CN115820698B

CN115820698B - 含有嵌合抗原受体和嵌合转换开关受体编码基因的融合基因及其应用

Info

Publication number: CN115820698B
Application number: CN202211464658.9A
Authority: CN
Inventors: 朱建高; 杨鑫; 杨文君
Original assignee: Carbiogene Therapeutics Co ltd
Current assignee: Carbiogene Therapeutics Co ltd
Priority date: 2022-11-22
Filing date: 2022-11-22
Publication date: 2025-01-21
Anticipated expiration: 2042-11-22
Also published as: WO2024108614A1; CN115820698A

Abstract

本发明公开了含有嵌合抗原受体和嵌合转换开关受体编码基因的融合基因及其应用。具体公开了氨基酸序列是SEQ ID No.1的融合蛋白以及包括嵌合抗原受体和嵌合转换开关受体的编码基因的核酸分子(SEQ ID No.3)。本发明通过设计含有嵌合抗原受体和嵌合转换开关受体编码基因的融合基因，将PD‑L1激活的抑制抗肿瘤T细胞反应转化为CD27介导的激活信号，赋予CAR‑T细胞抵御免疫抑制性肿瘤微环境的能力，并使其具有更强的体内持久性，通过促进细胞因子IFN‑γ和IFN‑α2的分泌来调节肿瘤附近的微环境，解除其免疫抑制性，调动机体自身免疫力参与对肿瘤细胞的杀伤作用，提高了CAR‑T细胞的抗肿瘤效果。

Description

含有嵌合抗原受体和嵌合转换开关受体编码基因的融合基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及含有嵌合抗原受体和嵌合转换开关受体(Chimeric Switch Receptor，CSR)编码基因的融合基因及其应用。

背景技术

嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)技术是采用基因工程技术修饰免疫细胞，使其表达外源性抗肿瘤基因，使得淋巴细胞等免疫细胞具有识别肿瘤细胞表面抗原的能力，并特异性识别和杀伤肿瘤细胞。近年来，CAR-T细胞治疗在B细胞等血液系统肿瘤中取得了令人鼓舞的疗效，然而其在血液肿瘤中的巨大成功尚未能在实体瘤中得以复制。实体瘤不同于血液系统肿瘤，CAR-T细胞在进入实体瘤时需要克服肿瘤细胞固有的异质性和抑制性的肿瘤微环境的复杂性，而肿瘤微环境的免疫抑制性及其结构的复杂性是T细胞免疫疗法广泛应用于实体瘤的主要障碍。

特异性识别肿瘤抗原只是CAR-T成功的第一步。肿瘤为了存活给自己创建了一个免疫抑制性的微环境，这个环境对于CAR-T是不友好的。肿瘤细胞的糖酵解使环境缺氧、呈酸性、营养耗竭。CAR-T功能的执行也需要糖酵解和氧化磷酸化，但是糖被肿瘤细胞耗尽了，CAR-T细胞的效应功能因而受损。在炎症环境中，肿瘤细胞通常会上调抑制性配体，如PD-L1和Galectin-9等。此外，肿瘤微环境还有大量抑制性免疫细胞和基质细胞，如肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)、髓性抑制细胞(MDSCs)、肿瘤相关巨噬细胞(TAMS)、肿瘤相关中性粒细胞(TANS)、肥大细胞和调节性T细胞(Tregs)。这些细胞和肿瘤细胞分泌的VEGF，TGF-β等能够导致肿瘤血管畸形，促进TAMS等免疫细胞的抗炎极化，参与上皮细胞间质转化(EMT)。它们还能产生活性氧(ROS)和诸如乳酸、吲哚胺2，3-双加氧酶(Ido)、前列腺素e2(PGE2)、可溶性脂肪酸和腺苷等分子，形成抑制性的免疫微环境。近期有研究表明，CAR-T细胞治疗后肿瘤微环境的免疫抑制作用变得更强了。

鉴于此，如何对CAR-T细胞进行相应的结构改造来克服免疫抑制的肿瘤微环境、进而提高临床治疗效果是CAR-T细胞治疗仍然面临的严峻挑战。研究和开发新的具有强大抗肿瘤作用的CAR-T细胞对肿瘤的免疫细胞治疗具有重要的理论意义和应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何预防或治疗肿瘤(如表达GPC3抗原的肿瘤)和/或调节肿瘤微环境的免疫抑制作用。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了核酸分子，所述核酸分子可包括嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)的编码基因和嵌合转换开关受体(ChimericSwitch Receptor，CSR)的编码基因。

进一步地，上述核酸分子中，所述嵌合转换开关受体可包括TGFβ受体II型胞外区(转化生长因子β的II型受体胞外区)、μPD-1和CD27跨膜区和胞浆区，所述μPD-1可为突变优化的PD-1的胞外区，其氨基酸序列可为SEQ ID No.1的第187-332位。

进一步地，上述核酸分子中，所述嵌合转换开关受体的编码基因可为下述任一种：

B1)编码融合蛋白的核酸分子；

B2)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

B3)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

所述融合蛋白可为下述任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

所述融合蛋白可为嵌合转换开关受体(Chimeric Switch Receptor，CSR)。

所述融合蛋白及其编码基因可用于提高CAR细胞抵御免疫抑制性肿瘤微环境的能力、使CAR细胞具有更强的体内持久性和/或抑制PD-1和TGFβ信号通路以增强CD27信号通路的效果。

所述融合蛋白的编码基因可用于制备本发明所述的核酸分子或含有本发明所述核酸分子的CAR细胞。

本文所述标签包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码融合蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的、具有与本发明融合蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述融合蛋白且具有所述融合蛋白的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

进一步地，上述核酸分子中，所述核酸分子还可包括IFNα基因(α干扰素基因)和/或P2A基因。

所述IFNα基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第1552-2118位。

所述P2A基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第1474-1551位。

进一步地，所述核酸分子中，所述嵌合抗原受体的编码基因可为靶向GPC3的嵌合抗原受体的编码基因。

所述GPC3为磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3)。

进一步地，所述靶向GPC3的嵌合抗原受体的编码基因可为下述任一种：

C1)编码氨基酸序列为SEQ ID No.4的蛋白质的核酸分子；

C2)编码序列是SEQ ID No.3第1-1473位的DNA分子；

C3)核苷酸序列是SEQ ID No.3第1-1473位的DNA分子。

进一步地，所述核酸分子可为下述任一种：

D1)核苷酸序列为SEQ ID No.3的DNA分子；

D2)SEQ ID No.3所示的核苷酸序列经过修饰和/或一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与D1)所示的DNA分子具有70％以上的同一性，且具有相同功能的DNA分子。

