CN115850493B - 一种二价纳米抗体Cablivi的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种二价纳米抗体Cablivi的分离纯化方法，特别是从重组毕赤酵母发酵液中，采用稀释降电导率‑阳离子交换法分离纯化二价纳米抗体Cablivi的方法。本发明通过稀释降低发酵液电导率，分步利用不同pH条件洗脱条件组合来去除杂蛋白，对表达二价纳米抗体Cablivi的重组毕赤酵母发酵液进行纯化。稀释降电导率‑pH 4.0阳离子交换‑pH 6.0阳离子交换两步最终纯化得到的二价纳米抗体Cablivi纯度达98％，回收率可达57.6％。本发明解决了之前纳米抗体Cablivi发酵液难以纯化的问题，并实现了组合不同条件快速二价纳米抗体Cablivi发酵液的纯化。本发明的分离纯化方法特异性高，操作条件温和，步骤简便，纯化效果好，纯度和回收率高，成本低，速度快，有利于商业化大规模生产。

Description

一种二价纳米抗体Cablivi的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及生物纯化领域，特别涉及二价纳米抗体Cablivi的分离纯化领域。

背景技术

纳米抗体最早由比利时科学家于1993年在Nature杂志中首次报道，是骆驼科动物（骆驼、大羊驼、羊驼及其近亲物种）缺失轻链的天然重链抗体的可变区组成的单域抗体，该抗体只包含一个重链可变区（VHH）和两个常规的CH2与CH3区，VHH晶体为2.5 nm，长4 nm，分子量只有15 kDa，因此被称作纳米抗体。纳米抗体（Nanobody，Nbs）是抗体家族的新成员，具有相对分子质量小、人源化简单、亲和力高、稳定性高、可微生物表达、免疫原性低、穿透力强、可溶性好等优势，在医学基础研究以及疾病诊断和治疗方面备受关注。

纳米抗体诸多方面性质均优于传统抗体。基于羊驼重链抗体的VHH单域抗体的特殊结构，兼具了传统抗体与小分子药物的优势，几乎完美克服了传统抗体的开发周期长，稳定性较低，保存条件苛刻等缺陷，逐渐成为新一代治疗性生物医药与临床诊断试剂中的新兴力量。相比于常规抗体，纳米抗体的优势有：1.分子量小，可穿透血脑屏障；2.原核或真核系统中高表达；3.特异性强，亲和力高；4.对人的免疫原性弱。纳米抗体的应用优势用于生物医药研发（基因工程药物研发、ADC药物研发）；用于临床体外诊断（胶体金法、酶联免疫吸附法、电化学发光法）；用于肿瘤研究、免疫学研究等基础研究。

Cablivi（CAPLACIZUMAB）是全球首个纳米抗体药物，也是首个专门治疗获得性血栓性血小板减少性紫癜（aTTP）的药物。aTTP的是一种危及生命的自身免疫性凝血障碍，特征是全身小血管中形成大量血凝块。Cablivi是一种强效选择性双价抗血管性血友病因子（vWF）纳米抗体，可阻断超大vWF多聚体与血小板相互作用，针对血小板聚集和随后发生的微小血凝块形成和积累具有立竿见影效果。然而现有技术并没有公开大规模、商业化生产纯化Cablivi纳米抗体的方法。

目前，从发酵液中分离纯化蛋白通常有亲和层析、离子交换层析以及凝胶过滤层析等等，且大多依托于AKTA蛋白纯化仪。在大多报道中，最常用的是亲和层析中的His标签纯化或Protein A亲核纯化含有Fc片段的抗体，使目的蛋白与镍离子结合，后用咪唑洗脱，从而进行纯化。通常用于酶制剂的任何纯化标签都不能用于医药用的蛋白，所以不能采用His标签进行纯化。因而无法将常用的蛋白纯化方法直接应用于分离药用级的重组蛋白。

