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CN115916814A - 细胞培养方法 - Google Patents

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CN115916814A
CN115916814A CN202180051162.6A CN202180051162A CN115916814A CN 115916814 A CN115916814 A CN 115916814A CN 202180051162 A CN202180051162 A CN 202180051162A CN 115916814 A CN115916814 A CN 115916814A
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B·本亚希亚
A·P·T·裴德诺伊尔
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UCB Biopharma SRL
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Abstract

本发明属于重组蛋白特别是诸如抗体的蛋白的制备领域。

Description

细胞培养方法
发明领域
本发明属于重组蛋白特别是诸如抗体的蛋白的制备领域。
发明背景
开发作为治疗性蛋白如治疗性抗体的重组蛋白需要以工业规模生产重组蛋白。为了实现此目的，可以采用不同的表达系统，原核生物系统和真核生物系统均可。然而过去二十年，大多数经批准的治疗性蛋白都通过哺乳动物细胞培养物制备，并且这类系统仍然是生产供人类使用的大量重组蛋白的优选表达系统。
已表明细胞培养条件，如培养基的组成(Kshirsagar R.等人,2012；US20130281355；WO2013158275)和生长条件，包括pH和温度(WO2011134919)，影响治疗性蛋白的产量和质量属性。在过去三十年中，大量的努力致力于建立细胞培养、培养基和重组蛋白表达的基本参数，其中研究重点致力于通过改变细胞培养基的组成(参见，例如HecklauC等人,2016；Zang L.等人,(2011))、操作条件以及开发大规模生物反应器来达到最佳细胞生长。
在给料培养基中以高浓度存在的一些组分在储存期间(在将所述培养基添加到生物反应器之前)易于沉淀，特别是所述培养基的pH为中性附近时。使用前这样的沉淀是不期望的，因为其实际上会影响培养基的确切组成(因为溶液/沉淀中组分的量是未知的)。WO2008013809涉及化学浓缩的给料培养基(10倍至100倍)，公开了盐通常在某个pH值(如，pH高于5.8)一起溶解时沉淀，或诸如叶酸的其他组分需要pH 8.6进行溶解。WO2008141207提供了稳定的给料培养基，其包含半胱氨酸、酪氨酸和任选胱氨酸，并且还包含丙酮酸盐作为以高浓度难以溶解的组分(如，酪氨酸或半胱氨酸)的稳定剂。WO2011133902提议用具有二至六个氨基酸的小肽(如，丙氨酰酪氨酸和/或丙氨酰半胱氨酸和/或丙氨酰胱氨酸二聚物)补充浓缩的给料培养基，以限制所述给料沉淀的风险。
然而，仍然需要提供进一步改良的给料培养基，其用于生产治疗性蛋白的细胞培养方法的情况下使用，同时对产量和蛋白异质性的影响最小。
发明概述
第一方面，本发明提供了用于培养表达重组蛋白的哺乳动物细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：在培养基中培养哺乳动物细胞，以及在生产阶段期间用至少一种给料培养基补充细胞培养物，其中所述至少一种给料培养基的pH为约5.0至约6.3。
第二方面，本发明提供了用于生产重组蛋白的方法，其中所述方法包括以下步骤：在培养基中培养表达所述重组蛋白的哺乳动物细胞，以及在生产阶段期间用至少一种给料培养基补充细胞培养物，其中所述至少一种给料培养基的pH为约5.0至约6.3。
第三方面，本发明提供了在给料培养基中减少或防止沉淀的方法，其中所述方法包括以下步骤：在培养基中培养表达重组蛋白的哺乳动物细胞，以及在生产阶段期间用至少一种给料培养基补充细胞培养物，其中所述至少一种给料培养基的pH为约5.0至约6.3。
第四方面，本发明涉及用于本文所述的任一种方法中的给料培养基，其中所述至少一种给料培养基的pH为约5.0至约6.3。
第五方面，本发明描述了由根据本发明的任一种方法生产的重组蛋白。在这些方面的任一方面的上下文中，给料培养基是主要给料培养基，例如浓缩的主要给料培养基。
定义
在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本文主题所属技术领域的技术人员通常理解的相同含义。如本文所使用，为了便于理解本发明，提供了以下定义。
如说明书和权利要求中所使用，在本文中用于诸如“A和/或B”的短语中的术语“和/或”，意在包括“A和B”、“A或B”、“A”和“B”。
