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CN115873127A - 重组长效人生长激素融合蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

重组长效人生长激素融合蛋白及其制备方法和用途 Download PDF

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CN115873127A
CN115873127A CN202210395423.2A CN202210395423A CN115873127A CN 115873127 A CN115873127 A CN 115873127A CN 202210395423 A CN202210395423 A CN 202210395423A CN 115873127 A CN115873127 A CN 115873127A
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ser
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CN202210395423.2A
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秦锁富
李娟�
周冬梅
游琼英
张伟
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Shenzhen Kexing Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Kexing Pharmaceutical Co ltd
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Abstract

本发明涉及一种Fc突变体、融合蛋白、核酸分子、表达载体、重组细胞、药物组合物及其用途。Fc突变体具有如SEQ ID NO:3～7任一项所示的氨基酸序列；融合蛋白包含：第二肽段，第二肽段为生物活性分子功能区，第三肽段，第三肽段包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或前述的Fc突变体，第二肽段与第三肽段相连。本发明的Fc突变体为单体形式，融合蛋白具有更高的体内外活性和更低的ADCC、CDC效应，可有效治疗生长激素缺乏症。

Description

重组长效人生长激素融合蛋白及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及分子生物学及药物领域，具体地，本发明涉及一种重组长效人生长激素融合蛋白及其制备方法和用途，更具体地，本发明涉及一种Fc突变体、融合蛋白、核酸分子、表达载体、重组细胞、药物组合物及其用途。
背景技术
生长激素缺乏症是一种公认的临床综合征，与许多代谢异常相关，包括身体成分异常、体能下降、脂质代谢改变、骨量减少、胰岛素抵抗增加和生活质量降低。大多数与生长激素缺乏症相关的代谢异常可通过重组人生长激素(rhGH)替代物逆转。传统的生长激素缺乏症治疗包括每天皮下注射rhGH，但是，该治疗方法较为繁琐，需每天进行注射，对许多患者来说并不方便，这引起了对治疗依从性差的担忧，这可能导致疗效降低。长效rhGH制剂或长效生长激素制剂不仅可以减少注射次数，提高依从性，还有助于提高GH治疗的疗效。
因此，仍亟需开发一种新的有效治疗生长激素缺乏症的融合蛋白。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种Fc突变体、融合蛋白、核酸分子、表达载体、重组细胞、药物组合物及其用途。本发明的Fc突变体易形成单体形式。本发明的融合蛋白稳定性强，可有效治疗生长激素缺乏症。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
发明人通过实验发现，对野生型IgG1的Fc片段的特定位点进行突变，例如，P228Delete、C229Delete、P230 Delete、T366R、L368H、P395K和K409D/K409T、以及L351S、M428Y和K447A中的至少之一，或者P228 Delete、C229 Delete、T366R、L368H、P395K和K409D或K409T，可使天然二聚体形式的Fc片段表达出来后形成单体形式的Fc突变体。并且，经过实验进一步发现，采用上述Fc突变体与生长激素连接可形成单体形式的融合蛋白，可以通过ProteinA纯化，简化纯化工艺，后续纯化工艺简单。同时，更为重要的是，该融合蛋白获得了更强的人生长激素受体结合活性、促进细胞增值活性和促进报告基因细胞表达荧光素酶活性，以及具有更长的半衰期和更好的体内生物学活性。
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种Fc突变体。根据本发明的实施例，包括：第一肽段，所述第一肽段相较于野生型IgG1的Fc片段，具有如下位点的突变：第228位、第229位、第230位、第366位、第368位、第395位和第409位，以及第351位、第428位和第447位中的至少之一；或第228位、第229位、第366位、第368位、第395位和第409位。发明人经过大量实验发现，上述突变有利于使天然二聚体形式的Fc片段表达出来后形成单体形式的Fc突变体，采用该单体形式的Fc突变体与生物活性分子融合，后续可通过ProteinA纯化，简化了纯化工艺；同时更为重要的是，采用该Fc突变体制得的融合蛋白具有更高的体内外活性和更低的ADCC、CDC效应。
需要说明的是，本文中所指的抗体IgG的Fc片段是指抗体IgG的CH2区和CH3区。
例如，野生型IgG1的Fc片段的氨基酸序列(包括CH2-CH3)如下所示：
PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:40)。
野生型IgG1的铰链区(Hinge)的氨基酸序列如下所示：
DKTHTG(SEQ ID NO:41)。
野生型IgG1的铰链区(Hinge)的核苷酸序列如下所示：
GACAAGACACACACCGGA(SEQ ID NO:42)。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种融合蛋白。根据本发明的实施例，所述融合蛋白包含：第二肽段，所述第二肽段包括生物活性分子功能区；第三肽段，所述第三肽段包括Fc突变体，所述Fc突变体具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或如第一方面所限定的Fc突变体，所述第二肽段与所述第三肽段相连。根据本发明实施例的融合蛋白具有更高体内外活性和更低的ADCC、CDC效应，且后续可通过ProteinA纯化，简化了纯化工艺。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种融合蛋白。根据本发明的实施例，所述融合蛋白的结构通式表示为X-L-Y或Y-L-X，其中X是第一种生物活性分子；L是不存在或为连接肽；Y是第二种生物活性分子；-为肽键；且所述活性分子X或Y选自蛋白或蛋白结构域、多肽、抗体或抗体片段。
需要说明的是，所述“X-L-Y”是指X的C端与L的N端相连、L的C端与Y的N端相连；所述“Y-L-X”是指Y的C端与L的N端相连、L的C端与X的N端相连。
根据本发明的实施例，第二方面或第三方面所述的融合蛋白还可以进一步包含如下附加技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，所述融合蛋白为单体形式。
根据本发明的实施例，所述X为人生长激素。在一些实施例中，所述人生长激素的氨基酸序列包括选自SEQ ID NO:1或者与其具有至少80％-99％同一性的氨基酸序列或者其序列的至少一部分。
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF(SEQ ID NO:1)。
根据本发明的实施例，所述人生长激素的核苷酸序列包括选自SEQ ID NO:11或者与其具有至少80％-99％同一性的核苷酸序列或者其序列的至少一部分或其序列的密码子优化序列。
TTTCCCACCATTCCTCTGAGCAGACTGTTCGACAACGCCATGCTGAGAGCCCACAGACTGCACCAGCTGGCCTTTGACACATACCAGGAGTTCGAGGAGGCCTACATCCCCAAGGAGCAGAAGTACAGCTTCCTGCAGAACCCCCAGACCAGCCTGTGCTTCAGCGAGAGCATCCCCACCCCCAGCAATAGAGAGGAGACACAGCAGAAGAGCAACCTGGAGCTGCTGAGAATCAGCCTGCTGCTGATCCAGAGCTGGCTGGAGCCCGTTCAATTTCTGAGAAGCGTGTTCGCCAACAGCCTGGTGTACGGCGCCAGCGATTCTAATGTGTACGACCTGCTGAAGGACCTGGAGGAGGGCATCCAGACCCTGATGGGCAGACTGGAGGACGGCTCTCCTAGAACCGGACAAATTTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACCAACAGCCACAACGACGACGCCCTGCTGAAGAACTACGGCCTGCTGTACTGCTTCAGAAAGGACATGGACAAGGTGGAGACATTCCTGAGAATCGTGCAGTGCAGAAGCGTGGAGGGCAGCTGCGGATTC(SEQ ID NO:11)。
根据本发明的实施例，所述Y为IgG Fc突变体(简称“Fc突变体”)。在一些实施例中，所述Y为Ig G1 Fc突变体。在一些实施例中，所述Ig G1 Fc突变体SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7中的至少之一或者与其中任一序列具有至少80％-99％同一性的氨基酸序列或者其中任一序列的至少一部分。
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLRCHVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTKPVLDSDGSFFLYSTLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:2)。
PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLRCHVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTKPVLDSDGSFFLYSTLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:3)。
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLRCHVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTKPVLDSDGSFFLYSTLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGA(SEQID NO:4)。
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTSPPSRDELTKNQVSLRCHVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTKPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVYHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:5)。
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTSPPSRDELTKNQVSLRCHVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTKPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVYHEALHNHYTQKSLSLSPGA(SEQID NO:6)。
DKTHTGPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLRCHVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTKPVLDSDGSFFLYSTLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:7)。
相比野生型IgG1的Fc片段，SEQ ID NO:2的第一肽段存在突变可以包括：P228Delete、C229 Delete、P230 Delete、T366R、L368H、P395K和K409T。
相比野生型IgG1的Fc片段，SEQ ID NO:3和7的第一肽段存在突变可以包括：P228Delete、C229Delete、T366R、L368H、P395K和K409T。
相比野生型IgG1的Fc片段，SEQ ID NO:4的第一肽段存在突变可以包括：P228Delete、C229 Delete、P230 Delete、T366R、L368H、P395K、K409T和K447A。
相比野生型IgG1的Fc片段，SEQ ID NO:5的第一肽段存在突变可以包括：P228Delete、C229 Delete、P230 Delete、L351S、T366R、L368H、P395K、K409D和M428Y。
相比野生型IgG1的Fc片段，SEQ ID NO:6的第一肽段存在突变可以包括：P228Delete、C229 Delete、P230 Delete、L351S、T366R、L368H、P395K、K409D、M428Y和K447A。
上述突变有利于使天然二聚体形式的Fc突变体表达出来后形成单体形式，有利于使融合蛋白可以通过ProteinA纯化，简化纯化工艺，提高体内外活性。
根据本发明的实施例，所述连接肽包括含有1个或更多个选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸。
根据本发明的实施例，所述连接肽的氨基酸序列包括选自(GGGGS)n，或者与其中任意一序列具有至少80％-99％同一性的氨基酸序列或者其中任意一序列的至少一部分，其中n为大于等于1的整数或者n为1、2、3、4、5或6。
根据本发明的实施例，所述连接肽的氨基酸序列包括选自SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10中的至少之一或者与其中任意一序列具有至少80％-99％同一性的氨基酸序列或者其中任意一序列的至少一部分。
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:8)。
GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:9)。
GGGGS(SEQ ID NO:10)
根据本发明的实施例，所述连接肽的核苷酸序列可以包括选自SEQ ID NO:21、SEQID NO:22、SEQ ID NO:23中的至少之一或者与其中任意一序列具有至少80％-99％同一性的核苷酸序列或者其中任意一序列的至少一部分或其中任一序列的密码子优化序列。
GGAGGAGGAGGAAGCGGAGGCGGAGGATCTGGAGGAGGAGGAAGC(SEQ ID NO:21)。
GGCGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGAAGT(SEQ ID NO:22)。
GGCGGCGGAGGATCT(SEQ ID NO:23)。
根据本发明的实施例，所述融合蛋白的氨基酸序列包括选自:SEQ ID NO:24、SEQID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQID NO:31中的至少之一或者与其中任意一序列具有至少80％-99％同一性的氨基酸序列或者其中任意一序列的至少一部分。
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLRCHVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTKPVLDSDGSFFLYSTLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:24)。
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFGGGGSGGGGSGGGGSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLRCHVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTKPVLDSDGSFFLYSTLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:25)。
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFDKTHTGPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLRCHVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTKPVLDSDGSFFLYSTLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:26)。
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFGGGGSGGGGSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLRCHVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTKPVLDSDGSFFLYSTLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:27)。
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFGGGGSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLRCHVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTKPVLDSDGSFFLYSTLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:28)。
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLRCHVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTKPVLDSDGSFFLYSTLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF(SEQ ID NO:29)。
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFGGGGSGGGGSGGGGSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTSPPSRDELTKNQVSLRCHVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTKPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVYHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:30)。
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTSPPSRDELTKNQVSLRCHVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTKPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVYHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF(SEQ ID NO:31)。
根据本发明的实施例，SEQ ID NO:24-31所示的氨基酸序列中的第一生物分子、第二生物分子和连接肽如下表所示：
Figure BDA0003597162480000051
根据本发明的实施例，所述融合蛋白的核苷酸序列包括选自SEQ ID NO:32、SEQID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQID NO:39中的至少之一或者与其中任意一序列具有至少80％-99％同一性的核苷酸序列或者其中任意一序列的至少一部分或其中任一序列的密码子优化序列。