所述70％以上的同一性可为至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述任一种：

E1)含有所述核酸分子的表达盒；

E2)含有所述核酸分子的重组载体、或含有E1)所述表达盒的重组载体；

E3)含有所述核酸分子的重组微生物、或含有E1)所述表达盒的重组微生物、或含有E2)所述重组载体的重组微生物；

E4)含有所述核酸分子的重组细胞、或含有E1)所述表达盒的重组细胞、或含有E2)所述重组载体的重组细胞；

E5)所述嵌合转换开关受体的编码基因；

E6)所述嵌合转换开关受体；

E7)所述融合蛋白。

上述生物材料中，E4)中所述细胞可为T细胞、NK细胞、γδT细胞、NKT细胞、巨噬细胞或干细胞。

所述重组细胞表达所述核酸分子。

进一步地，E4)中所述细胞可为T细胞。

进一步地，E4)中所述细胞可为人T细胞。

本文所述载体是指能够把外源DNA或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体，所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、病毒载体(如杆状病毒载体、逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒或疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)等)。在本发明的一个或多个实施方案中，所述载体为pUC57载体和/或逆转录病毒载体MP71。

本文所述微生物可为细菌、酵母、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、产碱菌属(Alcaligenes sp.)、假单胞菌属(Pseudomonassp.)、芽胞杆菌属(Bacillus sp.)等但不限于此。所述酵母可来自酿酒酵母(Saccharomyces sp.)、毕赤酵母(Pichia sp.)、耶氏酵母(Yarrowia sp.)、假丝酵母(Candida sp.)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces sp.)、汉逊酵母(Hansenula sp.)、克鲁维酵母(Kluyreromyces sp.)等但不限于此。所述藻可来自墨角藻属(Fucus sp.)、曲壳藻属(Achnanthes sp.)、茧形藻属(Amphiprora sp.)、双眉藻属(Amphora sp.)、纤维藻属(Ankistrodesmus sp.)、星胞藻属(Asteromonas sp.)、黄金色藻属(Boekelovia sp.)等但不限于此。所述真菌可来自镰刀菌属(Fusarium sp.)、丝核菌属(Rhizoctonia sp.)、轮枝菌属(Verticillium sp.)、青霉属(Penicillium sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、头孢霉属(Cephalosporium sp.)等但不限于此。在本发明的一个或多个实施方案中，所述微生物为大肠杆菌DH5α。

本文所述细胞(宿主细胞)是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于：哺乳动物的免疫细胞或具有向免疫细胞分化能力的干细胞。所述宿主细胞可包括T细胞、NK细胞、γδT细胞、NKT细胞、巨噬细胞或干细胞等但不限于此。在本发明的一个或多个实施方案中，所述细胞为人T细胞。

本文所述重组载体是指将外源目的基因与载体在体外连接构建而成的重组载体DNA分子，可以任何合适的方式构建，只要构建的重组载体可携带外源目的基因进入受体细胞、并为外源目的基因提供在受体细胞的复制、整合、扩增和/或表达能力即可。在本发明的一个或多个实施方案中，所述重组载体为重组载体pUC57-GPC3 CAR-IC和/或重组逆转录病毒载体MP71-GPC3 CAR-IC。

所述重组载体pUC57-GPC3 CAR-IC是将核苷酸序列为SEQ ID No.3的GPC3 CAR-IC基因克隆在pUC57载体上，得到的重组载体。重组载体pUC57-GPC3 CAR-IC含有SEQ ID No.3所示的DNA分子。

所述重组逆转录病毒载体MP71-GPC3 CAR-IC是将逆转录病毒载体MP71的NotI和EcoRI识别位点间的片段(小片段)替换为序列表中SEQ ID No.3的DNA片段，保持逆转录病毒载体MP71的其他核苷酸序列不变，得到的重组表达载体。重组逆转录病毒载体MP71-GPC3CAR-IC含有SEQ ID No.3所示的DNA分子。

本文所述重组微生物是指对目的微生物的基因进行操作和修饰，从而得到功能发生变化的微生物。如将外源目的基因或重组载体导入目的微生物后得到的重组微生物，或直接对目的微生物的内源基因进行基因编辑后得到的重组微生物。在本发明的一个或多个实施方案中，所述重组微生物为将所述重组逆转录病毒载体MP71-GPC3 CAR-IC导入大肠杆菌DH5α得到的重组菌，其含有SEQ ID No.3所示的DNA分子。

本文所述重组细胞是指对目的细胞的基因进行操作和修饰，从而得到功能发生变化的细胞。如将外源目的基因或重组载体导入目的细胞后得到的重组细胞。进一步地，本文所述重组细胞包括将CAR基因表达于受体细胞(如T细胞、NK细胞、γδT细胞、NKT细胞、巨噬细胞或干细胞)中稳定表达得到的重组细胞，如CAR-T细胞，CAR-NK细胞、CAR-巨噬细胞(CAR-M细胞)、CAR-iPSC或CAR-PSC但不限于此。在本发明的一个或多个实施方案中，所述重组细胞为GPC3 CAR-IC T细胞。

所述GPC3 CAR-IC T细胞为将所述重组逆转录病毒载体MP71-GPC3 CAR-IC通过包装细胞包装得到重组逆转录病毒后，将所述重组逆转录病毒导入T细胞得到的重组细胞，所述包装细胞可为Phoenix Ecotropic(ECO)细胞和PG13细胞。

