph为7.0，发酵时间为12h。

此外，本发明还提供一种基于上述方法得到的重组乳酸菌在制备益生菌产品或发酵剂中的应用，所述重组乳酸菌提高益生菌产品或发酵剂的抗氧化功能。

与现有技术相比，本发明通过构建一株产番茄红素的重组乳酸菌，测定自身和在脱脂乳中的抗氧化活性，发现重组乳酸乳球菌的抗氧化活性比出发菌株提高了1倍以上，且DPPH、ABTS和·OH自由基清除能力等显著增强，有望开发成为一种抗氧化的益生菌产品或发酵剂。

附图说明

图1为质粒构建过程；

图2为PCR验证和双酶切验证，其中，A为PCR验证，B为双酶切验证；

图3为电转入乳酸菌的转化子菌落PCR验证，其中，M为5000，1-3均为转化子；

图4为发酵后菌体对比；

图5为发酵液萃取后HPLC分析结果，其中，A为lycopene标准品，B为NZ9000重组菌株发酵萃取液；

图6为lycopene UPC²分析结果；

图7为不同乙酸浓度对番茄红素生产的影响；

图8为L.lactis NZ9000CRISPR-Cas9单质粒系统基因编辑工作原理；

图9为转化子菌落PCR验证，其中，M为5000，1为对照组，2-5均为转化子；

图10为△ldh对番茄红素生产的影响，其中，GZQ01为△ldh前产番茄红素重组菌株，GZQ02为△ldh后产番茄红素重组菌株；

图11为添加乙酸和△ldh后对番茄红素生产的影响；

图12为不同来源MVA途径基因过表达对番茄红素合成的影响，其中，GZQ03-GZQ09过表达基因来源于NZ9000，GZQ10-GZQ16过表达基因来源于S-3，GZQ017-GZQ23过表达基因来源于AR113；

图13为培养基优化对重组菌株GZQ12产番茄红素的影响，其中，A为葡萄糖添加量，B为胰蛋白胨添加量，C为酵母粉添加量；

图14为发酵温度对重组菌株GZQ12产番茄红素的影响；

图15为发酵时间对重组菌株GZQ12产番茄红素的影响；

图16为发酵初始pH对重组菌株GZQ12产番茄红素的影响；

图17为抗氧化测定结果，其中，A为DPPH清除能力，B为ABTS清除能力，C为·OH清除能力。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

以下各实施例中，所需培养基如下所示：

GM17培养基(1L)：胰蛋白胨5g，大豆蛋白胨5g，酵母浸出粉2.5g，牛肉浸出粉5g，乳糖20g，β-磷酸甘油二钠19g，MgSO_4.7 H₂O 0.58g，葡萄糖5g。

以下各实施例中，所需试剂如下所示：

番茄红素(HPLC≥90％，CAS#502-65-8)标准品，上海源叶生物有限公司；

氯霉素，生工生物工程(上海)股份有限公司；

二氯甲烷、丙酮为分析纯，甲醇为色谱纯，其他试剂均来自于国药集团；

质粒提取试剂盒，Axygen公司。

以下各实施例中，所需菌株如下所示：

嗜热链球菌S-3保藏信息如下：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)保藏编号为CGMCC No.12098，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年1月22日，在CN108220201A专利中公开过。

植物乳杆菌AR113保藏信息如下：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AR113保藏编号为CGMCC No.13909，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2017年03月22日，在CN111304134A专利中公开过。

乳酸乳球菌NZ9000来自市售。

以下各实施例中，所需质粒如下所示：

pACLYC质粒来源于文章Wang JF,Meng HL,Xiong ZQ,Zhang SL,WangY.Identification of novel knockout and up-regulated targets for improvingisoprenoid production in E.coli.Biotechnology letters,2014,36(5):1021-1027.

pNZ44质粒来源于文章McGrath S,Fitzgerald GF,van Sinderen D.Improvementand optimization of two engineered phage resistance mechanisms in Lactococcuslactis.Applied and environmental microbiology,2001,67(2):608-616.

pIB184质粒来源于文章Biswas I,Jha JK,Fromm N.Shuttle expressionplasmids for genetic studies in Streptococcus mutans.Microbiology(Reading),2008,154(Pt 8):2275-2282.