TTCCCCACCATTCCTCTGAGCCGGCTGTTCGACAACGCCATGCTGAGAGCCCACAGACTGCACCAGCTGGCCTTCGACACCTACCAAGAGTTCGAGGAAGCCTACATTCCCAAAGAGCAGAAGTACAGCTTCCTGCAGAACCCTCAGACCAGCCTGTGCTTCAGCGAGAGCATCCCCACACCTAGCAACAGAGAGGAAACCCAGCAGAAGTCCAACCTGGAACTGCTGCGGATCAGCCTGCTGCTGATCCAGTCTTGGCTGGAACCCGTGCAGTTCCTGAGAAGCGTGTTCGCCAACAGCCTGGTGTACGGCGCCAGCGACAGCAACGTTTACGACCTGCTGAAGGACCTGGAAGAGGGCATCCAGACACTGATGGGCAGACTGGAAGATGGCAGCCCTAGAACCGGCCAGATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACCAACAGCCACAACGACGACGCCCTGCTGAAAAACTACGGCCTGCTGTACTGCTTTCGGAAGGACATGGACAAGGTGGAAACCTTCCTGCGGATCGTGCAGTGCAGAAGCGTGGAAGGCAGCTGTGGATTTGCCCCTGAACTGCTCGGAGGCCCCTCCGTGTTTCTGTTCCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAACCCCAGGTTTACACACTGCCTCCAAGCAGGGACGAGCTGACCAAGAATCAGGTGTCCCTGCGGTGTCACGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCAAGCCAGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCACCCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAACAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCTCCTGGCAAA(SEQ ID NO:32)。
TTTCCCACCATCCCCCTGTCTAGACTGTTCGACAATGCCATGCTGAGAGCCCACAGACTGCACCAGCTGGCCTTTGACACATACCAGGAGTTCGAGGAGGCCTACATCCCCAAGGAGCAGAAGTACAGCTTCCTGCAGAACCCCCAGACCAGCCTGTGTTTCAGCGAAAGCATCCCCACCCCCAGCAATAGAGAGGAAACCCAGCAAAAGAGCAACCTGGAGCTGCTGAGAATCAGCCTGCTGCTGATCCAGAGCTGGCTGGAGCCTGTGCAATTTCTGAGAAGCGTGTTCGCCAATAGCCTGGTGTACGGCGCCAGCGATAGCAACGTGTATGATCTGCTGAAAGACCTGGAGGAGGGCATTCAGACACTGATGGGCAGACTGGAGGACGGCAGCCCTAGAACAGGACAGATTTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACCAACAGCCACAACGACGACGCCCTGCTGAAAAACTACGGCCTGCTGTACTGCTTCAGAAAGGACATGGACAAGGTGGAGACATTCCTGAGAATCGTGCAGTGCAGAAGCGTGGAGGGCAGCTGTGGATTTGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGCGGAGGATCTGGAGGAGGAGGAAGCGCTCCTGAACTGCTGGGAGGACCTAGCGTGTTTCTGTTTCCTCCCAAACCTAAAGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTTGATGTGTCTCATGAAGACCCCGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAAACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAAGATTGGCTGAATGGCAAGGAATACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCTATTGAAAAAACCATTAGCAAGGCTAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAAGTGTATACACTGCCCCCTAGCAGAGATGAACTGACCAAAAACCAGGTGAGCCTGAGATGCCACGTGAAGGGCTTTTACCCCAGCGACATTGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAACCTGAAAACAATTACAAGACCACCAAGCCCGTGCTGGACAGCGACGGATCTTTCTTTCTGTATAGCACCCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAATGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTATACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAA(SEQ ID NO:33)。
TTCCCTACAATCCCCCTGAGCAGACTGTTCGACAACGCCATGCTGAGAGCCCACAGACTGCACCAGTTAGCCTTTGATACCTATCAGGAGTTCGAGGAGGCCTACATCCCCAAGGAGCAGAAGTACAGCTTCCTGCAGAACCCCCAGACCAGCCTGTGTTTCAGCGAAAGCATCCCCACCCCCAGCAACAGAGAGGAGACACAGCAAAAGAGCAACCTGGAGCTGCTGAGAATCAGCCTGCTGCTGATCCAGAGCTGGCTGGAGCCTGTGCAATTCCTGAGAAGCGTGTTCGCCAATAGCCTGGTGTACGGCGCTAGCGACAGCAACGTGTATGACCTGCTGAAGGACCTGGAGGAGGGCATCCAAACACTGATGGGCAGACTGGAAGATGGCAGCCCCAGAACCGGACAAATTTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACCAACAGCCACAACGACGACGCCCTGCTGAAAAACTACGGCCTGCTGTATTGCTTCAGAAAGGACATGGACAAGGTGGAAACCTTCCTGAGAATCGTGCAGTGCAGAAGCGTGGAGGGCAGCTGTGGATTTGACAAGACACACACCGGACCCGCCCCCGAACTGCTGGGAGGACCTTCTGTGTTTCTGTTTCCTCCCAAACCCAAAGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTTGTGGATGTGTCTCATGAGGATCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACAAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAAGATTGGCTGAATGGAAAGGAATACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCTATTGAAAAAACAATTAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAACCTCAAGTGTATACCCTGCCTCCCAGCAGAGATGAGCTGACAAAAAATCAGGTGAGCCTGAGATGCCACGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATTGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGCCAACCTGAGAACAACTACAAGACCACCAAGCCCGTGCTGGACAGCGACGGATCTTTTTTTCTGTACAGCACCCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAATGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCATAATCACTACACCCAGAAAAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG(SEQ ID NO:34)。
TTCCCCACCATTCCTCTGAGCCGGCTGTTCGACAACGCCATGCTGAGAGCCCACAGACTGCACCAGCTGGCCTTCGACACCTACCAAGAGTTCGAGGAAGCCTACATTCCCAAAGAGCAGAAGTACAGCTTCCTGCAGAACCCTCAGACCAGCCTGTGCTTCAGCGAGAGCATCCCCACACCTAGCAACAGAGAGGAAACCCAGCAGAAGTCCAACCTGGAACTGCTGCGGATCAGCCTGCTGCTGATCCAGTCTTGGCTGGAACCCGTGCAGTTCCTGAGAAGCGTGTTCGCCAACAGCCTGGTGTACGGCGCCAGCGACAGCAACGTTTACGACCTGCTGAAGGACCTGGAAGAGGGCATCCAGACACTGATGGGCAGACTGGAAGATGGCAGCCCTAGAACCGGCCAGATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACCAACAGCCACAACGACGACGCCCTGCTGAAAAACTACGGCCTGCTGTACTGCTTTCGGAAGGACATGGACAAGGTGGAAACCTTCCTGCGGATCGTGCAGTGCAGAAGCGTGGAAGGCTCTTGCGGATTTGGCGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGAAGTGCTCCTGAACTGCTCGGAGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTCGAGGTGCACAACGCCAAGACAAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAACCCCAGGTTTACACACTGCCTCCAAGCAGGGACGAGCTGACCAAGAATCAGGTGTCCCTGCGGTGTCACGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCAAGCCAGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCACCCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAACAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCTCCTGGCAAA(SEQ ID NO:35)。
TTCCCCACCATTCCTCTGAGCCGGCTGTTCGACAACGCCATGCTGAGAGCCCACAGACTGCACCAGCTGGCCTTCGACACCTACCAAGAGTTCGAGGAAGCCTACATTCCCAAAGAGCAGAAGTACAGCTTCCTGCAGAACCCTCAGACCAGCCTGTGCTTCAGCGAGAGCATCCCCACACCTAGCAACAGAGAGGAAACCCAGCAGAAGTCCAACCTGGAACTGCTGCGGATCAGCCTGCTGCTGATCCAGTCTTGGCTGGAACCCGTGCAGTTCCTGAGAAGCGTGTTCGCCAACAGCCTGGTGTACGGCGCCAGCGACAGCAACGTTTACGACCTGCTGAAGGACCTGGAAGAGGGCATCCAGACACTGATGGGCAGACTGGAAGATGGCAGCCCTAGAACCGGCCAGATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACCAACAGCCACAACGACGACGCCCTGCTGAAAAACTACGGCCTGCTGTACTGCTTTCGGAAGGACATGGACAAGGTGGAAACCTTCCTGCGGATCGTGCAGTGCAGAAGCGTGGAAGGCTCTTGCGGATTTGGCGGCGGAGGATCTGCTCCTGAACTGCTCGGAGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAACCCCAGGTTTACACACTGCCTCCAAGCAGGGACGAGCTGACCAAGAATCAGGTGTCCCTGCGGTGTCACGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCAAGCCAGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCACCCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAACAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCTCCTGGCAAA(SEQ ID NO:36)。
GCTCCCGAACTGCTGGGAGGACCCAGCGTGTTTCTGTTTCCCCCTAAACCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCATGAGGACCCCGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAAGATTGGCTGAATGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCTATTGAAAAAACCATTAGCAAAGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAAGTGTACACATTACCCCCTAGCAGAGATGAACTGACCAAAAACCAGGTGAGCCTGAGATGCCACGTGAAGGGCTTTTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGACAACCTGAGAACAACTACAAGACCACCAAGCCCGTGCTGGACAGCGACGGATCTTTCTTTCTGTACAGCACCCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAATGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCATAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGAGCTGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGCGGAGGAGGATCTTTTCCCACAATTCCTCTGAGCAGACTGTTCGACAACGCCATGCTGAGAGCCCACAGACTGCACCAGCTGGCCTTTGACACATACCAGGAGTTCGAGGAGGCCTACATCCCCAAGGAGCAGAAGTACAGCTTCCTGCAGAACCCCCAGACCAGCCTGTGCTTTAGCGAAAGCATTCCCACCCCCAGCAACAGAGAGGAGACACAACAAAAGAGCAACCTGGAGCTGCTGAGAATCAGCCTGCTGCTGATCCAGAGCTGGCTGGAGCCCGTGCAATTTCTGAGAAGCGTGTTCGCCAATAGCCTGGTGTACGGCGCTAGCGATAGCAACGTGTATGACCTGCTGAAGGACCTGGAGGAGGGCATCCAAACCCTGATGGGCAGACTGGAGGACGGCAGCCCTAGAACAGGACAGATTTTTAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACCAACAGCCACAACGACGACGCCCTGCTGAAAAACTACGGCCTGCTGTACTGCTTCAGAAAGGACATGGACAAGGTGGAGACATTCCTGAGAATCGTGCAGTGCAGAAGCGTGGAGGGCAGCTGTGGATTT(SEQ ID NO:37)。
TTCCCCACAATCCCCCTGAGCAGACTGTTTGACAACGCCATGCTGAGAGCCCACAGACTGCACCAGCTGGCCTTCGATACATACCAGGAGTTTGAGGAGGCCTACATCCCCAAGGAGCAGAAGTACAGCTTCCTGCAGAACCCCCAGACCAGCCTGTGTTTCAGCGAGAGCATTCCCACACCCAGCAACAGAGAGGAAACCCAGCAAAAGAGCAACCTGGAGCTGCTGAGAATCAGCCTGCTGCTGATCCAGAGCTGGCTGGAGCCTGTGCAATTCCTGAGAAGCGTGTTCGCCAACAGCCTGGTGTACGGCGCTTCTGATAGCAATGTGTACGACCTGCTGAAGGACCTGGAGGAGGGCATTCAGACACTGATGGGCAGACTGGAGGACGGCAGCCCTAGAACAGGACAAATTTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACCAACAGCCACAACGACGACGCCCTGCTGAAAAACTACGGCCTGCTGTACTGCTTCAGAAAGGACATGGACAAGGTGGAGACATTCCTGAGAATCGTGCAGTGCAGAAGCGTGGAGGGCAGCTGTGGATTTGGAGGCGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCGCTCCTGAACTGCTGGGAGGACCTAGCGTGTTTCTGTTTCCTCCTAAACCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCATGAAGATCCCGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAAACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAAGATTGGCTGAATGGAAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCTATTGAAAAAACCATTAGCAAAGCTAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAAGTGTATACAAGCCCTCCCAGCAGGGACGAGCTGACCAAAAATCAGGTGAGCCTGAGATGCCACGTGAAGGGCTTTTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAATGGGAAAGCAATGGCCAACCCGAGAACAACTATAAGACCACCAAGCCCGTGCTGGACAGCGACGGATCCTTTTTTCTGTACAGCGACCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAATGTGTTCAGCTGCAGCGTGTATCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAAAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAA(SEQ ID NO:38)。
GCCCCTGAGCTGCTTGGAGGACCTAGCGTTTTTTTATTTCCCCCCAAACCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTTGTGGATGTGAGCCATGAAGATCCCGAGGTGAAATTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAAACAAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAAGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCTATTGAAAAAACCATTAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAACCCCAAGTGTATACCAGCCCCCCCAGCAGAGATGAGCTGACAAAAAATCAGGTGAGCCTGAGATGCCACGTGAAGGGCTTTTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAATCTAATGGACAACCTGAGAACAACTACAAGACCACCAAGCCCGTGCTGGACAGCGACGGGAGCTTTTTCCTGTATAGCGACCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAATGTGTTCAGCTGCAGCGTGTATCACGAGGCCCTGCATAATCACTACACCCAGAAAAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGAGCTGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCTTTTCCTACAATTCCTCTGAGCAGACTGTTCGACAACGCCATGCTGAGAGCCCACAGACTGCACCAGCTGGCCTTTGATACATACCAGGAGTTCGAGGAGGCCTACATCCCCAAGGAGCAGAAGTACAGCTTCCTGCAGAACCCCCAGACCAGCCTGTGTTTTAGCGAAAGCATTCCCACACCCAGCAATAGAGAAGAGACACAGCAGAAGAGCAACCTGGAGCTGCTGAGAATCAGCCTGCTGCTGATCCAGAGCTGGCTGGAGCCTGTGCAATTTCTGAGAAGCGTGTTCGCCAACAGCCTGGTGTACGGCGCTAGCGACTCTAACGTGTATGATCTGCTGAAAGACCTGGAGGAGGGCATCCAGACACTGATGGGCAGACTGGAGGACGGCAGCCCCAGAACAGGACAGATATTTAAGCAAACCTACAGCAAGTTCGACACCAACAGCCACAACGACGACGCCCTGCTGAAAAACTACGGCCTGCTGTACTGCTTCAGAAAGGACATGGACAAGGTGGAGACATTCCTGAGAATCGTGCAGTGCAGAAGCGTGGAGGGCAGCTGTGGATTT(SEQ ID NO:39)。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种用于构建融合蛋白的连接肽。根据本发明的实施例，所述连接肽的氨基酸序列包括选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10中的至少之一或者与其中任意一序列具有至少80％-99％同一性的氨基酸序列或者其中任意一序列的至少一部分。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码第一方面所述的Fc突变体、第二方面或第三方面所述的融合蛋白或第四方面所述的连接肽。根据本发明实施例的核酸分子所编码的Fc突变体为单体形式，采用该单体形式的Fc突变体与生物活性分子融合得到的融合蛋白，其具有更高体内外活性和更低的ADCC、CDC效应。根据本发明实施例的核酸分子所编码的融合蛋白后续可通过ProteinA纯化，简化了纯化工艺，且具有更高体内外活性和更低的ADCC、CDC效应。