所述GPC3 CAR-IC T细胞含有SEQ ID No.3所示的DNA分子，表达GPC3 CAR-IC基因(SEQ ID No.3)。

本发明还提供了本文中任一所述的核酸分子，和/或，所述生物材料的下述任一种应用：

F1)在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的应用；

F2)在制备用于预防或治疗表达GPC3抗原的肿瘤的药物中的应用；

F3)在调节肿瘤微环境的免疫抑制作用或制备调节肿瘤微环境的免疫抑制作用的产品中的应用；

F4)在预防或治疗肿瘤中的应用；

F5)在预防或治疗表达GPC3抗原的肿瘤中的应用；

F6)在预防或治疗肝癌、黑色素瘤、Wilm’s瘤、非小细胞肺癌、卵巢透明细胞癌、鳞状细胞癌、肾细胞癌、前列腺癌、直结肠癌、肝胚细胞瘤或神经胶质瘤中的应用。

进一步地，F3)中所述调节可为降低或抑制。

上述应用中，所述表达GPC3抗原的肿瘤可为肝癌、黑色素瘤、Wilm’s瘤、非小细胞肺癌、卵巢透明细胞癌、鳞状细胞癌、肾细胞癌、前列腺癌、直结肠癌、肝胚细胞瘤或神经胶质瘤但不限于此。

进一步地，所述肝癌可为肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)。

进一步地，所述鳞状细胞癌可为肺鳞癌。

进一步地，所述黑色素瘤可为恶性黑色素瘤。

进一步地，所述神经胶质瘤可为胶质母细胞瘤。

进一步地，所述表达GPC3抗原的肿瘤可为GPC3高表达的肿瘤。

进一步地，所述F1)可为在制备用于抑制和/或杀伤肿瘤的药物中的应用。

进一步地，所述F2)可为在制备用于抑制和/或杀伤表达GPC3抗原的肿瘤的药物中的应用。

所述抑制可为抑制肿瘤增殖和/或生长。

本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物的活性成分可为含有或表达本发明任一所述核酸分子的CAR细胞(如CAR-T细胞，CAR-NK细胞、CAR-巨噬细胞、CAR-iPSC或CAR-PSC)。

进一步地，所述药物组合物包括本文所述GPC3 CAR-IC T细胞。

进一步地，所述药物组合物还包括一种或者是多种药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂但不限于此。

所述药物组合物具有抗肿瘤作用，可用于预防或治疗肿瘤。

进一步地，所述药物组合物可用于预防或治疗哺乳动物肿瘤。

所述哺乳动物可为人、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猪，犬，羊，猴，兔、猫、牛、马中的任意一种但不限于此。

本文所述肿瘤可为实体瘤(如胰腺癌、肺癌、肾癌、肝癌或脑胶质瘤)。

进一步地，所述药物组合物的活性成分可为表达所述GPC3 CAR-IC基因(SEQ IDNo.3)的免疫效应细胞。

进一步地，所述药物组合物的活性成分可为所述GPC3 CAR-IC T细胞。

本发明还提供了一种预防或治疗肿瘤的方法，所述方法可为给予患有肿瘤疾病的患者施用含有本文E4)中所述重组细胞的药物。

上述方法中，所述重组细胞可为GPC3 CAR-IC T细胞，所述GPC3 CAR-IC T细胞可含有SEQ ID No.3所示的DNA分子。

上述方法中，所述肿瘤可为表达GPC3抗原的肿瘤。

上述方法中，所述表达GPC3抗原的肿瘤可为肝癌、黑色素瘤、Wilm’s瘤、非小细胞肺癌、卵巢透明细胞癌、鳞状细胞癌、肾细胞癌、前列腺癌、直结肠癌、肝胚细胞瘤或神经胶质瘤但不限于此。

上述方法中，所述肝癌可为肝细胞癌。

上述方法中，所述鳞状细胞癌可为肺鳞癌。

上述方法中，所述黑色素瘤可为恶性黑色素瘤。

上述方法中，所述神经胶质瘤可为胶质母细胞瘤。

本发明还提供了所述GPC3 CAR-IC T细胞的制备方法，所述方法包括：

(1)构建并合成GPC3 CAR-IC基因(SEQ ID No.3)；

(2)将所述GPC3 CAR-IC基因克隆到逆转录病毒载体MP71中，得到重组逆转录病毒载体MP71-GPC3 CAR-IC；

(3)将所述重组逆转录病毒载体MP71-GPC3 CAR-IC导入包装细胞进行包装，得到重组逆转录病毒；

(4)将所述重组逆转录病毒转染T细胞，得到所述GPC3 CAR-IC T细胞。

上述方法中，所述包装细胞可为Phoenix Ecotropic(ECO)细胞和PG13细胞。

本发明还提供了所述融合蛋白，和/或，所述核酸分子在制备GPC3 CAR-IC T细胞中的应用。

本文所述核酸分子可为含有嵌合抗原受体和嵌合转换开关受体编码基因的融合基因。

本文所述核酸分子可表达嵌合抗原受体、IFNα和融合蛋白，所述融合蛋白可为下述任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

进一步地，所述嵌合抗原受体的靶点可为GPC3。

进一步地，所述嵌合抗原受体可为下述任一种：

F1)氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；

F2)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与F1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

F3)在F1)或F2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

进一步地，所述IFNα可为下述任一种：

G1)氨基酸序列是SEQ ID No.5的蛋白质；

G2)将SEQ ID No.5所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与G1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

G3)在G1)或G2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

进一步地，本文所述核酸分子可表达氨基酸序列为SEQ ID No.4的嵌合抗原受体、氨基酸序列为SEQ ID No.5的IFNα和氨基酸序列为SEQ ID No.1的融合蛋白(嵌合转换开关受体)。

本文所述核酸分子可为GPC3 CAR-IC基因，所述GPC3 CAR-IC基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3，所述GPC3 CAR-IC基因从N端至C端依次可为嵌合抗原受体的编码基因、P2A基因、IFNα基因、启动子元件基因、嵌合转换开关受体的编码基因。结构示意图如图1所示(IFNα基因、启动子元件基因、嵌合转换开关受体的编码基因三部分可总称IC基因)。其中：

所述IC基因(IFNα基因+启动子元件基因+嵌合转换开关受体的编码基因)的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第1552-3882位。

所述嵌合抗原受体的编码基因从N端至C端依次可为Signal(信号肽)、GPC3 scFv(肿瘤抗原结合区，即单链抗体区)、Hinge(铰链区)、CD8(跨膜区)、4-1BB(胞内信号区)、CD3ζ(胞内信号区)的编码基因。所述嵌合抗原受体的编码基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第1-1473位，其编码嵌合抗原受体(CAR)的氨基酸序列可为SEQ ID No.4。