如说明书和权利要求中所使用，术语“细胞培养”或“培养”意指在体外(即，生物体或组织外部)生长、繁殖和/或维持细胞。哺乳动物细胞的合适培养条件是本领域已知的，如Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies(2005)中所教导。哺乳动物细胞可悬浮培养或附着于固体基质时培养。
术语“细胞培养基”、“培养基”、“培养介质”及其任何复数形式，是指可培养任何类型的细胞的任何培养基。“基础培养基”是指包含对细胞新陈代谢有用的所有必需成分的细胞培养基。这包括例如，氨基酸、脂质、碳源、维生素和矿物盐类。DMEM(Dulbecco改良Eagles培养基)、RPMI(Roswell ParkMemorial Institute培养基)或培养基F12(Ham's F12培养基)是可商购获得的基础培养基的实例。其他合适的培养基描述于例如WO9808934和US20060148074(二者以其整体并入本文)。其他合适的可商购获得的培养基包括但不限于，AmpliCHO CD培养基、DynamisTM培养基、
Figure BDA0004085362020000031
 AdvancedTM CHO Fed-batchSystem、CD FortiCHOTM培养基、CP OptiCHOTM培养基、最低必需培养基(MEM)、
Figure BDA0004085362020000032
CHO Growth A培养基、ActiProTM培养基、DMEM-Dulbecco改良Eagle培养基、以及RPMI-1640培养基。可选择地，所述基础培养基可以是专有培养基，在此又被称为“化学限定的培养基”或“化学成分限定的培养基”，其中所有的组分可按照化学式来描述且以特定浓度存在。培养基优选不含蛋白且不含血清，并且可根据培养细胞的需要补充有任何额外的一种或多种化合物，如氨基酸、盐、糖、维生素、激素、生长因子。
术语“给料培养基/补料培养基”或“给料”(及其复数形式)是指培养期间加入以补充被消耗的营养物的培养基。给料培养基可以是可商购获得的给料培养基或专有给料培养基(在此可替换地被称为“限定的给料培养基”或“化学限定的培养基”)。合适的可商购获得的给料培养基包括但不限于Cell BoostTM补充物、EfficientFeedTM补充物、ExpiCHOTM给料。可选择地，所述给料培养基可以是专有给料培养基，其中所有的组分可按照化学式来描述且以特定浓度存在。与基础培养基相比，给料培养基通常是浓缩的，以便不会增加培养物的最终体积到较高的水平。这样的给料培养基可包含细胞培养基的大部分组分，为其在基础培养基中正常量的例如约1.5倍、2倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、14倍、16倍、20倍、30倍、50倍、100倍、200倍或甚至500倍。专有给料培养基通常为粉末。可商购的给料为液体或粉末。当给料已为液体形式时，根据说明书页就这样使用。粉末给料在使用前需要溶解于例如水中。预期将它们溶解于给定量的水中(如，1L水中100g，参见图1A)。然而，可进一步浓缩粉末给料。在这种情况下，将以比正常需要的量更少的液体将其溶解(如，1L水中200g，参见图1B)。根据标准方案制备的可商购的液体给料或粉末给料在本文中也称为“正常”给料。根据浓缩方法制备的可商购的液体给料或粉末给料在本文中称为“浓缩的给料”。
可在整个培养过程中添加不同组成的不同给料培养基。例如，在同一过程中可使用三种不同的给料培养基：一种给料培养基由碳源(如，葡萄糖)组成，一种给料培养基包含被消耗的大部分营养物(这种给料在本文中又被称为“主要给料”、“主要给料培养基”或“至少一种给料培养基”)，以及另一种给料培养基包含一些其他营养物用于例如当该营养物存在聚集/稳定问题时(如，例如半胱氨酸和/或胱氨酸和/或酪氨酸)。
术语“生物反应器”是指其中可培养细胞的任何系统。它包括但不限于烧瓶、静置烧瓶、旋转烧瓶、试管、摇管、摇瓶、wave培养袋、生物反应器、纤维生物反应器、带或不带微载体的搅拌槽生物反应器。可选择地，该术语还包括微量滴定板、毛细管或多孔板。可使用任何尺寸的生物反应器，例如从1毫升(1mL，极小规模)至20000升(20000L或20KL，极大规模)，如0.1mL、0.5mL、1mL、5mL、0.01L、0.1L、1L、2L、5L、10L、50L、100L、500L、1000L(1KL)、2000L(2KL)、5000L(5KL)、10000L(10KL)、15000L(15KL)、或20000L(20KL)。
术语“分批给料培养”是指生长细胞的方法，其中添加(注意，“添加”在本发明的上下文中还被称为“补充”)大块(或几大块)或连续给料培养基(或给料介质)以补充被消耗的营养物，而无需去除任何培养基。给料(一种或多种)可根据预定的时间表(如，每天、每两天一次、每三天一次等)添加。可选择地，给料是连续的话，给料速率在整个培养中可以改变。这种细胞培养技术具有获得大于10x106至30x106个细胞/ml的量级的高细胞密度的潜力，这取决于培养基配方、细胞系和其他细胞生长条件。双阶段培养条件可通过多种给料策略和培养基配方来建立和维持。
