CN115862731B - 与花生含油量相关主效数量性状基因位点及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组与花生含油量相关主效数量性状基因位点及其应用，主效QTL命名为qCOA08_1和/或qCOA08_2，qCOA08_1位于花生基因组的第8个连锁群中，其标记区间为Chr.08_38056541‑Chr.08_40978133；qCOA08_2位于花生基因组的第8个连锁群中，其标记区间为Chr.08_44887537‑Chr.08_46776535。本发明提供的技术能够用于花生含油量相关的分子标记辅助育种MAS。

Description

与花生含油量相关主效数量性状基因位点及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是一种与花生含油量相关主效数量性状基因位点及应用分析。

背景技术

花生作为人类优质食用油的重要来源，已在100多个国家广泛种植。根据FAOSTAT(http://faostat3.fao.org/)公布的数据，全球花生荚果的年产量已经超过4400万吨，而中国占全球花生产量的38％，是世界上最大的花生生产国。即便如此，国内的花生产量仍然难以满足日益增长的食用花生油需求，而且由于中国现有耕地有限，通过增加耕地来增加花生产量是不现实的。据报道，花生含油量每增加1％，油脂加工的经济效益就会增加7％(Shasidhar et al.2017)。因此，提高花生单产和含油量以缓解不断增长的需求一直是全球花生育种计划的主要目标。

然而，几乎所有作物的产量和品质性状都是复杂的，数量性状受到遗传和环境因素的很大影响(Baring et al.2013；Wilson等，2013；Cui等，2020；Chen等人2019)。例如，Chen等人(2019)估计了多种环境下的几种产量相关性状。供试产量相关性状的遗传力在0.34～0.93之间，方差分析结果显示RIL群体间、环境间及RIL×环境互作均存在显著差异。在某些情况下，这些连续的数量性状和交替株系之间的边际变异会使田间试验中很难区分表现最好的株系。因此，弄清遗传力和遗传方式，有利于育种人员制定育种策略。目前，油脂含量的测定需要比较困难的过程，只有在收获后才能进行。在这种情况下，传统的提高含油量的育种策略被认为是一项成本高、效率低、耗时长的工作。在现代育种中，通过标记辅助选择(marker-assisted selection,MAS)可以在早期快速从种质资源中选择感兴趣的性状，且不受复杂环境的影响。MAS在培育具有一些复杂数量性状的优良作物方面取得了许多成功，如棉花、水稻和普通大豆(Tian et al.2021；Hulsekemp et al.2015；Shi等。2021)以及动物育种中(Chen等。2022)。然而，MAS的建立必须在特定的、有用的基因或QTL定位成功的条件下进行。

为了实现MAS育种目标，育种家们一直在努力寻找有价值的QTL。在世界各地的许多情况下，确定花生油含量的QTL并开展有针对性的育种工作，将是旨在确保人类食用油供应的项目的重要组成部分。遗憾的是，尽管育种家已经认识到MAS育种的重要性，但挖掘遗传资源提高花生油含量的研究明显滞后于大豆等其他油料作物，尤其是功能基因的克隆。由于花生品种缺乏相关的有利基因资源，利用MAS选育高油花生品种仍难以实现。因此，探索遗传资源，进一步通过图位克隆方式获得增加籽粒含油量有利基因，可以促进花生MAS育种，加快育种进程。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种一种与花生含油量相关主效数量性状基因位点及其应用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种筛选与花生含油量相关的基因的方法，利用全基因组序列分析筛选候选基因，首先对两个亲本花生品种冀花5号JH5和开选01-6KX01-6进行基因组变异的比较，经过筛选在JH5和KX01-6两个候选区域之间识别出高质量的可变SNPs和Indels，去除分布在内含子、基因间区域和编码区下游及其他不能导致功能缺失的变异，保留分布在5'-UTR、3'-UTR、上游、剪接和外显子编码区的变异，所得变异对应的基因确定为候选基因。

