CN115873811B - 一种pbcv-1连接酶突变体、表达纯化方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种PBCV‑1连接酶突变体、表达纯化方法及应用，对野生型PBCV‑1连接酶的第43位苏氨酸、第84位苏氨酸、第178位苏氨酸、第222位苏氨酸、第283位半胱氨酸中的任一或多个氨基酸位点进行突变得到PBCV‑1连接酶突变体，PBCV‑1连接酶突变体通过表达纯化方法得到，能够实现对大片段DNA序列的有效环化。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种PBCV-1连接酶突变体、表达纯化方法及应用。
背景技术
PBCV-1连接酶是来源于小球藻病毒的一种DNA连接酶，能够催化DNA5’磷酸末端和3’羟基末端的连接。连接需要一条互补的核酸序列起到“夹板”的作用，使待连接的两端靠近。连接过程分为三个步骤：1)连接酶攻击ATP的α-磷酸释放PPi，形成共价连接酶-腺苷酸中间体；2)AMP转移到DNA的5’-磷酸末端形成DNA-腺苷酸；3)DNA的3’-OH攻击DNA-腺苷酸，释放AMP并封闭缺口。每个化学步骤都需要Mg2+。该酶可以应用于单链DNA的连接、基于探针法的miRNA的检测和SNP或剪接体的检测、二代测序和分子诊断等多个领域。另外，PBCV-1连接酶也能够用于单链DNA的环化反应，然而对于大片段DNA的环化效率低下，限制了其应用。野生型的PBCV-1连接酶通常对小片段的DNA序列有较好的环化效果，但是对于大于300bp的片段环化效率较差，因此如何提高大片段DNA的环化效率是急需解决的问题。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种PBCV-1连接酶突变体、表达纯化方法及应用，以解决大片段DNA的环化效率低的问题。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种PBCV-1连接酶突变体，对野生型PBCV-1连接酶的第43位苏氨酸、第84位苏氨酸、第178位苏氨酸、第222位苏氨酸、第283位半胱氨酸中的任一或多个氨基酸位点进行突变得到PBCV-1连接酶突变体，其中所述野生型PBCV-1连接酶的序列为：
MAITKPLLAATLENIEDVQFPCLATPKIDGIRSVKQTQMLSRTFKPIRNSVMNRLLTELLPEGSDGEISIEGATFQDTTSAVMTGHKMYNAKFSYYWFDYVTDDPLKKYIDRVEDMKNYITVHPHILEHAQVKIIPLIPVEINNITELLQYERDVLSKGFEGVMIRKPDGKYKFGRSTLKEGILLKMKQFKDAEATIISMTALFKNTNTKTKDNFGYSKRSTHKSGKVEEDVMGSIEVDYDGVVFSIGTGFDADQRRDFWQNKESYIGKMVKFKYFEMGSKDCPRFPVFIGIRHEEDR。
在本发明一个较佳实施例中，所述PBCV-1连接酶突变体包括第一PBCV-1连接酶突变体，所述第一PBCV-1连接酶突变体中的第43位苏氨酸、第222位苏氨酸突变为赖氨酸，所述第一PBCV-1连接酶突变体的序列为：
MAITKPLLAATLENIEDVQFPCLATPKIDGIRSVKQTQMLSRKFKPIRNSVMNRLLTELLPEGSDGEISIEGATFQDTTSAVMTGHKMYNAKFSYYWFDYVTDDPLKKYIDRVEDMKNYITVHPHILEHAQVKIIPLIPVEINNITELLQYERDVLSKGFEGVMIRKPDGKYKFGRSTLKEGILLKMKQFKDAEATIISMTALFKNTNTKTKDNFGYSKRSKHKSGKVEEDVMGSIEVDYDGVVFSIGTGFDADQRRDFWQNKESYIGKMVKFKYFEMGSKDCPRFPVFIGIRHEEDR。