当使用本发明的方法和/或细胞培养技术时，在哺乳动物细胞中，重组蛋白通常直接分泌到培养基中。一旦所述蛋白分泌到培养基中，可先收获来自这类表达系统的上清液并澄清，以便开始分离目标蛋白并浓缩，然后纯化和配制该蛋白。
根据本发明的术语“生产阶段”包括制备重组蛋白的过程中细胞表达(即，产生)重组多肽(一种或多种)时的细胞培养阶段。生产阶段通常在期望的重组蛋白滴度增加时和/或细胞生长基本终止时开始，以及以在重组蛋白生产基本终止时收获细胞(或细胞培养液或上清液)结束。可将细胞维持在生产阶段，直至达到期望的细胞密度或期望的重组蛋白滴度。例如，可将细胞维持在随后的生产阶段，直至重组蛋白的滴度达到最大值。可选择地，可在该点之前收获培养物，这取决于技术人员的生产要求或细胞自身的需要。通常，生产阶段开始时，将细胞培养物从前期生产容器(N-1容器)中转移到生产容器(N容器)如生物反应器。在N-1容器中，细胞可根据本领域的任何技术培养，如灌注模式、分批模式或分批给料模式。收获是从生产容器中移出细胞培养流体期间的步骤，以在随后步骤中回收和纯化重组蛋白，如重组抗体。
如本文所用，“细胞浓度”(又被称为“细胞密度”)是指给定体积的培养基中细胞的数目。“活细胞浓度”(或“VCC”)是指给定体积的培养基中活细胞的数目。这通过标准活力测定来确定。
术语“活力”或“细胞活力”是指培养物中活细胞数目与总细胞数目之间的比率。虽然只要与培养开始相比不低于60％阈值的活力通常是可接受的，但是可接受的阈值可基于具体情况而确定。活力通常用于确定收获的时间。例如，在分批给料培养中，一旦活力达到60％或培养大约14天之后(通常14天+/-1天)可进行收获。
术语“滴度”是指溶液中目标重组蛋白的浓度。这通过标准滴定试验确定，如系列稀释连同检测方法(比色法、色谱法等)，利用CEDEX或蛋白A高压液相色谱法(HPLC)、Biacore
Figure BDA0004085362020000051
法或ForteBIO 
Figure BDA0004085362020000052
法，如实施例部分所使用的。
术语“更高的滴度”或“更高的生产率”及其等同物，意指与对照培养条件相比时滴度或生产率增加至少10％。如果与对照培养条件相比滴度或特定生产率在-10％至10％的范围内，则认为其被维持。术语“更低的滴度”或“更低的生产率”及其等同物意指与对照培养条件相比时滴度或生产率减少至少10％。
构成给料培养基的组分的沉淀(在本发明的上下文中又被称为给料的沉淀)可在制备或/和储存步骤之后发生。沉淀可目测评估为溶液中的小固体颗粒(在溶液中和/或作为颗粒沉积在容器底部)。所述评估完全在本领域技术人员的知识范围内。将术语“减少沉淀”理解为例如通过目测所评估的，与对照条件下观测的沉淀相比，给料培养基中沉积的沉淀物或/和沉淀物的减少。将术语“防止沉淀”理解为例如通过目测所评估的，给料培养基中没有沉积的沉淀物或/和沉淀物。
本文所使用的术语“异质性”是指由同一制备方法或同一制备批次内生产的分子群体中的单个分子(如，重组蛋白)之间的区别。异质性可能是由重组多肽的不完全或不均匀修饰造成的，例如由于多肽的翻译后修饰或由于转录或翻译期间的错误掺入。翻译后修饰可以是例如脱氨反应和/或氧化反应和/或小分子共价加成如糖化反应和/或异构化反应和/或片段化反应和/或其他反应的结果，并且还包括糖化模式的改变。这种异质性的化学物理表现导致所得到的重组多肽制备物中的各种特征，包括但不限于电荷变化谱、颜色或颜色强度和分子量谱。当测量重组蛋白的同等型时，除了主要电荷种类外，还测量酸性同等型(APG)和碱性同等型(BPG)。主要电荷种类代表期望获得的重组蛋白的同等型。
术语“重组蛋白”意指由重组技术产生的蛋白。重组技术完全在本领域技术人员的知识范围内(参见，例如Sambrook等人,1989及其更新版本)。术语“蛋白”可以是例如细胞因子、生长因子、激素、抗体或包含抗体的结构域或其他片段的融合蛋白。
本文所使用的术语“抗体”包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体和由本领域已知的重组技术产生的重组抗体。“抗体”包括任何物种的抗体，特别是哺乳动物物种；如，人抗体的任何同种型，包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgE、IgD，以及作为这种基本结构的二聚体产生的抗体，包括IgGA1、IgGA2、或五聚体如IgM及其修饰变体；非人灵长类动物抗体，如来自黑猩猩、狒狒、恒河猴或食蟹猴的抗体；啮齿类动物抗体，如来自小鼠或大鼠的抗体；兔、山羊或马抗体；骆驼科动物抗体(如，来自骆驼或美洲驼的抗体，如NanobodiesTM)及其衍生物；鸟类抗体，如鸡抗体；或鱼类抗体，如鲨鱼抗体。术语“抗体”也指“嵌合”抗体，其中至少一个重链和/或轻链抗体序列的第一部分来自第一物种，而重链和/或轻链抗体序列的第二部分来自第二物种。本文的目标嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，包含来源自非人灵长类动物(如，旧大陆猴，如狒狒、恒河猴或食蟹猴)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。