根据本发明的实施例，所述核苷酸序列包括选自SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23中的至少之一或者与其中任意一序列具有至少80％-99％同一性的核苷酸序列或者其中任意一序列的至少一部分或其中任一序列的密码子优化序列。
所述SEQ ID NO:21用于编码SEQ ID NO:8。
所述SEQ ID NO:22用于编码SEQ ID NO:9。
所述SEQ ID NO:23用于编码SEQ ID NO:10。
根据本发明的实施例，所述核苷酸序列包括选自SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39中的至少之一或者与其中任意一序列具有至少80％-99％同一性的核苷酸序列或者其中任意一序列的至少一部分或其中任一序列的密码子优化序列。
所述SEQ ID NO:32用于编码SEQ ID NO:24。
所述SEQ ID NO:33用于编码SEQ ID NO:25。
所述SEQ ID NO:34用于编码SEQ ID NO:26。
所述SEQ ID NO:35用于编码SEQ ID NO:27。
所述SEQ ID NO:36用于编码SEQ ID NO:28。
所述SEQ ID NO:37用于编码SEQ ID NO:29。
所述SEQ ID NO:38用于编码SEQ ID NO:30。
所述SEQ ID NO:39用于编码SEQ ID NO:31。
根据本发明的实施例，所述核苷酸序列包括选自SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中的至少之一或者与其中任意一序列具有至少80％-99％同一性的核苷酸序列或者其中任意一序列的至少一部分或其中任一序列的密码子优化序列。
所述SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16用于编码SEQ IDNO:2。
所述SEQ ID NO:14用于编码SEQ ID NO:3。
所述SEQ ID NO:17用于编码SEQ ID NO:4。
所述SEQ ID NO:18用于编码SEQ ID NO:5。
所述SEQ ID NO:19用于编码SEQ ID NO:6。
所述SEQ ID NO:20用于编码SEQ ID NO:7。
GCCCCTGAACTGCTCGGAGGCCCCTCCGTGTTTCTGTTCCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAACCCCAGGTTTACACACTGCCTCCAAGCAGGGACGAGCTGACCAAGAATCAGGTGTCCCTGCGGTGTCACGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCAAGCCAGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCACCCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAACAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCTCCTGGCAAA(SEQ ID NO:12)。
GCTCCTGAACTGCTGGGAGGACCTAGCGTGTTTCTGTTTCCTCCCAAACCTAAAGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTTGATGTGTCTCATGAAGACCCCGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAAACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAAGATTGGCTGAATGGCAAGGAATACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCTATTGAAAAAACCATTAGCAAGGCTAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAAGTGTATACACTGCCCCCTAGCAGAGATGAACTGACCAAAAACCAGGTGAGCCTGAGATGCCACGTGAAGGGCTTTTACCCCAGCGACATTGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAACCTGAAAACAATTACAAGACCACCAAGCCCGTGCTGGACAGCGACGGATCTTTCTTTCTGTATAGCACCCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAATGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTATACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAA（SEQ ID NO:13）。
CCCGCCCCCGAACTGCTGGGAGGACCTTCTGTGTTTCTGTTTCCTCCCAAACCCAAAGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTTGTGGATGTGTCTCATGAGGATCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACAAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAAGATTGGCTGAATGGAAAGGAATACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCTATTGAAAAAACAATTAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAACCTCAAGTGTATACCCTGCCTCCCAGCAGAGATGAGCTGACAAAAAATCAGGTGAGCCTGAGATGCCACGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATTGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGCCAACCTGAGAACAACTACAAGACCACCAAGCCCGTGCTGGACAGCGACGGATCTTTTTTTCTGTACAGCACCCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAATGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCATAATCACTACACCCAGAAAAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG（SEQ ID NO:14）。
GCTCCTGAACTGCTCGGAGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTCGAGGTGCACAACGCCAAGACAAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAACCCCAGGTTTACACACTGCCTCCAAGCAGGGACGAGCTGACCAAGAATCAGGTGTCCCTGCGGTGTCACGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCAAGCCAGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCACCCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAACAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCTCCTGGCAAA（SEQ ID NO:15）。
GCTCCTGAACTGCTCGGAGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAACCCCAGGTTTACACACTGCCTCCAAGCAGGGACGAGCTGACCAAGAATCAGGTGTCCCTGCGGTGTCACGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCAAGCCAGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCACCCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAACAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCTCCTGGCAAA（SEQ ID NO:16）。
GCTCCCGAACTGCTGGGAGGACCCAGCGTGTTTCTGTTTCCCCCTAAACCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCATGAGGACCCCGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAAGATTGGCTGAATGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCTATTGAAAAAACCATTAGCAAAGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAAGTGTACACATTACCCCCTAGCAGAGATGAACTGACCAAAAACCAGGTGAGCCTGAGATGCCACGTGAAGGGCTTTTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGACAACCTGAGAACAACTACAAGACCACCAAGCCCGTGCTGGACAGCGACGGATCTTTCTTTCTGTACAGCACCCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAATGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCATAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGAGCT(SEQ ID NO:17)。
GCTCCTGAACTGCTGGGAGGACCTAGCGTGTTTCTGTTTCCTCCTAAACCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCATGAAGATCCCGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAAACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAAGATTGGCTGAATGGAAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCTATTGAAAAAACCATTAGCAAAGCTAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAAGTGTATACAAGCCCTCCCAGCAGGGACGAGCTGACCAAAAATCAGGTGAGCCTGAGATGCCACGTGAAGGGCTTTTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAATGGGAAAGCAATGGCCAACCCGAGAACAACTATAAGACCACCAAGCCCGTGCTGGACAGCGACGGATCCTTTTTTCTGTACAGCGACCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAATGTGTTCAGCTGCAGCGTGTATCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAAAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAA(SEQ ID NO:18)。
GCCCCTGAGCTGCTTGGAGGACCTAGCGTTTTTTTATTTCCCCCCAAACCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTTGTGGATGTGAGCCATGAAGATCCCGAGGTGAAATTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAAACAAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAAGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCTATTGAAAAAACCATTAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAACCCCAAGTGTATACCAGCCCCCCCAGCAGAGATGAGCTGACAAAAAATCAGGTGAGCCTGAGATGCCACGTGAAGGGCTTTTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAATCTAATGGACAACCTGAGAACAACTACAAGACCACCAAGCCCGTGCTGGACAGCGACGGGAGCTTTTTCCTGTATAGCGACCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAATGTGTTCAGCTGCAGCGTGTATCACGAGGCCCTGCATAATCACTACACCCAGAAAAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGAGCT(SEQ ID NO:19)。
GACAAGACACACACCGGACCCGCCCCCGAACTGCTGGGAGGACCTTCTGTGTTTCTGTTTCCTCCCAAACCCAAAGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTTGTGGATGTGTCTCATGAGGATCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACAAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAAGATTGGCTGAATGGAAAGGAATACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCTATTGAAAAAACAATTAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAACCTCAAGTGTATACCCTGCCTCCCAGCAGAGATGAGCTGACAAAAAATCAGGTGAGCCTGAGATGCCACGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATTGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGCCAACCTGAGAACAACTACAAGACCACCAAGCCCGTGCTGGACAGCGACGGATCTTTTTTTCTGTACAGCACCCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAATGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCATAATCACTACACCCAGAAAAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG(SEQID NO:20)。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带第五方面所述的核酸分子。根据本发明实施例的表达载体导入合适的受体细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前面所述的Fc突变体、融合蛋白或连接肽的表达，以便大量获得所述Fc突变体、融合蛋白或连接肽。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞包括：携带第五方面所述的核酸分子；或，表达第一方面所述的Fc突变体、第二方面或第三方面所述的融合蛋白或第四方面所述的连接肽。根据本发明实施例的重组细胞可用于前面所述的Fc突变体、融合蛋白或连接肽的体外表达和大量获得。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：第二方面或第三方面所述的融合蛋白。根据本发明实施例的药物组合物可以用于预防和治疗融合蛋白的生物活性分子异常相关疾病。
根据本发明的实施例，所述药物组合物是用于口服、静脉内施用，如推注或通过连续灌注一段时间，通过皮下、肌肉内、动脉内、腹膜内、肺内、脑脊髓内、关节内、滑膜内、鞘内、损伤内、或吸入路径如鼻内，通常通过静脉内或皮下施用得药物组合物。
根据本发明的实施例，所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊、喷雾剂、注射剂、冻干粉针剂或预充针注射剂。
在本发明的第九方面，本发明提出了一种第二方面或第三方面所述的融合蛋白的制备方法。根据本发明的实施例，所述制备方法包括：培养第七方面所述的重组细胞，获得含融合蛋白的培养液；从上述培养液中分离出所述融合蛋白。由此，能够有效地制备第二方面和第三方面所述的融合蛋白。
在本发明的第十方面，本发明提出了一种第二方面或第三方面所述的融合蛋白、第五方面所述的核酸分子、第六方面所述的表达载体、第七方面所述的重组细胞、第八方面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防生长激素异常相关疾病。
有益效果
相比现有技术，本发明至少具有包括以下有益技术效果中的一种：
(1)本发明所使用的融合蛋白中的Fc突变体经过特定位点的突变，与该Fc突变体融合的生长激素以单体形式分泌表达，可通过ProteinA亲和层析纯化，后续纯化工艺简单。
(2)本发明所提供的融合蛋白对人GHR结合的EC50值低，与人GHR有很强的结合活性。
(3)本发明所提供的融合蛋白对促进Nb2-11细胞增殖的EC50值低，对Nb2-11细胞有很好的增殖作用。
(4)本发明所提供的融合蛋白促进报告基因细胞表达荧光素酶的EC50值低，且与对照样品(Genexine GX-H9)相当或更低，具有优异的促进报告基因细胞表达荧光素酶活性。
(5)本发明所提供的融合蛋白相比人生长激素具有更长的半衰期，更好的体内生物学活性。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明的一个实施例中融合蛋白的单体形式的示意图；
图2为本发明实施例7中J2或J18诱导的ADCC效应的结果图；
图3为本发明实施例9中体内生物学活性测定的各组大鼠体重增加结果趋势图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中，术语“室温”表示环境温度，可以为20℃-30℃；在一些实施例中，为22℃-28℃；在一些实施例中，为24℃-26℃；在一些实施例中，为25℃。
在本文中，“抗体片段”意即抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包含至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本文中，术语“变体”或“突变体”通常是指包含一个或多个核苷酸或氨基酸突变的任何天然存在的或工程化的分子。
在本文中，所述IgG1 Fc部分的氨基酸编号为根据EU编号系统编号，例如，第366位是指按EU编号系统编号第366位；所述“T366R”是指按EU编号系统编号第366位的苏氨酸被精氨酸替代；“L368H”是指按EU编号系统编号第368位的亮氨酸被组氨酸替代。
在本文中，术语“(GGGGS)n”表示n个GGGGS相连接，例如“(GGGGS)3”表示GGGGSGGGGSGGGGS。
