CN115896035B - 一种应用于病毒扩增的Vero细胞株、其构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种应用于病毒扩增的Vero细胞株、其构建方法及应用。所述Vero细胞株是通过将Vero细胞株基因组中STAT1和EMX2两个基因片段敲除后形成。与现有技术相比，本申请通过将Vero细胞株中的STAT1和EMX2中的两者敲除，使其在应用于猪流行性腹泻病毒等的扩增时，能够显著提高病毒的滴度，在病毒活疫苗和灭活疫苗制备中有广阔应用前景。
Description
技术领域
本申请涉及一种应用于病毒扩增的Vero细胞株，具体涉及一种应用于病毒扩增的Vero细胞株、其构建方法及应用，例如在病毒扩增，尤其是猪流行性腹泻病毒扩增中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
Vero细胞又称为绿猴肾细胞，是一种非整倍性的非洲绿猴(属名：Chlorocebus)肾细胞系，1962年日本千叶大学的安村美博分离正常成年非洲绿猴的肾脏上皮细胞并获得该细胞系。Vero细胞是连续的非整倍性细胞系，这意味着它的染色体数目异常，而作为连续细胞系，Vero细胞可以经过许多分裂周期而不老化。Vero细胞的干扰素分泌功能出现缺陷，与正常的哺乳动物细胞不同，它们在被病毒感染时不会分泌干扰素α/β。然而，它们仍然具有干扰素-α/β的受体，因此当将重组干扰素添加到其培养基中时，它们仍然可以作出反应。目前Vero细胞被广泛应用于病毒感染分子机制的研究、疫苗及重组蛋白的生产，并被看作是培养流感疫苗和研究病毒感染分子机制的理想细胞模型。
Vero细胞可以非常广泛的感染流感病毒，猪流行性腹泻病，还有猿猴空泡病毒、麻疹病毒、风疹病毒、节足动物携带性病毒及腺病毒等；后来被发现也容易感染细菌毒素，包括白喉毒素、不耐热肠毒素和志贺氏样毒素等。
猪流行性腹泻病毒(PEDV)属于冠状病毒中的alfa冠状病毒属。PEDV是引起猪腹泻的重要病原之一，各日龄猪均易感，又以哺乳仔猪危害最大。目前的防治手段以疫苗免疫为主，临床使用的主要为灭活疫苗与弱毒疫苗。灭活疫苗作为主要的疫苗之一，其对病毒的需求量较大。但是，现有技术中猪流行性腹泻病毒增殖滴度还不够高，成本较高。
猪流行性腹泻病毒可以在Vero细胞上进行复制。通过Vero细胞进行猪流行性腹泻病毒扩增，是生产猪流行性腹泻疫苗的主要方式。虽然Vero细胞中的干扰素表达具有问题对病毒侵染后的复制影响比较小，但是细胞内依然有多种基因对病毒复制有副作用。
发明内容
针对现有技术的不足，本申请的目的在于提供一种应用于病毒扩增的Vero细胞株、其构建方法及应用，该发明得到的细胞株提高了PEDV的增殖滴度，显著降低了成本。
为实现前述发明目的，本申请采用的技术方案包括：
本申请的一个方面提供了一种应用于病毒扩增的Vero细胞株，它是通过将Vero细胞株基因序列内STAT1和EMX2中的两个核苷酸片段敲除后形成。
在一个实施例中，所述应用于病毒扩增的Vero细胞株是通过将Vero细胞株基因序列内STAT1和EMX2两个核苷酸片段敲除后形成。
本申请的另一个方面提供了一种应用于病毒扩增的Vero细胞株的构建方法，其特征在于包括：通过扩增测序获取Vero细胞基因序列，并采用基因编辑技术对Vero细胞基因中的STAT1和EMX2中的一者或两者实施基因敲除，再经过克隆筛选纯化获得所述应用于病毒扩增的Vero细胞株。
较为优选的，可以将STAT1和EMX2共敲除后，再经过克隆筛选纯化获得所述应用于病毒扩增的Vero细胞株。
在一个实施例中，所述的构建方法具体包括：
(1)找到Vero细胞STAT1基因的靶点，设计对应的靶向sgRNA，包括sgRNA-STAT1-F和sgRNA-STAT1-R；
(2)PX459(pSpCas9(BB)-2A-Puro)V2.0载体用Bbs I内切酶酶切，然后与sgRNA-STAT1-F
和sgRNA-STAT1-R序列退火后形成的双链分子进行连接，得到敲除质粒PX459(pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA)V2.0；
(3)将所述敲除质粒PX459(pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA)V2.0转染入Vero细胞，嘌呤霉素加压筛选后，进行单克隆化，经过PCR验证得到STAT1应用于病毒扩增的Vero细胞株。
所述靶点的序列，针对Vero细胞基因中STAT1(SEQ ID NO：Nw_023666040.1)设计的基因敲除sgRNA的序列为：sgRNA-STAT1-F：caccgCGTAATCTTCAGGTATGACC和sgRNA-STAT1-R：aaacGGTCATACCTGAAGATTACGc。
(4)找到Vero细胞EMX2基因的靶点，设计对应的靶向sgRNA，包括sgRNA-EMX2-F和sgRNA-STAT2-R；
(5)PX459(pSpCas9(BB)-2A-Puro)V2.0载体用Bbs I内切酶酶切，然后与sgRNA-EMX2-F和sgRNA-EMX2-R序列退火后形成的双链分子进行连接，得到敲除质粒PX459(pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA)V2.0；