“人源化”抗体是包含来源自非人抗体的序列的嵌合抗体。在很大程度上，人源化抗体是人抗体(接受体抗体)，其中来自接受体的高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔、鸡或非人灵长类动物的高变区[或互补决定区(CDR)]的残基替换，具有期望的特异性、亲和性和活性。在大多数情况下，在CDR之外(即在框架区(FR))中的人(接受体)抗体的残基另外被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含接受体抗体或供体抗体中不存在的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体特性。人源化降低了非人抗体在人中的免疫原性，从而促进抗体在治疗人类疾病中的应用。人源化抗体和产生它们的几种不同技术是本领域熟知的。术语“抗体”还指可作为人源化的替代物产生的人抗体。例如，可以产生转基因动物(如，小鼠)，其在免疫后能够在不产生内源性鼠抗体的情况下产生人抗体的完整储库。体外获得人抗体/抗体片段的其他方法基于展示技术，例如噬菌体展示或核糖体展示技术，其中使用重组DNA文库，其至少部分人工产生或来自供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库。用于产生人抗体的噬菌体和核糖体展示技术是本领域熟知的。人抗体也可由分离的人B细胞产生，所述分离的人B细胞用目标抗原离体免疫并随后融合产生杂交瘤，然后可筛选出最佳人抗体。术语“抗体”指糖基化和非糖基化抗体两者。此外，本文所用的术语“抗体”不仅指全长抗体，还指抗体片段特别是抗原结合片段。抗体片段包含至少一个本领域已知的重链或轻链免疫球蛋白结构域并结合一种或多种抗原。根据本发明的抗体片段的示例包括Fab、经修饰的Fab、Fab'、经修饰的Fab'、F(ab')2、Fv、Fab-Fv、Fab-dsFv、Fab-Fv-Fv、scFv和Bis-scFv片段。所述片段也可以是双抗体、三抗体、三链抗体(triabody)、四抗体、微型抗体、单结构域抗体(dAb)如sdAb、VL、VH、VHH或骆驼科抗体(如，来自骆驼或美洲驼的抗体如NanobodyTM)以及VNAR片段。根据本发明的抗原结合片段还可包含与一个或两个scFv或dsscFv连接的Fab，每个scFv或dsscFv结合相同或不同的靶标(如，一个scFv或dsscFv结合治疗性靶标，而一个scFv或dsscFv通过结合例如白蛋白增加半衰期)。这种抗体片段的示例是FabdsscFv(又被称为
Figure BDA0004085362020000071
)或Fab-(dsscFv)2(又被称为
Figure BDA0004085362020000072
参见例如WO2015197772)。如上定义的抗体片段是本领域已知的。
发明详述
通常，在生产过程开始之前制备水性给料溶液(将粉末溶解至液体中直到达到预期浓度；将pH调节至目标值；参见图1)，并且在添加到生产生物反应器中之前将其储存于容器(如，袋或给料罐)中。在袋或罐连接到生产生物反应器之前，储存可于低温(如，2-8℃)进行。从此时起，储存通常于室温进行。应理解，由于生产过程通常持续约14天，主要给料储存长达14天，如果在培养开始之前早就制备好则可能更长。通常通过目测观察来观测给料培养基在其容器中(如，在袋或罐中)的沉淀。
本发明大体上涉及在哺乳动物细胞中生产重组蛋白的方法。特别地，本发明基于发明人的发现，即通过降低在分批给料工艺的框架中要添加的主要给料的pH，可以避免或至少减少所述主要给料在整个培养过程中的沉淀，而不影响整个工艺性能(如，根据VCC或滴定度所评估的)。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于培养表达重组蛋白的哺乳动物细胞的方法，其中该方法包括以下步骤：在培养基中培养哺乳动物细胞，以及在生产阶段期间用至少一种给料培养基补充细胞培养物，其中该至少一种给料培养基的pH为约5.0至约6.3。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于生产重组蛋白的方法，其中该方法包括以下步骤：在培养基中培养表达所述重组蛋白的哺乳动物细胞，以及在生产阶段期间用至少一种给料培养基补充细胞培养物，其中该至少一种给料培养基的pH为约5.0至约6.3。
在又一个实施方案中，本文描述了用于减少或防止给料培养基中沉淀的方法，其中该方法包括以下步骤：在培养物中培养表达重组蛋白的哺乳动物细胞，以及在生产阶段期间用至少一种给料培养基补充细胞培养物，其中该至少一种给料培养基的pH为约5.0至约6.3。
在本发明的整体上下文中，用于生产重组蛋白、用于培养表达重组蛋白的哺乳动物细胞、或者用于减少或防止给料培养基中沉淀的方法包括以下主要步骤：
(i)在生物反应器(如，生产生物反应器)的培养基(如，基础培养基)中接种哺乳动物细胞，
(ii)推动培养物进行生产阶段，其中哺乳动物细胞产生重组蛋白，其中在所述生产阶段期间，用至少一种给料培养基补充细胞培养物，