在本文中，术语“融合蛋白”通常指由两个或更多个蛋白或多肽融合得到的蛋白。编码所述两个或更多个蛋白或多肽的基因或核酸分子可彼此连接而形成融合基因或融合的核酸分子，该融合基因或融合的核酸分子可编码所述融合蛋白。所述融合基因的翻译产生单一多肽，其具有融合前的所述两个或更多个蛋白或多肽中至少一个、甚至每一个的性质。重组融合蛋白通过用于生物学研究或治疗的重组DNA技术人工创造。重组融合蛋白是通过融合基因的遗传工程创造的蛋白质。本发明涉及重组融合蛋白，并且术语融合蛋白和重组融合蛋白在本文以相同含义使用。本文描述的融合蛋白通常包含至少两个结构域(A和C)，并且任选地包含第三组分，介于所述两个结构域之间的接头。重组融合蛋白的生成是本领域已知的，并且通常涉及自编码第一蛋白或多肽的cDNA序列去除终止密码子，然后通过连接或重叠延伸PCR以符合读框的方式附接第二蛋白的cDNA序列。该DNA序列然后会由细胞表达成为单一蛋白质。该蛋白质可以经工程化以包括两种原始蛋白质或多肽的完整序列，或仅仅为其中的一部分。
本发明融合蛋白通常由生物合成的方法制备。根据本发明所述的核苷酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本发明的编码核酸序列。
在本文中，术语“同一性”、“同源性”或“相似相”均用于描述相对于参考序列的氨基酸序列或核酸序列时，采用通过常规的方法进行确定两个氨基酸序列或核酸序列之间的相同氨基酸或核苷酸的百分比，例如参见，Ausubel等，编著(1995)，Current Protocols inMolecular Biology，第19章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)；和ALIGN程序(Dayhoff(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure 5：Suppl.3(National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.)。关于比对序列和测定序列同一性有很多算法，包括，Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法；Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444的相似性搜索方法；Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)；和BLASTP，BLASTN，和BLASTX算法(参见Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。利用这些算法的计算机程序也是可获得的，并且包括但不限于：ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，或者WU-BLAST-2(Altschul等，Meth.Enzym.，266：460-480(1996))；或者GAP，BESTFIT，BLAST Altschul等，上文，FASTA，和TFASTA，在Genetics Computing Group(GCG)包，8版，Madison，Wisconsin，USA中可获得；和Intelligenetics，Mountain View，California提供的PC/Gene程序中的CLUSTAL。
在本文中，术语“核苷酸”通常是指可为核糖核苷酸、脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式，及其组合。
在本文中，术语“至少90％同一性”指与各参考序列至少为90％，可为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％的同一性。
在本文中，术语“至少80％-99％序列同一性”指与各参考序列至少80％-99％、至少81％-99％、至少82％-99％、至少83％-99％、至少84％-99％、至少85％-99％、至少86％-99％、至少87％-99％、至少88％-99％、至少89％-99％、至少90％-99％、至少91％-99％、至少92％-99％、至少93％-99％、至少94％-99％、至少95％-99％、至少96％-99％、至少97％-99％、至少98％-99％或至少99％的序列同一性。
在本文中，术语“表达载体”通常是指能够插入在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述表达载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述表达载体还包括具有多种上述功能的载体。所述表达载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述表达载体的合适的宿主细胞，所述表达载体可以产生期望的表达产物。
在本文中，术语“重组细胞”通常是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞。其中，术语“宿主细胞”是指可导入重组表达载体的原核细胞或真核细胞。本文所用术语“转化的”或“转染的”是指通过本领域已知的各种技术将核酸(例如载体)引入细胞。合适的宿主细胞可以用本发明的DNA序列转化或转染，并且可以用于靶蛋白的表达和/或分泌。可用于本发明的合适宿主细胞的例子包括永生化杂交瘤细胞、NS/0骨髓瘤细胞、293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、Cap细胞(人羊水来源的细胞)和CoS细胞。
在本文中，术语“药物组合物”通常是指单位剂量形式，并且可以通过制药领域中熟知的方法的任何一种进行制备。所有的方法包括使活性成分与构成一种或多种附属成分的载体相结合的步骤。通常，通过均匀并充分地使活性化合物与液体载体、细碎固体载体或这两者相结合，制备组合物。
在本文中，术语“药学上可接受的辅料”均可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本发明的化合物不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本发明所考虑的范围。
对本文所提及的其他药学上可接受的辅料或工艺可参考关于此主题的大量文献，具体而言参见Handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版，Arthur H.Kibbe编辑，American Pharmaceutical Association,Washington,USA和Pharmaceutical Press,London；以及Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie、Kosmetik和angrenzendeGebiete，H.P.Fiedler编辑，第4版，编辑Cantor、Aulendorf和早期版本。
在本文中，术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明的融合蛋白可以通过任何常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜、静脉、肌肉、皮下、皮层、口服、局部、鼻腔、肺部、直肠和涂抹，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。优选地，本发明的融合蛋白采用注射方式被给药。
在本文中，术语“生长激素异常相关疾病”通常是指由于生长激素异常引起的疾病，例如生长激素缺乏或异化状态引起的相关疾病，包括但不限于，儿童生长激素缺乏症、特发性体型矮小、成人生长激素缺乏、特纳氏综合征(TurnersSyndrome)、普拉德威利综合征(Prader Willi Syndrome)、子宫内生长迟缓、特发性身材矮小、肾衰竭、化疗治疗和AIDS治疗期间的异化状态。生长激素缺乏可包括先天或获得性缺乏。关于先天缺陷，当垂体没有发展成生长激素分泌紊乱时，生长激素缺陷可能发生。获得性生长激素缺乏可能由于难于递送而导致缺氧导致脑组织损伤而发生。生长激素缺乏的其它原因包括由用于治疗脑瘤或出生后结核性脑膜炎的辐射引起的垂体损伤。生长激素缺乏表现出诸如生长迟缓和身材矮小的症状，并且先天生长激素缺乏表现出低葡萄糖症状，从新生儿开始。另外，儿童表现出诸如焦虑增加和活力降低的症状。
在本文中，术语“治疗”是指用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述化合物的药物给予有需要的个体。
需要说明的是，本领域技术人员所理解的是，Fc突变体的单体或二聚体形式决定了它所形成的融合蛋白的单体或二聚体形式。
本发明提出了一种Fc突变体、融合蛋白、核酸分子、表达载体、重组细胞、药物组合物及其用途，下面将分别对其进行详细描述。
Fc突变体
在本发明的一个方面，本发明提出了一种Fc突变体。根据本发明的实施例，包括：第一肽段，所述第一肽段相较于野生型IgG1的Fc片段，具有如下位点的突变：第228位、第229位、第230位、第366位、第368位、第395位和第409位，以及第351位、第428位和第447位中的至少之一；或第228位、第229位、第366位、第368位、第395位和第409位。
发明人经过大量实验发现，上述突变有利于使天然二聚体形式的Fc片段表达出来后形成单体形式的Fc突变体，采用该单体形式的Fc突变体与生物活性分子融合，且后续可通过ProteinA纯化，简化了纯化工艺；此外，采用该Fc突变体制得的融合蛋白具有更高体内外活性和更低的ADCC、CDC效应。
根据本发明的实施例，所述第一肽段相较于野生型IgG1的Fc片段，具有如下位点的突变：1)第228位、第229位、第230位、第366位、第368位、第395位、第409位和第447位；或，2)第228位、第229位、第230位、第351位、第366位、第368位、第395位、第409位和第428位；或，3)第228位、第229位、第230位、第351位、第366位、第368位、第395位、第409位、第428位和第447位。由此，上述突变可形成单体形式的Fc突变体。
根据本发明的实施例，所述第一肽段相较于野生型IgG1的Fc片段，具有如下位点的突变：T366R、L368H、P395K和K409D或K409T；以及L351S、M428Y和K447A中的至少之一。由此，上述突变可形成单体形式的Fc突变体。
根据本发明的实施例，所述第一肽段相较于野生型IgG1的Fc片段，具有如下位点的突变：1)P228Delete、C229 Delete、P230 Delete、T366R、L368H、P395K、K447A和K409D或K409T；或，2)P228Delete、C229 Delete、P230 Delete、L351S、T366R、L368H、P395K、M428Y和K409D或K409T；或，3)P228 Delete、C229 Delete、P230 Delete、L351S、T366R、L368H、P395K、M428Y、K447A和K409D或K409T；或，4)P228 Delete、C229 Delete、T366R、L368H、P395K和K409D或K409T。发明人经过大量实验，对特定位点进行突变后，得到的上述单体形式的Fc突变体，该Fc突变体与生物活性分子融合后的融合蛋白以单体形式分泌表达，该融合蛋白具有更高体内外活性和更低的ADCC、CDC效应，例如，Fc突变体与生长激素融合后的融合蛋白，具有对人生长激素受体结合力强、细胞增殖的活性好和体外活性高等优点。
优选地，所述第一肽段相较于野生型IgG1的Fc片段，具有如下位点的突变：P228Delete、C229Delete、P230 Delete、L351S、T366R、L368H、P395K、M428Y、K447A和K409D或K409T。
发明人经过大量的实验发现，上述Fc突变体与人生长激素融合，得到的融合蛋白具有更高的对人生长激素受体结合力、更高的细胞增殖的活性和更高的体外活性。示例性地，根据本发明实施例的融合蛋白J16和J18的Fc突变体的突变位点不同，J18中的Fc突变体中同时含有上述位点突变，而J16相较于J18不存在L351S和M428Y突变，而融合蛋白J18对人生长激素受体结合力、细胞增殖的活性和体外活性均更强。并且，融合蛋白J17与融合蛋白J2(P228 Delete、C229 Delete、P230 Delete、T366R、L368H、P395K和K409D)相比，融合蛋白J17相较于J2增加了L351S和M428Y突变、且J2和J17的第409位的突变位点不同(J17为K409T)，但J17融合蛋白对细胞增殖的活性和体外活性均更强。因此，采用同时存在L351S和M428Y突变的Fc突变体制得的融合蛋白对人生长激素受体结合力、细胞增殖的活性和体外活性均较高。
根据本发明的实施例，所述Fc突变体进一步包括：野生型IgG1的铰链区片段，所述野生型IgG1的铰链区片段的C端与所述第一肽段的N端相连。
根据本发明的实施例，所述野生型IgG1的铰链区片段具有如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述Fc突变体具有如SEQ ID NO:3～7任一项所示的氨基酸序列。发明人发现，采用上述Fc突变体与生物活性分子融合得到的融合蛋白具有较高的体内外生物活性。
根据本发明的实施例，所述Fc突变体为单体形式。
融合蛋白
在本发明的又一方面，本发明提出了一种融合蛋白。根据本发明的实施例，所述融合蛋白包含：第二肽段，所述第二肽段包括生物活性分子功能区；第三肽段，所述第三肽段包括Fc突变体，所述Fc突变体具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或如前限定的Fc突变体，所述第二肽段与所述第三肽段相连。发明人经过大量实验发现，本发明融合蛋白为单体形式，具有更高体内外活性和更低的ADCC、CDC效应；并且，该融合蛋白后续可通过ProteinA纯化，简化了纯化工艺。
需要说明的是，“单体”是指具有1条Fc突变体，具体结构参见图1。
根据本发明的实施例，所述第二肽段包含生长激素、生长激素类似物、生长激素功能区或生长激素类似物功能区，优选为人生长激素或人生长激素功能区。发明人发现，本发明的融合蛋白为单体形式，其具有更高体内外活性和更低的ADCC、CDC效应，并且，具有对人生长激素受体结合力强、细胞增殖的活性好和体外活性高等优点。
根据本发明的实施例，所述人生长激素具有如SEQ ID NO:1或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述第二肽段的N端与所述第三肽段的C端相连；或者，所述第二肽段的C端与所述第三肽段的N端相连。由此，采用上述连接方式制得的融合蛋白，具有更高的体内外活性。
根据本发明的实施例，所述第二肽段的N端与所述第三肽段的C端相连。发明人经过大量实验发现，采用上述连接方式得到的融合蛋白，可进一步提高其对相应受体的结合力、细胞增殖的活性和体外活性，例如：Fc突变体和生长激素融合制得的融合蛋白，其在动物体内的药效更好。
根据本发明的实施例，所述融合蛋白进一步包括连接肽，所述连接肽设置于所述第二肽段和第三肽段之间。由此，采用过上述连接肽可融合的第二肽段和第三肽段，提高最终所得到的融合蛋白的生物活性。示例性地，融合蛋白J1、J2、J6和J7的连接肽不同，相较于没有连接肽的J1，J2、J6和J7对人GHR结合活性较好、且对细胞增殖的促进效果较好。
根据本发明的实施例，所述连接肽的N端与所述第三肽段的C端相连，所述连接肽的C端与所述第二肽段的N端相连；或者，所述连接肽的N端与所述第二肽段的C端相连，所述连接肽的C端与所述第三肽段的N端相连。
根据本发明的实施例，所述连接肽的N端与所述第三肽段的C端相连，所述连接肽的C端与所述第二肽段的N端相连。发明人经过大量实验发现，采用上述连接方式得到的融合蛋白，可进一步提高其对相应受体的结合力、细胞增殖的活性和体外活性，例如：Fc突变体和生长激素融合制得的融合蛋白可在动物体内的药效更好。
根据本发明的实施例，所述连接肽的氨基酸序列为(GGGGS)n，其中n为大于或等于1的整数，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。由此，采用过上述连接肽可融合的第二肽段和第三肽段，可提高最终所得到的融合蛋白的生物活性。
根据本发明的实施例，所述连接肽具有如SEQ ID NO:8～10任一项所示的氨基酸序列。由此，采用过上述连接肽可融合的第二肽段和第三肽段，可进一步提高最终所得到的融合蛋白的生物活性。
根据本发明的实施例，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:24～31任一项所示的氨基酸序列。发明人经过实验发现，上述融合蛋白对人生长激素受体结合力强、细胞增殖的活性好和体外活性高。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对Fc突变体所描述的特征和优点，同样适用于该融合蛋白，在此不再赘述。
核酸分子
在本发明的另一方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码前述的Fc突变体或前述的融合蛋白。利用该核酸分子可以有效地用于表达上述Fc突变体或融合蛋白，尤其是在原核生物或者低等真核生物表达体系中可以有效地表达上述融合蛋白，该融合蛋白为单体形式，具有更高体内外活性和更低的ADCC、CDC效应。
根据本发明的实施例，所述核酸分子为DNA。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对Fc突变体和融合蛋白所描述的特征和优点，同样适用于该核酸分子，在此不再赘述。
表达载体
在本发明的另一方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带前述的核酸分子。利用该表达载体能够在细胞内有效地表达上述Fc突变体或融合蛋白，尤其是在原核生物或者低等真核生物表达体系中可以有效地表达上述融合蛋白，该融合蛋白为单体形式，具有更高体内外活性和更低的ADCC、CDC效应。
根据本发明的实施例，所述表达载体为真核表达载体。
根据本发明的实施例，所述表达载体为慢病毒载体。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对Fc突变体、融合蛋白和核酸分子所描述的特征和优点，同样适用于该表达载体，在此不再赘述。
重组细胞
在本发明的另一方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞包括：携带前述的核酸分子；或，表达前述的Fc突变体或前述的融合蛋白。利用该重组细胞可有效地表达上述Fc突变体或融合蛋白，尤其是在原核生物或者低等真核生物表达体系中可以有效地表达上述融合蛋白，该融合蛋白为单体形式，具有更高体内外活性和更低的ADCC、CDC效应。
根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过前述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。
根据本发明的实施例，所述重组细胞为真核细胞。
根据本发明的实施例，所述重组细胞为哺乳动物细胞。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对Fc突变体、融合蛋白、核酸分子和表达载体所描述的特征和优点，同样适用于该重组细胞，在此不再赘述。
药物组合物
在本发明的另一方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：前述的融合蛋白。根据本发明实施例的药物组合物可以用于预防和治疗生长激素异常相关疾病。
根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括药学上可接受的辅料。
根据本发明的实施例，所述药物组合物的剂型为注射剂。
根据本发明的实施例，所述药物组合物的给药途径包括皮下注射或静脉注射。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对Fc突变体、融合蛋白、核酸分子、表达载体和重组细胞所描述的特征和优点，同样适用于该药物组合物，在此不再赘述。
预防和/或治疗生长激素异常相关疾病的方法
在本发明的另一方面，本发明提出了一种预防和/或治疗生长激素异常相关疾病的方法。根据本发明的实施例，所述方法包含：向受试者施用药学上可接受量的前述的融合蛋白或前述的药物组合物。根据本发明的实施例，该方法可有效预防或治疗生长激素异常相关疾病。
根据本发明的实施例，所述方法的给药途径包括皮下注射或静脉注射。
根据本发明的实施例，所述生长激素异常相关疾病至少包括选自下列之一：儿童生长激素缺乏症、特发性体型矮小、成人生长激素缺乏、特纳氏综合征、普拉德-威利综合征、肾衰竭、化疗治疗和AIDS治疗期间的异化状态引起的疾病、子宫内生长迟缓。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对Fc突变体、融合蛋白、核酸分子、表达载体、重组细胞和药物组合物所描述的特征和优点，同样适用于该预防和/或治疗生长激素异常相关疾病的方法，在此不再赘述。
用途
在本发明的另一方面，本发明提出了一种前述的融合蛋白、前述的核酸分子、前述的表达载体、前述的重组细胞、前述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防生长激素异常相关疾病。
根据本发明的实施例，所述生长激素异常相关疾病至少包括选自下列之一：儿童生长激素缺乏症、特发性体型矮小、成人生长激素缺乏、特纳氏综合征、普拉德-威利综合征、肾衰竭、化疗治疗和AIDS治疗期间的异化状态引起的疾病、子宫内生长迟缓。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对Fc突变体、融合蛋白、核酸分子、表达载体、重组细胞和药物组合物所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：制备重组长效人生长激素融合蛋白表达载体