目前纳米抗体的纯化仍依赖于在N端或C端融合亲和标签(如His6、GST、MBP)，利用亲和层析技术纯化，但是蛋白酶切除亲和标签后又增加了下游纯化压力。CN114409787A（公开日期2022年04月29日）公开了一种针对HER3纳米抗体的分离纯化方法，其包括：将预处理后的菌体依次经粗分离处理及蛋白除杂处理后，得到纳米抗体，预处理包括对菌体进行破碎处理，菌体表达HER3纳米抗体的菌体，蛋白除杂处理包括层析处理。CN114539351A（公开日期2022年05月27日）公开了一种纳米抗体的纯化方法，包括如下步骤：将纳米抗体收获液依次进行阳离子层析和阴离子层析，收集阴离子层析洗脱液；其中，所述阴离子层析采用的洗脱液的pH为7±0.5，所述洗脱液包含：10±2mM的Na₂HPO₄、10±2mM的NaH₂PO₄、0.01M～0.03M的精氨酸以及2mM～8mM的(NH₄)₂SO₄。CN110204612A（公开日期2019年09月06日）公开一种采用Protein A亲和层析纯化纳米抗体药物的方法，包括步骤：(1)调节纳米抗体样品的pH；(2)用平衡缓冲液平衡层析柱；(3)将步骤(1)调节后的样品上样至层析柱；(4)用清洗缓冲液进行清洗；(5)用洗脱缓冲液进行洗脱。CN111378030A（公开日期2020年07月07日）公开了一种纳米抗体分离纯化的方法，涉及生物技术领域，括如下步骤：1)低pH沉淀杂蛋白：将待纯化样品用酸性溶液调节pH至酸性，静置后，离心去除沉淀，留取上清溶液；2)高温沉淀杂蛋白：将经步骤1)获得的上清溶液加热，保温静置后，离心去除沉淀，留取上清溶液；3)超滤法去除杂蛋白：将经步骤2)获得的上清溶液进行超滤，透过超滤膜的蛋白溶液即为高纯度纳米抗体。上述现有技术专利申请公开的纯化纳米抗体的方法并不适用于商业化大规模生产，并且上述方法并不适合特定的纳米抗体Cablivi的纯化分离。

因此，目前亟需寻找一种更为简单有效的纯化方法用于纳米抗体的分离纯化，特别是具有独特构象、较难纯化的纳米抗体Cablivi。

发明内容

为了解决目前利用重组毕赤酵母发酵得到的纳米抗体，特别是纳米抗体Cablivi的分离和纯化存在如下技术难题。首先，现有的纳米抗体的纯化存在纯化过程繁琐，成本高问题。其次，纳米抗体在进行纳滤的过程中可滤过载量低，如此增加了纳滤膜的需求量，同时目前商业化纳滤膜成本较高，导致纳米抗体的纯化成本较高，限制了其推广应用。最后，纳米抗体VHH的结构仅由重链可变区构成，缺乏FC片段。虽然可以利用不同标签来纯化纳米抗体，包括MBP、SUMO、VHH-Fc、His等，例如His标签通过镍亲和层析，但是镍亲和层析存在着特异性差，一步很难达到高纯度的要求。同时，并且带着His标签对进入临床不理想等问题。

针对如上技术难题，本发明对纳米抗体，特别是纳米抗体Cablivi分离和纯化工艺做了创造性地改进。具体本发明采用稀释降电导率-阳离子交换法，从重组毕赤酵母发酵液中分离纯化二价纳米抗体Cablivi。本发明通过在发酵液中分步利用不同pH条件洗脱条件组合来去除杂蛋白，对表达二价纳米抗体Cablivi的重组毕赤酵母发酵液进行纯化，并对其进一步超滤浓缩，最终纯化得到的二价纳米抗体Cablivi。

本发明的一方面，提供一种分离纯化二价纳米抗体Cablivi的方法，其特征在于，包含如下步骤：

步骤（1）样品预处理：预处理以降低包含Cablivi的发酵液电导率到小于10 ms/cm，得到上样液；

步骤（2）上样液上样阳离子交换柱；

步骤（3）阳离子交换步骤：利用如(a)-(c)任一所述步骤分离纯化二价纳米抗体Cablivi：

(a) pH 6.0阳离子交换步骤，包含用50-60 mM，pH 6.0的NaAc-HAc缓冲液平衡阳离子交换柱，再用1-2 M NaCl缓冲溶液进行梯度洗脱，收集洗脱峰，得到纯化后的二价纳米抗体Cablivi；

(b) pH 4.0阳离子交换步骤，包含用20-30 mM，pH 4.0的HCOONa缓冲液平衡阳离子交换柱；再用1-2 M NaCl缓冲溶液进行梯度洗脱，收集洗脱峰，得到纯化后的二价纳米抗体Cablivi；或者

(c) pH 4.0阳离子交换-pH 6.0阳离子交换步骤，包含用20-30 mM，pH 4.0的HCOONa缓冲液平衡阳离子交换柱；再用1-2 M NaCl缓冲溶液进行梯度洗脱，得到纯化后的二价纳米抗体Cablivi原液，随后所述原液超滤浓缩得到脱盐浓缩液，降低所述脱盐浓缩液的电导率到小于10 ms/cm，上样至阳离子交换柱，用50-60 mM，pH 6.0的NaAc-HAc缓冲液平衡阳离子交换柱，再用1-2 M NaCl缓冲溶液进行梯度洗脱，收集洗脱峰，得到纯化后的二价纳米抗体Cablivi。