(6)将所述敲除质粒PX459(pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA)V2.0转染入已经敲除了STAT1基因的Vero细胞，嘌呤霉素加压筛选后，进行单克隆化，经过PCR验证得到应用于病毒扩增的Vero细胞株。
所述靶点的序列，针对Vero细胞基因中EMX2(SEQ ID NO：NW_023666048.1)设计的基因敲除sgRNA的序列为：sgRNA-EMX2-F：CACCGTAGGGGCGTCTACTCCAACC和sgRNA-EMX2-R：AAACGGTTGGAGTAGACGCCCCTAC。
在一个实施例中，所述基因编辑技术包括CRISPR/Cas9基因编辑技术。
在本发明中，所述生长液都是含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基，所述维持液是无血清V-LSM培养基。
相较于现有技术，本发明至少具有以下有益效果：
(1)基于CRISPR/Case9技术的STAT1和EMX2基因敲除方法设计了一段特异的sgRNA识别STAT1和EMX2基因，最终导致其表达异常，其中提供的Vero细胞STAT1和EMX2敲除方法具有很强的实用性。
(2)本发明的方法还可以用于其它基因的特异性敲除，具有高效、经济等优势。
(3)本发明对STAT1和EMX2基因的研究，为研发新型抗PEDV药物和探寻有效猪腹泻病防控方法提供重要依据。
(4)本发明通过Vero-STAT1-EMX2-KO细胞PEDV接毒实验，测定病毒滴度，确定STAT1和EMX2基因具有抑制PEDV复制的作用。
(5)本发明建立的STAT1和EMX2敲除的细胞系，提高了PEDV的增殖滴度，显著降低了成本，为探索PEDV高复制水平的细胞系提供依据，为进一步研究PEDV增殖具有重要作用，在PEDV疫苗生产中具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出了PX459(pSpCas9(BB)-2A-Puro)V2.0载体的结构，其中的BbsI酶切点位于245bp和267bp两处；
图2示出了分别采用野生型Vero细胞和Vero-STAT1-EMX2-KO细胞增殖PEDV，收取细胞上清进行病毒的滴度测定结果，其中横坐标为接毒后时间(hpi)，纵坐标为PEDV病毒滴度水平log(TCID50/ml)。
具体实施方式
以下通过实施例并结合附图进一步详细说明本申请的技术方案。然而，所选的实施例仅用于说明本申请，而不限制本申请的范围。实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1 Vero-STAT1-EMX2-KO细胞的构建
一、sgRNA设计与制备
根据GenBank中所登录的非洲绿猴基因组STATl基因序列(SEQ ID NO：NW_023666040.1)和EMX2基因序列(SEQ ID NO：NW_023666048.1)查找这两个基因的外显子序列。通过sgRNA设计网站(http：//crispr.mit.edu)对STAT1和EMX2基因靶点进行筛选。设计靶向该靶点的sgRNA序列，在5’端添加CACCG，得到sgRNA-STAT1-F和sgRNA-EMX2-F序列，在5’端添加AAAC，3’端添加C，得到sgRNA-STAT1-R和sgRNA-EMX2-R序列。
sgRNA-STAT1-F：CACCGCGTAATCTTCAGGTATGACC
sgRNA-STAT1-R：AAACGGTCATACCTGAAGATTACGC
sgRNA-EMX2-F：CACCGTAGGGGCGTCTACTCCAACC
sgRNA-EMX2-R：AAACGGTTGGAGTAGACGCCCCTAC
二、重组质粒构建
1、线性化载体
PX459(pSpCas9(BB)-2A-Puro)V2.0载体图谱如图1。将PX459(pSpCas9(BB)-2A-Puro)V2.0载体用Bbs I内切酶进行单酶切。酶切体系：限制性内切酶Bbs I 1μL，PX459(pSpCas9(BB)-2A-Puro)V2.0质粒1μg，10×NE Buffer 2uL，ddH2O补足体积至20μL。酶切的反应程序为：37℃酶切1h，65℃热处理30min进行酶切终止。酶切产物使用1％琼脂糖凝胶进行电泳，切取目的带进行胶回收试剂盒回收DNA。
2、sgRNA片段的退火
分别将sgRNA-STAT1-F片段和sgRNA-STAT1-R，sgRNA-EMX2-F和sgRNA-EMX2-R片段退火形成两端均具有粘性末端的sgRNA双链分子。退火体系：10×T4 PolynucleotideKinase(T4 PNK)Reaction Buffer 2μL、sgRNA-DBN1-F(100uM)1μL、sgRNA-DBN1-R(100uM)1μL，PNK酶1μL，ddH2O补足体积至10uL。在PCR仪中设置反应程序20℃30min，95℃5min后降温到25℃，降温速度为5℃min-1。
3、连接
将退火后形成的sgRNA双链分子与PX459(pSpCas9(BB)-2A-Puro)V2.0载体质粒的Bbs I单酶切产物进行连接。连接体系：稀释200倍的退火产物1μL，PX459(pSpCas9(BB)-2A-Puro)V2.0酶切产物1.5μL，T4 DNA Ligase Bufier 1μL，T4 DNA Ligase 0.5μL，总体系为10μL；将连接体系置于电子孵育器中在16℃过夜连接或者室温连接1.5h。
4、转化