所述嵌合抗原受体的编码基因中，Signal(信号肽)的编码基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第1-63位，GPC3 scFv的编码基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第64-789位，Hinge(铰链区)+CD8(跨膜区)的编码基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第790-996位，4-1BB(胞内信号区)的编码基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第997-1137位，CD3ζ(胞内信号区)的编码基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第1138-1473位。

所述P2A基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第1474-1551位。其编码的P2A肽可为来源于病毒的短肽，通常被称为“自我剪切”肽。P2A肽的“自我剪切”功能可使一条转录产物产生多种蛋白，即通过自我切割形成上游产物和下游产物两个蛋白。

所述IFNα基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第1552-2118位，其编码的IFNα(α干扰素)的氨基酸序列可为SEQ ID No.5。

所述启动子元件基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第2119-2661位，其中，SEQID No.3的第2136-2635位为启动子。

所述嵌合转换开关受体的编码基因从N端至C端依次可为TRII胞外区(TGFβ受体II型胞外区)、Linker(接头)、μPD-1、CD27跨膜区和胞浆区的编码基因。进一步地，所述CD27的跨膜区和胞浆区的编码基因可为密码子优化得到的oCD27，其在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。所述嵌合转换开关受体的编码基因的核苷酸序列可为SEQ IDNo.3的第2662-3882位(即SEQ ID No.2所示的核苷酸序列)，其编码嵌合转换开关受体(CSR)的氨基酸序列可为SEQ ID No.1。

所述嵌合转换开关受体的编码基因中，TRII胞外区(TGFβ受体II型胞外区)的编码基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第2662-3159位，Linker(接头)的编码基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第3160-3219位，μPD-1的编码基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.3的第3220-3657位，CD27的跨膜区和胞浆区(即oCD27)的编码基因的核苷酸序列可为SEQ IDNo.3的第3658-3882位。

本文所述嵌合抗原受体可特异性杀伤GPC3⁺肿瘤细胞。GPC3全称为磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3)，是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的成员，通过细胞膜上的糖基磷脂酰肌醇锚定连接于细胞表面，在大多数的肝癌组织中呈特异性高表达，能够用于靶向肝癌细胞启动杀瘤，是一种理想的肿瘤治疗靶点。

本文所述IFNα(α干扰素)可广谱抗瘤，直接调控肿瘤细胞的增殖、凋亡和迁移；抑制肿瘤血管的新生和转移；具有免疫调节功能，可通过以下方式增强抗肿瘤免疫活性：上调肿瘤细胞中MHC I、肿瘤抗原和PD-L1的表达；激活天然免疫细胞如NK、DC和γδT细胞，特别是NK细胞的扩增、迁移和功能；调控适应性免疫细胞如T细胞和B细胞，特别是T细胞的扩增、迁移、功能和存活；负性调节免疫抑制细胞如TAM、Treg和髓样抑制细胞MDSCs；上调肿瘤细胞中PD-L1的表达。

本文所述嵌合转换开关受体能够抑制PD-1和TGFβ信号通路以达到增强CD27信号通路的效果，赋予CAR-T细胞抵御免疫抑制性肿瘤微环境的能力，并使其具有更强的体内持久性；由于肿瘤细胞通常在其表面表达PD-L1以激活T细胞上的抑制性PD-1来规避/抑制抗肿瘤T细胞反应，因此嵌合转换开关受体将上述抑制作用转化为CD27介导的激活信号，同时通过PD-1靶向有利于CAR-T细胞向表达PD-L1的肿瘤部位聚集。

虽然本发明构建了核苷酸序列为SEQ ID No.3的GPC3 CAR-IC基因，但本发明不限于该特定序列，本领域技术人员可对GPC3 CAR-IC基因中的P2A基因和/或启动子元件基因进行替换，例如采用与P2A基因具有相同“自我剪切”功能的F2A(VKQTLNFDLLKLAGCVESNPG)、T2A(EGRGSLLTCGDVEENPG)、E2A(QCTNYALLKLAGDVESNPG)等但不限于此，启动子元件基因可采用本领域已知的启动子，只要构建的核酸分子能够表达氨基酸序列为SEQ ID No.4的嵌合抗原受体、氨基酸序列为SEQ ID No.5的IFNα和氨基酸序列为SEQ ID No.1的融合蛋白(嵌合转换开关受体)，并且与本发明所述核酸分子功能相同，均视为与本发明核酸分子等同的核酸分子，这些等同的核酸分子均未脱离本发明的保护范围。

本申请的发明人经过广泛而深入的研究，设计了一种含有嵌合抗原受体和嵌合转换开关受体编码基因的融合基因，并设计构建了以GPC3为靶点的GPC3 CAR-IC基因(SEQ IDNo.3)，经逆转录病毒包装、感染，从而获得了GPC3 CAR-IC T细胞。本发明构建的GPC3 CAR-IC T细胞表达两个人工受体，一个是嵌合抗原受体(CAR)，用于肿瘤相关抗原的识别，特异性杀伤GPC3⁺肿瘤细胞，靶向肝癌细胞启动杀瘤。另一个是嵌合转换开关受体(CSR)，用于将肿瘤微环境中的免疫抑制信号转化为CAR-T细胞中的激活信号，其中的TRII胞外区可以结合HCC中大量分泌的TGFβ，阻断其抑制通路，并激活CAR-T细胞中的CD27信号通路，为CAR-T细胞提供生长刺激，增强CAR-T细胞的存活、迁移，抑制肿瘤微环境；CSR中的μPD-1也可以结合HCC中表达的PD-L1，阻断T细胞上的PD-1信号通路，抑制T细胞衰竭，同时激活CAR-T细胞中的CD27信号通路，增强杀瘤效果。此外本发明构建的GPC3 CAR-IC T细胞还表达IFNα，用于广谱抗瘤、降低抗原异质性和肿瘤细胞逃逸、增强免疫细胞浸润、免疫调节、改善肿瘤微环境以及抗HBV/HCV感染。

实验结果表明，本发明构建的GPC3 CAR-IC T细胞与不表达IC基因(IFNα基因+启动子元件基因+嵌合转换开关受体的编码基因)的对照细胞相比，其IFN-γ分泌水平更高、有抗原刺激下能够分泌高水平的IFN-α2、特异性细胞毒作用更强、杀伤GPC3⁺靶细胞的作用更强，其分泌的IFN-α2能够诱导NK细胞分泌功能效应分子IFN-γ。HepG2皮下荷瘤NSG小鼠模型的体内杀瘤实验结果显示，在给药(GPC3-IC CAR-T细胞)后，小鼠血清中的IFN-α2和IFN-γ的分泌显著增加，表明本发明的GPC3 CAR-IC T细胞抑瘤效应更快、更好，具有更强的体内杀瘤活性。

