CN115847893B - 一种构建pcos小鼠模型的来曲唑缓释管制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种构建PCOS小鼠模型的来曲唑缓试管制备方法，其方法包括：切割段状硅胶管、半封闭段状硅胶管、压入来曲唑粉末、全封闭段状硅胶管以及制得来曲唑缓试管；本发明依次通过切割段状硅胶管，对段状硅胶管进行半封闭，在段状硅胶管中压入来曲唑粉末，对段状硅胶管进行全封闭，以此来制得来曲唑缓试管，弥补了国内来曲唑缓释球市场的缺失，制作简便，并且能够根据实验者的实际情况来调整制备来曲唑缓释管的长度，极大地方便了科研人员，节约了实验操作时间，同时也降低了经济成本，非常值得推广。
Description
技术领域
本发明涉及缓试管制备技术领域，尤其涉及一种构建PCOS小鼠模型的来曲唑缓试管制备方法。
背景技术
多囊卵巢综合征(PCOS)是生育年龄妇女常见的一种复杂的内分泌及代谢异常所致的疾病，总体患病率在6％-10％之间。除具有稀发排卵或无排卵、高雄激素血症、卵巢多囊样改变的典型临床表现外，胰岛素抵抗、高胰岛素血症和肥胖也是该综合征常见的临床特征，并可加重PCOS的严重程度。
关于PCOS模型选择，原则上应选择生理、生殖功能与人类最为相近的灵长类动物，如恒河猴等，但繁殖期长且成本较高，科研应用受限。大鼠、小鼠等啮齿类动物，遗传背景稳定、性激素敏感度高、繁殖力强、动情周期短，同时实验可操作性强，来源广泛、价格低廉、易于饲养，使得其造模周期短、成模率高、模型稳定具有复制性，是目前最常选择的PCOS动物种类。其中，大鼠发情周期稳定，且体型和器官较大、血容量高，有利于操作及样本收集，但存在不易进行复制及基因工程改造等缺点。小鼠近交多，品种一致性高，较易复制，实验可重复性高，更有利于基因工程方面的研究。构建PCOS的小鼠模型，现在多是用来曲唑灌胃21天或者皮下注射脱氢表雄酮(DHEA)的方法，目前也有用颈部皮下植入来曲唑缓释球的PCOS小鼠造模方式，应用前景更为广阔。
以上PCOS的小鼠模型构建方法中，来曲唑灌胃时间长，而且用药物干预期间也需要持续灌胃，这样一方面是对小鼠消化系统有持续损伤，影响实验结果，另一方面是大大增加了实验操作时间，给科研人员造成极大的不便；而皮下注射DHEA需要混合油剂作为载体使用，而且需要每天定时定量注射，会造成小鼠皮下油剂堆积，给小鼠生命造成较大的影响，小鼠的状态往往不佳，从而影响实验结果；另外现有的专用于PCOS造模的来曲唑缓释球极难获得，造成相关领域科研人员缺乏建立模型的原料，严重影响科研进展，因此，本发明提出一种构建PCOS小鼠模型的来曲唑缓试管制备方法以解决现有技术中存在的问题。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提出一种构建PCOS小鼠模型的来曲唑缓试管制备方法，解决现有的来曲唑缓试管制备方法实验操作时间长，实验结果不准确，以及来曲唑缓释球原料难以获得的问题。
为了实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案实现：一种构建PCOS小鼠模型的来曲唑缓试管制备方法，包括以下步骤：
步骤一：先根据实际制备需要获取足量的硅胶管原料，再对获取的硅胶管原料进行高压消毒，接着将高压消毒后的硅胶管原料放置到超净工作台，随后对切割刀片进行杀菌消毒，并利用杀菌消毒后的切割刀片将高压消毒后的硅胶管原料切割成段状硅胶管；
步骤二：先根据步骤一中制得的段状硅胶管内径规格，获取与其内径规格适配的圆柱形木杆，再将获取的圆柱形木杆切割为圆柱形木块，随后将切割得到的圆柱形木块塞入段状硅胶管的一端，实现对段状硅胶管一端的封闭，得到半封闭段状硅胶管；