进一步地，所述步骤（1）中发酵液电导率降低至6 ms/cm。

进一步地，所述步骤（c）中所述脱盐浓缩液电导率降低至6 ms/cm。

进一步地，所述步骤（3）中NaAc-HAc缓冲液浓度为60 mM，所述HCOONa缓冲液浓度为30 mM，所述NaCl缓冲溶浓度为 1 M。

进一步地，所述步骤（a）-（c）中收集洗脱峰为通过检测UV 280 nm收集洗脱峰。

进一步地，所述步骤（1）样品预处理，包括通过稀释、膜包法或超滤管法对于发酵液进行降低电导率或者浓缩，降低发酵液中的盐离子浓度，以降低上样蛋白样品的电导率，电导率降低到小于10 ms/cm，以保证目标蛋白正常结合到对应的离子填料。

进一步地，是从微生物发酵液中分离纯化二价纳米抗体Cablivi；优选地，所述微生物发酵液是重组毕赤酵母发酵液；更优选地，所述重组毕赤酵母为重组毕赤酵母X33。

进一步地，所述二价纳米抗体Cablivi的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，Cablivi的DNA序列如SEQ ID NO: 2所示。

进一步地，所述发酵液的制备包含如下步骤：

(A)一级种子培养：将保存的所述重组毕赤酵母进行活化，在25-32℃，100-250rpm的条件下培养16-18 h；

(B)二级种子培养：将一级种子液以体积比1-5％的量接种到种子培养基中，在25-32℃，100-300 rpm的条件下培养至OD₆₀₀＝6-8；

(C)发酵培养：将种子液接种到发酵培养基中，发酵罐培养，控制DO为10％-50％，优选地，控制DO为30％，搅拌转速200-800 rpm，通气量0.5-2.5 vvm，并添加一定浓度的纯氧以维持发酵液DO在适当的范围内；

(D)发酵上清的制备：发酵至少76 h后，取发酵液离心去除菌体，上清液采用真空抽滤，并进行收集得到发酵液。

进一步地，所述维持发酵液DO在适当的范围为10％-50％。

进一步地，所述方法还包含步骤（4）蛋白纯度检测，包含对步骤（3）纯化后所得到的二价纳米抗体Cablivi蛋白纯度进行检测，所述检测的方法包含选自（a）SDS-PAGE、（b）HPLC、（c）毛细管凝胶电泳CE-SDS中的一种或多种方法对纯化的二价纳米抗体Cablivi蛋白纯度进行检测。

本发明提供的稀释降电导率-阳离子交换法分离纯化纳米抗体Cablivi具有以下一种或多种优异的技术效果：

1. 本发明的稀释降电导率-阳离子交换法不依赖纯化标签，纯化获得的二价纳米抗体Cablivi可直接作为分离药用级的重组蛋白。

2. 本发明的纯化分离方法纯化过程简单、高效，仅通过降低预处理发酵液电导率、上样平衡，NaCl梯度洗脱，即可获得高回收率高纯度的纳米抗体Cablivi。

3. 本发明稀释降电导率-pH 6.0阳离子交换法纯化，Cablivi回收率可以达到70.17%，回收目标蛋白纯度为75.5%。稀释降电导率-pH 4.0阳离子交换法纯化，Cablivi回收率可以达到82.04%，蛋白纯度为87.1%。通过本发明两步方法最终纯化得到的二价纳米抗体Cablivi纯度达98％，回收率可达57.6％。

4. 本发明实现了从发酵液中快速高效纯化，解决了之前纳米抗体Cablivi发酵液难以纯化的问题，并实现了组合不同条件快速二价纳米抗体Cablivi发酵液的纯化。本发明的分离纯化方法特异性高，操作条件温和，步骤简便，纯化效果好，回收率高，成本低，速度快，有利于商业化大规模生产。