本发明通过设计含有嵌合抗原受体和嵌合转换开关受体编码基因的融合基因来构建CAR-T细胞，将PD-L1和TGFβ激活的抑制抗肿瘤T细胞反应转化为CD27介导的激活信号，赋予CAR-T细胞抵御免疫抑制性肿瘤微环境的能力，并使其具有更强的体内持久性，促进了CAR-T细胞的扩增、延长了体内存活时间以及促进细胞因子分泌，实现了通过促进细胞因子IFN-γ和IFN-α2的分泌来调节肿瘤附近的微环境，解除其免疫抑制性，通过调动机体自身免疫力参与对肿瘤细胞的杀伤作用。提高了CAR-T细胞的抗肿瘤效果，对肿瘤(如肝细胞癌)的CAR-T治疗具有重要的意义和广泛的应用价值。

附图说明

图1为GPC3 CAR-IC基因结构示意图。

图2为实施例2中的CAR表达检测结果。

图3为实施例3中的CAR-IC细胞分泌IFN-γ(图3中A)和IFN-α2(图3中B)的细胞功能检测结果。

图4为实施例4中的CAR-IC细胞的细胞毒(脱颗粒CD107a)功能检测结果。

图5为实施例5中的CAR-T细胞毒作用检测结果。图5中A为对靶细胞HepG2的杀伤作用，图5中B为对阴性对照细胞U87 MG的杀伤作用。

图6为实施例6中体外检测GPC3 CAR-IC T细胞与靶细胞共培养分泌的IFN-α2对NK细胞的诱导作用。

图7为实施例7中的移植瘤HepG2-NSG模型评估体内杀瘤作用和动物存活情况。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的pUC57载体为北京擎科生物科技有限公司产品。

下述实施例中的逆转录病毒载体MP71记载于如下文献中：Engels B,Cam H,etal.Retroviral Vectors for High-Level Transgene Expression in T Lymphocytes[J].Human Gene Therapy,2003,14(12):1155-1168.，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)来源于健康志愿者的静脉血。

下述实施例中的HepG2细胞为中国科学院细胞库产品，目录号为SCSP-510。

下述实施例中的U87 MG细胞为中国科学院细胞库产品，目录号为TCHu138。

下述实施例中的NSG小鼠(6～7周龄，体重18～25g)购自百奥赛图江苏基因生物技术有限公司。

下述实施例中的RPMI-1640培养基为sigma公司产品，货号为R8758。

下述实施例中含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基(10％FBS RPMI-1640培养基)是以RPMI-1640培养基(R8758)为溶剂，以胎牛血清为溶质配制而成，也称为完全培养基。

实施例1、CAR-IC细胞构建

本实施例构建的CAR-IC细胞以GPC3为靶点，表达两个人工受体，一个是嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)，用于肿瘤相关抗原的识别，另一个是嵌合转换开关受体(Chimeric Switch Receptor，CSR)，用于将肿瘤微环境中的免疫抑制信号转化为CAR-T细胞中的激活信号，进而为CAR-T细胞提供生长刺激，增强CAR-T细胞的存活、迁移，抑制肿瘤微环境。具体构建方法如下：

1、GPC3 CAR-IC基因设计

GPC3 CAR-IC基因从N端至C端依次为嵌合抗原受体的编码基因、P2A基因、IFNα基因、启动子元件基因、嵌合转换开关受体的编码基因。结构示意图如图1所示(IFNα基因、启动子元件基因、嵌合转换开关受体的编码基因三部分总称IC基因)。其中：

IC基因(IFNα基因+启动子元件基因+嵌合转换开关受体的编码基因)的核苷酸序列为SEQ ID No.3的第1552-3882位。

嵌合抗原受体的编码基因从N端至C端依次为Signal(信号肽)、GPC3 scFv(肿瘤抗原结合区，即单链抗体区)、Hinge(铰链区)、CD8(跨膜区)、4-1BB(胞内信号区)、CD3ζ(胞内信号区)的编码基因。所述嵌合抗原受体的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3的第1-1473位，其编码嵌合抗原受体(CAR)的氨基酸序列为SEQ ID No.4。

嵌合抗原受体的编码基因中，Signal(信号肽)的编码基因的核苷酸序列为SEQ IDNo.3的第1-63位，GPC3 scFv的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3的第64-789位，Hinge(铰链区)+CD8(跨膜区)的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3的第790-996位，4-1BB(胞内信号区)的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3的第997-1137位，CD3ζ(胞内信号区)的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3的第1138-1473位。

P2A基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3的第1474-1551位。其编码的P2A肽为来源于病毒的短肽，通常被称为“自我剪切”肽。P2A肽的“自我剪切”功能可使一条转录产物产生多种蛋白，即通过自我切割形成上游产物和下游产物两个蛋白。

IFNα基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3的第1552-2118位，其编码的IFNα(α干扰素)的氨基酸序列为SEQ ID No.5。

启动子元件基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3的第2119-2661位，其中，SEQ IDNo.3的第2136-2635位为启动子。

嵌合转换开关受体的编码基因从N端至C端依次为TRII胞外区(TGFβ受体II型胞外区)、Linker(接头)、μPD-1、CD27跨膜区和胞浆区的编码基因。进一步地，CD27跨膜区和胞浆区的编码基因为密码子优化得到的oCD27，其在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。μPD-1为突变优化的PD-1的胞外区。嵌合转换开关受体的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3的第2662-3882位(即SEQ ID No.2所示的核苷酸序列)，其编码嵌合转换开关受体(CSR)的氨基酸序列为SEQ ID No.1。

嵌合转换开关受体的编码基因中，TRII胞外区(TGFβ受体II型胞外区)的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3的第2662-3159位，Linker(接头)的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3的第3160-3219位，μPD-1的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3的第3220-3657位，CD27跨膜区和胞浆区(即oCD27)的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3的第3658-3882位。