一种筛选与花生含油量相关的基因的方法，通过转录组分析筛选候选基因，检测qCOA08_1和qCOA08_2两个候选区间中所有基因在油脂代谢关键期的表达模式，候选区间的全部基因作为候选基因，首先将在两个亲本花生品种冀花5号JH5和开选01-6KX01-6中均未表达的候选基因去除，这些基因不作为qCOA08_1和qCOA08_2的效应基因，剩余候选基因根据倍数变化和P值检测差异表达，检测标准为：倍数变化为log2fc≥1或≤-1，P指为P<0.001；即可得到qCOA08_1和qCOA08_2候选区间为数不多的差异表达基因DEGs，然后从所得差异表达基因DEGs中筛选强候选基因，经过试验验证或文献验证得到最终的候选基因或候选基因小组。

作为本发明的一种优选技术方案，所述强候选基因为花生Ah.UVRI66基因，其编码乙烯转录因子Wrinkled 1WRI1。

作为本发明的一种优选技术方案，所述Ah.UVRI66基因的FPKM值在低含油量品种KX01-6中为4.65，而Ah.UVRI66在高含油量品种JH5中表达量为22.03，为低油品种的5倍。

作为本发明的一种优选技术方案，所述Ah.UVRI66基因表达差异的分子来源在于启动子区主导的基因表达模式变异。

作为本发明的一种优选技术方案，所述Ah.UVRI66的启动子区在748和749核苷酸之间存在一个6bp ATATAT的插入，对应花生亲本之间含油量表达差异的分子来源或候选分子来源。

一种与花生含油量相关的主效QTL，所述主效QTL命名为qCOA08_1和/或qCOA08_2，所述qCOA08_1位于花生基因组的第8个连锁群中，其标记区间为Chr.08_38056541-Chr.08_40978133；所述qCOA08_2位于花生基因组的第8个连锁群中，其标记区间为Chr.08_44887537-Chr.08_46776535。

所述主效QTL的用途，用于开发与花生含油量相关的分子标记及其引物。

所述主效QTL的用途，用于花生含油量相关的分子标记辅助育种。

主效QTL的用途，基于所述主效QTL开发紧密连锁分子标记，通过专用的dCAPs标记识别所述紧密连锁分子标记，由此识别待测花生植株是否为对应的基因型，实现高含油量花生的分子标记辅助育种。

用于花生含油量性状识别的分子标记，为关联于主效QTL qCOA08_1下游侧翼序列的分子标记Chr.8_46776535，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1所示。

用于鉴定或辅助鉴定花生含油量性状的dCAPs引物，包括：对应于分子标记Chr.8_46776535的dCAPs-F和dCAPs-R引物对，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；对应的酶切位点为EcoRI，对应的识别序列为GAATTC。

用于花生含油量性状识别的分子标记，为关联于主效QTL qCOA08_1上游侧翼序列的分子标记Chr.8_44887537，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.4所示。

用于鉴定或辅助鉴定花生含油量性状的dCAPs引物，包括：对应于分子标记Chr.8_44887537的dCAPs-F和dCAPs-R引物对，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；对应的酶切位点为BsrBI，对应的识别序列为GAGCGG。

用于花生含油量性状识别的分子标记，为关联于主效QTL qCOA08_2上游侧翼序列的分子标记Chr.8_38056541，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.7所示。

用于鉴定或辅助鉴定花生含油量性状的dCAPs引物，包括：对应于分子标记Chr.8_38056541的dCAPs-F和dCAPs-R引物对，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；对应的酶切位点为FokI，对应的识别序列为GGATG。

用于花生含油量性状识别的分子标记，为关联于主效QTL qCOA08_2下游侧翼序列的分子标记Chr.8_40978133，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.10所示。

用于鉴定或辅助鉴定花生含油量性状的dCAPs引物，包括：对应于分子标记Chr.8_44887537的dCAPs-F和dCAPs-R引物对，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；对应的酶切位点为HindIII，对应的识别序列为AAGCTT。

用于鉴定或辅助鉴定花生含油量性状的试剂盒，通过检测花生主效QTL qCOA08_1或qCOA08_2的多态性，用于花生含油量相关的分子标记辅助育种。

作为本发明的一种优选技术方案，所述试剂盒包含序列表中SEQ ID NO.2和SEQID NO.3组成的dCAPs引物对，和/或序列表中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的dCAPs引物对，和/或序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9组成的dCAPs引物对，和/或序列表中SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12组成的dCAPs引物对