将Trans5α化学感受态细胞从-80℃取出，立即插入冰中融化，刚化冻时，向其中加入连接产物，冰上孵育30min；取出放42℃水浴锅热激45s后，放回冰上静置2min，然后加入500uL LB培养基，置37℃、200rpm培养1h。分别吸取200uL、50uL、10uL培养液，加入含氨苄抗性的LB(100μg/mL氨苄霉素)培养皿上，用拐棒涂布均匀，37℃温箱培养12h。
5、筛选目的菌落
挑选单菌落进行测序鉴定，将鉴定正确的菌株进一步扩大培养，提取质粒送擎科生物公司测序。测序比对正确的重组质粒命名为PX459(pSpCas9(BB)-2A-Puro-STAT1sgRNA)V2.0和PX459(pSpCas9(BB)-2A-Puro-EMX 2sgRNA)V2.0。
三、靶向Vero细胞STAT1和EMX-2基因的敲除
Vero细胞培养于含有8％新生牛血清和1％双抗(青霉素、链霉素)的高糖DMEM完全培养基。将Vero细胞以1×106个/孔接种6孔板。当细胞汇合度达70％，用Lipofectamine3000试剂盒将重组质粒PX459(pSpCas9(BB)-2A-Puro-STAT1sgRNA)V2.0转染入Vero细胞。转染8h后，将培养基更换为含8ug/mL嘌呤霉素的培养基进行加压筛选。培养第三天更换一次，继续培养直到加压筛选的第6天，胰酶消化细胞，使用有限稀释法，稀释至10个细胞/mL，然后在96孔板中按照每孔100uL铺板。观察并标记单个细胞的孔，适时补液。当细胞长至汇合度为50％-70％，胰酶消化，进行原孔传代，之后逐渐进行96、24、12孔板的扩大培养。当细胞转入12孔板后，取部分细胞用PCR方法确定是否为敲除STAT1基因的单克隆细胞株。筛选出的细胞为Vero-STAT1-KO细胞。
Vero-STAT1-KO细胞培养于含有8％新生牛血清和1％双抗(青霉素、链霉素)的高糖DMEM完全培养基。将Vero细胞以1×106个/孔接种6孔板。当细胞汇合度达70％，用Lipofectamine3000试剂盒将重组质粒PX459(pSpCas9(BB)-2A-Puro-EMX2sgRNA)V2.0转染入Vero-STAT1-KO细胞。转染8h后，将培养基更换为含8ug/mL嘌呤霉素的培养基进行加压筛选。培养第三天更换一次，继续培养直到加压筛选的第6天，胰酶消化细胞，使用有限稀释法，稀释至10个细胞/mL，然后在96孔板中按照每孔100uL铺板。观察并标记单个细胞的孔，适时补液。当细胞长至汇合度为50％-70％，胰酶消化，进行原孔传代，之后逐渐进行96、24、12孔板的扩大培养。当细胞转入12孔板后，取部分细胞用PCR方法确定是否为敲除EMX2基因的单克隆细胞株。筛选出的细胞为Vero-STAT1-EMX2-KO细胞。
实施例2 Vero-STAT1-EMX2-KO细胞PEDV复制水平研究
获得Vero-STAT1-EMX2-KO细胞株后，为了研究该细胞对PEDV增殖的影响，对野生型Vero细胞和Vero-STAT1-EMX2-KO细胞进行接毒实验。T-25方瓶中，每瓶接种1*10E6个Vero细胞或Vero-STAT1-EMX2-KO细胞。培养48h，PBS清洗细胞，将PEDV以MOI＝0.1的剂量接毒，每瓶加入病毒和维持液(含有15ug/ml胰酶的VLSM)5ml，培养24h后收获培养上清，并进行病毒滴度log(TCID50/ml)检测。
TCID5o检测方法的具体操作步骤：Vero细胞进行96孔板的铺板，培养细胞正好长满单层。PBS洗3遍，将病毒培养物用维持液(含有15ug/mL胰酶的高糖DMEM完全培养基)稀释8个梯度(10-1-10-8)，每个梯度设置24个重复孔，按照每孔100ul加入至96孔板中，同时设置只加维持液的空白对照孔。置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，期间每天观察记录细胞病变情况，直到细胞不病变为止。统计病变细胞孔数，通过Reed-Muench两氏法计算病毒的TCID50，结果如图2所示。
应当理解，上述实施例仅为说明本申请的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本申请的内容并据以实施，并不能以此限制本申请的保护范围。凡根据本申请精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本申请的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种应用于病毒扩增的Vero细胞株，其特征在于：它是通过将Vero细胞株基因序列内STAT1和EMX2核苷酸片段敲除后形成。
2.根据权利要求1所述应用于病毒扩增的Vero细胞株在生产猪流行性腹泻病毒活疫苗或灭活疫苗中的用途。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2334850A1 (en) * | 1998-06-12 | 1999-12-16 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Novel methods and interferon deficient substrates for the propagation of viruses |
| US6468544B1 (en) * | 1998-06-12 | 2002-10-22 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Interferon inducing genetically engineered attenuated viruses |
