CN115894715B - 一种抗奶牛乳房炎主要致病菌的融合抗菌肽的制备 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗奶牛乳房炎主要致病菌的融合抗菌肽制备方法。通过对合成得到的多条抗菌肽的抑菌活性进行评价，筛选出抗菌效果最好的两条抗菌肽“RGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAG”和“LKRVWKRVFKLLKRYWRQLKKPVR”，将其通过Flexible Linker“GGGGS”连接得到融合抗菌肽。构建特异性表达载体，利用毕赤酵母X33表达融合抗菌肽AP‑14829并进行活性评估。本发明获得的融合抗菌肽AP‑14829对奶牛乳房炎的几种主要致病菌均有较强的抑制作用，且抑菌效果明显优于单一的抗菌肽。体外溶血性实验已证实AP‑14829对红细胞无明显伤害作用。通过酵母表达所得到的多肽相较于原核表达更加接近自然状态，因此活性更高，从而保证了多肽功能的正常行使。
Description
技术领域
本发明涉及一种融合抗菌肽、一种表达融合抗菌肽的酵母的制备。
背景技术
奶牛乳房炎(bovine mastitis)是一种由多种病原微生物引起的炎症性疾病，具有侵袭乳腺组织和长期感染的特点。分为浆液性乳房炎、纤维素性卡他乳房炎、化脓性乳房炎、出血性乳房炎、坏疽性乳房炎和隐性乳房炎。近年来我国乳业迅速发展,奶牛存栏、原料奶产量和乳制品产量成倍增长,乳制品消费稳步提高,乳制品进出口贸易总额不断增加。乳业的产业链长、产业关联度极高,乳业的健康发展对优化农村产业结构、增加农民收入、改善居民膳食结构、带动国民经济相关产业发展具有重要作用。作为奶牛业三大疫病之首，奶牛乳腺炎影响全球乳业，造成巨大的经济损失和动物健康下降。主要危害有产奶量明显减少、奶的品质严重下降使其保健作用大大降低、母牛繁殖能力下降，此外治疗该病还会产生高额的治疗费用，使母牛寿命大大缩短等，该病的存在严重制约着奶牛养殖业快速健康发展，已成为我国奶牛养殖业发展的瓶颈(YangNa,Zhang Qingjuan,Mao Ruoyu,Hao Ya,MaXuanxuan,Teng Da,Fan Huan,Wang Jianhua.Effect ofNZ2114 against Streptococcusdysgalactiae biofilms and its application in murine mastitis model[J].Frontiers in Microbiology,2022,13.)。
抗菌肽(AMPs)是一类广泛存在于生物体内的有抗菌能力的短肽，通常由15到30个氨基酸组成。是机体免疫系统的重要组成部分(Na Dong,Chensi Wang,Tingting Zhang,Lei Zhang,Chenyu Xue,Xinjun Feng,Chongpeng Bi,Anshan Shan.Bioactivity andBactericidal Mechanism of Histidine-Richβ-Hairpin PeptideAgainst Gram-Negative Bacteria[J].International Journal of Molecular Sciences,2019,20(16).)。20世纪80年代，瑞典科学家用蜡状芽孢杆菌诱导惜古比天蚕后发现了第一个抗菌肽——天蚕素(Steiner H,Hultmark D,A,Bennich H,Boman H G.Sequence andspecificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity.[J].Nature,1981,292(5820).)。抗菌肽的特点有：一、能够抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。二、分子量小，发挥作用和降解迅速，无残留。三、作用机制独特，对真核细胞无伤害，安全可靠(Exley Sarah E,Paslay Lea C,Sahukhal Gyan S,Abel BrooksA,Brown Tyler D,McCormick Charles L,Heinhorst Sabine,Koul Veena,Choudhary Veena,ElasriMohamed O,Morgan Sarah E.Antimicrobial Peptide Mimicking Primary Amine andGuanidine Containing Methacrylamide Copolymers Prepared by RaftPolymerization.[J].Biomacromolecules,2015,16(12).)。
因此，抗菌肽有望为解决日益严重的奶牛乳房炎提供有力帮助。目前抗菌肽越来越受到人们的关注，应用抗菌肽制剂治疗奶牛乳房炎已成为国内外研究的热点(PenGuihong,Yang Na,Teng Da,Mao Ruoyu,Hao Ya,Wang Jianhua.A Review on the Use ofAntimicrobial Peptides to Combat Porcine Viruses.[J].Antibiotics(Basel,Switzerland),2020,9(11).)。
发明内容
本发明提供一种转基因酵母，同时本发明提供的这种转基因酵母可高效表达能抑制奶牛乳房炎主要致病菌的融合抗菌肽，所提供的融合抗菌肽命名为AP-14829。
本发明提供的具有抑菌活性的融合抗菌肽，该具有抑菌活性的融合抗菌肽能够抗奶牛乳房炎的主要致病菌，命名为AP-14829，其特征在于：由两条抗菌肽“RGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAG”和“LKRVWKRVFKLLKRYWRQLKKPVR”通过FlexibleLinker“GGGGS”连接得到，所述得到的融合抗菌肽AP-14829的序列如下：RGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAGGGGGSLKRVWKRVFKLLKRYWRQLKKPVR。
