CN115851737B - 一种杉木组成型启动子Cula11及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种杉木组成型启动子Cula11及其应用。所述杉木组成型启动子Cula11的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其互补体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述Cula11启动子相比于传统的启动子CaM35S、Zmubi及CmYLCV在杉木原生质体中活性更强，可能会更适合用于杉木基因工程。所述Cula11启动子在杨树的根与叶中的活性，比目前常用的启动子CaM35S活性更强。在水稻中，所述Cula11启动子在根和叶中的表达活性也比广泛应用于水稻基因工程的启动子CaM35S、Zmubi、Actin1、CMYLCV等更强。

Description

一种杉木组成型启动子Cula11及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种杉木组成型启动子Cula11及其应用，所述Cula11启动子可以在杉木原生质体中高效驱动目标基因的表达，并在过表达杨树、水稻根与叶片中具有很强的活性。

背景技术

杉木（Cunninghamia lanceolata（Lamb.）Hook）是杉科杉木属乔木，主要分布于我国南方亚热带的17个省区。利用基因工程进行杉木的分子育种是目前的一个研究热点和难点。启动子是进行基因过量表达的必须元件。其中，组成型的强启动子可以在所有组织器官和发育阶段均能启动基因表达，具有在所有组织、无时空特异性的强表达目标基因。在实际应用中，组成型启动子在不同条件下在大多数组织中都表达，通常源自植物病毒或植物管家基因。然而，目前可应用于杉木分子育种的启动子，尤其是从杉木中分离的强组成型启动子几乎没有报道。

在双子叶基因工程领域中，来自花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子是用于基础研究和转基因植物开发的最广泛使用的启动子之一。这种启动子在许多植物的不同组织中的表达量相对较高。这种在不同植物组织中的强烈表达是由多种组织特异性元件的叠加效应造成的。黄叶卷曲病毒中分离的CmYLCV启动子也是一种较为常用的组成型表达启动子，已被证明在拟南芥、烟草、番茄、玉米和水稻的愈伤组织、分生组织以及营养和生殖组织中具有高度活性。加上其极窄的宿主选择范围，使得 CmYLCV 启动子成为调节多种植物物种中转基因表达的强有力工具。目前CaMV35S启动子与CmYLCV启动子已经是组成型启动子的代表，主要应用于双子叶植物的基因工程领域。

水稻等单子叶植物中，CaM35S启动子的活性相对较低。因此，一系列来源于单子叶植物的组成型启动子被分离鉴定，并被应用于单子叶植物的基因工程。目前较为常用的启动子有来源于玉米的ZmUBI启动子、来源于水稻的Act1、OsTubA1、OsCc1、RUBQ1等。这些启动子在水稻、玉米、小麦、竹子等单子叶植物中强表达，在单子叶植物的分子育种中发挥着重要的作用。ZmUBI启动子的应用最为广泛，其在几乎所有的细胞类型、幼嫩组织都强烈表达，但是在较老的组织中表达能力较差。

在转基因育种或基因功能研究时，组成型启动子可使外源基因在植物中高效、持续、稳定的长久表达，有利于外源基因发挥其功能。来源于其他物种的启动子在被用于异源表达时，经常发生基因沉默的现象，另外为了避免同时使用同一个类型的启动子驱动多个基因导致基因抑制或沉默现象，需要不同的启动子，尤其是内源性的启动子。在过去的几十年中，尽管应用于单子叶和双子叶植物的启动子已经有较多的选择，然而从裸子植物中分离的启动子几乎没有报道。少数裸子植物的转基因报道，多采用CaM35S作为启动子，远不能满足杉木等裸子植物的基因工程需求。因此，分离鉴定杉木内源的强组成型启动子对我国杉木等裸子植物的转基因育种具有重要意义。

发明内容

本发明旨在提供一种驱动外源基因在杉木中表达的启动子Cula11，并获得该启动子的应用，尤其是在以杨树为代表的双子叶植物及以水稻为代表的单子叶植物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种组成型表达启动子Cula11，来源于杉木，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其互补体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组载体，所述重组载体包含上述的杉木组成型启动子Cula11。

一种重组菌株，所述重组菌株含有上述的重组载体。

优选的，所述重组菌株为根癌农杆菌。

上述一种组成型表达启动子Cula11在培育转基因植物中的应用。

优选的，所述植物为杉木、水稻或杨树。

优选的，所述应用具体为：将组成型表达启动子Cula11连接于植物双元表达载体PCAMBIA1301的待表达的基因的序列上游得到重组载体，将所述重组载体的产物转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