在本发明一个较佳实施例中，所述PBCV-1连接酶突变体包括第二PBCV-1连接酶突变体，所述第二PBCV-1连接酶突变体中的第43位苏氨酸、第84位苏氨酸、第178位苏氨酸、第222位苏氨酸突变为赖氨酸，第283位半胱氨酸突变为赖氨酸，所述第二PBCV-1连接酶突变体的序列为
MAITKPLLAATLENIEDVQFPCLATPKIDGIRSVKQTQMLSRKFKPIRNSVMNRLLTELLPEGSDGEISIEGATFQDTTSAVMKGHKMYNAKFSYYWFDYVTDDPLKKYIDRVEDMKNYITVHPHILEHAQVKIIPLIPVEINNITELLQYERDVLSKGFEGVMIRKPDGKYKFGRSKLKEGILLKMKQFKDAEATIISMTALFKNTNTKTKDNFGYSKRSKHKSGKVEEDVMGSIEVDYDGVVFSIGTGFDADQRRDFWQNKESYIGKMVKFKYFEMGSKDKPRFPVFIGIRHEEDR。
提供一种PBCV-1连接酶突变体的表达纯化方法，包括步骤为：(1)基因合成及密码子优化并连接到PET系列质粒，获得PBCV-1连接酶突变体的表达载体；(2)PBCV-1连接酶突变体的表达载体在大肠杆菌中诱导表达；(3)诱导表达完成后，对目标蛋白进行分离纯化。
在本发明一个较佳实施例中，步骤(2)中在大肠杆菌中诱导表达条件为：大肠杆菌的培养温度为37℃，诱导温度为16℃、25℃、30℃或37℃，培养时间为20h、16h、12h或4h。
在本发明一个较佳实施例中，步骤(3)中对目标蛋白进行分离纯化包括步骤为收集菌体，重悬于缓冲液中得到菌体悬浮液，对菌体悬浮液超声破碎，采用亲和层析方法分离纯化。
在本发明一个较佳实施例中，所述缓冲液包括10～50mM的pH缓冲剂、10～100mM盐、0.5mM～2mM还原剂，pH为7.0～8.0。
在本发明一个较佳实施例中，采用亲和层析方法后再使用离子交换层析去除杂蛋白，最终透析实现分离纯化。
提供一种PBCV-1连接酶突变体，所述PBCV-1连接酶突变体在大片段DNA环化反应中的应用。
在本发明一个较佳实施例中，所述大片段DNA为大于300bp的DNA片段。
本发明的有益效果是：本发明的PBCV-1连接酶突变体、表达纯化方法及应用，通过对野生型PBCV-1连接酶进行氨基酸位点突变，得到能够对大片段DNA序列有效环化的突变体，结果表明对连接效率能提升2-3倍。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
图1是本发明的野生型PBCV－1连接酶及其突变体的SDS－PAGE图，其中1代表maker，2代表野生型PBCV-1连接酶，3代表第一PBCV-1连接酶突变体，4代表第二PBCV-1连接酶突变体。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：PBCV-1连接酶突变体的设计
为了提高PBCV-1连接酶对大片段DNA的环化效率，对野生型PBCV-1连接酶结构进行分析，对影响该酶活性的氨基酸位点第43位苏氨酸(T)、第84位苏氨酸(T)、第178位苏氨酸(T)、第222位苏氨酸(T)和第283位半胱氨酸(C)进行优化。
提供一种PBCV-1连接酶突变体，对野生型PBCV-1连接酶的第43位苏氨酸、第84位苏氨酸、第178位苏氨酸、第222位苏氨酸、第283位半胱氨酸中的任一或多个氨基酸位点进行突变得到PBCV-1连接酶突变体，其中所述野生型PBCV-1连接酶的序列为：
MAITKPLLAATLENIEDVQFPCLATPKIDGIRSVKQTQMLSRTFKPIRNSVMNRLLTELLPEGSDGEISIEGATFQDTTSAVMTGHKMYNAKFSYYWFDYVTDDPLKKYIDRVEDMKNYITVHPHILEHAQVKIIPLIPVEINNITELLQYERDVLSKGFEGVMIRKPDGKYKFGRSTLKEGILLKMKQFKDAEATIISMTALFKNTNTKTKDNFGYSKRSTHKSGKVEEDVMGSIEVDYDGVVFSIGTGFDADQRRDFWQNKESYIGKMVKFKYFEMGSKDCPRFPVFIGIRHEEDR。