嵌合抗原受体可特异性杀伤GPC3⁺肿瘤细胞。GPC3全称为磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3)，是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的成员，通过细胞膜上的糖基磷脂酰肌醇锚定连接于细胞表面，在大多数的肝癌组织中呈特异性高表达，能够用于靶向肝癌细胞启动杀瘤，是一种理想的肿瘤治疗靶点。

IFNα(α干扰素)可广谱抗瘤，直接调控肿瘤细胞的增殖、凋亡和迁移；抑制肿瘤血管的新生和转移；具有免疫调节功能，可通过以下方式增强抗肿瘤免疫活性：上调肿瘤细胞中MHC I、肿瘤抗原和PD-L1的表达；激活天然免疫细胞如NK、DC和γδT细胞，特别是NK细胞的扩增、迁移和功能；调控适应性免疫细胞如T细胞和B细胞，特别是T细胞的扩增、迁移、功能和存活；负性调节免疫抑制细胞如TAM、Treg和髓样抑制细胞MDSCs；上调肿瘤细胞中PD-L1的表达。

嵌合转换开关受体由TRII型胞外区、μPD-1和CD27跨膜区和胞浆区组成，能够抑制PD-1和TGFβ信号通路以达到增强CD27信号通路的效果，赋予CAR-T细胞抵御免疫抑制性肿瘤微环境的能力，并使其具有更强的体内持久性；由于肿瘤细胞通常在其表面表达PD-L1以激活T细胞上的抑制性PD-1来规避/抑制抗肿瘤T细胞反应，因此嵌合转换开关受体将上述抑制作用转化为CD27介导的激活信号，同时通过PD-1靶向有利于CAR-T细胞向表达PD-L1的肿瘤部位聚集。

2、GPC3 CAR-IC基因合成

野生型人CD27跨膜区和胞浆区的编码基因全长序列称为nCD27，经密码子优化得到oCD27，保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞的表达。oCD27的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3的第3658-3882位所示。

根据步骤1中的设计(参见图1)构建GPC3 CAR-IC基因，由擎科生物科技有限公司合成，克隆在pUC57载体上，得到重组载体pUC57-GPC3 CAR-IC，并测序确定。

GPC3 CAR-IC基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，其表达氨基酸序列为SEQ IDNo.4的嵌合抗原受体、氨基酸序列为SEQ ID No.5的IFNα和氨基酸序列为SEQ ID No.1的融合蛋白(嵌合转换开关受体)。

3、CAR-IC细胞构建

将步骤2中构建的GPC3 CAR-IC基因转入T细胞中稳定表达，得到表达GPC3 CAR-IC基因(SEQ ID No.3)的T细胞，命名为GPC3 CAR-IC T细胞。具体步骤如下：

3-1、构建重组逆转录病毒载体

(1)用NotI(NEB)和EcoRI(NEB)双酶切重组载体pUC57-GPC3 CAR-IC，切胶回收目的基因片段。

(2)用NotI和EcoRI双酶切逆转录病毒载体MP71，切胶回收载体大片段。

(3)用T4连接酶(NEB)连接上述目的基因片段和载体大片段，即得到携带GPC3CAR-IC基因的重组逆转录病毒载体MP71-GPC3 CAR-IC。

(4)将重组逆转录病毒载体MP71-GPC3 CAR-IC转化感受态大肠杆菌DH5α，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，得到MP71-GPC3 CAR-IC质粒。

(5)按照上述方法同时构建不含IC基因的MP71-GPC3 CAR质粒作为对照。

重组逆转录病毒载体MP71-GPC3 CAR-IC(即MP71-GPC3 CAR-IC质粒)是将逆转录病毒载体MP71的NotI和EcoRI识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的DNA片段，保持逆转录病毒载体MP71的其他核苷酸序列不变，得到的重组表达载体。

重组逆转录病毒载体MP71-GPC3 CAR(即MP71-GPC3 CAR质粒)是将逆转录病毒载体MP71的NotI和EcoRI识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ IDNo.3的第1-1473位所示的DNA片段(嵌合抗原受体的编码基因)，保持逆转录病毒载体MP71的其他核苷酸序列不变，得到的重组表达载体。

3-2、逆转录病毒包装

将步骤3-1中制备的MP71-GPC3 CAR-IC和MP71-GPC3 CAR质粒分别导入包装细胞进行包装，完成病毒装配，得到逆转录病毒。病毒包装具体步骤如下：

a)第1天：Phoenix Ecotropic(ECO)细胞应是小于20代、不过分长满的。以0.6×10⁶/ml的细胞密度铺板，10cm皿添加10mL DMEM培养基，充分混匀细胞，37℃培养过夜；

b)第2天：ECO细胞融合度达到90％左右进行转染(通常是铺板14-18h左右)；准备质粒12.5μg，1.25M CaCl₂ 250μL，H₂O 1mL，总体积为1.25mL；在另一个管里添加跟质粒复合物等体积的2×HBS，边加质粒复合物边涡旋震荡20s。温柔地将混合物沿着边加入到ECO皿中，37℃培养4h，去除培养基，PBS洗一遍，重新加入预热的新鲜培养基；

c)第4天：转染48h后收集上清，用0.45μm滤器过滤即得到逆转录病毒溶液，分装保存于-80℃；

d)NTC 6孔板中每孔加入1.2mL 15ug/mL的Retronectin包板溶液，4℃过夜；

e)小心吸去封闭液，加入2mL/孔PBS洗涤，每孔加入5mL上述病毒溶液，32℃、2000×g离心2h，吸弃未结合的病毒上清；

f)取对数期PG13细胞用10mL PBS润洗一次，加入1mL 0.25％的重组胰酶，室温静置2-3min；

g)加入5ml含10％FBS的完全培养基，终止消化，1500rpm离心5min；

h)弃上清，用完全培养基调整细胞密度为0.5×10⁵cell/mL，按照3mL/孔加入上述病毒包板过的NTC 6孔板中，使最终细胞数为1.5×10⁵cell/孔；

i)1000rpm离心1min，37℃、5％CO₂培养48h；

j)传代1～2代后转到T175培养瓶中用含12％FBS的DEME培养基培养2d；

k)更换新的含12％FBS的DEME培养基继续培养48h后收集上清，用0.45μm滤器过滤即得到逆转录病毒溶液，分装保存于-80℃。

3-3、逆转录病毒感染人的T细胞

a)复苏冻存的健康人外周血PBMC，用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基调整细胞密度为1×10⁶-2×10⁶个细胞/mL。

