CN115927005B - 两面针内生真菌y118的固体发酵培养基及其制备和培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵技术领域，提供两面针内生真菌Y118的固体发酵培养基及其制备和培养方法，所述固体发酵培养基是由固体料和营养液组成；其中，固体料按重量百分比是由80～90％麦片，10～20％大米组成；所述营养液按重量百分比是由以下原料组成：麦芽糖2.0～3.0％，蛋白胨1.0～2.0％，KH2PO4 0.1～0.3％，MgSO4 0.10～0.20％，其余为水；pH：5.5～6.5，固体料和营养液之比为1g：1ml。本发明的固体发酵培养基具有原料广、成本低、制作简单、菌丝萌发率高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及两面针内生真菌Y118的固体发酵培养基及其制备和培养方法。
背景技术
过度过量滥用化学肥料、农药等，是危害人类健康以及破坏生态环境的首要因素之一。由于土壤侵蚀退化和盐分沉积、不良元素和重金属超标、营养供应体系不平衡等因素导致土壤的养分供应能力正在不断衰弱。微生物菌剂对于实现农业生产可持续化十分重要。微生物菌剂通过在土壤中固定、增溶或转化有益微生物对植物营养的吸收发挥了巨大作用，另外，微生物菌剂可以在长时间内保持土壤的可用能力，对土壤微生物群落活性产生积极影响。
植物内生菌是在寄主植物体内繁衍生息的，其生物代谢的生命过程中能产生大量功能不一的次生生物活性物质，有部分次生生物活性产物具备与农药化肥等相似的功效，这无疑是对植物生长发育有益的生物学影响，如对寄主植物体防治病虫害、杀灭病原微生物、溶磷固氮释钾促生作用等。植物内生菌作为新的生物刺激剂和下一代生物肥料的潜力已经为研究所证明。文献“抗人参根腐病生防菌剂的研发与评价[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(02):182-190.黄贻杰,董林林,尉广飞,等.”中公开了从三七中筛选了一株内生菌，以草炭为载体，研发出了安全有效的抗人参根腐病微生物菌剂，并且显著促进了人参幼苗的叶长和鲜重。文献“一种多功能化内生型巨大芽孢杆菌的菌肥对反季节鲜食玉米品质提升效果的研究[J].中国农学通报,2020,36(18):130-133.徐征,邱世明等.”中公开了对反季节鲜食玉米施加筛选研制的内生型巨大芽孢杆菌替代化学肥料，结果发现显著提高了鲜食玉米的品质。由于内生真菌对植物生长的积极意义，如果能研究相应的内生真菌培养基，对内生真菌扩大培养后用作微生物肥料，将对植物的生长和土壤的保护具有积极意义。
内生真菌Y118为本课题组自两面针原植物中分离获得，通过前期的实验发现其对寄主两面针组培苗有促进生长的作用。在固体发酵过程当中，培养基质作为微生物生长发育所需营养元素的来源对发酵结果起着决定性的作用。以内生真菌Y118为活菌制作的固体发酵培养基，筛选其适合的生长条件，制作Y118固体发酵培养基，可以实现环境友好，资源节约，绿色安全和低能耗，为菌苗共培养做实验基础。然而目前还没有关于内生真菌Y118固体发酵培养基的相关报道。
发明内容
本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供两面针内生真菌Y118的固体发酵培养基及其制备和培养方法，该固体发酵培养基具有原料广、成本低、制作简单、菌丝萌发率高等优点。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
两面针内生真菌Y118的固体发酵培养基，所述固体发酵培养基是由固体料和营养液组成；其中，固体料按重量百分比是由80～90％麦片，10～20％大米组成；所述营养液按重量百分比是由以下原料组成：麦芽糖2.0～3.0％，蛋白胨1.0～2.0％，KH2PO4 0.1～0.3％，MgSO4 0.10～0.20％，其余为水；pH：5.5～6.5，固体料和营养液之比为1g：1ml。
本发明中，优选地，所述固体料按重量百分比是由85％麦片，15％大米组成。
本发明中，优选地，所述营养液按重量百分比是由以下原料组成：麦芽糖2.5％，蛋白胨1.5％，KH2PO4 0.2％，MgSO4 0.15％，其余为水；pH：6.0。
本发明还提供上述两面针内生真菌Y118的固体发酵培养基的制备方法，包括以下步骤：
(1)按以下重量百分比称取固体料原料：80～90％麦片，10～20％大米；
(2)按以下重量百分比称取营养液原料：麦芽糖2.0～3.0％，蛋白胨1.0～2.0％，KH2PO4 0.1～0.3％，MgSO4 0.10～0.20％，其余为水；将营养液原料混合均匀并调节pH为5.5～6.5；