为了提高酶与模板链的结合能力，同时保持二级结构不变，可将第43位苏氨酸、第84位苏氨酸、第178位苏氨酸、第222位苏氨酸突变为赖氨酸(K)，将第283位半胱氨酸突变为赖氨酸。
具体所述PBCV-1连接酶突变体可以为第一PBCV-1连接酶突变体，所述第一PBCV-1连接酶突变体中的第43位苏氨酸、第222位苏氨酸突变为赖氨酸，所述第一PBCV-1连接酶突变体的序列为：
MAITKPLLAATLENIEDVQFPCLATPKIDGIRSVKQTQMLSRKFKPIRNSVMNRLLTELLPEGSDGEISIEGATFQDTTSAVMTGHKMYNAKFSYYWFDYVTDDPLKKYIDRVEDMKNYITVHPHILEHAQVKIIPLIPVEINNITELLQYERDVLSKGFEGVMIRKPDGKYKFGRSTLKEGILLKMKQFKDAEATIISMTALFKNTNTKTKDNFGYSKRSKHKSGKVEEDVMGSIEVDYDGVVFSIGTGFDADQRRDFWQNKESYIGKMVKFKYFEMGSKDCPRFPVFIGIRHEEDR。
所述PBCV-1连接酶突变体可以为第二PBCV-1连接酶突变体，所述第二PBCV-1连接酶突变体中的第43位苏氨酸、第84位苏氨酸、第178位苏氨酸、第222位苏氨酸突变为赖氨酸，第283位半胱氨酸突变为赖氨酸，所述第二PBCV-1连接酶突变体的序列为
MAITKPLLAATLENIEDVQFPCLATPKIDGIRSVKQTQMLSRKFKPIRNSVMNRLLTELLPEGSDGEISIEGATFQDTTSAVMKGHKMYNAKFSYYWFDYVTDDPLKKYIDRVEDMKNYITVHPHILEHAQVKIIPLIPVEINNITELLQYERDVLSKGFEGVMIRKPDGKYKFGRSKLKEGILLKMKQFKDAEATIISMTALFKNTNTKTKDNFGYSKRSKHKSGKVEEDVMGSIEVDYDGVVFSIGTGFDADQRRDFWQNKESYIGKMVKFKYFEMGSKDKPRFPVFIGIRHEEDR。
实施例二：PBCV-1连接酶突变体的表达纯化
在PBCV-1连接酶突变体设计好后，基因合成(由南京擎科生物科技有限公司合成)及密码子优化并连接到PET-28a质粒，获得PBCV-1连接酶突变体的表达载体。
PBCV-1连接酶突变体的表达载体在大肠杆菌中诱导表达。分别取野生型PBCV-1连接酶及突变体的表达质粒5-10μL加进BL21(DE3)感受态，混匀后冰浴30min，42℃热激45-90s，冰浴1-2min。加900μLLB，37℃/220rpm/1h孵育，2000rpm/90s离心，留少许上清吹打混匀，涂布于含卡那抗性的LB平板，37℃倒置培养过夜。挑上述单克隆接入5mL LB，37℃/220rpm振荡至浑浊，将所有菌液接入500mL LB(Kan+)培养基，37℃/220rpm振荡至OD＝0.6-0.8，加入终浓度0.5M IPTG，16℃/120-140rpm过夜低温诱导。
诱导表达完成后，通过离心收集菌体，对目标蛋白进行分离纯化。将诱导后的菌液4℃/3500rpm/10min离心，收集菌体。使用缓冲液重悬菌体，缓冲液的pH为7.0～8.0，含有10～50mM Na2HPO4作为pH缓冲剂，含有10～100mM NaCl作为盐。裂解和纯化所用缓冲液含有0.5mM～2mM还原剂，可以防止酶内部错误二硫键折叠。缓冲液使用无核酸酶水进行配制，并进行过滤和高温高压灭菌处理。具体可以是重悬于50mL缓冲液(20mM Na2HPO4，20mM NaCl，5％甘油，pH为7.0)，使用超声方式裂解破碎，4℃/9000rpm/30min离心，收集上清。