本申请中将人生长激素(SEQ ID NO:1)与Fc突变体(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:7)进行连接，构建融合蛋白，分别得到J1和J3。本申请中将人生长激素(SEQ ID NO:1)通过连接肽(SEQ ID NO:8-10)与多种Fc突变体(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4-6)进行连接，构建融合蛋白，分别得到J2、J6、J7和J16-18。具体的实验操作如下：
将编码人生长激素的核苷酸序列(SEQ ID NO:11)、编码连接肽的核苷酸序列(SEQID NO:21-23)以及编码多种突变的Fc突变体的核苷酸序列(SEQ ID NO:16-20)进行组合，采用基因全合成及分子克隆技术分别将核苷酸序列SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39克隆至表达载体pCDNA3.4(购自Thermo Fisher)中，分别得到各核苷酸序列的融合蛋白表达载体。
实施例2：重组长效人生长激素融合蛋白表达
利用Expi CHO-S(Gibco、A29133)作为宿主细胞，将实施例1获得的多个质粒转染宿主细胞，采用化学转染试剂Polyplus-FectoPRO(polyplus，116-010)瞬时表达融合蛋白(即为重组长效人生长激素融合蛋白)，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：24-31。实验操作如下：
1、Expi CHO-S细胞瞬染前一天对细胞进行传代，用培养基将细胞密度调整为3×106细胞/mL左右。将细胞培养瓶放回摇床(37℃、8％CO2)继续培养。
2、瞬染当天(每个分子转染1L)：取Expi CHO-S细胞液进行细胞计数，用培养基将细胞密度调整为6×106细胞/mL左右。
3、配制转染复合物：取16个无菌细胞培养瓶，8个标记“DNA”，8个标记“FectoPRO”，在“FectoPRO”瓶中加入转染试剂Polyplus-FectoPRO；在8个“DNA”瓶中全部加入60mLOpti-MEM溶液和每个“DNA”瓶各自加入500μg实施例1所得各核苷酸序列的融合蛋白表达载体；混匀，得融合蛋白表达载体稀释液，将各核苷酸序列得融合蛋白表达载体稀释液分别加入“FectoPRO”瓶中混匀，室温孵育10min后加入细胞液中摇匀，将细胞培养瓶放回摇床继续培养转染。
4、转染18-22h后加入适量OPM-CHO ProFeed，并测细胞液生化指标。根据生化指标，补葡糖糖至6g/L。转染4d后开始测Titer，并隔天补料补糖。细胞活率<80％即得CHO细胞发酵液，可收获上清液进行纯化。
实施例3：重组长效人生长激素融合蛋白纯化
将实施例2所得到的CHO细胞发酵液进行二级离心(一级：3000×g、30min；二级：12000×g、20min)，收集上清液经0.2μm滤器过滤，待用。
Protein A亲和层析：使用pH7.2的含20mM磷酸盐和150mM氯化钠的水溶液平衡层析柱至少3个柱体积，上样过滤后的澄清滤液，料液保留在层析柱上的时间为5分钟，上完样品后，再使用pH7.2的含20mM磷酸盐和150mM氯化钠的水溶液平衡层析柱至少1个柱体积，按照顺序使用pH 4.5的含50mM醋酸(HAc)的缓冲液，pH4.0的含50mM HAc的缓冲液，和pH 3.5的含50mM HAc的缓冲液，分别洗脱目的蛋白，当出现吸收峰时，收峰范围为50mAU-peak-50mAU，得到SEC纯度符合要求(＞98.0)的融合蛋白，含核苷酸序列SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38或SEQID NO:39的Expi CHO-S细胞经发酵、层析后分别得到J1融合蛋白、J2融合蛋白、J3融合蛋白、J6融合蛋白、J7融合蛋白、J16融合蛋白、J17融合蛋白、J18融合蛋白。融合蛋白的具体结构如图1所示，其中，J1、J2、J3、J6、J7和J17的结构参见图1左图，J16和J18的结构参见图1右图。
实施例4：融合蛋白对人GHR结合试验
本实施例对实施例3获得的纯化后的融合蛋白进行体外受体(人生长激素受体，简称人GHR)结合活性检测，并以Genexine GX-H9为对照组，具体实验操作如下：
将人GHR稀释制得0.5μg/ml包被液，分别以100μL/孔加入酶标板，2～8℃包被12小时以上。弃去包板残液，加入1％BSA-PBST(含1％牛血清白蛋白的磷酸盐吐温缓冲液)，每孔300μL，37℃封闭1小时。每孔加入300μL的PBST(磷酸盐吐温缓冲液)洗3次，将重组长效人生长激素融合蛋白和Genexine GX-H9稀释至5μg/ml，再5倍稀释8个梯度浓度，100μL/孔加入酶标板。37℃孵育1小时，每孔加入300μL的PBST，洗涤3次后加入1％BSA-PBST稀释10000倍的Goat anti human IgG Fc-HRP，100μL/孔加样。37℃孵育1小时后，每孔加入300μL的PBST，洗涤3次，拍干。加入TMB显色液，每孔100μL。室温反应5分钟后加2M H2SO4水溶液终止反应，100μL/孔。将中止反应的酶标板置酶标仪上，450nm波长下读取吸光度OD450值并计算各融合蛋白的对人GHR结合活性EC50，见表1所示，结果表明，从结合活性来看，本发明所提供的融合蛋白对人GHR结合的EC50值低，与人GHR有很强的结合活性。参见相对GenexineGX-H9的结合活性，说明与Genexine GX-H9相比，与人GHR的结合活性趋同或较好。
其中，Genexine GX-H9的氨基酸序列为：
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:43)。
表1：重组长效人生长激素融合蛋白对人GHR结合活性试验检测结果
Figure BDA0003597162480000191
实施例5：重组长效人生长激素融合蛋白促进Nb2-11细胞增殖的实验
分别将实施例3获得的纯化后的融合蛋白进行实验，并以上述Genexine GX-H9为对照组，具体实验操作如下：
收集细胞并以每毫升1×105个细胞的浓度悬浮在培养基(PRMI 1640培养基，含1％FBS和50μM的β-巯基乙醇)。将每份50μL细胞样品加到96孔细胞培养板的各孔中。用50μL含有0.051ng/mL-3000ng/mL各种浓度重组长效人生长激素融合蛋白和Genexine GX-H9的分析培养基培养上述细胞。在37℃、5％CO2湿润培养箱中培养该细胞板96小时，然后在各孔中添加50μL ellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega，G7571)。10分钟后，酶标仪检测化学发光信号。由所得剂量反应曲线可测定重组长效人生长激素融合蛋白的生物活性，结果如表2所示，本发明所提供的融合蛋白对促进Nb2-11细胞增殖的EC50值低，对Nb2-11细胞有很好的增殖作用。与Genexine GX-H9相比，促进Nb2-11细胞增殖相对活性趋同或较好。
表2：重组长效人生长激素融合蛋白促进Nb2-11细胞增殖的实验检测结果
Figure BDA0003597162480000201
实施例6：重组长效人生长激素融合蛋白对报告基因细胞生物学活性实验
本实施例以实施例3获得的纯化后的融合蛋白进行实验，并以上述Genexine GX-H9为对照组，具体实验操作如下：
取对数生长期的报告基因细胞(293-GHR/STAT5 cell line)，胰酶消化后铺板(costar，3917)，4×104cells/well，50μL/well，将96孔白板放在37℃、5％CO2培养箱中孵育过夜。细胞加入梯度稀释的重组长效人生长激素融合蛋白，起始浓度为100nM，5倍梯度稀释，10个梯度浓度，稀释液加入细胞中，添加体积为50μL/well，将96孔白板放在37℃、5％CO2培养箱中孵育6小时。孵育结束后，取出96孔白板和Nano-Glo Luciferase Assay试剂盒(promega，N112B)，均平衡至室温，样品孔加入反应底物，添加体积为50μL/well，室温放置10分钟，采用酶标仪(Promega，GM2000)记录luminescence信号值，以蛋白浓度作为X轴，以luminescence信号值为Y轴，用GraphPad Prisim 5作四参数拟合，计算EC50值，结果如表3所示。结果表明，本发明所提供的融合蛋白促进报告基因细胞表达荧光素酶的EC50值低，且与对照组相当或更低，具有优异的促进报告基因细胞表达荧光素酶活性。
表3：重组长效人生长激素融合蛋白促进报告基因细胞表达荧光素酶的实验检测结果
融合蛋白编号 EC<sub>50</sub>(ng/mL) 相对Genexine GX-H9相对活性(％)
J1 95.47 79.67
J2 70.81 101.71
J3 87.06 82.72
J6 84.14 92.58
J7 89.72 95.29
J16 39.69 215.12
J17 56.46 157.46
J18 33.61 302.59
实施例7：测试样品诱导效应细胞Jurkat-CD16a-luc对靶细胞CHO-K1-PD-L1/GHR的ADCC效应
1、样品信息
样品名称 浓度(mg/mL)
M7824 2.05
2(J2) 0.6
5(Genexine GX-H9) 1.33
18(J18) 2.66
Acterma 20
2、细胞处理
靶细胞CHO-K1-PD-L1/GHR(上海甲贝生物医药技术有限公司，SBTCL015)处理：实验前2天进行传代处理，弃上清，用5mL PBS清洗细胞后，加入1mL的0.25％Trypsin-EDTA，37℃培养箱消化1min后，加入6mL的培养基1(450mL F12培养基+50mL FBS)终止消化，并重悬至单细胞悬液，弃去5mL细胞悬液，并加入8mL的培养基1(450mL F12培养基+50mL胎牛血清(FBS))，并加入120μL的G418，G418作用浓度为600μg/mL，混匀，放入培养箱继续培养。
效应细胞Jurkat-CD16a-luc(上海甲贝生物医药技术有限公司，SBTCL001)处理：实验前2天进行传代处理，吹打混匀细胞悬液，取5mL细胞悬液至新的T75培养瓶中，然后加入15mL的培养基2(450mL RPMI 1640培养基+50mL FBS)，并加入320μL的G418，G418作用浓度为800μg/mL，60μL的潮霉素B(Hygromycin B)，Hygromycin B作用浓度为150μg/mL，混匀，放入培养箱继续培养。
3.3、实验流程
第一天，用分析培养基1(40mL F12培养基+0.4mL FBS)将靶细胞CHO-K1-PD-L1/GHR密度调整至1.83×105细胞/mL，50μL/孔铺板过夜；第二天，先将测试样品(即为J2或J18)、阳性对照M7824以及阴性对照Acterma用分析培养基2(RPMI 1640培养基)一级稀释至0.1mg/mL，二级稀释至24μg/mL，再3倍稀释9个梯度，25μL/孔加入细胞板中，混匀，放置37℃培养箱中共孵育45min后，将细胞板取出；用分析培养基2(RPMI 1640培养基)将效应细胞Jurkat-CD16a-luc密度调整至1.47×106细胞/mL，25μL/孔加入细胞板中，混匀，放置37℃培养箱中共孵育5.5h后，将细胞板取出室温平衡后，加入One-Glo Luciferase AssaySystem(Promega，E6120)，100μL/孔加入细胞板中，移液器吹打10次混匀；室温避光裂解10min后，酶标仪检测化学发光信号值。结果如图2所示，在ADCC实验中加入阳性对照PD-L1抗体M7824(上海甲贝生物医药技术有限公司)、阴性对照IL-6R抗体Acterma(罗氏)及测试样品后，阳性对照M7824诱导效应细胞Jurkat-CD16a-luc对靶细胞CHO-K1-PD-L1/GHR有明显ADCC效应，阴性对照Acterma无ADCC效应，测试样品无ADCC效应，其中，图2的横坐标的浓度单位为ng/ml。
实施例8：测试样品诱导人血清补体对靶细胞CHO-K1-PD-L1/GHR的CDC效应
1、样品信息
样品名称 浓度(mg/mL)
Avelumab 22.65
J2 0.6
Genexine GX-H9 1.33
J18 2.66
Acterma 20
2、细胞处理
靶细胞CHO-K1-PD-L1/GHR处理：实验前2天进行传代处理，弃上清，用5mL PBS清洗细胞后，加入1mL的0.25％Trypsin-EDTA，37℃培养箱消化1min后，加入6mL的培养基1(450mL F12培养基+50mL FBS)终止消化，并重悬至单细胞悬液，弃去5mL细胞悬液，并加入8mL的培养基1(450mL F12培养基+50mL FBS)，并加入120μL的G418，G418作用浓度为600μg/mL，混匀，放入培养箱继续培养。
3、实验流程
第一天，用分化培养基(99％F12培养基+1％FBS)将靶细胞CHO-K1-PD-L1/GHR密度调整至2.0×105细胞/mL，50μL/孔铺板过夜；第二天，先将测试样品(即为J2或J18)、阳性对照Avelumab(PD-L1抗体，上海甲贝生物医药技术有限公司)以及阴性对照Acterma用分化培养基(99％F12培养基+1％FBS)一级稀释至0.1mg/mL，二级稀释至15μg/mL，再3倍稀释7个梯度，50μL/孔加入细胞板中，混匀，放置37℃培养箱中共孵育30min后，将细胞板取出；加入30％补体(含有70％分化培养基+30％补体)，50μL/孔，混匀，放置37℃培养箱中共孵育6h后，将细胞板取出室温平衡后，加入One-Glo Luminescent Cell Viability Assay，50μL/孔加入细胞板中，移液器吹打10次混匀；室温避光裂解10min后，酶标仪检测化学发光信号值。结果表明，在CDC实验中加入阳性对照PD-L1抗体Avelumab、阴性对照IL-6R抗体Acterma及SBT123供试品分子后，阳性对照Avelumab诱导人血清补体对靶细胞CHO-K1-PD-L1/GHR有明显CDC效应，阴性对照Acterma无CDC效应，测试样品无CDC效应。
实施例9：体内生物学活性测试
对J2融合蛋白和J18融合蛋白进行长效体内促生长的药效学研究：选取4周龄SPF级雄性SD大鼠，体重60g-80g。试验前2周清洁条件下手术摘除垂体，去垂体手术后2周为恢复期，给药前选择大鼠体重变化小于手术前体重±10％的合格健康动物，去垂体大鼠按体重均匀随机分为5组，分别为模型组、J2融合蛋白低剂量组、J2融合蛋白高剂量组、J18融合蛋白低剂量组和J18融合蛋白高剂量组；每组8只。给药方式为颈部皮下注射，J2融合蛋白低剂量组按9.35nmol/kg的给药量给药J2融合蛋白；J18融合蛋白低剂量组按9.35nmol/kg的给药量给药J18融合蛋白；J2融合蛋白高剂量组按56.1nmol/kg的给药量给药J2融合蛋白；J18融合蛋白高剂量组按56.1nmol/kg的给药量给药J18融合蛋白；模型组给予溶媒；各组按上述方式每周给药或给予溶媒一次，共给药或给予溶媒2次。给药后每只大鼠每天同一时间称重，计算每天大鼠体重变化情况，14天后停止试验，大鼠称重。给药后某天体重增加(g)为每只动物当日体重与给药前体重之差。实验结束进行解剖检查，确认无蝶鞍区垂体残留。比较14天内各组体重增加变化，结果如图3所示，其中，“2#-低”为J2融合蛋白低剂量组，“2#-高”为J2融合蛋白高剂量组，“18#-低”为J18融合蛋白低剂量组，“18#-高”为J18融合蛋白高剂量组；2#-低vs模型组，p＝0.0083；2#-高vs模型组，p＜0.0001；18#-低vs模型组，p＝0.0030；18#-高vs模型组，p＝0.0003。
由图3的结果可知：
(1)相比模型组，J2融合蛋白和J18融合蛋白在低剂量和高剂量的情况下，均能显著提高大鼠体重，说明本发明所提供的融合蛋白具有良好的体内活性。
(2)高剂量组的体重增长幅度比低剂量组的更大。
(3)J18融合蛋白高剂量组比J2高剂量组具有更显著的效果。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳科兴药业有限公司
<120> 重组长效人生长激素融合蛋白及其制备方法和用途
<130> PDI220116
<160> 43
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 191
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 1
<400> 1
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
1 5 10 15
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu
20 25 30
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro
35 40 45
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg
50 55 60
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu
65 70 75 80
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val
85 90 95
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100 105 110
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
115 120 125
Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser
130 135 140
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr
145 150 155 160
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe
165 170 175
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
180 185 190
<210> 2
<211> 217
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<220>
<223> 2
<400> 2
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Arg Cys His Val Lys Gly Phe Tyr Pro
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Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Lys Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 3
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 3
<400> 3
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
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Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 4
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<213> Artificial
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<223> 5
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Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
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115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Arg Cys His Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Lys Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Tyr His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala
210 215
<210> 7
<211> 224
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 7
<400> 7
Asp Lys Thr His Thr Gly Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
35 40 45
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
50 55 60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
85 90 95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
115 120 125
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Arg Cys
130 135 140
His Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Lys Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 8
<400> 8
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 9
<400> 9
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 10
<400> 10
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 11
<211> 573