(3)将固体料原料和营养液原料按照固液比为1g：1ml混合，混匀后灭菌，即得所述固体发酵培养基。
本发明中，优选地，所述灭菌的条件为121℃，灭菌50min。
利用上述两面针内生真菌Y118的固体发酵培养基进行内生真菌Y118固体发酵的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)内生真菌Y118的菌种活化培养，用PDA培养基活化内生真菌Y118菌株，于28℃培养3～6天，选择白色、致密、无污染的菌丝体作为试验菌株；
(2)将所述试验菌株接种至固体发酵培养基中，进行固体发酵。
本发明中，优选地，所述PDA培养基的组成为：削皮马铃薯200g/L，葡萄糖和琼脂粉各20g/L，pH调节7.0。
本发明中，优选地，所述固体发酵的温度25℃，湿度为80％。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明中以80～90％麦片，10～20％大米为固体培养基载体，具有分散性好、透气性强，纤维含量高的特点，营养液中的氮源和碳源分别为蛋白胨和麦芽糖，本发明的培养基适合两面针内生真菌Y118的生长，具有满袋时间短、菌丝萌发率高等优点，可为科研工作者或企业提供更优质的培养基选择。
2、本发明的固体发酵培养基具有原料广、成本低、制作简单，可以规模化应用。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明研制的两面针内生真菌Y118的固体发酵培养基，是由固体料和营养液组成；其中，固体料按重量百分比是由80～90％麦片，10～20％大米组成；所述营养液按重量百分比是由以下原料组成：麦芽糖2.0～3.0％，蛋白胨1.0～2.0％，KH2PO4 0.1～0.3％，MgSO4 0.10～0.20％，其余为水；pH：5.5～6.5，固体料和营养液之比为1g：1ml。
本发明中所涉及的两面针内生真菌Y118已经保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为：CGMCC40326，保藏日期为2022年9月23日。
实施例1
1、两面针内生真菌Y118的固体发酵培养基的组成：
由固体料和营养液组成，固体料按重量百分比是由85％麦片，15％大米组成；营养液按重量百分比是由以下原料组成：麦芽糖2.5％，蛋白胨1.5％，KH2PO4 0.2％，MgSO40.15％，其余为水；pH：6.5，固体料和营养液之比为1g：1ml。
2、固体发酵培养基的制备：
(1)按以下重量百分比称取固体料原料：85％麦片，15％大米；
(2)按以下重量百分比称取营养液原料：麦芽糖2.5％，蛋白胨1.5％，KH2PO40.2％，MgSO4 0.15％，其余为水；将营养液原料混合均匀并调节pH为6.5；
(3)将固体料原料和营养液原料按照固液比为60g：60ml混合，混匀后在高压灭菌锅中于121℃，灭菌50min，即得固体发酵培养基。
3、两面针内生真菌Y118的固体发酵培养：
(1)内生真菌Y118的菌种活化培养，用PDA培养基活化内生真菌Y118菌株，于28℃培养3～6天，选择白色、致密、无污染的菌丝体作为试验菌株；PDA培养基的组成为：削皮马铃薯200g/L，葡萄糖和琼脂粉各20g/L，pH调节7.0；
(2)将所述试验菌株接种至固体发酵培养基中，采用菌种袋进行熟料袋栽方法，在温度为25℃，湿度为80％的条件下进行固体发酵。
实施例2
固体发酵培养基的制备流程和内生真菌Y118的固体发酵培养方法与实施例1相同。不同之处在于，两面针内生真菌Y118的固体发酵培养基的组成为：
由固体料和营养液组成，固体料按重量百分比是由80％麦片，20％大米组成；营养液按重量百分比是由以下原料组成：麦芽糖2.0％，蛋白胨1.0％，KH2PO4 0.1％，MgSO40.20％，其余为水；pH：5.5，固体料和营养液之比为1g：1ml。
实施例3
固体发酵培养基的制备流程和内生真菌Y118的固体发酵培养方法与实施例1相同。不同之处在于，两面针内生真菌Y118的固体发酵培养基的组成为：
由固体料和营养液组成，固体料按重量百分比是由90％麦片，10％大米组成；营养液按重量百分比是由以下原料组成：麦芽糖3.0％，蛋白胨2.0％，KH2PO4 0.3％，MgSO40.10％，其余为水；pH：6.0，固体料和营养液之比为1g：1ml。
本发明在进行固体发酵培养基筛选时做了大量试验，为了体现本发明的优越性，现将部分试验情况记录如下：
对比例1-12