附图说明

图1为本发明不同时间段其发酵液Cablivi纳米抗体的表达量的电泳结果；

图2为本发明疏水层析纯化纳米抗体Cablivi层析程序图谱；

图3为本发明疏水层析纯化纳米抗体Cablivi不同时间段收集到出峰蛋白含量SDS-PAGE电泳结果；

图4为本发明稀释降电导率-pH 6.0阳离子交换法纯化纳米抗体Cablivi层析程序图谱；

图5为本发明稀释降电导率-pH 6.0阳离子交换法纯化纳米抗体Cablivi不同时间段收集到出峰蛋白含量SDS-PAGE电泳结果；

图6为本发明稀释降电导率-pH 4.0阳离子交换法纯化纳米抗体Cablivi层析程序图谱；

图7为本发明稀释降电导率-pH 4.0阳离子交换法纯化纳米抗体Cablivi不同时间段收集到出峰蛋白含量SDS-PAGE电泳结果；

图8为本发明稀释降电导率-pH 4.0阳离子交换法-pH 6.0阳离子交换法纯化纳米抗体Cablivi层析程序图谱；

图9为本发明稀释降电导率-pH 4.0阳离子交换法-pH 6.0阳离子交换法纯化纳米抗体Cablivi不同时间段收集到出峰蛋白含量SDS-PAGE电泳结果；

图10为本发明稀释降电导率-pH 4.0阳离子交换法-pH 6.0阳离子交换法纯化纳米抗体Cablivi纯化样品纯度及回收率结果电泳图；

图11为本发明SDS-PAGE检测纳米抗体Cablivi样品纯度结果；

图12为本发明SEC-HPLC检测纳米抗体Cablivi样品纯度结果；

图13为本发明CE-SDS检测纳米抗体Cablivi样品纯度结果。

具体实施方式

实施例1 高表达纳米抗体Cablivi发酵液的制备

发酵液的制备包括以下步骤：

步骤1：从-80℃超低温冰箱中取出保存的重组高表达X33/pPICZα A-Cablivi菌株甘油管，于生物安全柜内接种 400 μL 菌种液至 200 mL 种子培养基(BMGY)中，封口摇匀后置于恒温摇床培养，温度30℃，转速250 rpm，培养24 h 后，用紫外分光光度计测OD₆₀₀ 值在2-6 即可。

步骤2：发酵起始时溶氧为100％，随着发酵进行，溶氧逐步将低。当DO 低于20％时，依次通过增加空气进气速率（最高进气量<2 vvm）、增加氧气比例的方式来维持DO>20％（调控后DO<40％）；批式发酵末期，甘油耗尽，DO 逐步上升趋近于100％；结束时进行补料确认，可通过生化分析仪直接检测甘油含量，或者适当添加一部分甘油观察DO 值是否下降，下降则表示甘油耗尽，可以进行下一阶段培养。

步骤3：甘油补料阶段。以0.2 rpm转速添加甘油（18.15 mL/hr/L初始发酵体积）。待菌体湿重达到200 g/L以上时，结束本阶段发酵，即停止补料，饥饿处理菌体，直至DO接近100％，表示甘油耗尽菌体处于饥饿状态，可以开始下一阶段培养（湿重接近时，适当减少取样间隔，结束时仅停止补料，其它设置不变）。

步骤4：甲醇补料阶段。以6 mL/h（0.2 rpm, 3 L 培养体积）流加甲醇补料液。起始阶段2-3 h，菌体在适应甲醇环境，DO值波动较大，最后会恢复平稳。DO低于20％时，依次通过增加空气进气速率（最高进气量≤ 2 vvm）、增加氧气比例的方式来维持DO>20％（调控后DO<40％）；每隔1 h 进行验证，可通过生化分析仪直接检测甲醇含量，或增加甲醇流速DO值下降，或断料后DO 值短时间内迅速上升（3 min 内），提升流速0.1 rpm。调整流速后重复此步骤，直至流速调整为1.5 rpm。同时，发酵液取样10 mL。用以测pH、OD₆₀₀、湿重、甲醇含量、蛋白表达量，其不同时间段其发酵液Cablivi纳米抗体的表达量的电泳结果如图1所示。将发酵液下罐，收集发酵液，于落地式离心机10000×g，离心15 min，弃去沉淀，收集上清。分装部分上清于4℃保存，待用；剩余上清原液于-20℃保存。