b)Ficoll分离液(天津灏洋)收集PBMC，磁珠法分离获得CD3⁺T细胞，按磁珠:CD3⁺细胞＝3:1加入临床级Dynabeads Human T Expander CD3/CD28磁珠(Invitrogen)活化T细胞。

c)T细胞活化后第二天，用PBS稀释至终浓度为15μg/mL的RetroNectin(TAKARA)包被非组织处理培养板，6孔板每孔1.2mL。避光，4℃过夜备用。

d)T细胞活化培养两天后，取出包被好的6孔板，吸弃包被液，加入PBS洗板一次。

e)步骤3-2中制备的逆转录病毒溶液加入孔内，每孔加5-6mL，32℃、2000×g离心2h。每孔加入含hIL-2(500U/mL)的新鲜完全培养基3mL，继续培养1天。

f)细胞感染后，每天观察细胞的密度，适时补加含100U/mL IL-2的T细胞培养液，使T细胞的密度维持在5×10⁵/mL左右，便于细胞扩增。

g)由此获得感染了步骤3-2中制备的逆转录病毒的CAR-IC细胞和对照CAR T细胞，分别命名为GPC3 CAR-IC T细胞(即表达核苷酸序列为SEQ ID No.3的GPC3 CAR-IC基因的T细胞)和作为对照的GPC3 CAR T细胞(即表达核苷酸序列为SEQ ID No.1的第1-1473位所示DNA分子的T细胞)。

实施例2、CAR-IC细胞的CAR表达检测

实施例1中制备的GPC3 CAR-IC T细胞和GPC3 CAR T细胞，以及CTR T细胞(即无病毒转染的T细胞，作为对照)采用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基于37℃培养，并记为D0天，培养至D8天进行CAR表达检测。

1、GPC3 CAR表达检测：

(1)细胞离心(1500rpm×5min)后弃上清，96孔圆形底板中每孔加入200μL FACSbuffer(1×PBS含0.1％NaN₃和2％FBS)重悬，1500rpm离心5min；

(2)每孔加入60μL配制好的荧光标记抗体和荧光标记重组蛋白的预混液(预混液配制参见表1，其中荧光标记抗体为荧光标记抗人CD3/CD4/CD8抗体，荧光标记重组蛋白(rp)为FITC标记的GPC3重组蛋白)重悬混匀，4℃孵育30min；

表1、预混液的配制

标记物	荧光标记	货号	品牌	稀释度	用量(μL)
						CD3	PE	344806	Biolegend	1:100	0.6
CD4	APCCy7	317450	Biolegend	1:200	0.3
						CD8a	PECy7	301012	Biolegend	1:200	0.3
GPC3重组蛋白	FITC	GP3-HF258	Acrobiosystems	1:50	1.2

(3)每孔加入200μL FACS buffer，1500rpm离心5min；

(4)弃上清，用400μL FACS buffer重悬细胞转移至流式读数管中，流式细胞仪(BDCanto-II)读取细胞，分析GPC3 CAR在T细胞中的百分比。

2、干扰素α2(IFNα2)表达检测：

(3)每孔加入200μL FACS buffer，1500rpm离心5min；

(4)弃上清，每孔加入150μL Cytofix/Cytoperm(BD公司，货号55472)重悬混匀，避光、室温孵育15min；

(5)1500rpm离心5min后弃上清，每孔加入200μL Perm/Wash buffer(BD公司，货号554723)重悬混匀，1500rpm离心5min，离心洗涤2次；

(6)每孔加入20μL配制好的抗人IFN-α2重悬混匀，避光、室温孵育20min；

(7)每孔加入200μL的0.5％BSA，1500rpm离心5min，离心洗涤2次；

(8)每孔加入20μL配制好的SA-APC重悬混匀，4℃孵育10min；

(9)每孔加入200μL的0.5％BSA，1500rpm离心5min。弃上清后，用400μL FACSbuffer重悬细胞转移至流式读数管中，流式细胞仪(BDCanto-II)读取细胞，分析IFNα2在T细胞中的百分比。

3、μPD-1/TRⅡ表达检测：

(2)每孔加入60μL配制好的荧光标记抗体和荧光标记重组蛋白的预混液(预混液配制参见表1，其中荧光标记抗体为荧光标记抗人CD3/CD4/CD8抗体，荧光标记重组蛋白(rp)为FITC标记的GPC3重组蛋白)悬混匀，4℃孵育30min；

(3)每孔加入200μL FACS buffer，1500rpm离心5min；

(4)弃上清，用400μL FACS buffer重悬细胞转移至流式读数管中，流式细胞仪(BDCanto-II)读取细胞，分析μPD-1/TRⅡ在T细胞中的百分比。

检测结果如图2所示，CAR-IC细胞(即实施例1中制备的GPC3 CAR-IC T细胞)中同时表达CAR(即GPC3 CAR)、IFNα2、μPD-1和TRⅡ，说明CAR-IC细胞中CAR分子的表达达到预期设计。

实施例3、CAR-IC细胞分泌IFN-γ和IFN-α2的细胞功能检测

受试细胞为实施例1中制备的GPC3 CAR-IC T细胞和GPC3 CAR T细胞，以及CTR T细胞(即无病毒转染的T细胞)。

上述受试细胞培养至D10天，按每孔1mL共1×10⁶个细胞加入24孔TC板中，以受试细胞:靶细胞＝1:1的比例加入HepG2细胞，置于37℃培养箱共培养，并记为D0天。

检测分组及对照如下：

CTR T+Medium：每孔1mL共1×10⁶个细胞无病毒转染的T细胞(CTR T细胞)中加入1mL Medium(10％FBS RPMI-1640培养基)；

CTR T+HepG2：每孔1mL共1×10⁶个细胞无病毒转染的T细胞(CTR T细胞)中加入1mL共1×10⁶个HepG2细胞；

GPC3 CAR T+Medium：每孔1mL共1×10⁶个常规靶向GPC3的CAR T细胞(GPC3 CAR T细胞)中加入1mL Medium(10％FBS RPMI-1640培养基)；