以下各实施例中，所需仪器如下所示：

超微量核酸蛋白定量仪Nanodrop 2000c，美国Thermo公司；

冷冻离心机，德国Sigma公司；

分光光度计DU-800型，美国Beckman公司；

生化培养箱，上海博迅实业有限公司；

MicroPulse电击转化仪，德国Bio-Rad公司；

Waters e2695高效液相色谱，沃特世科技有限公司(中国，上海)。

以下实施例中，核苷酸序列如下所示：

crtE异源酶基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.1所示：

crtB异源酶基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.2所示：

crtI异源酶基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.3所示：

pGZQ01质粒的核苷酸序列，序列如SEQ ID No.4所示：

乳酸脱氢酶基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID No.5所示：

嗜热链球菌3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID No.6所示：

来源于NZ9000的mvaS异源酶基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.7所示：

来源于NZ9000的mvaA异源酶基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.8所示：

来源于NZ9000的mvaD异源酶基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.9所示：

来源于NZ9000的mvaK1异源酶基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.10所示：

来源于NZ9000的mvaK2异源酶基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.11所示：

来源于NZ9000的idi异源酶基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.12所示：

来源于NZ9000的IspA异源酶基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.13所示：

来源于S-3的mvaS异源酶基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.14所示：

来源于S-3的mvaA异源酶基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.15所示：

来源于S-3的mvaD异源酶基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.16所示：

来源于S-3的mvaK1异源酶基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.17所示：

来源于S-3的mvaK2异源酶基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.18所示：

来源于S-3的idi异源酶基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.19所示：

来源于S-3的IspA异源酶基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.20所示：

来源于AR113的mvaS异源酶基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.21所示：

来源于AR113的mvaA异源酶基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.22所示：

来源于AR113的mvaD异源酶基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.23所示：

来源于AR113的mvaK1异源酶基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.24所示：

来源于AR113的mvaK2异源酶基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.25所示：

来源于AR113的idi异源酶基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.26所示：

来源于AR113的IspA异源酶基因的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO.27所示。

其余如无特别说明的原料或处理技术，则表明其均为本领域的常规市售产品或常规处理技术。

实施例

1重组乳酸乳球菌番茄红素合成途径构建

(1)重组质粒构建

以pACLYC质粒为模板，扩增出目的片段crtE和crtIB，将2个目的片段进行OverlapPCR扩增出片段crtEIB。然后将乳酸菌穿梭质粒pNZ44用限制性内切酶XbaI和SpeI酶切与crtEIB片段进行无缝克隆连接，得到重组质粒pGZQ01。

(2)重组乳酸菌验证

选取实验室保藏的乳酸乳球菌NZ9000，将重组质粒pGZQ01分别电转入乳酸乳球菌NZ9000(L.lactis NZ9000)感受态细胞中，随机挑选转化子利用引物pNZ44-YZ-F和pNZ44-YZ-R进行菌落PCR验证，验证正确后甘油保藏，得到重组乳酸乳球菌GZQ01。

(3)重组菌发酵和发酵产物萃取

将重组乳酸乳球菌GZQ01(NZ9000/pGZQ01)于30℃、200r/min发酵24h后，收集菌体用于提取番茄红素和测定产量，分别取两份等量发酵液，一份用于将发酵液稀释5倍后，用分光光度计测定OD₆₀₀，菌体总OD₆₀₀值为稀释倍数乘以稀释菌液OD₆₀₀读数。

番茄红素提取方法如下：用1mL丙酮进行番茄红素萃取，置于55℃水浴锅中萃取15min，其间每隔5min涡旋振荡20s，然后12000g离心10min取上清液获得番茄红素萃取液。