本发明还提供了一种能够高效表达上述融合抗菌肽的转基因酵母的制备方法：选择上述融合抗菌肽的氨基酸序列设计其核苷酸序列，选用毕赤酵母偏好性密码子优化后，加入起始密码子ATG，将目的序列插入至pPICZαA载体多克隆位点的EcoRI和NotI之间，转入酵母细胞。
本发明的转基因酵母在防治奶牛乳房炎中的应用。
本发明所述的具有具有抗菌活性的融合抗菌肽的制备方法是用转基因酵母表达后从酵母细胞裂解物中分离获得。
本发明的具有抑菌活性的融合抗菌肽在奶牛乳房炎防治中的应用。
本发明提供了一种对奶牛乳房炎主要致病菌有明显抑制作用的融合抗菌肽。进一步，所述的融合抗菌肽是通过融合抗菌肽的氨基酸序列设计其核苷酸序列，选用毕赤酵母偏好性密码子优化后，加入起始密码子ATG，将目的序列插入至pPICZαA载体多克隆位点的EcoRI和NotI之间，转入酵母细胞，经酵母表达后在酵母细胞裂解物中分离获得。
作为融合抗菌肽，AP-14829能够抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。分子量小，发挥作用和降解迅速。同时酵母表达的过程中细胞对蛋白进行的各种修饰也是化学合成和原核表达所不具备的。经过真核表达所得到的多肽更加接近自然状态，因此活性更高，从而保证了多肽功能的正常行使。
附图说明
图1是融合抗菌肽的tricine SD-PAGE鉴定图。
图2是融合抗菌肽的抑菌圈图。
图3是融合抗菌肽的溶血活性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细叙述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
融合抗菌肽的制备步骤如下：
抗菌肽的筛选与融合：
1、抗菌肽的筛选
从抗菌肽数据库进行筛选出十二条抗菌肽，化学合成后经抑菌圈实验验证其活性，选择抑菌效果最好的两条抗菌肽“RGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAG”和“LKRVWKRVFKLLKRYWRQLKKPVR”通过Flexible Linker“GGGGS”连接得到融合抗菌肽，所得到的融合抗菌肽命名为AP-14829。
重组酵母表达载体的构建：
1、pPICZαA-AP-14829质粒载体的构建
根据杂合抗菌肽AP-14829的氨基酸序列设计其核苷酸序列，选用毕赤酵母偏好性密码子优化后，加入起始密码子ATG。将目的序列合成后连接至pPICZαA载体多克隆位点的EcoRI和NotI之间。
2、质粒转入酵母x33
将质粒pPICZαA-AP-14829线性化后电转入感受态的酵母X33。在Zeocin抗性的平板上涂布培养转入了质粒的酵母X33，待阳性转化子长出后挑取单菌落进行菌落PCR，选择已成功转入质粒的酵母进行扩大培养。
融合抗菌肽的表达与检测：
将上述得到的酵母置于液体培养基中28℃，220rpm培养96h，间隔时间取出1ml菌液保存于-80℃，并补充终浓度0.8％的甲醇，取样时间点：24h、48h、72h、96h。各个时间点取菌液8000rpm离心1min。将沉淀与等体积玻璃珠混合后加入100μL裂解缓冲液,剧烈震荡100s，使用液氮速冻，重复8次，8000rpm离心10min,取20μL上清液与等体积上样缓冲液混合后煮沸10min，进行Tricine-SDS-PAGE电泳。
融合抗菌肽的活性检测：
1、抑菌活性检测
将重组酵母细胞裂解后纯化分离得到融合抗菌肽AP-14829，用纯化后的抗菌肽对几种有害菌进行抑菌圈实验验证其抗菌活性。使用打孔法(每个孔的直径为7.8mm)，每个孔中加入150μL纯化后的蛋白(用纯化蛋白的洗脱缓冲液做阴性对照，用Zeocin做阳性对照)。测量每个抑菌圈的大小，每种菌重复三次。
2、溶血活性检测
采集1mL牛的血液于抗凝管中，2000rpm，离心5min，弃上清，收集红细胞；用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)PBS洗涤红细胞，重复3次，最后用10mL PBS重悬细胞，制成红细胞悬液。取100μL纯化后的多肽加于96孔板的每排1号孔中，并向其他各孔中加入50μLPBS缓冲液。将1号孔中的多肽溶液吸出50μL，依次加入邻近孔内，一直稀释至12号孔，最后孔取50μL弃去。阳性对照组每孔加入50μL 0.2％Tritonx-100和50μL红细胞悬液，阴性对照组加50μLPBS和50μL红细胞悬液。37℃孵育1h，用酶标仪测570nm波长处吸光值，试验重复3次，结果取平均值。代入公式计算溶血率:溶血率(％)＝(A样－A阴性)/(A阳性－A阴性)×100％。
Claims (3)
1.一种抗奶牛乳房炎主要致病菌的融合抗菌肽AP-14829，其特征在于：由两条抗菌肽“RGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAG”和“LKRVWKRVFKLLKRYWRQLKKPVR”通过FlexibleLinker“GGGGS”连接得到，所述融合抗菌肽AP-14829的序列如下：RGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAGGGGGSLKRVWKRVFKLLKRYWRQLKKPVR。
2.一种能高效表达权利要求1所述的融合抗菌肽的转基因酵母，其特征在于：选择权利要求1所述的抗奶牛乳房炎主要致病菌的融合抗菌肽AP-14829，根据该抗菌肽的氨基酸序列设计其核苷酸序列，选用毕赤酵母偏好性密码子优化后，加入起始密码子ATG，将上述目的序列插入至pPICZαA载体多克隆位点的EcoRI和NotI之间，将重组质粒转入酵母细胞。
3.根据权利要求1所述的抗奶牛乳房炎主要致病菌的融合抗菌肽AP-14829的制备方法，其特征在于：从权利要求2所得到的酵母细胞裂解物中分离获得。
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| The antimicrobial peptide SAAP-148 combats drug-resistant bacteria biofilms;Anna de et al;Sci. Transl. Med.;20181231;第10卷;3-4 * |
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