本发明的显著优点在于：

本发明所述Cula11启动子相比于传统的启动子CaM35S、Zmubi及CmYLCV在杉木原生质体中活性更强。所述Cula11启动子在杨树的根与叶中的活性，比目前常用的启动子CaM35S活性更强。在水稻中，所述Cula11启动子在根和叶中的表达活性也比广泛应用于水稻基因工程的启动子CaM35S、ZmUBI、Actin1、CMYLCV等更强。

说明书附图

图1：重组载体pCambia1301-Cula11质粒图谱。。

图2：Cula11-eGFP质粒图谱。

图3：Cula11启动子在杉木原生质体中的表达情况（A），及表达荧光强度的测定（B）。

图4：Cula11启动子在转基因水稻中的活性分析。

图5：Cula11启动子在转基因杨树中的活性分析。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1杉木组成型表达启动子Cula11的克隆

根据本课题组杉木三代全场转录组的序列，依据杉木Cula11基因的上游序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的in-fusion同源重组位点。所设计的引物序列如下：

正向引物：5’-ggccagtgccaagctctcgaAGGCGATGTGTCAACTAGTGAGT-3’，

反向引物：

5’-cctcgcccttgctcaccatgGTTGATGATCACGAATAACACTAGAAATT-3’。

以杉木基因组DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子片段，PCR反应体系及扩增程序如下：

PCR反应体系：

扩增程序：94 ℃, 3 min→(94 ℃, 30 s→68 ℃, 30 s→68 ℃, 1 min 20 s)×2 cycles→(94 ℃, 30s→67 ℃, 30 s→68 ℃, 1 min 20 s)×2 cycles→(94 ℃,30s→66 ℃, 30 s→68 ℃, 1min20 s)×2 cycles……(94 ℃, 30 s→57 ℃, 30 s→68℃, 1 min 20 s) ×2 cycles→(94 ℃, 30s→56 ℃, 30 s→68 ℃, 1 min 20 s)×15cycles→68 ℃, 5 min→12 ℃, 10 min。

扩增完成的片段进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件：在1.5%的琼脂糖凝胶中 140V的电压下电泳20 min。切下与目的条带大小一致的凝胶做胶回收，然后通过infusion的方法连入植物双元表达载体pCambia1301（购自Cambia公司）的GUS基因上游，得到重组载体pCambia1301-Cula11（质粒图谱如图1所示），按照热激法将重组载体pCambia1301-Cula11转化大肠杆菌JM109感受态细胞后，再经菌落PCR筛选获得阳性克隆，然后，挑取单克隆摇菌液提质粒，测序验证。验证正确的克隆即为所要获得的杉木组成型表达启动子Cula11，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示，其互补体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2利用启动子Cula11驱动绿色荧光蛋白（eGFP）报告基因在杉木中表达

以上述含有Cula11启动子序列的pCambia1301-Cula11质粒为模板，利用含有XhoI酶切位点Cula11启动子特异性的引物，通过PCR获得Cula11的启动子序列片段，经XhoI酶切位点将Cula11启动子克隆至经改造的35S:NLS-eGFP载体的eGFP基因的序列上游，替换掉原始35S:NLS-eGFP载体中的CaMV35S启动子，构成Cula11启动子驱动eGFP报告基因的终载体Cula11-eGFP（质粒图谱如图2所示），经测序验证后利用冻融法转入根癌农杆菌EHA105，并进行菌液PCR检测阳性克隆，挑取阳性克隆导入杉木原生质体中，在荧光显微镜下观察，照相，分析启动子活性。

与此同时，将ZmUbi启动子、CmYLCV启动子分别克隆至经改造的35S:NLS-eGFP载体的eGFP基因的序列上游，替换掉原始35S:NLS-eGFP载体中的CaMV35S启动子，，构成ZmUbi启动子驱动eGFP报告基因的终载体ZmUbi-eGFP以及CmYLCV启动子驱动eGFP报告基因的终载体CmYLCV-eGFP，经测序验证后利用冻融法转入根癌农杆菌EHA105，并进行菌液PCR检测阳性克隆，挑取阳性克隆导入杉木原生质体中，在荧光显微镜下观察，照相，分析启动子活性。

其中，所述ZmUbi启动子已公开于文献【Christensen A H , Quail P H .Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants[J]. TransgenicResearch, 1996, 5(3):213-218.】。