使用亲和层析方法获得较高纯度的PBCV-1连接酶。更进一步的，使用离子交换层析去除更多的杂蛋白，使蛋白纯度达到90％以上。蛋白最终透析至储存缓冲液。具体是上清上样于His重力柱，使用洗脱缓冲液(100mM咪唑，20mM Na2HPO4，20mM NaCl，5％甘油，PH7.0)洗脱目的蛋白。然后使用阳离子交换进一步纯化，用低盐Buffer A(20mM Na2HPO4，20mMNaCl，5％甘油，PH 7.0)将亲和层析所得蛋白稀释5倍，上样于经低盐Buffer A平衡的阳离子交换柱，用高盐Buffer B(20mM Na2HPO4，1M NaCl，5％甘油，PH 7.0)进行线性洗脱，根据洗脱峰收集蛋白，SDS-PAGE电泳鉴定，所获目的蛋白用透析Buffer C(20mM Na2HPO4，100mMNaCl，1mM DTT，0.5mM EDTA，50％甘油，pH 7.0)过夜透析，收集，-20℃保存。
所得蛋白结果如图1所示，野生型PBCV-1连接酶和各突变体均能良好可溶表达。
实施例三：PBCV-1连接酶突变体环化效率检测
以550bp+84bp的DNA片段为模板进行测试，其序列如下所示：
模板投入量为0.5～1pmol，优选1pmol。向反应体系中加入环化所需的‘夹板’序列oligo(Oligo的序列为GCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGG)、PBCV-1连接酶、反应buffer进行环化，然后使用磁珠法纯化产物，使用Qubit进行定量，最后计算环化效率。
对野生型PBCV-1及突变得到两个突变体第一PBCV-1连接酶突变体和第二PBCV-1连接酶突变体，对比三种酶对550bp+84bp DNA片段的环化效率。分别使用三种酶进行如下的环化反应：
(1)变性
按下表配制反应体系，混匀后，短暂离心。98℃，5min；立即置于冰上冷却5min。
反应体系为：
(2)连接
按下表配制反应体系，混匀后，短暂离心。25℃，15min；4℃保存。
反应体系为：
(3)消化
按下表配制反应体系，混匀后，短暂离心。37℃，30min；4℃保存。
(4)测浓度
使用Thermo公司的QubitTM ssDNA Assay Kit和e QubitTM Flex Fluorometer设备测产物浓度。
(5)计算环化效率：
连接效率＝产物浓度*产物体积/总的投入量(500ng)*100％。
结果如下：
结果显示：对550bp+84bp DNA片段的连接效率第一PBCV-1连接酶突变体为10.8％和第二PBCV-1连接酶突变体为7.4％，与野生型PBCV-1的3.3％相比，提高了2-3倍。两个突变体第一PBCV-1连接酶突变体和第二PBCV-1连接酶突变体对DNA片段的环化效率相比野生型明显提高。其中第一PBCV-1连接酶突变体环化效率更高。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (7)
1.一种PBCV-1连接酶突变体，其特征在于，所述PBCV-1连接酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的PBCV-1连接酶突变体的表达纯化方法，其特征在于，包括步骤为：(1)基因合成及密码子优化并连接到PET系列质粒，获得PBCV-1连接酶突变体的表达载体；(2)PBCV-1连接酶突变体的表达载体在大肠杆菌中诱导表达；(3)诱导表达完成后，对目标蛋白进行分离纯化。
3.根据权利要求2所述的表达纯化方法，其特征在于，步骤(2)中在大肠杆菌中诱导表达条件为：大肠杆菌的培养温度为37℃，诱导温度为16℃、25℃、30℃或37℃，培养时间为20h、16h、12h或4h。
4.根据权利要求2所述的表达纯化方法，其特征在于，步骤(3)中对目标蛋白进行分离纯化包括步骤为收集菌体，重悬于缓冲液中得到菌体悬浮液，对菌体悬浮液超声破碎，采用亲和层析方法分离纯化。
5.根据权利要求4所述的表达纯化方法，其特征在于，所述缓冲液包括10～50mM的pH缓冲剂、10～100mM盐、0.5mM～2mM还原剂，pH为7.0～8.0。
6.根据权利要求2所述的表达纯化方法，其特征在于，采用亲和层析方法后再使用离子交换层析去除杂蛋白，最终透析实现分离纯化。
7.权利要求1所述的PBCV-1连接酶突变体在大片段DNA环化反应中的应用，其特征在于，所述大片段DNA为大于300bp的DNA片段。
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