如下表1给出了发酵液表达获得的二价纳米抗体Cablivi的氨基酸序列和DNA序列。

表1 二价纳米抗体Cablivi序列信息

Cablivi	序列信息
		氨基酸序列	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGRELVAAISRTGGSTYYPDSVEGRFTISRDNAKRMVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQVTVSSAAAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGRELVAAISRTGGSTYYPDSVEGRFTISRDNAKRMVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQVTVSS （SEQ ID NO:1）
DNA序列	GAGGTTCAATTGGTTGAATCCGGTGGTGGTTTGGTTCAACCAGGTGGTTCTTTGAGATTGTCCTGTGCTGCTTCCGGTAGAACCTTCTCTTACAATCCAATGGGTTGGTTCAGACAGGCTCCAGGTAAGGGTAGAGAATTGGTTGCTGCTATCTCCAGAACTGGTGGTTCCACTTACTACCCAGACTCTGTTGAGGGTAGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAGAATGGTCTACTTGCAGATGAACTCCTTGAGAGCTGAGGACACTGCCGTTTACTATTGTGCTGCTGCTGGTGTTAGAGCCGAGGATGGTAGAGTTAGAACTTTGCCATCCGAGTACACTTTCTGGGGTCAAGGTACTCAGGTTACTGTTTCTTCTGCTGCTGCCGAAGTTCAGTTGGTAGAAAGTGGTGGTGGACTTGTTCAGCCTGGTGGATCCTTGAGACTTTCTTGTGCAGCATCCGGTCGTACTTTCAGCTATAACCCTATGGGATGGTTTAGACAAGCCCCTGGTAAAGGTCGTGAATTGGTCGCAGCAATTTCAAGAACCGGCGGATCTACTTACTATCCTGATTCCGTCGAAGGCAGGTTCACTATTTCCAGGGATAACGCTAAGCGTATGGTGTACCTTCAAATGAACTCTTTGCGTGCCGAGGATACCGCTGTTTATTACTGTGCAGCCGCAGGCGTTAGAGCTGAAGATGGAAGGGTAAGAACACTGCCCTCTGAGTATACTTTTTGGGGACAGGGAACCCAAGTTACCGTTTCCTCTTAA（SEQ ID NO:2）

实施例2 疏水层析纯化纳米抗体Cablivi

疏水层析纯化纳米抗体Cablivi包含如下步骤：

步骤1：样品预处理。样品纯化前使用0.45 μm 的滤膜（赛多利斯）滤除样品中的不溶性杂质；若样品中杂质过多，显著堵塞滤膜时，可使用深层过滤（Claricap 深层滤芯，科百特）以去除杂质。同时，取10 mL过滤后的发酵液，利用高浓度 (NH₄)₂SO₄以浓度为4 M的水溶液形式等体积(10 mL)加入，以提高发酵液的电导率。

步骤2： Butyl疏水柱（纳微，22010523 L01W15KB）纯化。清洗过程：纯水冲洗2 CV（柱体积）；0.5 M NaOH 冲洗2 CV；纯水冲洗2 CV；再生液冲洗2 CV。平衡：平衡液冲洗5-10CV至基线、pH、电导率平稳。上样量为处理后样品20 mL，调整样品的起始pH和电导率，载样，收集流穿样品（集样和截止限设置为20~50 mAu）。洗涤：平衡液冲洗10 CV，至基线、pH、电导率平稳。 洗脱：洗脱液0-50%梯度洗脱，冲洗体积30 CV，收集样品峰，留样检测。洗脱：100%洗脱液冲洗5 CV，收集样品峰，留样检测，整个层析程序图谱如图2所示。

再生液为：1.7 M (NH₄)₂SO₄（pH 8.0）.

平衡液为：20 mM Tris-HCl、1.7 M (NH₄)₂SO₄（pH 8.0）.

洗脱液为：：20 mM Tris-HCl, （pH 8.0）.

步骤3：纯化样品SDS-PAGE检测。样品与蛋白Loading Buffer （SDS，DTT和溴酚蓝）按5：1比例混匀，使最终样品的蛋白Loading Buffer 浓度不低于1×，98℃或沸水浴变性10min。随后，安装电泳槽和胶板（去封口胶带），倒入电泳缓冲液，内槽应充溢，外槽液面应高于电极丝。 缓慢拔除预制胶的梳子，取针筒吸取缓冲液，逐个伸入胶孔中吹去甘油。点样，合上槽盖，通电，80 V 电压下电泳40 分钟，至样品压缩成线。升高电压值120 V 继续电泳，至指示带靠近或抵达凝胶底端。以蛋白染色仪对电泳完的凝胶进行染色、脱色，设置程序为Stain 3 min；Destain 2 min；Destain 1 min。将凝胶转移至凝胶成像系统内，成像、修饰图像、设置泳道、标注泳道，并进行相应分析。不同时间段收集到出峰蛋白含量SDS-PAGE结果如图3所示，目标条带和其杂蛋白基本上没有分离效果，即通过SDS-PAGE无法观察到目标蛋白和杂蛋白的分离，说明纳米抗体Cablivi的纯化效果较差，疏水纯化方法不适合纳米抗体Cablivi的纯化。