其中，所述CmYLCV启动子已公开于文献【A Multipurpose Toolkit to EnableAdvanced Genome Engineering in Plants[J]. The Plant Cell, 2017.】。

其中，所述经改造的35S:NLS-eGFP载体已公开于文献【Liu K H ,Niu Y ,KonishiM , et al. Discovery of nitrate-CPK-NLP signalling in centralnutrient-growth networks[J]. Nature, 2017, 545(7654):311-316.】。

结果表明（图3），Cula11启动子在杉木原生质体中呈现较强的荧光强度，表明Cula11启动子在杉木中有驱动基因表达的活性；通过荧光强度的比较，我们发现，Cula11启动子在杉木原生质体中的活性分别比CaMV35S、ZmUbi、CmYLCV高4.2、3.2和1.6倍。

实施例3利用启动子Cula11驱动GUS基因在水稻和杨树中表达

将上述含有Cula11启动子序列的pCambia1301-Cula11质粒利用冻融法转入根癌农杆菌EHA105，并进行菌液PCR检测阳性克隆，挑取阳性克隆用于水稻的遗传转化。水稻种子去壳后消毒，用无菌滤纸吸干表面水分后接于愈伤诱导培养基上，于28℃光培养诱导愈伤组织。通过农杆菌介导法转化水稻愈伤组织，经筛选得到抗性愈伤组织后接入分化培养基，待其长出绿芽后接入生根培养基。当小苗较健壮时剪取叶片，利用植物基因组DNA提取试剂盒提取其基因组DNA，后通过扩增GUS基因部分序列进行PCR验证，对阳性植株的叶片和根系组织进行GUS组织化学染色分析，在体视显微镜下观察，照相，分析启动子活性。

将上述含有Cula11启动子序列的pCambia1301-Cula11质粒利用冻融法转入根癌农杆菌EHA105，并进行菌液PCR检测阳性克隆，挑取阳性克隆用于水稻的遗传转化。以杨树无菌苗叶片为外植体，放在含有pCambia1301-Cula11质粒的根癌农杆菌EHA105菌液中侵染15~20 min，侵染后取出外植体置于无菌滤纸上吸干其表面的菌液，放在共培养培养基上，在25℃黑暗条件下共培养3 d；然后将这些叶片取出，用无菌水置于冲洗5~6次，再转移至含250 mg/L羧苄的无菌水中，放入28℃摇床摇10 min，后将叶片取出用无菌滤纸吸干表面水分；然后将叶片平铺于培养基上进行筛选，每20d转到新培养基中进行继代培养，至叶片边缘有不定芽冒出，后接入生根培养基。当小苗较健壮时剪取叶片，利用植物基因组DNA提取试剂盒提取其基因组DNA，后通过扩增GUS基因部分序列进行PCR验证，对阳性植株的叶片和根系组织进行GUS组织化学染色分析，在体视显微镜下观察，照相，分析启动子活性。

与此同时，将CaM35S、Zmubi、Actin1、CMYLCV启动子分别连入植物双元表达载体pCambia1301的GUS基因上游，按照热激法将重组载体转化大肠杆菌JM109感受态细胞后，再经菌落PCR筛选获得阳性克隆，然后，挑取单克隆摇菌液提质粒，验证正确的质粒利用冻融法转入根癌农杆菌EHA105，并进行菌液PCR检测阳性克隆，挑取阳性克隆用于水稻和杨树的遗传转化。

GUS染色结果表明（图4至图5），Cula11启动子能够调控GUS基因在水稻和杨树的地上及地下各个组织均有表达；同时，Cula11启动子在杨树的根与叶中的活性，比目前常用的启动子CaM35S活性更强；在水稻中，Cula11启动子在根和叶中的表达活性也比广泛应用于水稻基因工程的启动子CaM35S、Zmubi、Actin1、CMYLCV更强。

Claims (6)

1.一种杉木组成型启动子Cula11，其特征在于：所述杉木组成型启动子Cula11的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的杉木组成型启动子Cula11，其特征在于：所述杉木组成型启动子Cula11的互补体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组载体，其特征在于：所述重组载体包含权利要求1所述的杉木组成型启动子Cula11。

4.一种重组菌株，其特征在于：所述重组菌株含有权利要求3所述的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株为根癌农杆菌。

6.权利要求1所述的杉木组成型启动子Cula11在培育转基因植物中的应用，其特征在于：所述植物为杉木、水稻或杨树。