其中所述至少一种给料培养基的pH限定在特定范围内。所述给料培养基优选为主要给料培养基，并且可以是浓缩的给料培养基(如，浓缩的主要给料培养基)。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于在本文所述任何方法中使用的给料培养基，其中所述至少一种给料培养基的pH为约5.0至约6.3。取决于用于生产重组蛋白、用于培养表达重组蛋白的哺乳动物细胞或用于减少或防止给料培养基中沉淀的整体策略，根据本发明的给料培养基(即，具有pH约5.0至约6.3)还可在生产阶段之前的阶段使用，例如在N-1阶段期间。在进一步的方面，本发明描述了由根据本发明的任何一种方法生产的重组蛋白。
在本发明的整体上下文中，开始培养时(步骤(i))的培养基优选为无蛋白无血清的培养基。所述无蛋白无血清培养基可以是可商购获得的或化学限定的培养基。
在本发明的整体上下文中，所述至少一种给料培养基(本文中也被称为主要给料培养基)优选为无蛋白无血清的给料培养基，并且包含全部或大部分必需组分。如果不包括在所述至少一种给料培养基中，碳源可经由不同给料带入。(至少一种)给料培养基可以是根据标准方案制备和使用(如图1A所公开)的“标准给料”，或者可以是浓缩的给料培养基(如，如图1B所公开的限定的浓缩的主要给料培养基，或可商购的浓缩的给料培养基)。可选择地，同样在本发明的整体上下文中，(至少一种)给料培养基(本文中也称为主要给料培养基)优选为无蛋白无血清的给料培养基，并且包含全部或大部分必需组分，但是不包含任何的游离氨基酸：半胱氨酸和/或胱氨酸(均被称为Cys)和酪氨酸(Tyr)，因为已知这些氨基酸难以溶解且在pH低于约8.0时稳定。碳源以及Cys和Tyr可经由不同给料带入，例如由碳源组成的一种给料和1)由Cys、Tyr组成的一种给料或2)分别由Cys和Tyr组成的两种不同给料。在本发明的整体上下文中，至少一种给料培养基可以是根据标准方案制备和使用(如图1A所公开)的“标准给料”，也可以是浓缩的给料培养基(如，如图1B所公开的限定的浓缩的主要给料培养基，或可商购获得的浓缩的给料培养基)。在另一种替代方案中，同样在本发明的整体上下文中，(至少一种)给料培养基(本文中又被称为主要给料培养基)优选为无蛋白和无血清的给料培养基，且包含全部或大部分必需组分，但不包含任何的游离氨基酸：半胱氨酸和/或胱氨酸(均被称为Cys)、色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)。碳源以及Cys、Tyr、Trp可经由不同给料带入，如由碳源组成的一种给料和1)由Cys、Tyr、Trp组成的一种给料，2)由选自Cys、Tyr、Trp中的任意两种氨基酸的组合组成的两种给料，第三种氨基酸在分开的给料中添加，或3)分别由Cys、Tyr和Trp组成的三种不同给料。在本发明的整体上下文中，至少一种给料培养基可以是根据标准方案制备和使用(如图1A所公开)的“标准给料”，也可以是浓缩的给料培养基(如，如图1B所公开的限定的浓缩的主要给料培养基或可商购获得的浓缩的给料培养基)。
在本发明的整体上下文中，(至少一种)给料培养基的pH为约5.0至约6.3，优选约5.2至约6.2。pH范围的下限可以例如选自以下中的任一个：5.20、5.25、5.30、5.35、5.40、5.45、5.50、5.55、5.60、5.65、5.70、5.75、5.80或5.85。pH范围的上限可以例如选自以下中的任一个：6.00、6.05、6.10、6.15或6.20。根据本发明的给料培养基的pH可以例如为5.20、5.25、5.30、5.35、5.40、5.45、5.50、5.55、5.60、5.65、5.70、5.75、5.80、5.85、5.90、5.95、6.00、6.05、6.10、6.15或6.20。
在本发明的整体上下文下，由于(至少一种)给料培养基的pH降低，可以避免或至少减少主要给料在整个培养过程中的沉淀，而不影响整体工艺性能。
在本发明的上下文中，生产阶段在生物反应器(如，生产生物反应器)中进行，优选体积等于或大于50L、等于或大于100L、等于或大于500L、等于或者大于1,000L、等于或大于2,000L、等于或大于5,000L、等于或大于10,000L或者等于或大于20,000L。换句话而言，生产重组蛋白的哺乳动物细胞在生物反应器(如，生产生物反应器)中培养，优选体积等于或大于50L、等于或大于100L、等于或大于500L、等于或大于1,000L、等于或大于2,000L、等于或大于5,000L、等于或大于10,000L、或者等于或大于20,000L。
在本发明的整体上下文中，合适的哺乳动物宿主细胞(又被称为哺乳动物细胞)包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)、淋巴细胞系如NSO骨髓瘤细胞和SP2细胞、COS细胞、骨髓瘤或杂交瘤细胞。在优选实施方案中，哺乳动物细胞是CHO。合适类型的CHO细胞可包括CHO和CHO-K1细胞，包括dhfr-CHO细胞，例如CHO-DG44细胞和CHO-DXB11细胞，其可与DHFR可选择标志物一起使用，或者可与谷氨酰胺合成酶可选择标志物一起使用的CHOK1-SV细胞。宿主细胞优选用编码目标重组蛋白的表达载体稳定转化或转染。