步骤三：先将来曲唑粉末倒入干净的塑料培养皿中，再在步骤二中制得的半封闭段状硅胶管的开口端压入来曲唑粉末，并用于半封闭段状硅胶管内径适配的铁线将其中的来曲唑粉末压实，直至来曲唑粉末的长度达到4mm即为达标；
步骤四：将步骤二中制得的圆柱形木块塞入步骤三中带有来曲唑粉末的半封闭段状硅胶管的开口端，实现对半封闭段状硅胶管两端的全封闭，得到全封闭来曲唑硅胶管；
步骤五：先将步骤四中制作好的全封闭来曲唑硅胶管置于离心管中，再将无菌生理盐水加入离心管中对全封闭来曲唑硅胶管进行水浴浸泡，浸泡完成后得到用于皮下植入的来曲唑缓试管。
进一步改进在于：所述步骤一中，所述硅胶管原料的内径为0.04mm，所述硅胶管原料的外径为0.085mm，所述切割后的段状硅胶管长8mm。
进一步改进在于：所述步骤一中，对获取的硅胶管进行高压消毒的具体步骤为：先将硅胶管原料放入超高压容器内，接着在密闭的超高压容器内，用水作为介质对硅胶管原料施以400～600MPa的压力，以杀灭硅胶管原料上的细菌。
进一步改进在于：所述步骤一中，对切割刀片进行杀菌消毒的具体步骤为：先将待使用的切割刀片浸泡至酒精中进行杀菌，再将酒精浸泡后的切割刀片擦干，并放入紫外线消毒机中进行进一步杀菌消毒。
进一步改进在于：所述步骤二中，所述圆柱形木杆的截面直径与段状硅胶管的内径适配，所述圆柱形木块的长度为2mm，所述圆柱形木块在塞入段状硅胶管前进行高温消毒。
进一步改进在于：所述步骤三中，所述干净的塑料培养皿在使用前先进行高温杀菌消毒，所述来曲唑粉末压实完成后利用尺子检测曲唑粉末的长度，以判断是否达标。
进一步改进在于：所述步骤五中，所述离心管为50ml离心管，所述无菌生理盐水的浓度为0.9％，用量为30ml，所述全封闭来曲唑硅胶管进行水浴浸泡的温度为37℃，浸泡时间为24h。
进一步改进在于：所述圆柱形木块采用酒精浸泡消毒，所述塑料培养皿通过高温杀菌釜进行杀菌消毒，设置杀菌温度为100～120℃。
本发明的有益效果为：本发明依次通过切割段状硅胶管，对段状硅胶管进行半封闭，在段状硅胶管中压入来曲唑粉末，对段状硅胶管进行全封闭，以此来制得来曲唑缓试管。弥补了国内来曲唑缓释球市场的缺失，制作简便，并且能够根据实验者的实际情况来调整制备来曲唑缓释管的长度，极大地方便了科研人员，节约了实验操作时间，同时也降低了经济成本，非常值得推广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明的制备方法流程图；
图2是本发明实施例中的动情周期变化示意图；
图3是本发明实施例中的卵巢形态变化示意图；
图4是本发明实施例中的血清激素变化示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
参见图1，本实施例提供了一种构建PCOS小鼠模型的来曲唑缓试管制备方法，包括以下步骤：
步骤一：切割段状硅胶管
先根据实际制备需要获取足量的硅胶管原料，硅胶管原料的内径为0.04mm，硅胶管原料的外径为0.085mm，再对获取的硅胶管原料进行高压消毒，接着将高压消毒后的硅胶管原料放置到超净工作台，随后对切割刀片进行杀菌消毒，并利用杀菌消毒后的切割刀片将高压消毒后的硅胶管原料切割成长8mm的段状硅胶管；
对获取的硅胶管进行高压消毒的具体步骤为：先将硅胶管原料放入超高压容器内，接着在密闭的超高压容器内，用水作为介质对硅胶管原料施以400MPa的压力，以杀灭硅胶管原料上的细菌；
对切割刀片进行杀菌消毒的具体步骤为：先将待使用的切割刀片浸泡至酒精中进行杀菌，再将酒精浸泡后的切割刀片擦干，并放入紫外线消毒机中进行进一步杀菌消毒；
步骤二：半封闭段状硅胶管
先根据步骤一中制得的段状硅胶管内径规格，获取圆柱形木杆，圆柱形木杆的截面直径与段状硅胶管的内径适配，再将获取的圆柱形木杆切割为长度为2mm圆柱形木块，随后将切割得到的圆柱形木块塞入段状硅胶管的一端，实现对段状硅胶管一端的封闭，得到半封闭段状硅胶管，其中圆柱形木块在塞入段状硅胶管前采用酒精浸泡消毒；