所述的试剂盒、引物或分子标记，在花生分子育种中用于鉴定或辅助鉴定花生的含油量性状。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明基于RIL群体构建了包含2840个多态性SNP标记的高分辨率遗传图谱，并在6个环境中稳定检测到2个效应较大的有价值QTL位点qCOA08_1和qCOA08_2。根据侧翼标记物的物理位置，qCOA08_1和qCOA08_2的物理间隔被定位在～2.9Mb和～1.7Mb之间。同时进行全基因组重测序和转录组分析，将候选基因的数量限定在40个以内。而一个编码WRI1转录因子并在亲本间表现出不同表达模式的强候选基因。本发明为花生优异等位基因的克隆提供了实用基础，与qCOA08_1和qCOA08_2紧密连锁的多态SNP标记或开发的dCAPs标记有助于加快MAS的育种进程。

附图说明

图1为6种环境下RIL种群油分的表型分布及差异分析相关图谱。

图2为20条染色体上多态性SNPs标记的物理位置(A)及对应的遗传图谱(B)。

图3为两个候选区变异的基因组分布图(a)及编码区突变类型图(b)。

图4为野外条件下通过NIL分析确认花生高油基因1-AhyHOF1的定位和功能；其中，测试性状的值以平均SE(n＝6株植物)给出，星号表示Student’s t检验中p＝0.05(*)、p＝0.01(**)和p＝0.001(**)水平的NILs之间存在显著差异，“ns”表示无显著差异。

具体实施方式

以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。在以下实施例的描述中，为了说明而不是为了限定，提出了诸如特定系统结构、技术之类的具体细节，以便透彻理解本申请实施例。然而，本领域的技术人员应当清楚，在没有这些具体细节的其它实施例中也可以实现本申请。在其它情况中，省略对众所周知的系统、装置、电路以及方法的详细说明，以免不必要的细节妨碍本申请的描述。

如在本申请说明书和所附权利要求书中所使用的那样，术语“如果”可以依据上下文被解释为“当...时”或“一旦”或“响应于确定”或“响应于检测到”。类似地，短语“如果确定”或“如果检测到[所描述条件或事件]”可以依据上下文被解释为意指“一旦确定”或“响应于确定”或“一旦检测到[所描述条件或事件]”或“响应于检测到[所描述条件或事件]”。另外，在本申请说明书和所附权利要求书的描述中，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

实施例1、自然环境下RILs群体的表型评价

为挖掘能够提高花生含油量的基因资源，选用含油量表型差异较大的花生品种冀花5号(JH5)和开选01-6(KX01-6)构建重组自交系(RIL)(Table.1)。通过广义遗传力(h² _b)和含油量的分布，确定RIL群体是否适合进行油分含量的遗传分析。由表1可知，6种环境下的含油量均值大多数位于亲本均值之间，而RILs的最小值和最大值均超过亲本均值的极值，这表明JH5和KX01-6之间存在广泛的遗传变异。此外，6个环境中含油量的h² _b值较高，为0.81(表1)，RILs直方图结果显示，含油量存在广泛的超亲遗传，这种超亲遗传力主要来源于遗传重组，这在QTL分析中是有利的。此外，尽管试验站环境对油分含量有显著影响，3502农场(NC)试验站油分含量平均值显著高于堤上(DS)试验站(图1)，但峰度和偏度绝对值在0.02～0.66之间，表明RILs油分含量呈连续近似正态分布，符合典型的数量性状特征。综上所述，田间试验的含油量观察结果表明，由JH5和KX01-6杂交产生的RIL群体适合进行含油量的QTL分析。