在本发明的整体上下文中，重组蛋白可以是细胞因子、生长因子、激素、融合蛋白(如，包含抗体的结构域或其他片段的蛋白)或抗体。当蛋白是抗体时，其优选是IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
本发明的方法任选地还包括从细胞培养基中回收重组蛋白的步骤(收获步骤)，优选在生产结束时。在收获之后，可纯化重组蛋白，例如如果蛋白是抗体，则使用蛋白A层析纯化。该方法还任选地包括配制纯化的重组蛋白的步骤，例如配制成具有高蛋白浓度的配制剂，例如浓度为10mg/ml或更高，例如50mg/ml或更高、例如100mg/ml或更高、例如150mg/ml或更高。无任何限制地，制剂可以是液体制剂、冻干制剂或喷雾干燥制剂。
附图简述
图1：A)由粉末制备“标准”给料。B)由粉末制备“浓缩的”给料
图2：表达mAb1的细胞的活细胞浓度分布图
图3：第13天和第14天时的mAb1滴度
图4：表达mAb1的细胞的活细胞浓度分布图
图5：生产mAb1的性能
图6：表达mAb2的细胞的活细胞浓度分布图
图7：第13天和第14天时的mAb2滴度
图8：表达mAb3的细胞的活细胞浓度分布图
图9：第14天时的mAb3滴度
图10：表达mAb4的细胞的活细胞浓度分布图
图11：第13天和第14天时的mAb4滴度
实施例
细胞系、细胞培养和实验规程
使用CHO-DG44细胞系。细胞在2L搅拌槽玻璃生物反应器(STR)或摇瓶中培养，该生物反应器(STR)具有由多发酵控制系统(MFCS，Sartorius Stedim Biotech)控制的供应塔(C-DCUII，Sartorius Stedim Biotech)。使用分别生产mAb1、mAb2、mAb3或mAb4的四种不同生产细胞系。mAb1和mAb3是pI分别为8.3-8.7和7.70-7.90的IgG4抗体。mAb2和mAb4是pI为8.7-9.2的
Figure BDA0004085362020000111
抗体。
反应器配备有三段式叶片叶轮。调整培养初始体积以确保培养结束体积是最佳的。将生产生物反应器以目标接种密度(TSD)接种在化学限定的基础培养基中。生产生物反应器的pH控制设置为7.0，死区为0.2(pH 7.0±0.2)。pO2目标设置为40-60％空气饱和度，并根据标准实践控制。温度控制在36.8℃，死区为0.2(36.8℃±0.2)。
将浓缩的主要给料用于实施例1至3和5。通过在液体中溶解该主要给料粉末直至达到所需浓度(与该粉末的标准方案相比浓缩约2倍)来制备该主要给料(水性)，并将pH调节至目标pH。实施例4中使用的非浓缩给料通过根据该粉末的标准方案(为了达到1倍浓度)通过溶解主要给料粉末来制备，并将pH调节至目标pH。在所有培养过程中，将装有主要给料的袋子保持于室温。接种后48小时，以预定速率开始连续营养物给料(使用浓缩的给料，被称为“主要给料”)。根据需要，即当葡萄糖浓度降至给定阈值之下(每天测量葡萄糖浓度)时，向培养物中添加葡萄糖块给料。由于主要给料不包含Cys、Tyr和Trp中的任何一种，因此分开添加这些氨基酸。
生产在给料实验模式下于室温操作14天。在此阶段期间，单克隆抗体(mAb)被分泌到培养基中。每天取样测定VCD、活力、离线pH、pCO2、渗透度、葡萄糖-乳酸盐浓度、氨基酸浓度和mAb浓度。在添加给料之前取样进行氨基酸分析。
分析方法
通过使用
Figure BDA0004085362020000121
XR(Beckman-Coulter,Inc.,Brea,CA)自动细胞计数设备对细胞进行计数，该设备基于台盼蓝排除法操作。使用Cedex Bio-HT(Roche)测定培养基中的葡萄糖和乳酸盐水平。使用2020型冰点渗透压仪(Advanced Instruments,Inc.,Norwood,MA)测定渗透度。使用BioProfile 
Figure BDA0004085362020000123
型血液气体分析仪(Nova BiomedicalCorporation，Waltham，MA)进行离线气体和pH测量。还使用CedexBioHT系统(Roche)每天测量代谢物浓度。使用CEDEX或蛋白A高压液相色谱法(HPLC)进行产物滴度分析，其使用分析前于-80℃储存的细胞培养上清液样品。在
Figure BDA0004085362020000124
 Xpress系统上用蛋白A纯化法纯化细胞培养物上清液样品。通过成像毛细管电泳(ProteinSimple iCE3)测定纯化的mAb的主要同等型的相对百分比。使用SAS软件JMP
Figure BDA0004085362020000122
进行统计分析。
实施例1—低给料pH减少给料沉淀同时保持生产阶段(N阶段)的细胞培养性能
对于该实验，2L生物反应器用产生mAb1的CHO细胞以3.75x106个细胞/mL的接种密度接种。两个生物反应器的接种物源自相同的N-1生物反应器。在本实验中，如上述实验规程中所述，测试了分批给料模式的三种条件。生物反应器ID 1、2和3具有相同的给料策略，除了用具有两种不同pH的主要给料进行给料：分别为6.5、6.0和5.5。