步骤三：压入来曲唑粉末
先将来曲唑粉末倒入干净的塑料培养皿中，塑料培养皿在使用前先通过高温杀菌釜以100℃的温度进行高温消毒，再在步骤二中制得的半封闭段状硅胶管的开口端压入来曲唑粉末，并用于半封闭段状硅胶管内径适配的铁线将其中的来曲唑粉末压实，直至来曲唑粉末的长度达到4mm即为达标，来曲唑粉末压实完成后利用尺子检测曲唑粉末的长度，以判断是否达标；
步骤四：全封闭段状硅胶管
将步骤二中制得的圆柱形木块塞入步骤三中带有来曲唑粉末的半封闭段状硅胶管的开口端，实现对半封闭段状硅胶管两端的全封闭，得到全封闭来曲唑硅胶管；
步骤五：制得来曲唑缓试管
先将步骤四中制作好的全封闭来曲唑硅胶管置于50ml离心管中，再将30ml无菌生理盐水加入离心管中对全封闭来曲唑硅胶管以37℃的温度进行水浴浸泡，无菌生理盐水的浓度为0.9％，浸泡24h后得到用于皮下植入的来曲唑缓试管。
实施例二
参见图1，本实施例提供了一种构建PCOS小鼠模型的来曲唑缓试管制备方法，包括以下步骤：
步骤一：切割段状硅胶管
先根据实际制备需要获取足量的硅胶管原料，硅胶管原料的内径为0.04mm，硅胶管原料的外径为0.085mm，再对获取的硅胶管原料进行高压消毒，接着将高压消毒后的硅胶管原料放置到超净工作台，随后对切割刀片进行杀菌消毒，并利用杀菌消毒后的切割刀片将高压消毒后的硅胶管原料切割成长8mm的段状硅胶管；
对获取的硅胶管进行高压消毒的具体步骤为：先将硅胶管原料放入超高压容器内，接着在密闭的超高压容器内，用水作为介质对硅胶管原料施以600MPa的压力，以杀灭硅胶管原料上的细菌；
对切割刀片进行杀菌消毒的具体步骤为：先将待使用的切割刀片浸泡至酒精中进行杀菌，再将酒精浸泡后的切割刀片擦干，并放入紫外线消毒机中进行进一步杀菌消毒；
步骤二：半封闭段状硅胶管
先根据步骤一中制得的段状硅胶管内径规格，获取圆柱形木杆，圆柱形木杆的截面直径与段状硅胶管的内径适配，再将获取的圆柱形木杆切割为长度为2mm圆柱形木块，随后将切割得到的圆柱形木块塞入段状硅胶管的一端，实现对段状硅胶管一端的封闭，得到半封闭段状硅胶管，其中圆柱形木块在塞入段状硅胶管前采用酒精浸泡消毒；
步骤三：压入来曲唑粉末
先将来曲唑粉末倒入干净的塑料培养皿中，塑料培养皿在使用前先通过高温杀菌釜以120℃的温度进行高温消毒，再在步骤二中制得的半封闭段状硅胶管的开口端压入来曲唑粉末，并用于半封闭段状硅胶管内径适配的铁线将其中的来曲唑粉末压实，直至来曲唑粉末的长度达到4mm即为达标，来曲唑粉末压实完成后利用尺子检测曲唑粉末的长度，以判断是否达标；
步骤四：全封闭段状硅胶管
将步骤二中制得的圆柱形木块塞入步骤三中带有来曲唑粉末的半封闭段状硅胶管的开口端，实现对半封闭段状硅胶管两端的全封闭，得到全封闭来曲唑硅胶管；
步骤五：制得来曲唑缓试管
先将步骤四中制作好的全封闭来曲唑硅胶管置于50ml离心管中，再将30ml无菌生理盐水加入离心管中对全封闭来曲唑硅胶管以37℃的温度进行水浴浸泡，无菌生理盐水的浓度为0.9％，浸泡24h后得到用于皮下植入的来曲唑缓试管。
将本实施例制得的来曲唑缓试管植入试验小鼠皮下进行生殖和代谢功能的评估，得出试验小鼠的动情周期变化情况、卵巢形态变化(HE染色)情况和血清激素变化情况，如下：
1、动情周期变化
如图2所示，Control组的小鼠均表现出正常的动情周期(4-5天)，而Model组小鼠的动情周期明显紊乱，表现为动情周期延长(>5天)或无动情周期变化，一直处于动情间期，其中P代表动情前期，E代表动情期，M代表动情后期，D代表动情间期；
2、卵巢形态变化
如图3所示，与Control组相比，Model组小鼠的卵巢中未见明显的黄体，且窦状卵泡数量明显增加；