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 11
<400> 11
tttcccacca ttcctctgag cagactgttc gacaacgcca tgctgagagc ccacagactg 60
caccagctgg cctttgacac ataccaggag ttcgaggagg cctacatccc caaggagcag 120
aagtacagct tcctgcagaa cccccagacc agcctgtgct tcagcgagag catccccacc 180
cccagcaata gagaggagac acagcagaag agcaacctgg agctgctgag aatcagcctg 240
ctgctgatcc agagctggct ggagcccgtt caatttctga gaagcgtgtt cgccaacagc 300
ctggtgtacg gcgccagcga ttctaatgtg tacgacctgc tgaaggacct ggaggagggc 360
atccagaccc tgatgggcag actggaggac ggctctccta gaaccggaca aattttcaag 420
cagacctaca gcaagttcga caccaacagc cacaacgacg acgccctgct gaagaactac 480
ggcctgctgt actgcttcag aaaggacatg gacaaggtgg agacattcct gagaatcgtg 540
cagtgcagaa gcgtggaggg cagctgcgga ttc 573
<210> 12
<211> 651
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 12
<400> 12
gcccctgaac tgctcggagg cccctccgtg tttctgttcc ctccaaagcc taaggacacc 60
ctgatgatca gcagaacccc tgaagtgacc tgcgtggtgg tggatgtgtc ccacgaggat 120
cccgaagtga agttcaattg gtacgtggac ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag 180
cctagagagg aacagtacaa cagcacctac agagtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac 240
caggattggc tgaacggcaa agagtacaag tgcaaggtgt ccaacaaggc cctgcctgct 300
cctatcgaga aaaccatcag caaggccaag ggccagccta gggaacccca ggtttacaca 360
ctgcctccaa gcagggacga gctgaccaag aatcaggtgt ccctgcggtg tcacgtgaag 420
ggcttctacc cttccgatat cgccgtggaa tgggagagca atggccagcc tgagaacaac 480
tacaagacca ccaagccagt gctggacagc gacggctcat tcttcctgta cagcaccctg 540
accgtggaca agtccagatg gcaacagggc aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag 600
gccctgcaca accactacac ccagaagtcc ctgagcctgt ctcctggcaa a 651
<210> 13
<211> 651
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 13
<400> 13
gctcctgaac tgctgggagg acctagcgtg tttctgtttc ctcccaaacc taaagacacc 60
ctgatgatca gcagaacccc cgaggtgacc tgcgtggtgg ttgatgtgtc tcatgaagac 120
cccgaagtga agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcacaatgc taaaaccaag 180
cccagagagg agcagtacaa cagcacctac agagtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac 240
caagattggc tgaatggcaa ggaatacaag tgcaaggtga gcaacaaggc cctgcccgcc 300
cctattgaaa aaaccattag caaggctaag ggccagccca gagagcccca agtgtataca 360
ctgcccccta gcagagatga actgaccaaa aaccaggtga gcctgagatg ccacgtgaag 420
ggcttttacc ccagcgacat tgccgtggag tgggagagca atggccaacc tgaaaacaat 480
tacaagacca ccaagcccgt gctggacagc gacggatctt tctttctgta tagcaccctg 540
accgtggaca agagcagatg gcagcagggc aatgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag 600
gccctgcaca atcactatac ccagaagagc ctgagcctga gccccggcaa a 651
<210> 14
<211> 654
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 14
<400> 14
cccgcccccg aactgctggg aggaccttct gtgtttctgt ttcctcccaa acccaaagac 60
accctgatga tcagcagaac ccccgaggtg acctgcgtgg ttgtggatgt gtctcatgag 120
gatcccgagg tgaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcacaa tgctaagaca 180
aagcccagag aggagcagta caacagcacc tacagagtgg tgagcgtgct gaccgtgctg 240
caccaagatt ggctgaatgg aaaggaatac aagtgcaagg tgagcaacaa ggccctgccc 300
gcccctattg aaaaaacaat tagcaaggcc aagggccagc ccagagaacc tcaagtgtat 360
accctgcctc ccagcagaga tgagctgaca aaaaatcagg tgagcctgag atgccacgtg 420
aagggcttct accccagcga cattgccgtg gagtgggaaa gcaatggcca acctgagaac 480
aactacaaga ccaccaagcc cgtgctggac agcgacggat ctttttttct gtacagcacc 540
ctgaccgtgg acaagagcag atggcagcag ggcaatgtgt tcagctgcag cgtgatgcac 600
gaggccctgc ataatcacta cacccagaaa agcctgagcc tgagccccgg caag 654
<210> 15
<211> 651
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 15
<400> 15
gctcctgaac tgctcggagg cccttccgtg ttcctgtttc ctccaaagcc taaggacacc 60
ctgatgatca gcagaacccc tgaagtgacc tgcgtggtgg tggatgtgtc ccacgaggat 120
cccgaagtga agttcaattg gtacgtggac ggcgtcgagg tgcacaacgc caagacaaag 180
cctagagagg aacagtacaa cagcacctac agagtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac 240
caggattggc tgaacggcaa agagtacaag tgcaaggtgt ccaacaaggc cctgcctgct 300
cctatcgaga aaaccatcag caaggccaag ggccagccta gggaacccca ggtttacaca 360
ctgcctccaa gcagggacga gctgaccaag aatcaggtgt ccctgcggtg tcacgtgaag 420
ggcttctacc cttccgatat cgccgtggaa tgggagagca atggccagcc tgagaacaac 480
tacaagacca ccaagccagt gctggacagc gacggctcat tcttcctgta cagcaccctg 540
accgtggaca agtccagatg gcaacagggc aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag 600
gccctgcaca accactacac ccagaagtcc ctgagcctgt ctcctggcaa a 651
<210> 16
<211> 651
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 16
<400> 16
gctcctgaac tgctcggagg cccttccgtg ttcctgtttc ctccaaagcc taaggacacc 60
ctgatgatca gcagaacccc tgaagtgacc tgcgtggtgg tggatgtgtc ccacgaggat 120
cccgaagtga agttcaattg gtacgtggac ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag 180
cctagagagg aacagtacaa cagcacctac agagtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac 240
caggattggc tgaacggcaa agagtacaag tgcaaggtgt ccaacaaggc cctgcctgct 300
cctatcgaga aaaccatcag caaggccaag ggccagccta gggaacccca ggtttacaca 360
ctgcctccaa gcagggacga gctgaccaag aatcaggtgt ccctgcggtg tcacgtgaag 420
ggcttctacc cttccgatat cgccgtggaa tgggagagca atggccagcc tgagaacaac 480
tacaagacca ccaagccagt gctggacagc gacggctcat tcttcctgta cagcaccctg 540
accgtggaca agtccagatg gcaacagggc aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag 600
gccctgcaca accactacac ccagaagtcc ctgagcctgt ctcctggcaa a 651
<210> 17
<211> 651
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 17
<400> 17
gctcccgaac tgctgggagg acccagcgtg tttctgtttc cccctaaacc taaggacacc 60
ctgatgatca gcagaacccc cgaggtgacc tgcgtggtgg tggatgtgag ccatgaggac 120
cccgaagtga aattcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcacaatgc taagaccaag 180
cccagagagg agcagtacaa cagcacctac agagtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac 240
caagattggc tgaatggcaa agagtacaag tgcaaggtga gcaacaaggc cctgcccgcc 300
cctattgaaa aaaccattag caaagccaag ggccagccca gagagcccca agtgtacaca 360
ttacccccta gcagagatga actgaccaaa aaccaggtga gcctgagatg ccacgtgaag 420
ggcttttacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atggacaacc tgagaacaac 480
tacaagacca ccaagcccgt gctggacagc gacggatctt tctttctgta cagcaccctg 540
accgtggaca agagcagatg gcagcagggc aatgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag 600
gccctgcata atcactacac ccagaagagc ctgagcctga gccccggagc t 651
<210> 18
<211> 651
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 18
<400> 18
gctcctgaac tgctgggagg acctagcgtg tttctgtttc ctcctaaacc caaggacacc 60
ctgatgatca gcagaacccc cgaggtgacc tgcgtggtgg tggatgtgag ccatgaagat 120
cccgaagtga agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcacaatgc taaaaccaag 180
cccagagagg agcagtacaa cagcacctac agagtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac 240
caagattggc tgaatggaaa ggagtacaag tgcaaggtga gcaacaaggc cctgcccgcc 300
cctattgaaa aaaccattag caaagctaag ggccagccca gagagcccca agtgtataca 360
agccctccca gcagggacga gctgaccaaa aatcaggtga gcctgagatg ccacgtgaag 420
ggcttttacc ccagcgacat cgccgtggaa tgggaaagca atggccaacc cgagaacaac 480
tataagacca ccaagcccgt gctggacagc gacggatcct tttttctgta cagcgacctg 540
accgtggaca agagcagatg gcagcagggc aatgtgttca gctgcagcgt gtatcacgag 600
gccctgcaca atcactacac ccagaaaagc ctgagcctga gccccggcaa a 651
<210> 19
<211> 651
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 19
<400> 19
gcccctgagc tgcttggagg acctagcgtt tttttatttc cccccaaacc taaggacacc 60
ctgatgatca gcagaacccc cgaggtgacc tgcgtggttg tggatgtgag ccatgaagat 120
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cccagagagg agcagtacaa cagcacctac agagtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac 240
caagattggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtga gcaacaaggc cctgcccgcc 300
cctattgaaa aaaccattag caaggccaag ggccagccca gagaacccca agtgtatacc 360
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ggcttttacc ccagcgacat cgccgtggag tgggaatcta atggacaacc tgagaacaac 480
tacaagacca ccaagcccgt gctggacagc gacgggagct ttttcctgta tagcgacctg 540
accgtggaca agagcagatg gcagcagggc aatgtgttca gctgcagcgt gtatcacgag 600
gccctgcata atcactacac ccagaaaagc ctgagcctga gccccggagc t 651
<210> 20
<211> 672
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 20
<400> 20
gacaagacac acaccggacc cgcccccgaa ctgctgggag gaccttctgt gtttctgttt 60
cctcccaaac ccaaagacac cctgatgatc agcagaaccc ccgaggtgac ctgcgtggtt 120
gtggatgtgt ctcatgagga tcccgaggtg aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 180
gtgcacaatg ctaagacaaa gcccagagag gagcagtaca acagcaccta cagagtggtg 240
agcgtgctga ccgtgctgca ccaagattgg ctgaatggaa aggaatacaa gtgcaaggtg 300
agcaacaagg ccctgcccgc ccctattgaa aaaacaatta gcaaggccaa gggccagccc 360
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agcctgagat gccacgtgaa gggcttctac cccagcgaca ttgccgtgga gtgggaaagc 480
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agctgcagcg tgatgcacga ggccctgcat aatcactaca cccagaaaag cctgagcctg 660
agccccggca ag 672
<210> 21
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 21
<400> 21
ggaggaggag gaagcggagg cggaggatct ggaggaggag gaagc 45
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 22
<400> 22
ggcggcggag gatctggcgg aggtggaagt 30
<210> 23
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 23
<400> 23
ggcggcggag gatct 15
<210> 24
<211> 408
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 24
<400> 24
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
1 5 10 15
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu
20 25 30
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro
35 40 45
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg
50 55 60
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu
65 70 75 80
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val
85 90 95
Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp
100 105 110
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
115 120 125
Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser
130 135 140
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr
145 150 155 160
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe
165 170 175
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Ala
180 185 190
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
195 200 205
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
210 215 220
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
225 230 235 240
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
245 250 255
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
260 265 270
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
275 280 285
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
290 295 300
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
305 310 315 320
Lys Asn Gln Val Ser Leu Arg Cys His Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
325 330 335
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
340 345 350
Lys Thr Thr Lys Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
355 360 365
Ser Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
370 375 380
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
385 390 395 400
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
405
<210> 25
<211> 423
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 25
<400> 25
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
1 5 10 15
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu
20 25 30
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro
35 40 45
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg
50 55 60
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu
65 70 75 80
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val
85 90 95
Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp
100 105 110
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
115 120 125
Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser
130 135 140
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr
145 150 155 160
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe
165 170 175
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Gly
180 185 190
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro
195 200 205
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
210 215 220
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
225 230 235 240
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
245 250 255
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
260 265 270
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
275 280 285
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
290 295 300
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
305 310 315 320
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
325 330 335
Asn Gln Val Ser Leu Arg Cys His Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
340 345 350
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
355 360 365
Thr Thr Lys Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
370 375 380
Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
385 390 395 400
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
405 410 415
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
420
<210> 26
<211> 415
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 26
<400> 26
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
1 5 10 15
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu
20 25 30
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro
35 40 45
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg
50 55 60
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu
65 70 75 80
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val
85 90 95
Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp
100 105 110
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
115 120 125
Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser
130 135 140
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr
145 150 155 160
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe
165 170 175
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Asp
180 185 190
Lys Thr His Thr Gly Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
195 200 205
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
210 215 220
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
225 230 235 240
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
245 250 255
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
260 265 270
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
275 280 285
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
290 295 300
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
305 310 315 320
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Arg Cys His
325 330 335
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
340 345 350
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Lys Pro Val Leu Asp Ser
355 360 365
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
370 375 380
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
385 390 395 400
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
405 410 415
<210> 27
<211> 418
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 27
<400> 27
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
1 5 10 15
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu
20 25 30
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro
35 40 45
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg
50 55 60
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu
65 70 75 80
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val
85 90 95
Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp
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Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
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Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser
130 135 140
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr
145 150 155 160
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe
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Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
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Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
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Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
275 280 285
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Lys Pro Val
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Thr Leu Thr Val Asp
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
405 410 415
Gly Lys
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<211> 413
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 28
<400> 28
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
1 5 10 15
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu
20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
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130 135 140
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Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe
165 170 175
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Gly
180 185 190
Gly Gly Gly Ser Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
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Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
275 280 285
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<213> Artificial
<220>
<223> 29
<400> 29
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Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
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<213> Artificial
<220>
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<400> 30
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<211> 423
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 31
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420
<210> 32
<211> 1224
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 32
<400> 32
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tccctgagcc tgtctcctgg caaa 1224
<210> 33
<211> 1269
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 33
<400> 33
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 34
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<213> Artificial
<220>
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ctgaccgtgg acaagtccag atggcaacag ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac 1200
gaggccctgc acaaccacta cacccagaag tccctgagcc tgtctcctgg caaa 1254
<210> 36
<211> 1239
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 36
<400> 36
ttccccacca ttcctctgag ccggctgttc gacaacgcca tgctgagagc ccacagactg 60
caccagctgg ccttcgacac ctaccaagag ttcgaggaag cctacattcc caaagagcag 120
aagtacagct tcctgcagaa ccctcagacc agcctgtgct tcagcgagag catccccaca 180
cctagcaaca gagaggaaac ccagcagaag tccaacctgg aactgctgcg gatcagcctg 240
ctgctgatcc agtcttggct ggaacccgtg cagttcctga gaagcgtgtt cgccaacagc 300
ctggtgtacg gcgccagcga cagcaacgtt tacgacctgc tgaaggacct ggaagagggc 360
atccagacac tgatgggcag actggaagat ggcagcccta gaaccggcca gatcttcaag 420
cagacctaca gcaagttcga caccaacagc cacaacgacg acgccctgct gaaaaactac 480
ggcctgctgt actgctttcg gaaggacatg gacaaggtgg aaaccttcct gcggatcgtg 540
cagtgcagaa gcgtggaagg ctcttgcgga tttggcggcg gaggatctgc tcctgaactg 600
ctcggaggcc cttccgtgtt cctgtttcct ccaaagccta aggacaccct gatgatcagc 660
agaacccctg aagtgacctg cgtggtggtg gatgtgtccc acgaggatcc cgaagtgaag 720
ttcaattggt acgtggacgg cgtggaagtg cacaacgcca agaccaagcc tagagaggaa 780
cagtacaaca gcacctacag agtggtgtcc gtgctgaccg tgctgcacca ggattggctg 840
aacggcaaag agtacaagtg caaggtgtcc aacaaggccc tgcctgctcc tatcgagaaa 900
accatcagca aggccaaggg ccagcctagg gaaccccagg tttacacact gcctccaagc 960
agggacgagc tgaccaagaa tcaggtgtcc ctgcggtgtc acgtgaaggg cttctaccct 1020
tccgatatcg ccgtggaatg ggagagcaat ggccagcctg agaacaacta caagaccacc 1080
aagccagtgc tggacagcga cggctcattc ttcctgtaca gcaccctgac cgtggacaag 1140
tccagatggc aacagggcaa cgtgttcagc tgcagcgtga tgcacgaggc cctgcacaac 1200
cactacaccc agaagtccct gagcctgtct cctggcaaa 1239