(4)发酵产物检测

番茄红素标准曲线制备：称取2mg番茄红素标准品，加入丙酮进行溶解，定容至10mL容量瓶，配制成200μg/mL母液，用丙酮进行倍比稀释并用0.22μm的微孔滤膜过滤到进样瓶中，用HPLC检测，以峰面积X对番茄红素浓度Y进行线性回归，回归方程为：Y＝0.0288X-0.0219，R²＝0.9998。

采用C18柱(4.6mm×150mm，Waters)检测步骤(3)中得到的番茄红素萃取液，HPLC条件为：柱温30℃；流动相：甲醇：二氯甲烷(75:25，v:v)；流速1.0mL/min；进样量10μL；DAD灯检测；检测波长为472nm。

(5)超高效合相色谱仪(UPC²)鉴定

将步骤(3)中得到的番茄红素萃取液用真空浓缩仪浓缩，直至有机液体完全挥发，用甲基叔丁基醚复溶过0.22μm有机膜后用Waters UPC²进行检测。

测定条件为：配备PDA检测器的ACQUITY UPC²系统和专用色谱柱

HSS C18SB Column 100A，1.8μm；流动相为20％甲醇和80％CO₂，流速1mL/min，柱温40℃，检测波长450nm，背压13.793MPa(2000psi)，进样量2μL。

实施例2代谢工程提高乳酸乳球菌异源合成番茄红素

2-1强化乙酰辅酶A供给

(1)重组乳酸乳球菌GZQ01添加不同浓度乙酸

从-80℃冰箱里将重组乳酸乳球菌GZQ01菌株取出，置于冰上融化，按3％接种量接于5mL ep管活化，接着将活化好的菌液按3％接种量接于转接至250mL锥形瓶(含50mL GM17培养基)中，30℃、200rpm/min摇瓶发酵12h，发酵初期加入浓度为0、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％和1％的乙酸共同发酵。

(2)敲除ldh后产番茄红素的重组NZ9000构建

基于CRISPR-Cas9技术在乳酸乳球菌NZ9000建立编辑系统实现敲除ldh基因，得到L.lactis NZ9000-△ldh菌株，制备L.lactis NZ9000-△ldh感受态，然后将pGZQ01质粒转入感受态中，在12.5kV/cm下进行电转，然后加入900μL复苏培养基，30℃培养箱静置2h。复苏后的菌悬液涂布带抗生素的GM17筛选平板，5000rpm离心5min收集细胞，吸取100μL复苏液涂布平板，30℃培养箱静置24～36h后，挑取单菌落进行PCR验证，验证正确即得重组乳酸乳球菌GZQ02(NZ9000-△ldh/pGZQ01)。

(3)重组乳酸乳球菌GZQ02添加0.2％乙酸

从-80℃冰箱里将重组乳酸乳球菌GZQ02菌株取出，置于冰上融化，按3％接种量接于5mL ep管活化，接着将活化好的菌液按3％接种量接于转接至250mL锥形瓶(含50mL GM17培养基)中，30℃、200rpm/min摇瓶发酵12h，发酵初期加入浓度为0.2％乙酸。

2-2强化MVA途径基因表达水平

(1)重组质粒构建

分别过表达来源乳酸乳球菌NZ9000、嗜热链球菌S-3和植物乳杆菌AR113的MVA途径基因，构建过表达来源于NZ9000的MVA途径基因质粒为例，以pIB184质粒作为表达载体，选择NZ9000菌液作模板，依次扩增出目的片段mvaS、mvaA、mvaD、mvaK1、mvaK2、idi和IspA，并用限制性内切酶BamHI&EcoRI酶切分别与目的片段进行无缝克隆连接，得到重组质粒pGZQ02-pGZQ08；

同样构建来源于S-3途径基因，得到重组质粒pGZQ09-pGZQ15；

同样构建来源于AR113的途径基因，得到重组质粒pGZQ16-pGZQ21。

(2)重组菌验证

将构建好的质粒转入重组乳酸乳球菌GZQ02(NZ9000-△ldh/pGZQ01)感受态中，在12.5kV/cm下进行电转，然后加入900μL复苏培养基(GM17培养基)，30℃培养箱静置2h。复苏后的菌悬液涂布带抗生素的GM17筛选平板。5000rpm离心5min收集细胞，吸取100μL复苏液涂布平板。30℃培养箱静置24～36h后，挑取单菌落进行PCR验证，验证正确即得GZQ03-GZQ23菌株。