固体发酵培养基的制备流程和内生真菌Y118的固体发酵培养方法与实施例1相同，内生真菌Y118的固体发酵培养时，采用相同的发酵袋，每个发酵袋各接入1块直径约1.5cm的菌饼。固体发酵培养基中营养液的组成与实施例1相同，固液比相同，不同之处在于固体料的组成，其固体料的具体组成如下表1：
表1对比例1-12中固体料的组成
对比例13-20
固体发酵培养基的制备流程和内生真菌Y118的固体发酵培养方法与实施例1相同，内生真菌Y118的固体发酵培养时，采用相同的发酵袋，每个发酵袋各接入1块直径约1.5cm的菌饼。固体发酵培养基中固体料的组成与实施例1相同，固液比相同，不同之处在于营养液中的氮源、碳源的种类和含量，其营养液的具体组成如下表2和表3：
表2对比例13-18中营养液的组成
表3对比例21-27中营养液的组成
按照上述实施例1-3和对比例1-28的固体发酵培养方法进行内生真菌Y118的培养，培养过程中，观察菌丝开始吃料时间、菌丝长势、长满袋的时间、内生菌消耗质量等，结果如下表4。
表4内生真菌Y118的生长情况
从表4的试验结果可知，采用本发明实施例1-3的固体发酵培养基，内生菌消耗质量大，满袋时间短于对比例组，说明本发明的固体发酵培养基更适合两面针内生真菌Y118的生长，菌丝萌发率高。以木屑作为固体基质生长状况较差的原因可能是单一木屑作为基质营养不足，由此可知，内生真菌Y118菌丝体的生长一方面和固体基质的营养成分有关系，另一方面与固体基质的可渗透性紧密联系。以玉米粉作固体基质，颗粒细密，通气功能较差，菌丝体生长受固体基质中氧气丰富程度的影响，因此菌丝玉米粉固体基质中生长状况较差。本试验筛选85％麦片，15％大米为固体培养基载体，具有分散性好、透气性强，纤维含量高的优点，因而更适合内生真菌Y118菌丝生长。而最适合内生真菌Y118生长需求的氮源和碳源分别为蛋白胨和麦芽糖，本发明所用的固体基质、氮源和碳源选择适宜，使得内生真菌Y118满袋时间短，消耗量大。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
Claims (8)
1.两面针内生真菌Y118的固体发酵培养基，其特征在于：所述两面针内生真菌Y118的分类命名为拟茎点霉（Phomopsis sp.），保藏编号为：CGMCC NO.40326；所述固体发酵培养基是由固体料和营养液组成；其中，固体料按重量百分比是由80～90%麦片，10～20%大米组成；所述营养液按重量百分比是由以下原料组成：麦芽糖2.0～3.0 %， 蛋白胨1.0～2.0 %，KH2PO4 0.1～0.3%，MgSO4 0.10～0.20 %，其余为水；pH：5.5～6.5，固体料和营养液之比为1g：1ml。
2.根据权利要求1所述的两面针内生真菌Y118的固体发酵培养基，其特征在于：所述固体料按重量百分比是由85%麦片，15%大米组成。
3.根据权利要求1所述的两面针内生真菌Y118的固体发酵培养基，其特征在于：所述营养液按重量百分比是由以下原料组成：麦芽糖2.5 %， 蛋白胨1.5 %，KH2PO4 0.2 %，MgSO40.15 %，其余为水；pH：6.0。
4.根据权利要求1所述的两面针内生真菌Y118的固体发酵培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）按以下重量百分比称取固体料原料：80～90%麦片，10～20%大米；
（2）按以下重量百分比称取营养液原料：麦芽糖2.0～3.0 %，蛋白胨1.0～2.0 %，KH2PO40.1～0.3%，MgSO4 0.10～0.20 %，其余为水；将营养液原料混合均匀并调节pH为5.5～6.5；
（3）将固体料原料和营养液原料按照固液比为1g：1ml混合，混匀后灭菌，即得所述固体发酵培养基。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述灭菌的条件为121 ℃，灭菌 50min。
6.利用权利要求1～3中任一项所述的两面针内生真菌Y118的固体发酵培养基进行内生真菌Y118固体发酵的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）内生真菌Y118的菌种活化培养，用 PDA培养基活化内生真菌Y118菌株，于28 ℃培养 3~6 天，选择白色、致密、无污染的菌丝体作为试验菌株；
（2）将所述试验菌株接种至固体发酵培养基中，进行固体发酵。
7.根据权利要求6所述固体发酵的方法，其特征在于：所述PDA培养基的组成为：削皮马铃薯200 g/L，葡萄糖和琼脂粉各20 g/L，pH 调节7.0。
8.根据权利要求6所述固体发酵的方法，其特征在于：所述固体发酵的温度25℃，湿度为80 %。
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