表1.自然环境下含油性的遗传学分析

Note:DS,Dishang experiment station；NC,Nongchang experiment station；

实施例2、高分辨率遗传图谱构建

为了挖掘高含油量自交系中有利的等位基因，采用Affymetrix基因分型芯片对192个RILs家系进行了基因分型(Clevenger et.al,2017)。经过严格筛选，共鉴定出2840个多态性SNP标记，并将这些保留的标记定位到花生20条染色体上，构建了高分辨率的遗传图谱(图2)。结果显示，构建的遗传连锁图谱覆盖3706.382cM遗传距离，每个连锁群平均长度为185.32cM。在20个连锁群中，A07的LG Chr07连锁群长度最长为263.75cM,A02的LG Chr02连锁群最短，仅为77.34cM。每组平均有142个多态性标记，其中A03号染色体有309个多态性标记最多，A01号染色体有26个多态性标记最少。图谱相邻多态性标记之间的平均距离为1.31cM，在A02染色体上的平均距离为0.28cM，在B09染色体上的平均距离为4.44cM(表2)。为了检验构建的遗传图谱的准确性，将AhFAD2A和AhFAD2B基因控制的油酸含量性状(Varshney et al.2014；Kamdar等人，2021；Chi et al.2011)也进行了定位。结果表明，在09号染色体和19号染色体上分别定位到qFAD09和qFAD19两个主要位点，可解释54.4％的表型变异，LOD分别为14.54和11.80。AhFAD2A和AhFAD2B分别落在qFAD09和qFAD19的95％置信区间内，这强烈说明AhFAD2A和AhFAD2B是qFAD09和qFAD19的调控基因。这一结果验证了本研究构建的连锁图谱的准确性和实用性。

表2.用于鉴定与含油量相关的QTL的重组近交系(RIL)群体的SNP标记特征总结。

实施例3、自然环境下含油量QTL的鉴定

为进一步提高高油品种的标记辅助选择(MAS)的效率，利用2个试验站3年的RILs数据进行QTL分析。结果表明，在6个试验环境下，共检测到14个显著QTL，对192个F_9:11花生RILs的表型变异贡献率为5.9％～20.7％，其LOD值为2.50～9.61。但除qCOA18_1和qCOA18_2外，大部分qtl不能在两个以上环境中同时检测到，这表明油分含量是由许多有效的次要QTL控制的，容易受到不同环境的影响。另外，由于qCOA08_1和qCOA08_2在5个或5个以上的环境中都能同时被检测到，其遗传变异最高值分别为16.1％和20.7％，增效等位基因均来自高油分品种冀花5号。qCOA08_1和qCOA08_2的最高LOD值分别为7.28和9.61，其峰值LOD值分别位于Chr.08_38056541至Chr.08_40978133和Chr.08_44936784至Chr.08_46776535的物理间隔内。总之，我们认为这两个QTL是两个有价值的主效应遗传位点，可用于提高花生油含量，但需要进一步确定更精确的物理区间或基因。

实施例4、利用全基因组序列确定候选基因

为了进一步筛选qCOA08_1和qCOA08_2的候选基因，对两个亲本进行了基因组变异的比较。经过严格筛选，在JH5和KX01-6两个候选区域之间共识别出912个高质量的可变SNPs和Indels(Table.S1)。其中超过87％(796)的变异分布在内含子、基因间区域和编码区下游，不太可能导致功能缺失，而分别有0.88％(8)、0.99％(9)、7.13％(65)、0.11％(1)和3.62％(33)分布在5'-UTR、3'-UTR、上游、剪接和外显子编码区(图3a)。在外显子编码区域的变异中，分别有18个和8个SNPs变异引起了非同义或同义突变，而其他7个SNPs或Indels变异引起了显著的结构突变，包括移码删除、移码插入、非移码删除、提前终止和终止子缺失，并可能导致功能缺陷(图3b)。进一步分析表明，所有这些变异共发生在24个预测基因中(表4)，包括2个未知蛋白和22个根据Tifrunner v1.0注释基因组注释的基因。目前没有发现任何公开的信息可以支持这些注释基因之一可以增加油合成。因此假设qCOA08_1和qCOA08_2位点的功能变异也可能是由差异启动子引起的基因表达模式引起的。

表3.使用生长在六种环境中的192个F9花生RIL检测油含量的推定QTL

^a标记或间隔表示链接图上LOD最大的区域。

^b加值>0和<0分别代表来自JH5和KX01-6的QTL的递增效应。

表4.候选基因中出现由SNPs和Indels引起的突变类型.