图2显示三种pH的主要给料的类似趋势。此外，如图3所报告的，主要给料的较低pH不会对mAb滴度产生负面影响。无论哪一天收获(第13天或第14天)，在任何测试条件(即，pH5.5、6.0和6.5)下生长的细胞都显示类似的mAb1滴度。
观测到对主要给料沉淀的显著影响。如表1所示，pH 6.5的主要给料出现沉淀，但具有较低pH(pH 6.0和5.5)的主要给料未出现沉淀。在N阶段结束时(主要给料瓶与生物反应器1/2/3断开后；未显示图片)进行了目测检查。pH 6.5观察到沉淀的主要给料溶液浑浊。相反，pH 6.0或更低的主要给料溶液观察到清澈/透明溶液。
表1：N阶段期间用于补充的主要给料瓶内的沉淀出现(是＝沉淀出现；否＝无沉淀出现)。
条件 主要给料pH 主要给料瓶中的沉淀
生物反应器ID 1 6.5 是
生物反应器ID 2 6.0 否
生物反应器ID 3 5.5 否
注意到当使用较低pH的主要给料时，培养物的pH几乎不受影响，并且保持在目标pH 7.0±0.2的目标范围内。
结论：实施例1显示所有条件之间对工艺性能无差异(如通过VCC和滴度测量所评估的)。结论是，在生产过程中用较低pH(相对于其标准pH，即pH 6.5)的主要给料补充培养物未影响工艺性能，并且能减少和/或避免主要给料补充期间和/或之后的沉淀。
实施例2—用低pH的主要给料补充大规模生产mAb1
对于本实验，用生产mAb1的CHO细胞接种2L和2000L生物反应器。2L生物反应器以3.75x106个细胞/mL的接种密度接种，而2000L生物反应器以3.40x106个细胞/mL的接种密度接种。每种生物反应器的接种物均来自三种不同的N-1生物反应器。根据上述实验规程，测试了不同规模的分批给料工艺的两种实验条件。生物反应器ID/4/5/6具有相同的给料策略，除了用具有两种不同pH的主要给料进行给料：分别为6.5和6.0(参见表2)。
表2：实施例2的实验条件
条件 主要给料pH 规模
生物反应器ID 4 6.0 2L
生物反应器ID 5 6.5 2L
生物反应器ID 6 6.0 2000L
细胞生长分布图如图4所示。生物反应器ID 4和5的细胞生长呈现类似的趋势。与小规模条件相比，生物反应器ID 6(大规模)显示稍好的细胞生长。进一步地，与其他条件相比，生物反应器ID 6显示更好的滴度(第13天和第14天)(参见图5)。结果证实，与2L规模得到的数据相比，大规模的方法导致更好的mAb1生产。此外，它们证实补充较低pH的主要给料对总体mAb1生产没有负面影响。根据实施例1，pH 6.5时观察到沉淀的主要给料溶液浑浊。相反，无论生产规模如何，对于pH6.0的主要给料溶液观察到澄清/透明溶液。
表3：主要给料瓶内的沉淀出现(第14天)
条件 主要给料瓶中的沉淀
生物反应器ID 4 否
生物反应器ID 5 是
生物反应器ID 6 否
结论：实施例2证实了实施例1的结果，并强调与其标准pH(即，pH6.5)相比，在小规模和大规模过程期间可将较低pH的主要给料添加到细胞培养物以生产抗体，对整体工艺性能没有负面影响。出乎意料地，与小规模得到的数据相比，大规模结果显示细胞生长和最终滴度的改善。
实施例3—补充低pH的主要给料来生产mAb2
对于本实验，用生产mAb2的CHO细胞以2.25x106个细胞/mL的接种密度接种2L和200L生物反应器。在本实验中，如上述实验程序所述，测试了不同规模的分批给料工艺的两种实验条件。生物反应器ID 7/8/9具有相同的给料策略，除了用具有两种不同pH的主要给料进行给料：分别为6.5和6.0(参见表4)。
表4：实施例3的实验条件
条件 主要给料pH 规模
生物反应器ID 7 6.5 2L
生物反应器ID 8 6.0 2L
生物反应器ID 9 6.0 200L
细胞生长分布图示于图6中。在第13天之前，两种生长条件和两种生长规模的细胞生长呈现相似的趋势。生物反应器ID 9还显示滴度与生物反应器ID 7和8的滴度相当(参见图7)。结果证实，无论规模如何，添加较低pH的主要给料对总体mAb2生产没有负面影响，同时具有至少减少浓缩主要给料的沉淀的优点。
结论：实施例3证实了实施例1和2的结果，并强调与其标准pH(即，pH 6.5)相比，在大规模过程期间可将较低pH的主要给料添加到细胞培养物中来生产抗体，对整体工艺性能没有负面影响，并且能降低和/或避免整体培养过程中主要给料的沉淀。
实施例4—补充低pH的非浓缩的主要给料来生产mAb3
对于本实验，用生产mAb3的CHO细胞以0.35x106个细胞/mL的接种密度接种2L生物反应器。在本实验中，如上述实验程序所述，测试了2L规模的分批给料工艺的两种实验条件。生物反应器ID 10/11根据相同的给料策略用非浓缩的主要给料进行给料，除了以两种不同pH：分别为6.5和5.5(参见表5)。
表5：实施例4的实验条件
条件 主要给料pH 规模
生物反应器ID 10 6.5 2L
生物反应器ID 11 5.5 2L