(3)重组菌发酵和产量测定

参照实施例1中(3)和(4)的步骤。

实施例3优化发酵条件提高乳酸乳球菌异源合成番茄红素

(1)培养基对重组菌合成番茄红素产量影响

基于GM17培养基，选取葡萄糖、胰蛋白胨和酵母粉作为三因素，探究葡萄糖不同添加量(2.5、5、7.5和10g/L)、胰蛋白胨不同添加量(2.5、5、7.5和10g/L)和酵母粉不同添加量(0、2.5、5和7.5g/L)对番茄红素产量的影响，确定最佳条件，测定不同培养基发酵12h后菌体OD₆₀₀和番茄红素产量，测定方法参照实施例1中(3)和(4)的步骤。

(2)发酵温度对重组菌合成番茄红素产量影响

将活化好的重组菌株GZQ12以3％接种量接入实施例3步骤(1)中优化后GM17培养基发酵，分别置于20℃、25℃、30℃和37℃的恒温摇床中振荡培养，测定发酵12h后菌体OD₆₀₀和番茄红素产量，测定方法参照实施例1中(3)和(4)的步骤。

(3)发酵时间对重组菌合成番茄红素产量影响

将活化好的GZQ12以3％接种量接入实施例3步骤(1)中优化后GM17培养基发酵，置于30℃的恒温摇床中振荡培养，分别摇瓶发酵8h、12h、16h、20h和24h，测定发酵后菌体OD₆₀₀和番茄红素产量，测定方法参照实施例1中(3)和(4)的步骤。

(4)发酵pH对重组菌合成番茄红素产量影响

将活化好的GZQ12以3％接种量接入实施例3步骤(1)中优化后GM17培养基发酵，置于30℃的恒温摇床中振荡培养，将发酵培养基的初始pH值设定为5.0，5.5，6.0，7.0和8.0，测定发酵12h后菌体OD₆₀₀和番茄红素产量，测定方法参照实施例1中(3)和(4)的步骤。

实施例4重组乳酸乳球菌抗氧化活性测定

(1)制备样品

将活化好的对照NZ9000/pNZ44菌株、重组菌株GZQ12调整细胞密度OD₆₀₀＝1.0接种于优化后的GM17培养基，同时将重组菌株GZQ12调整细胞密度OD₆₀₀＝1.0接种于脱脂乳中，30℃、200r/min发酵24h后，5000r/min将发酵液离心10min，收集上清液。菌体用PBS洗涤2～3次，调整细胞密度OD₆₀₀＝1.0，即得细胞菌悬液，进行后续上清和细胞菌悬液的抗氧化活性测定。

(2)DPPH的清除能力测定

取中1mL样品，与2mL浓度为0.2mmol/L的DPPH-无水乙醇溶液混合于室温避光30min，517nm下测定吸光值。空白调零是用1mL蒸馏水和2mL无水乙醇混合，每组测定3个平行，计算公式如(1.1)：

清除率(％)＝【A₀-(A_X-A₁)】/A₀×100％ (1.1)

A_X：样品组吸光值；A₁：等体积的无水乙醇代替DPPH溶液的吸光值；A₀：以等体积无水乙醇代替样品的吸光值。

(3)ABTS自由基清除能力测定

配制7mmol/L的ABTS溶液和2.45mmol/L的K2S2O8溶液，取10mL K2S2O8溶液和10mLABTS溶液混合均匀混合于室温避光放置过夜12h以上，ABTS+自由基工作液是以乙醇稀释至734nm处吸光值为0.700±0.02。取200μL ABTS+自由基工作液和4mL待测液于试管中混合，置于30℃水浴避光反应6分钟，734nm下测定吸光值。清除率按下式(1.2)：

清除率(％)＝(A₀-Ax)/A₀×100％ (1.2)