实施例3稀释降电导率-pH 6.0阳离子交换法纯化纳米抗体Cablivi

稀释降电导率-pH 6.0阳离子交换法纯化纳米抗体Cablivi包含如下步骤：

步骤1：样品预处理。样品纯化前使用0.45 μm 的滤膜（赛多利斯）滤除样品中的不溶性杂质；若样品中杂质过多，显著堵塞滤膜时，可使用深层过滤（Claricap 深层滤芯，科百特）以去除杂质。随后，取10 mL过滤后的发酵液进行稀释，通过添加40 mL纯水对发酵液进行稀释至最终体积为50 mL，以降低发酵液的电导率，降低电导率至6 ms/cm。

步骤2：阳离子UniGel 30-SP（纳微，22062812 G10W09KD）在pH 6.0交换层析。清洗过程：纯水冲洗2 CV；0.5 M NaOH 冲洗2 CV；纯水冲洗2 CV；再生液冲洗2 CV。平衡：平衡液冲洗5-10 CV，至基线、pH、电导率平稳。上样：取样品预处理后50 mL样品进行上样，收集流穿样品。 洗涤：平衡液冲洗10 CV，至基线、pH、电导率平稳。洗脱：洗脱液按照0-50%梯度洗脱，冲洗体积30 CV，收集样品峰，留样检测。洗脱：100%洗脱液冲洗5 CV，收集样品峰，留样检测，整个层析程序图谱如图4所示。

再生液为：1 M NaCl；

平衡液为：60 mM NaAc-HAc，（pH 6.0）；

洗脱液为：60 mM NaAc-HAc、1 M NaCl，（pH 6.0）；

步骤3： 纯化样品SDS-PAGE检测。样品与蛋白Loading Buffer 按比例混匀，使最终样品的蛋白Loading Buffer 浓度不低于1X，98℃或沸水浴变性10 min。随后，安装电泳槽和胶板（去封口胶带），倒入电泳缓冲液，内槽应充溢，外槽液面应高于电极丝。 缓慢拔除预制胶的梳子，取针筒吸取缓冲液，逐个伸入胶孔中吹去甘油。 点样，合上槽盖，通电，80 V电压下电泳40 min，至样品压缩成线。升高电压值120 V 继续电泳，至指示带靠近或抵达凝胶底端。以蛋白染色仪对电泳完的凝胶进行染色、脱色，设置程序为Stain 3 min；Destain2 min；Destain 1 min。将凝胶转移至凝胶成像系统内，成像、修饰图像、设置泳道、标注泳道，并进行相应分析。不同时间段收集到出峰蛋白含量SDS-PAGE结果如图5所示， Cablivi回收率可以达到70.17%，回收目标蛋白纯度为75.5%。

实施例4稀释降电导率-pH 4.0阳离子交换法纯化纳米抗体Cablivi；

稀释降电导率-pH 4.0阳离子交换法纯化纳米抗体Cablivi包含如下步骤：

步骤1：样品预处理。样品纯化前使用0.45 μm 的滤膜（赛多利斯）滤除样品中的不溶性杂质；若样品中杂质过多，显著堵塞滤膜时，可使用深层过滤（Claricap 深层滤芯，科百特）以去除杂质。随后，取10 mL过滤后的发酵液进行稀释，通过添加40 mL纯水对发酵液进行稀释，降低发酵液的电导率，降低电导率至6 ms/cm。

步骤2：纳微的阳离子UniGel 30-SP在pH 4.0交换层析。清洗：纯水冲洗2 CV；0.5M NaOH 冲洗2 CV；纯水冲洗2 CV；再生液冲洗2 CV。 平衡：平衡液冲洗5-10 CV，至基线、pH、电导率平稳。上样：取稀释处理后50 mL样品进行上样，收集流穿样品。洗涤：平衡液冲洗10 CV，至基线、pH、电导率平稳。洗脱：洗脱液0-50%梯度洗脱，冲洗体积30 CV，收集样品峰，留样检测。洗脱：100%洗脱液冲洗5 CV，收集样品峰，留样检测， 整个层析程序图谱如图6所示。

再生液为：1 M NaCl；

平衡液为：30 mM HCOONa缓冲液，（pH 4.0）；

洗脱液为：30 mM HCOONa缓冲液、1 M NaCl，（pH 4.0）；

步骤3：纯化样品SDS-PAGE检测。样品与蛋白Loading Buffer 按比例混匀，使最终样品的蛋白Loading Buffer 浓度不低于1 X，98℃或沸水浴变性10 min。随后，安装电泳槽和胶板（去封口胶带），倒入电泳缓冲液，内槽应充溢，外槽液面应高于电极丝。 缓慢拔除预制胶的梳子，取针筒吸取缓冲液，逐个伸入胶孔中吹去甘油。 点样，合上槽盖，通电，80 V电压下电泳~40 分钟，至样品压缩成线。升高电压值120 V 继续电泳，至指示带靠近或抵达凝胶底端。以蛋白染色仪对电泳完的凝胶进行染色、脱色，设置程序为Stain 3 min；Destain 2 min；Destain 1 min。将凝胶转移至凝胶成像系统内，成像、修饰图像、设置泳道、标注泳道，并进行相应分析。不同时间段收集到出峰，蛋白含量SDS-PAGE结果如图7所示，目标蛋白Cablivi回收率可以达到82.04%，蛋白纯度为87.1%。