| CN102827804A (zh) * | 2012-08-30 | 2012-12-19 | 苏州市沃美生物技术有限公司 | 适用于Vero细胞微载体悬浮放大培养的培养基及方法 |
| CN111373032A (zh) * | 2017-11-24 | 2020-07-03 | 渥太华医院研究所 | 用于增强干扰素敏感性病毒的生产、生长、扩散或溶瘤和免疫治疗功效的组合物和方法 |
| CN114058619A (zh) * | 2021-11-19 | 2022-02-18 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | Riplet敲除细胞系的构建及作为小核糖核酸病毒科病毒疫苗生产细胞系的应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090175826A1 (en) * | 2006-06-05 | 2009-07-09 | Elankumaran Subbiah | Genetically-engineered newcastle disease virus as an oncolytic agent, and methods of using same |
| US10883086B2 (en) * | 2015-07-06 | 2021-01-05 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Methods and compositions related to increased influenza virus production |
-
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2334850A1 (en) * | 1998-06-12 | 1999-12-16 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Novel methods and interferon deficient substrates for the propagation of viruses |
| CN1312725A (zh) * | 1998-06-12 | 2001-09-12 | 纽约城市大学辛乃山医科学校 | 用作疫苗和药剂的具有被改变的干扰素拮抗剂活性的减毒负链病毒 |
| US6468544B1 (en) * | 1998-06-12 | 2002-10-22 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Interferon inducing genetically engineered attenuated viruses |
| CN102827804A (zh) * | 2012-08-30 | 2012-12-19 | 苏州市沃美生物技术有限公司 | 适用于Vero细胞微载体悬浮放大培养的培养基及方法 |
| CN111373032A (zh) * | 2017-11-24 | 2020-07-03 | 渥太华医院研究所 | 用于增强干扰素敏感性病毒的生产、生长、扩散或溶瘤和免疫治疗功效的组合物和方法 |
| CN114058619A (zh) * | 2021-11-19 | 2022-02-18 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | Riplet敲除细胞系的构建及作为小核糖核酸病毒科病毒疫苗生产细胞系的应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Experimental methods to study the pathogenesis of human enteric RNA viruses;Aggarwal S等;《Viruses》;第13卷(第6期);975 * |
| Gene-edited vero cells as rotavirus vaccine substrates;Orr-Burks N等;《Vaccine X》;第3卷;摘要和第5-7页材料与方法 * |
| Perspectives for the optimization and utility of the rotavirus reverse genetics system;Ding S等;《Virus Research》;第303卷;198500 * |
| Porcine epidemic diarrhea virus infection inhibits interferon signaling by targeted degradation of STAT1;Guo L等;《Journal of Virology》;第90卷(第18期);第8281-8292页 * |
| 利用CRISPR/Cas9技术构建Ⅰ型干扰素受体基因敲除的Vero细胞系及其对PEDV增殖特性影响的研究;黎嘉豪;《中国优秀硕士学位论文全文数据库(电子期刊) 基础科学辑》(第2020年第8期);第A006-441页 * |
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