A_X：样品组吸光值；A₀：以等体积无水乙醇代替样品的吸光值。

(4)·OH自由基清除能力测定

样品浓度同上，取3mL样品溶液与500μL 6mmol/L的FeSO4·7H2O溶液、500μL6mmol/L的乙醇-水杨酸溶液充分混匀，再加入500μL 6mmol/L的H2O2溶液，于37℃反应30min，在510nm下测定反应液的吸光度。清除率按下式(1.3)：

清除率(％)＝【A₀-(A_X-A₁)】/A₀×100％ (1.3)

A_X：样品组吸光值；A₁：以等体积的dd H₂O代替H₂O₂溶液的吸光值；A₀：空白吸光度值，以等体积的dd H₂O代替样品的吸光值。

实施例5结果

5-1重组乳酸菌异源合成番茄红素宿主筛选

乳酸菌以内源IPP和DMAPP合成FPP为前体，通过crtE、crtB和crtI三个异源酶连续催化合成番茄红素。结合KEGG代谢途径分析发现乳酸菌具有完整MVA途径，但缺乏crtE、crtB和crtI三个酶基因，所以不能合成番茄红素。pACLYC质粒携带这3个酶基因，本研究以该质粒为模板，引物pGZQ01-crtE-F、pGZQ01-crtE-R、pGZQ01-SD-crtIB-F、pGZQ01-SD-crtIB-R扩增出目的片段crtE和crtIB，通过琼脂糖凝胶电泳验证片段大小正确后，利用割胶回收试剂盒回收目的片段。然后将2个目的片段按照pmol比1:1进行Overlap PCR扩增出片段crtEIB。同样经过琼脂糖凝胶电泳验证片段大小正确后，用割胶回收试剂盒将目的片段回收。将乳酸菌穿梭质粒pNZ44用限制性内切酶XbaI和SpeI酶切，酶切产物回收与crtEIB片段进行无缝克隆连接，转至大肠杆菌感受态，氯霉素抗性平板筛选转化子(图1)

挑取转化子PCR验证，经琼脂糖凝胶电泳分析：在3000bp与5000bp之间存在扩增条带，并且与预期条带大小(3343bp)一致(图2A)，然后将单菌落接于4mL试管，37℃、200r/min振荡培养12h提取质粒，用限制性内切酶XbaI和SpeI酶切验证(图2B)

为验证pGZQ01成功转化至L.lactis NZ9000，随机挑选转化子利用引物pNZ44-YZ-F和pNZ44-YZ-R进行菌落PCR验证，均有条带且与理论值(3343bp)一致(图3)。实验结果表明，pGZQ01质粒成功转化至L.lactis NZ9000中。

虽然菌落PCR验证pGZQ01质粒已成功电转入L.lactis NZ9000(图3)，但将发酵液离心后观察菌体颜色，发现明显存在差异。我们可以看出对照菌株NZ9000/pNZ44离心后菌体是白色，而重组菌株GZQ01(NZ9000/pGZQ01)离心后菌体呈现粉红色，在图中表现为深色(图4)，猜测重组菌株GZQ01菌体颜色变化是由于合成番茄红素造成。

将萃取液通过高效液相色谱测定，可以看出番茄红素标准品在9min左右出现吸收峰(图5A)，重组菌GZQ01萃取液在同一时间和标准品有相同吸收峰(图5B)，该结果表明NZ9000异源合成番茄红素。结合标准曲线和HPLC分析，得出重组菌株GZQ01合成番茄红素产量为0.48mg/L。

以番茄红素标准品作为对照，对重组菌株GZQ01发酵萃取液进行超高效色谱仪(UPC²)检测。其中，A、B分别对应标准品和重组菌株GZQ01发酵萃取液，从质谱结果我们可以发现NZ9000发酵萃取液和标准品在同一出峰时间都出现明显吸收峰(图6A、B)，表明在质粒pGZQ01在NZ9000中成功表达，合成的物质即为番茄红素。