实施例5稀释降电导率-pH 4.0阳离子交换法-pH 6.0阳离子交换法纯化纳米抗体Cablivi

首先，按照实施例4的方法对纳米抗体Cablivi进行pH 4.0的阳离子纯化，将目标蛋白洗脱峰即第二个洗脱峰全部收集到一个离心管内，作为pH 6.0阳离子纯化的样品。将pH 4.0纯化的第二个洗脱峰全部收集到一个50 mL的离心管内，通过纯水稀释到50 mL以降低其电导率，电导率降低至6 ms/cm，随后进行6.0阳离子交换法，其纯化步骤和实施例3类似。整个层析程序图谱如图8所示。

纯化样品SDS-PAGE检测。样品与蛋白Loading Buffer 按比例混匀，使最终样品的蛋白Loading Buffer 浓度不低于1 X，98℃或沸水浴变性10 min。随后，安装电泳槽和胶板（去封口胶带），倒入电泳缓冲液，内槽应充溢，外槽液面应高于电极丝。 缓慢拔除预制胶的梳子，取针筒吸取缓冲液，逐个伸入胶孔中吹去甘油。点样，合上槽盖，通电，80 V 电压下电泳40 min，至样品压缩成线。升高电压值120 V 继续电泳，至指示带靠近或抵达凝胶底端。以蛋白染色仪对电泳完的凝胶进行染色、脱色，设置程序为Stain 3 min；Destain 2 min；Destain 1 min。将凝胶转移至凝胶成像系统内，成像、修饰图像、设置泳道、标注泳道，并进行相应分析。不同时间段收集到出峰蛋白含量SDS-PAGE结果如图9所示，利用电泳图分析软件对表达蛋白量进行测量，结合样品收集体积，电泳图以及纯化样品纯度及回收率如图10所示，通过蛋白灰度计算 其在pH 4.0的条件下，目标蛋白Cablivi回收率可以达到82.04%，在第二步pH 6.0的条件下，目标蛋白Cablivi回收率可以达到70.17%。通过对两步纯化蛋白回收率及纯度计算，其目标蛋白Cablivi的最终回收率为57.6%，蛋白纯度可以达到95%。

实施例6 通过SDS-PAGE, SEC-HPLC和CE-SDS检测纯化纳米抗体纯度

1、SDS-PAGE检测样品纯度。对于经过实施例5两次阳离子纯化后得到纳米抗体Cablivi，再利用超滤对其进行换液浓缩，随后，通过BCA检测其蛋白浓度具体操作为：选取酶标板上20个孔，分为标准组和样品组。其中16个孔，每个标准品设置1个重复，各孔分别加入20 μL相应浓度的标准蛋白质溶液；剩余4孔，分为2个重复组，重复孔编号相同。其中编号不同的两孔加入浓度不同的20 μL样品稀释液。各酶标孔加入200 μLBCA工作液，迅速混匀。在37°C水浴中保温30 min。冷却至室温后，在酶标仪上测各孔的A562值。以标准组各孔A562平均值为纵坐标，对应的蛋白质浓度为横坐标，在Microsoft Excel软件中绘制标准曲线。根据两个相同样品稀释液A562值的平均值，在标准曲线上计算出该样品经过稀释后的蛋白质浓度。选择合适稀释度的样品计算最终的样品蛋白浓度，再由稀释倍数计算原样品蛋白质浓度。得到纯化后蛋白样品浓度后，吸取10 μg的纯化后的二价纳米抗体Cablivi，SDS-PAGE胶检测纯化后蛋白浓度，其结果如图11所示，其通过检测其泳道灰度，其蛋白纯度为100%。

2、SEC-HPLC检测样品纯度。对蛋白纯度进行SEC-HPLC检测时，其选用的色谱柱为赛分的Zenix-150，流动相为150 mM BP+300 mM NaCl，用流动相冲洗色谱柱大于5 CV，待基线平稳后，进行蛋白上样，其检测波长为280 nm。待检测结束后，对SEC-HPLC检测的结果进行分析，其结果如图12所示，通过对出峰面积进行积分，其蛋白纯度为97.23%。