细胞生长分布图示于图8中。在第14天之前，两种生长条件的细胞生长呈现相似的趋势。生物反应器ID 10和11显示相当的滴度(第14天)(参见图9)。结果证实，添加较低pH的非浓缩的主要给料对总体mAb2生产没有负面影响。N阶段结束时(主要给料瓶与生物反应器10/11分离之后，未示出图)进行目测检查。pH 6.5时观察到沉淀的非浓缩的主要给料溶液浑浊。相反地，pH 5.5的非浓缩的主要给料观察到澄清/透明溶液。
表6：N阶段期间用于补充的主要给料瓶内的沉淀出现(是＝沉淀出现；否＝无沉淀出现)
条件 主要给料pH 主要给料瓶中的沉淀
生物反应器ID 10 6.5 是
生物反应器ID 11 5.5 否
结论：实施例4证实了实施例1、2、3的结果，并强调了与其标准pH(即，pH 6.5)相比，可将较低pH的主要给料添加到细胞培养物中来生产抗体，对整体工艺性能没有负面影响。实施例4强调了较低pH的非浓缩的给料能减少和/或避免总体培养过程中非浓缩的主要给料的沉淀。
实施例5—补充低pH的主要给料来生产mAb4
对于本实验，用生产mAb4的CHO细胞以7.5x106个细胞/mL的接种密度接种2L生物反应器。在本实验中，如上述实验程序所述，测试了2L规模的分批给料工艺的两种实验条件。生物反应器ID 12/13具有相同的给料策略，除了用具有两种不同pH的浓缩的主要给料进行给料：分别为6.0和5.5(参见表7)。
表7：实施例5的实验条件
条件 主要给料pH 规模
生物反应器ID 12 6.0 2L
生物反应器ID 13 5.5 2L
尽管与生物反应器ID 12相比，生物反应器ID 13显示稍低的细胞生长(参见图10)，但是它们显示相当的滴度(第14天)(参见图11)。结果证实，添加较低pH的主要给料对整体mAb4生产没有负面影响。N阶段结束时(主要给料瓶与生物反应器12/13分离之后；未示出图)进行目测检查。对pH 6.0和pH 5.5的主要给料溶液观察到澄清/透明溶液。
表8：N阶段期间用于补充的主要给料瓶内的沉淀出现(是＝沉淀出现；否＝无沉淀出现)
条件 主要给料pH 主要给料瓶中的沉淀
生物反应器ID 12 6.0 否
生物反应器ID 13 5.5 否
结论：实施例5证实实施例1、2、3和4的发现，并且强调了可将较低pH的主要给料添加到细胞培养物中生产抗体，对整体工艺性能没有不利影响。以0.5pH单位降低pH(即，主要给料pH 5.5与主要给料pH 6.0相比)似乎对细胞生长的影响最小。实施例5强调了在14天的细胞培养中补充低pH主要给料的可行性。
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Claims (14)

1.用于培养表达重组蛋白的哺乳动物细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：在培养基中培养所述哺乳动物细胞，以及在生产阶段期间用至少一种给料培养基补充细胞培养物，其中所述至少一种给料培养基的pH为约5.0至约6.3。
2.用于生产重组蛋白的方法，其中所述方法包括以下步骤：在培养基中培养表达所述重组蛋白的哺乳动物细胞，在生产阶段期间用至少一种给料培养基补充细胞培养物，其中所述至少一种给料培养基的pH为约5.0至约6.3。
3.用于减少或防止给料培养基中沉淀的方法，其中所述方法包括以下步骤：在培养基中培养表达重组蛋白的哺乳动物细胞，以及在生产阶段用至少一种给料培养基补充细胞培养物，其中所述至少一种给料培养基的pH为约5.0至约6.3。
4.用于根据权利要求1至3中任一项所述的方法中的给料培养基，其中所述至少一种给料培养基的pH为约5.0至约6.3。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法或者根据权利要求4所述的给料培养基，其中所述至少一种给料培养基是主要给料培养基，例如浓缩的主要给料培养基。
6.根据权利要求1至3和5中任一项所述的方法或者根据权利要求4或权利要求5所述的给料培养基，其中所述pH为约5.2至约6.2。
7.根据权利要求1至3、5或6中任一项所述的方法，其中所述方法为分批补料法。
8.根据权利要求1至3或5至7中任一项所述的方法或者根据权利要求4至6中任一项所述的给料培养基，其中所述给料培养基不包含游离氨基酸Cys和Tyr中的任何一种。
9.根据权利要求1至3或5至7中任一项所述的方法或者根据权利要求4至6中任一项所述的给料培养基，其中所述给料培养基不包含游离氨基酸Cys、Tyr和Trp中的任何一种。
10.根据权利要求1至3或5至9中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
11.根据权利要求1至3或5至10中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白为细胞因子、生长因子、激素、抗体或融合蛋白。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中所述抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
14.重组蛋白，其根据权利要求1至3或5至10中任一项所述的方法生产。
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