5-2添加乙酸后菌株特性研究

在微生物体内乙酸通过乙酰辅酶A合成酶能够催化生成乙酰辅酶A，而乙酰辅酶A作为番茄红素等萜类物质的合成前体，增加它的供给能够进一步提高番茄红素产量，具有广阔的研究前景。

添加乙酸后重组菌合成番茄红素产量相较于对照增加，其中0.2％添加量的产量最高，能达到0.73mg/L，比对照增加58.6％。随着添加量增加，菌体OD₆₀₀和番茄红素产量开始降低，尤其是乙酸添加量1％时，番茄红素产量和OD₆₀₀甚至比对照都低(图7)，表明适量乙酸确实可以增加番茄红素产量，但是添加量过高会不利于菌体生长和番茄红素积累。

5-3敲除ldh基因及重组菌株特性研究

乳酸乳球菌利用葡萄糖通过糖酵解途径代谢分解产生丙酮酸，可作为中间代谢产物用于合成番茄红素，也可进一步通过乳酸脱氢酶LDH合成乳酸，因此乳酸合成途径是番茄红素合成的竞争支路。为提高番茄红素合成，本实验通过敲除乳酸脱氢酶的基因ldh来阻断乳酸合成，减少丙酮酸的消耗。利用本实验室建立的乳酸乳球菌的单质粒pLL基因编辑CRISPR-Cas9系统，选取L.lactis NZ9000基因组中编码乳酸脱氢酶基因ldh(945bp)作为靶基因，设计sgRNA和同源臂，构建过程如下所述，以质粒pIB184为模板，P23-XbaI-up/down为引物，PCR扩增获得226bp含有启动子P23的片段；以pLL24为模板，以XbaI-up、XbaI-P23-down，repA-P23-up、repA-down为引物，分别PCR扩增616bp、1174bp的片段；再以获得的三个片段为模板，XbaI-up、repA-down为引物进行Overlap PCR扩增获得长度为1921bp的片段。该片段与以Xbal/Spel双酶切质粒pLL24后获得的载体骨架以无缝克隆的方式连接，利用引物XbaI-up、repA-down进行验证，获得的阳性转化子命名为pLL25。

pLL25以及对照质粒pCas9分别电转化至L.lactis NZ9000的感受态细胞中，每100μL感受态细胞中添加质粒1μg，全涂于GM17(Em10μg/mL)的固体培养基，30℃培养24～36h。敲除质粒转化后，利用引物Cldh-HA-YZ-F/R进行验证，通过菌落PCR验证转化子以及华大测序割胶回收后的片段，确定基因ldh的无缝敲除，得到的突变株命名为L.lactis NZ9000-△ldh(图8)。

将L.lactis NZ9000-△ldh菌株制备成感受态细胞，电转入质粒pGZQ01，涂布于Cm抗性平板，挑出长出的阳性克隆子，经PCR验证正确，经基因测序将获得正确的菌株命名为GZQ02(图9)。

通过HPLC测定△ldh后重组菌株GZQ02的番茄红素产量，敲除后重组菌株GZQ02生产番茄红素产量为0.92mg/L，相比敲除前提高1倍(图10，“*”表示在P<0.05时与对照组有差异；“**”表示在P<0.01时与对照组有差异；“***”表示在P<0.001时与对照组有差异)，表明ldh基因对番茄红素合成确实有影响，阻断LDH途径可以使代谢途径中丙酮酸更多流向乙酰辅酶A，提高它的供给，从而增加番茄红素产量。

添加乙酸和△ldh都能增加乙酰辅酶A的供给，提高重组L.lactis NZ9000菌株合成番茄红素的产量。对比两种方式产量差异，发现△ldh后重组菌株GZQ02产量更高，相比添加乙酸提高25.5％。为近一步提高产量，在重组菌株GZQ02发酵时添加0.2％乙酸，发现菌体OD₆₀₀和番茄红素产量都急剧下降，OD₆₀₀为0.99，番茄红素产量为0.35mg/L(图11)。