实施例5、通过转录组分析确定候选基因

为了进一步确定qCOA08_1和qCOA08_2背后的调控基因，我们检测了qCOA08_1和qCOA08_2两个候选区间中所有基因在油脂代谢关键期的表达模式。结果qCOA08_1和qCOA08_2候选区间内分别注释了153和146个候选基因。其中，55个预测基因在两个亲本中均未表达，说明这些基因都不是qCOA08_1和qCOA08_2的候选基因，而其余144个预测基因根据倍数变化(log2fc≥1或≤-1)和P值(P<0.001)检测差异表达。结果显示，qCOA08_1和qCOA08_2候选区间内分别只有13个和6个差异表达基因(DEGs)，但只有10个差异表达基因的启动子区存在差异，表明目标基因很可能隐藏在这些基因中。令人兴奋的是，在这10个预测基因中，有一个很强的候选基因，Ah.UVRI66编码一个乙烯转录因子Wrinkled 1(WRI1)引起了我们的高度关注。根据转录组分析(表5)，Ah.UVRI66的FPKM值在低含油量品种KX01-6中约为4.65，而Ah.UVRI66在高含油量品种JH5中表达量约为22.03，为低油品种的5倍。此外，在Ah.UVRI66启动子区的在748和749核苷酸之间发现了一个6bp(ATATAT)的插入，暗示亲本之间表达的差异可能是由插入的6bp片段引起的。同时，根据前人的文献，我们发现WRI1家族基因已被广泛研究，并被证明是一个在油料植物中转录调控种子储油合成的主基因。因此，综合所有的结果，我们推测Ah.UVRI66是qCOA08_2背后的调控基因。无论如何，我们将qCOA08_2背后的调控基因命名为花生花生高油基因1(High Oil Favorable gene 1 in Arachis hypogaea AhyHOF1)。

表5.分别在qCOA08_1和qcoa08_2的候选区间中差异表达基因的注释

实施例6、分子标记及其引物的开发。

课题组已经成功开发了dCAPs标记，具体引物和序列见下表。

实施例7、AhyHOF1对花生油品质影响的评价

为方便AhyHOF1功能分析，基于所开发的分子标记及其引物，从F5群体中筛选出一个高世代剩余杂合单株(RHP)，并从其后代中构建了一组近等基因型(NILs)，并对其脂肪酸组成进行了田间鉴定。此后，我们将与JH5母本表型一致的系记为#AhyHOF1，与KX01-6父本表型一致的等位系记为#AhyHOF1。通过观察油分含量和10种脂肪酸组成(FAC)对这些NILs进行了评估(图4)。正如预期的那样，#AhyHOF1的油分比#Ahyhof1高约1.6个百分点左右(图4a)。同时，在脂肪酸成分(FAC)评价中，10个FAC性状中有5个(图4b、c、e、f和j)在#AhyHOF1和#Ahyhof1之间差异不显著，2个FAC性状(包括C18:0和C20:0，图4d和h)在#AhyHOF1中显著高于#Ahyhof1，其他3个FAC在#AhyHOF1中均显著高于#Ahyhof1(图4j、i和k)。以上结果表明，AhyHOF1主要通过增加部分脂肪酸组成含量来提高花生油含量，在田间环境中AhyHOF1对花生油品质有一定影响。

综上实施例可见，本发明基于RIL群体构建了包含2840个多态性SNP标记的高分辨率遗传图谱，并在6个环境中稳定检测到2个效应较大的有价值QTL位点qCOA08_1和qCOA08_2。根据侧翼标记物的物理位置，qCOA08_1和qCOA08_2的物理间隔被定位在～2.9Mb和～1.7Mb之间。同时进行全基因组重测序和转录组分析，将候选基因的数量限定在40个以内。而一个编码WRI1转录因子并在亲本间表现出不同表达模式的强候选基因，很可能通过影响部分FAC合成来调控油脂积累。本研究为花生优异等位基因的克隆提供了有价值的信息。与qCOA08_1和qCOA08_2紧密连锁的多态SNP标记(或开发的dCAPs标记)有助于加快MAS的育种进程。本发明克服了以往研究中MAS育种的这些局限性，利用48K基因芯片构建了一个双亲本RIL群体的高分辨率遗传图谱，探索了可用于MAS育种的稳定有效的基因位点，开发了可用于育种的分子标记。这些信息对今后开展花生油含量育种工作具有重要科研和实用意义。

以上所述实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种与花生含油量相关的分子标记的用途，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；其特征在于：所述用途为在分子标记辅助育种MAS中用于鉴定或辅助鉴定花生的含油量性状；通过专用的dCAPs引物对识别所述分子标记，由此识别待测花生植株是否为对应的基因型，实现高含油量花生的分子标记辅助育种；所述dCAPs引物对的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。