3、CE-SDS检测样品纯度。选用SCIEX的PA 800 plus检测纯化得到的纳米抗体Cablivi的纯度，首先，对样品利用超滤管进行超滤浓缩到蛋白浓度在10 mg/mL左右，其盐离子浓度小于 50 mM。毛细管柱选择为直径50 μm，有效长度20.2 cm的涂层中性毛细管柱；工作电压为15 kV；检测波长为214 nm；进样时间为20 s。待检测结束后，对CE-SDS检测的结果进行分析，其结果如图13所示，通过对出峰面积进行积分，其蛋白纯度为98.50%。

本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种分离纯化二价纳米抗体Cablivi的方法，其特征在于，包含如下步骤：

步骤（1）样品预处理：预处理以降低包含Cablivi的发酵液电导率至6 ms/cm，得到上样液；

所述发酵液中包含表达Cablivi的重组毕赤酵母；

步骤（2）上样液上样阳离子交换柱；

步骤（3）阳离子交换步骤：利用pH 4.0阳离子交换-pH 6.0阳离子交换步骤分离纯化二价纳米抗体Cablivi：包含用30 mM，pH 4.0的HCOONa缓冲液平衡阳离子交换柱；再用1 MNaCl缓冲溶液进行梯度洗脱，得到纯化后的二价纳米抗体Cablivi原液，随后所述原液超滤浓缩得到脱盐浓缩液，降低所述脱盐浓缩液的电导率至6 ms/cm，上样至阳离子交换柱，用60 mM，pH 6.0的NaAc-HAc缓冲液平衡阳离子交换柱，再用1-2 M NaCl缓冲溶液进行梯度洗脱，收集洗脱峰，得到纯化后的二价纳米抗体Cablivi；

所述步骤（3）中收集洗脱峰为通过检测UV 280 nm收集洗脱峰。

2. 根据权利要求1所述的分离纯化二价纳米抗体Cablivi的方法，其特征在于，所述步骤（1）样品预处理，包括通过稀释、膜包法或超滤管法对于发酵液进行降低电导率或者浓缩，降低发酵液中的盐离子浓度，以降低上样蛋白样品的电导率，电导率降低到6 ms/cm，以保证目标蛋白正常结合到对应的离子填料。

3.根据权利要求1所述的分离纯化二价纳米抗体Cablivi的方法，其特征在于，步骤（1）预处理的发酵液是重组毕赤酵母发酵液。

4.根据权利要求3所述的分离纯化二价纳米抗体Cablivi的方法，其特征在于，所述重组毕赤酵母为重组毕赤酵母X33。

5.根据权利要求1所述的分离纯化二价纳米抗体Cablivi的方法，其特征在于，所述二价纳米抗体Cablivi的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，Cablivi的DNA序列如SEQ IDNO: 2所示。

6.根据权利要求1所述的分离纯化二价纳米抗体Cablivi的方法，其特征在于，步骤（1）中所述发酵液的制备包含如下步骤：

(A)一级种子培养：将保存的所述重组毕赤酵母进行活化，在25-32℃，100-250 rpm的条件下培养16-18 h；

(B)二级种子培养：将一级种子液以体积比1-5％的量接种到种子培养基中，在25-32℃，100-300 rpm的条件下培养至OD₆₀₀＝6-8；

(C)发酵培养：将种子液接种到发酵培养基中，发酵罐培养，控制DO为10％-50％，搅拌转速200-800 rpm，通气量0.5-2.5 vvm，并添加一定浓度的纯氧以维持发酵液DO在适当的范围内；

(D)发酵上清的制备：发酵至少76 h后，取发酵液离心去除菌体，上清液采用真空抽滤，并进行收集得到发酵液。

7.根据权利要求6所述的分离纯化二价纳米抗体Cablivi的方法，其特征在于，所述步骤(C)发酵培养中控制DO为30％。

8.根据权利要求6所述的分离纯化二价纳米抗体Cablivi的方法，其特征在于，所述维持发酵液DO在适当的范围为10％-50％。

9.根据权利要求1所述的分离纯化二价纳米抗体Cablivi的方法，其特征在于，所述方法还包含步骤（4）蛋白纯度检测，对纯化后所得到的二价纳米抗体Cablivi蛋白纯度进行检测。

10.根据权利要求9所述的分离纯化二价纳米抗体Cablivi的方法，其特征在于，所述步骤（4）的检测方法包含选自SDS-PAGE、HPLC、毛细管凝胶电泳CE-SDS中的一种或多种方法对纯化的二价纳米抗体Cablivi蛋白纯度进行检测。