5-4过表达不同来源的MVA途径基因

MVA途径是乳酸乳球菌异源合成番茄红素的前体途径，包括mvaE、mvaS、mvaA、mvaK1、mvaK2、mvaD和idi在内的7个途径基因，强化途径基因表达可增加IPP和DMAPP积累，从而增加番茄红素产量。选取不同来源的MVA途径基因进行过表达，可以强化重组菌株合成番茄红素。

将获得的21株过表达基因后重组菌株摇瓶发酵后，用丙酮萃取色素，通过HPLC测定发酵萃取液中番茄红素产量。我们发现强化途径基因表达后重组菌株合成番茄红素产量大多数都有所提高。过表达MVA途径mvaA基因后，重组菌株(GZQ05，GZQ12，GZQ19)番茄红素产量相比过表达其他基因都高(图12C)，mvaA可能是MVA途径中的关键基因。其中，过表达来源于S-3的mvaA基因得到的重组菌株GZQ12合成番茄红素产量最高，达到1.22mg/L，相比对照(GZQ02)提高约30％。其它途径基因过表达后产量相近，过表达来源于S-3的mvaD基因后得到的重组菌株GZQ13合成番茄红素产量达到1.03mg/L，相比对照提高了12％(图12D)；过表达来源于AR113的mvaK1基因的重组菌株GZQ21和过表达NZ9000的idi基因的重组菌株GZQ09生产番茄红素产量相近，产量约达到1.01mg/L，相比对照(GZQ02)提高了10.8％(图12G)。

5-5培养基条件对番茄红素产量影响

微生物生长与代谢产物积累受到培养基显著影响，培养基优化能改善菌株生长和影响目标代谢物合成。葡萄糖作为GM17培养基的碳源，通过优化添加量可以改变重组菌株GZQ12异源合成番茄红素产量。当添加量从2.5g/L到10g/L时，菌体生长呈现先增后逐渐平缓的趋势，番茄红素产量也是同样，当添加量为7.5g/L时，产量最高，达到1.17mg/L(图13A)。改变不同胰蛋白胨添加，从2.5g/L到10g/L，当添加量为7.5g/L，OD₆₀₀为1.95，番茄红素产量最高，番茄红素产量为1.21mg/L(图13B)。改变不同酵母粉添加，从0g/L到7.5g/L，当添加量为5g/L，菌体OD₆₀₀和番茄红素产量都是最高，OD₆₀₀为2.19，番茄红素产量为1.24mg/L(图13C)。因此，优化后的GM17中葡萄糖添加量为7.5g/L，胰蛋白胨添加量为7.5g/L和酵母粉添加量为5g/L。

为确定重组菌株GZQ12合成番茄红素最佳培养温度，本实验研究不同温度下菌株的特性。在改变培养温度时番茄红素产量发生明显变化，当培养温度从20℃到30℃时，番茄红素产量是随之增加；当培养温度继续上升，从30℃升至37℃时，番茄红素的产量却出现反转，开始下降。当发酵温度为30℃时，菌体OD₆₀₀和番茄红素产量达到峰值，OD₆₀₀为1.53，产量为1.21mg/L(图14)，因此，重组菌株GZQ12合成番茄红素最佳培养温度为30℃。

随着发酵时间的增加，番茄红素的产量和菌体OD₆₀₀不断增加，在第12h时，产量和OD₆₀₀达到最高，当发酵时间继续延长，菌体浓度和产量却达到饱和，不再增加(图15)。说明发酵12h以后培养基中营养物质几乎所剩无几，抑制菌体生长和代谢，导致OD₆₀₀和番茄红素产量均不在增加。因此，重组菌株GZQ12合成番茄红素最佳发酵时间为12h，发酵结束时可以获得番茄红素产量为1.29mg/L，OD₆₀₀达到1.52。

番茄红素全反式双键结构，使其分子稳定性对pH变化也会变得敏感，因此在一定程度上培养基的酸碱度变化会导致番茄红素的异构化。在培养基初始pH为7.0时，发酵结束后合成的番茄红素产量最高。在其他pH条件下，番茄红素的产量均有不同程度降低，尤其是在培养基初始pH为5.0时，产量最低(图16)。对比初始pH在5.0和8.0时番茄红素的产量，可以看出番茄红素在酸性环境中更敏感，在酸性环境下番茄红素构型更加不稳定，外界环境不利于菌体生长，使得发酵终点的OD₆₀₀下降，导致番茄红素积累下降。因此，重组菌株GZQ12合成番茄红素最佳发酵pH为7.0，发酵结束时可以获得番茄红素产量为1.44mg/L，OD₆₀₀达到1.66。