3、血清激素变化
如图4所示，与Control组相比，Model组的血清双氢睾酮(DHT)和空腹胰岛素(FINS)水平显著升高，而总睾酮(T)无明显差异。
通过上述生殖和代谢功能的评估，证实本实施例制备出的来曲唑缓试管成功构建了PCOS小鼠模型，具有明显的高雄激素血症和胰岛素抵抗表型。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种构建PCOS小鼠模型的来曲唑缓释管制备方法,其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：先根据实际制备需要获取足量的硅胶管原料，再对获取的硅胶管原料进行高压消毒，接着将高压消毒后的硅胶管原料放置到超净工作台，随后对切割刀片进行杀菌消毒，并利用杀菌消毒后的切割刀片将高压消毒后的硅胶管原料切割成段状硅胶管；
步骤二：先根据步骤一中制得的段状硅胶管内径规格，获取与其内径规格适配的圆柱形木杆，再将获取的圆柱形木杆切割为圆柱形木块，随后将切割得到的圆柱形木块塞入段状硅胶管的一端，实现对段状硅胶管一端的封闭，得到半封闭段状硅胶管；
步骤三：先将来曲唑粉末倒入干净的塑料培养皿中，再在步骤二中制得的半封闭段状硅胶管的开口端压入来曲唑粉末，并用于半封闭段状硅胶管内径适配的铁线将其中的来曲唑粉末压实，直至来曲唑粉末的长度达到4mm即为达标；
步骤四：将步骤二中制得的圆柱形木块塞入步骤三中带有来曲唑粉末的半封闭段状硅胶管的开口端，实现对半封闭段状硅胶管两端的全封闭，得到全封闭来曲唑硅胶管；
步骤五：先将步骤四中制作好的全封闭来曲唑硅胶管置于离心管中，再将无菌生理盐水加入离心管中对全封闭来曲唑硅胶管进行水浴浸泡，浸泡完成后得到用于皮下植入的来曲唑缓释管。
2.根据权利要求1所述的一种构建PCOS小鼠模型的来曲唑缓释管制备方法，其特征在于：所述步骤一中，所述硅胶管原料的内径为0.04mm，所述硅胶管原料的外径为0.085mm，所述切割后的段状硅胶管长8mm。
3.根据权利要求1所述的一种构建PCOS小鼠模型的来曲唑缓释管制备方法，其特征在于：所述步骤一中，对获取的硅胶管进行高压消毒的具体步骤为：先将硅胶管原料放入超高压容器内，接着在密闭的超高压容器内，用水作为介质对硅胶管原料施以400～600MPa的压力，以杀灭硅胶管原料上的细菌。
4.根据权利要求1所述的一种构建PCOS小鼠模型的来曲唑缓释管制备方法，其特征在于：所述步骤一中，对切割刀片进行杀菌消毒的具体步骤为：先将待使用的切割刀片浸泡至酒精中进行杀菌，再将酒精浸泡后的切割刀片擦干，并放入紫外线消毒机中进行进一步杀菌消毒。
5.根据权利要求1所述的一种构建PCOS小鼠模型的来曲唑缓释管制备方法，其特征在于：所述步骤二中，所述圆柱形木杆的截面直径与段状硅胶管的内径适配，所述圆柱形木块的长度为2mm，所述圆柱形木块在塞入段状硅胶管前进行高温消毒。
6.根据权利要求1所述的一种构建PCOS小鼠模型的来曲唑缓释管制备方法，其特征在于：所述步骤三中，所述干净的塑料培养皿在使用前先进行高温杀菌消毒，所述来曲唑粉末压实完成后利用尺子检测曲唑粉末的长度，以判断是否达标。
7.根据权利要求1所述的一种构建PCOS小鼠模型的来曲唑缓释管制备方法，其特征在于：所述步骤五中，所述离心管为50ml离心管，所述无菌生理盐水的浓度为0.9%，用量为30ml，所述全封闭来曲唑硅胶管进行水浴浸泡的温度为37℃，浸泡时间为24h。
8.根据权利要求1所述的一种构建PCOS小鼠模型的来曲唑缓释管制备方法，其特征在于：所述圆柱形木块采用酒精浸泡消毒，所述塑料培养皿通过高温杀菌釜进行杀菌消毒，设置杀菌温度为100～120℃。
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