<210> 37
<211> 1269
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 37
<400> 37
gctcccgaac tgctgggagg acccagcgtg tttctgtttc cccctaaacc taaggacacc 60
ctgatgatca gcagaacccc cgaggtgacc tgcgtggtgg tggatgtgag ccatgaggac 120
cccgaagtga aattcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcacaatgc taagaccaag 180
cccagagagg agcagtacaa cagcacctac agagtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac 240
caagattggc tgaatggcaa agagtacaag tgcaaggtga gcaacaaggc cctgcccgcc 300
cctattgaaa aaaccattag caaagccaag ggccagccca gagagcccca agtgtacaca 360
ttacccccta gcagagatga actgaccaaa aaccaggtga gcctgagatg ccacgtgaag 420
ggcttttacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atggacaacc tgagaacaac 480
tacaagacca ccaagcccgt gctggacagc gacggatctt tctttctgta cagcaccctg 540
accgtggaca agagcagatg gcagcagggc aatgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag 600
gccctgcata atcactacac ccagaagagc ctgagcctga gccccggagc tggaggagga 660
ggaagcggag gaggaggaag cggcggagga ggatcttttc ccacaattcc tctgagcaga 720
ctgttcgaca acgccatgct gagagcccac agactgcacc agctggcctt tgacacatac 780
caggagttcg aggaggccta catccccaag gagcagaagt acagcttcct gcagaacccc 840
cagaccagcc tgtgctttag cgaaagcatt cccaccccca gcaacagaga ggagacacaa 900
caaaagagca acctggagct gctgagaatc agcctgctgc tgatccagag ctggctggag 960
cccgtgcaat ttctgagaag cgtgttcgcc aatagcctgg tgtacggcgc tagcgatagc 1020
aacgtgtatg acctgctgaa ggacctggag gagggcatcc aaaccctgat gggcagactg 1080
gaggacggca gccctagaac aggacagatt tttaagcaga cctacagcaa gttcgacacc 1140
aacagccaca acgacgacgc cctgctgaaa aactacggcc tgctgtactg cttcagaaag 1200
gacatggaca aggtggagac attcctgaga atcgtgcagt gcagaagcgt ggagggcagc 1260
tgtggattt 1269
<210> 38
<211> 1269
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 38
<400> 38
ttccccacaa tccccctgag cagactgttt gacaacgcca tgctgagagc ccacagactg 60
caccagctgg ccttcgatac ataccaggag tttgaggagg cctacatccc caaggagcag 120
aagtacagct tcctgcagaa cccccagacc agcctgtgtt tcagcgagag cattcccaca 180
cccagcaaca gagaggaaac ccagcaaaag agcaacctgg agctgctgag aatcagcctg 240
ctgctgatcc agagctggct ggagcctgtg caattcctga gaagcgtgtt cgccaacagc 300
ctggtgtacg gcgcttctga tagcaatgtg tacgacctgc tgaaggacct ggaggagggc 360
attcagacac tgatgggcag actggaggac ggcagcccta gaacaggaca aattttcaag 420
cagacctaca gcaagttcga caccaacagc cacaacgacg acgccctgct gaaaaactac 480
ggcctgctgt actgcttcag aaaggacatg gacaaggtgg agacattcct gagaatcgtg 540
cagtgcagaa gcgtggaggg cagctgtgga tttggaggcg gaggaagcgg aggaggagga 600
agcggaggag gaggaagcgc tcctgaactg ctgggaggac ctagcgtgtt tctgtttcct 660
cctaaaccca aggacaccct gatgatcagc agaacccccg aggtgacctg cgtggtggtg 720
gatgtgagcc atgaagatcc cgaagtgaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 780
cacaatgcta aaaccaagcc cagagaggag cagtacaaca gcacctacag agtggtgagc 840
gtgctgaccg tgctgcacca agattggctg aatggaaagg agtacaagtg caaggtgagc 900
aacaaggccc tgcccgcccc tattgaaaaa accattagca aagctaaggg ccagcccaga 960
gagccccaag tgtatacaag ccctcccagc agggacgagc tgaccaaaaa tcaggtgagc 1020
ctgagatgcc acgtgaaggg cttttacccc agcgacatcg ccgtggaatg ggaaagcaat 1080
ggccaacccg agaacaacta taagaccacc aagcccgtgc tggacagcga cggatccttt 1140
tttctgtaca gcgacctgac cgtggacaag agcagatggc agcagggcaa tgtgttcagc 1200
tgcagcgtgt atcacgaggc cctgcacaat cactacaccc agaaaagcct gagcctgagc 1260
cccggcaaa 1269
<210> 39
<211> 1269
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 39
<400> 39
gcccctgagc tgcttggagg acctagcgtt tttttatttc cccccaaacc taaggacacc 60
ctgatgatca gcagaacccc cgaggtgacc tgcgtggttg tggatgtgag ccatgaagat 120
cccgaggtga aattcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcacaatgc caaaacaaag 180
cccagagagg agcagtacaa cagcacctac agagtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac 240
caagattggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtga gcaacaaggc cctgcccgcc 300
cctattgaaa aaaccattag caaggccaag ggccagccca gagaacccca agtgtatacc 360
agccccccca gcagagatga gctgacaaaa aatcaggtga gcctgagatg ccacgtgaag 420
ggcttttacc ccagcgacat cgccgtggag tgggaatcta atggacaacc tgagaacaac 480
tacaagacca ccaagcccgt gctggacagc gacgggagct ttttcctgta tagcgacctg 540
accgtggaca agagcagatg gcagcagggc aatgtgttca gctgcagcgt gtatcacgag 600
gccctgcata atcactacac ccagaaaagc ctgagcctga gccccggagc tggaggagga 660
ggaagcggag gaggaggaag cggaggagga ggatcttttc ctacaattcc tctgagcaga 720
ctgttcgaca acgccatgct gagagcccac agactgcacc agctggcctt tgatacatac 780
caggagttcg aggaggccta catccccaag gagcagaagt acagcttcct gcagaacccc 840
cagaccagcc tgtgttttag cgaaagcatt cccacaccca gcaatagaga agagacacag 900
cagaagagca acctggagct gctgagaatc agcctgctgc tgatccagag ctggctggag 960
cctgtgcaat ttctgagaag cgtgttcgcc aacagcctgg tgtacggcgc tagcgactct 1020
aacgtgtatg atctgctgaa agacctggag gagggcatcc agacactgat gggcagactg 1080
gaggacggca gccccagaac aggacagata tttaagcaaa cctacagcaa gttcgacacc 1140
aacagccaca acgacgacgc cctgctgaaa aactacggcc tgctgtactg cttcagaaag 1200
gacatggaca aggtggagac attcctgaga atcgtgcagt gcagaagcgt ggagggcagc 1260
tgtggattt 1269
<210> 40
<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 40
<400> 40
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145 150 155 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 41
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 41
<400> 41
Asp Lys Thr His Thr Gly
1 5
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 42
<400> 42
gacaagacac acaccgga 18
<210> 43
<211> 436
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 43
<400> 43
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
1 5 10 15
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu
20 25 30
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro
35 40 45
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg
50 55 60
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu
65 70 75 80
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val
85 90 95
Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp
100 105 110
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
115 120 125
Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser
130 135 140
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr
145 150 155 160
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe
165 170 175
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Arg
180 185 190
Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu
195 200 205
Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr
210 215 220
Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
225 230 235 240
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
245 250 255
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
260 265 270
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
275 280 285
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
290 295 300
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
305 310 315 320
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
325 330 335
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
340 345 350
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
355 360 365
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
370 375 380
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
385 390 395 400
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
405 410 415
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
420 425 430
Ser Leu Gly Lys
435

Claims (10)

1.一种Fc突变体，其特征在于，包括：
第一肽段，所述第一肽段相较于野生型IgG1的Fc片段，具有如下位点的突变：
第228位、第229位、第230位、第366位、第368位、第395位和第409位，以及第351位、第428位和第447位中的至少之一；或
第228位、第229位、第366位、第368位、第395位和第409位；
任选地，所述第一肽段相较于野生型IgG1的Fc片段，具有如下位点的突变：
1)第228位、第229位、第230位、第366位、第368位、第395位、第409位和第447位；或，
2)第228位、第229位、第230位、第351位、第366位、第368位、第395位、第409位和第428位；或，
3)第228位、第229位、第230位、第351位、第366位、第368位、第395位、第409位、第428位和第447位；
任选地，所述第一肽段相较于野生型IgG1的Fc片段，具有如下突变：
1)P228 Delete、C229 Delete、P230 Delete、T366R、L368H、P395K、K447A和K409D或K409T；或，
2)P228 Delete、C229 Delete、P230 Delete、L351S、T366R、L368H、P395K、M428Y和K409D或K409T；或，
3)P228 Delete、C229 Delete、P230 Delete、L351S、T366R、L368H、P395K、M428Y、K447A和K409D或K409T；或
4)P228 Delete、C229 Delete、T366R、L368H、P395K和K409D或K409T；
任选地，进一步包括：
野生型IgG1的铰链区片段，所述野生型IgG1的铰链区片段的C端与所述第一肽段的N端相连；
任选地，所述野生型IgG1的铰链区片段具有如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列；
任选地，所述Fc突变体具有如SEQ ID NO:3～7任一项所示的氨基酸序列；
任选地，所述Fc突变体为单体形式。
2.一种融合蛋白，其特征在于，包含：
第二肽段，所述第二肽段包括生物活性分子功能区；
第三肽段，所述第三肽段包括Fc突变体，所述Fc突变体具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或如权利要求1所限定的Fc突变体，所述第二肽段与所述第三肽段相连。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二肽段包含生长激素、生长激素类似物、生长激素功能区或生长激素类似物功能区，优选为人生长激素或人生长激素功能区；
任选地，所述人生长激素具有如SEQ ID NO:1或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列；
任选地，所述第二肽段的N端与所述第三肽段的C端相连；或者，
所述第二肽段的C端与所述第三肽段的N端相连。
4.根据权利要求2或3所述的融合蛋白，其特征在于，进一步包括连接肽，所述连接肽设置于所述第二肽段和第三肽段之间；
任选地，所述连接肽的N端与所述第三肽段的C端相连，所述连接肽的C端与所述第二肽段的N端相连；或者，
所述连接肽的N端与所述第二肽段的C端相连，所述连接肽的C端与所述第三肽段的N端相连；
任选地，所述连接肽的氨基酸序列为(GGGGS)n，其中n为大于或等于1的整数，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
任选地，所述连接肽具有如SEQ ID NO:8～10任一项所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:24～31任一项所示的氨基酸序列。
6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的Fc突变体或权利要求2～5任一项所述的融合蛋白；
任选地，所述核酸分子为DNA。
7.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求6所述的核酸分子；
任选地，所述表达载体为真核表达载体；
优选地，所述表达载体为慢病毒载体。
8.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包括：
携带权利要求6所述的核酸分子；或，
表达权利要求1所述的Fc突变体或权利要求2～5任一项所述的融合蛋白；
任选地，所述重组细胞是通过将权利要求7所述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的；
任选地，所述重组细胞为真核细胞；
优选地，所述重组细胞为哺乳动物细胞。
9.一种药物组合物，其特征在于，包括：
权利要求2～5任一项所述的融合蛋白；
任选地，所述药物组合物进一步包括药学上可接受的辅料；
任选地，所述药物组合物的剂型为注射剂；
任选地，所述药物组合物的给药途径包括皮下注射或静脉注射。
10.权利要求2～5任一项所述的融合蛋白、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的表达载体、权利要求8所述的重组细胞、权利要求9所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防生长激素异常相关疾病；
任选地，所述生长激素异常相关疾病至少包括选自下列之一：
儿童生长激素缺乏症、特发性体型矮小、成人生长激素缺乏、特纳氏综合征、普拉德-威利综合征、肾衰竭、化疗治疗和AIDS治疗期间的异化状态引起的疾病、子宫内生长迟缓。
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