5-6重组菌株抗氧化活性测定

选取L.lactis NZ9000/pNZ44菌株作为对照，将GZQ12分别接种于GM17培养基和脱脂乳中，测定他们的DPPH清除率。GZQ12的DPPH清除效率远高于对照菌株，在上清液中GZQ12清除能力为67.58％，L.lactis NZ9000/pNZ44清除能力仅为31.62％。在细胞菌悬液中GZQ12的清除率为62.12％，相比对照提高1倍以上；同时将GZQ12接种入脱脂乳中清除率也明显高于对照空质粒菌株，上清液中清除能力为63.72％，细胞菌悬液中清除能力达到59.04％(图17A)。

L.lactis NZ9000/pNZ44、GZQ12在GM17培养基发酵和GZQ12在脱脂乳中发酵后的上清液和细胞菌悬液对ABTS自由基清除能力，无论是上清液也还是细胞菌悬液，清除能力GZQ12大于对照菌株，GZQ12在脱脂乳发酵后得到的上清液和细胞菌悬液的清除力也高于对照菌株，ABTS自由基清除能力提高了54.5％(图17B)。L.lactis NZ9000/pNZ44、GZQ12在GM17中发酵和GZQ12在脱脂乳中发酵后上清液和细胞菌悬液对·OH自由基清除能力，上清液中对照菌株的清除率为41.69％，而GZQ12的清除率达到67.98％，将GZQ12接种于脱脂乳中发酵后上清液清除率液比对照明显更高，为60.29％；在细胞菌悬液中液得到相同结果，GZQ12明显高于对照菌株(图17C)。因此，以DPPH、ABTS和·OH三个指标评价重组菌GZQ12的抗氧化活性，与对照对比，重组菌的清除率都显著提高，表明GZQ12由于合成番茄红素使菌株具有更高的抗氧化活性。

表1.本研究中使用的菌株和质粒

表2.本研究中使用的引物序列

Claims

1.一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法，其特征在于，将crtE、crtB和crtI三个异源酶基因导入重组乳酸菌中，实现重组乳酸菌异源合成番茄红素，从而提高重组乳酸菌抗氧化活性；

所述crtE异源酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述crtB异源酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述crtI异源酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法，其特征在于，将pGZQ01质粒导入重组乳酸菌中，实现乳酸乳球菌异源合成番茄红素，从而提高乳酸乳球菌抗氧化活性，

3.根据权利要求1所述的一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法，其特征在于，所述重组乳酸菌来源于敲除乳酸脱氢酶基因的乳酸乳球菌，所述乳酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

4.根据权利要求3所述的一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法，其特征在于，所述乳酸乳球菌为NZ9000。

5.根据权利要求1所述的一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法，其特征在于，所述重组乳酸菌来源于敲除乳酸脱氢酶基因且过表达MVA途径基因的乳酸乳球菌。

6.根据权利要求5所述的一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法，其特征在于，所述MVA途径基因为乳酸乳球菌NZ9000、嗜热链球菌S-3或植物乳杆菌AR113中的MVA途径基因。

7.根据权利要求5所述的一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法，其特征在于，所述过表达MVA途径的基因为嗜热链球菌3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因，所述嗜热链球菌3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

8.根据权利要求1所述的一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法，其特征在于，将重组乳酸菌在培养基中培养，培养基中加入乙酸。

9.根据权利要求1所述的一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法，其特征在于，培养温度为30℃，pH为7.0，发酵时间为12h。

10.基于权利要求1-9中任一所述的方法得到的重组乳酸菌在制备益生菌产品或发酵剂中的应用，所述重组乳酸菌提高益生菌产品或发酵剂的抗氧化功能。