GPC3 CAR T+HepG2：每孔1mL共1×10⁶个常规靶向GPC3的CAR T细胞(GPC3 CAR T细胞)中加入1mL共1×10⁶个HepG2细胞；

GPC3 CAR-IC T+Medium：每孔1mL共1×10⁶个靶向GPC3的CAR-IC T细胞(GPC3CAR-IC T细胞)中加入1mL Medium(10％FBS RPMI-1640培养基)；

GPC3 CAR-IC T+HepG2：每孔1mL共1×10⁶个靶向GPC3的CAR-IC T细胞(GPC3 CAR-IC T细胞)中加入1mL共1×10⁶个HepG2细胞。

连续三天(D1天、D2天、D3天)取上述共培养细胞检测分泌的IFN-γ和IFN-α2。

具体检测步骤如下：

1、上述培养D1天、D2天、D3天的共培养细胞，调整细胞密度至2×10⁶个/mL，取100μL加入96孔U底板，每孔加入终浓度为5μg/mL的Brefeldin A(Med Chem Express，HY-16592)，置于37℃培养箱孵育5～6小时。

2、孵育完成后进行流式细胞染色，操作步骤如下：

(1)细胞离心(1500rpm×5min)后弃上清，每孔加入200μL FACS buffer(1×PBS含0.1％NaN₃和2％FBS)重悬，1500rpm离心5min，重复此步骤2次；

(2)每孔加入60μL配制好的荧光抗体(荧光标记抗人CD3/CD4/CD8/GPC3(rp))重悬混匀，避光、室温孵育10min；

(3)每孔加入200μL FACS buffer，1500rpm离心5min后弃上清；

(4)每孔加入150μL Cytofix/Cytoperm(BD公司，货号55472)重悬混匀，避光、室温孵育15min；

(5)1500rpm离心5min弃上清后，每孔加入200μL Perm/Wash buffer(BD公司，货号554723)重悬混匀，1500rpm离心5min，离心洗涤2次；

(6)每孔加入20μL稀释的APC标记的抗人IFN-γ(Biolegend，货号506510)或抗人IFN-α2(Biolegend，货号537204)重悬混匀，避光、室温孵育20min；

(7)每孔加入200μL Perm buffer，1500rpm离心5min。弃上清后，用400μL FACSbuffer重悬细胞并转移至流式读数管中，用流式细胞仪(BD Canto-II)读取细胞，分析功能效应分子IFN-γ和IFN-α2在GPC3 CAR-IC T细胞和对照细胞中的百分比。

检测结果如图3所示，与靶细胞(HepG2细胞)共培养后，GPC3 CAR T细胞和GPC3CAR-IC T细胞均能特异性分泌T细胞效应分子IFN-γ；与GPC3 CAR T细胞相比，GPC3 CAR-IC T细胞的IFN-γ分泌水平更高。此外，在无抗原刺激条件下，GPC3 CAR-IC T细胞可分泌低水平的IFN-α2；有抗原刺激下，GPC3 CAR-IC T细胞可分泌高水平的IFN-α2。

实施例4、CAR-IC细胞的细胞毒(脱颗粒CD107a)功能检测

检测CAR-IC细胞的脱颗粒能力，即CD107a的表达。受试细胞为实施例1中制备的GPC3 CAR-IC T细胞和GPC3 CAR T细胞，以及CTR T细胞(即无病毒转染的T细胞)。

1)上述受试细胞培养至D10天，调整细胞密度至2×10⁶个/mL，取100μL加入96孔U底板中；

2)以受试细胞:靶细胞＝1:1的比例每孔加入100μL共2×10⁵个HepG2细胞作为CAR抗原特异性刺激(+HepG2)或阴性对照U87 MG细胞(+U87 MG)，同时每孔加入100μL Medium(10％FBS RPMI-1640培养基)为阴性对照(+Medium)；

3)每孔加入1μL APC标记的抗人CD107a抗体(Biolegend公司，货号328620)，37℃孵育1h；

4)每孔加入10μL 1:50倍稀释的Monensin Solution(Invitrogen，货号00-4505-51)，继续孵育3h；

5)孵育完成后进行流式细胞染色，操作步骤如下：

(1)细胞离心(1500rpm×5min)后弃上清，每孔加入200μL FACS buffer(1×PBS含0.1％NaN₃和2％FBS)重悬混匀，1500rpm离心5min，重复此步骤2次；

(3)1500rpm离心5min。弃上清后，用400μL FACS buffer重悬细胞并转移至流式读数管中，用流式细胞仪(BD Canto-II)读取细胞并分析细胞脱颗粒分子CD107a在T细胞中的百分比。

检测结果如图4所示，与靶细胞共培养后，GPC3 CAR T细胞和GPC3 CAR-IC T细胞均能特异性上调CD107a脱颗粒作用。此外，与GPC3 CAR-T细胞相比，GPC3 CAR-IC T细胞的特异性细胞毒作用(CD107a)更强。

实施例5、CAR-T细胞毒作用检测

1)上述受试细胞培养至D10天，调整细胞密度至2×10⁵个/mL，取100μL加入96孔U底板中；加入终浓度为100μg/mL的D-萤火虫荧光素钠盐(Yeasen Biotechnology，货号40901ES08，储存浓度为100mg/mL)，重复3孔；

2)按不同的效靶比率(1:1、1:3、1:9、1:27)分别加入靶细胞HepG2或阴性对照细胞U87 MG(1:1条件下靶细胞的细胞密度为2×10⁴个细胞)，37℃培养16h。

3)用TECAN spark酶标仪测量荧光数值，取三个重复孔的平均值计算CAR-T细胞的特异性杀伤活性(Cytotoxicity)：

Specific lysis％＝100-100×(Eexp-Emin)/(Tmax-Tmin)

Eexp：效应细胞和靶细胞共培养时的RLU数值；

Emin：无细胞的情况下，效应细胞的自发死亡RLU数值；

Tmax：无效应细胞的情况下，靶细胞的自发死亡RLU数值；

Tmin：最大杀伤率条件下的RLU数值。

检测结果如图5所示，GPC3 CAR T细胞和GPC3 CAR-IC T细胞均能特异性杀伤GPC3⁺靶细胞(HepG2细胞)，对GPC3^-靶细胞(U87 MG细胞)无杀伤作用；对照CTR T细胞对GPC3⁺靶细胞和GPC3^-靶细胞均无杀伤作用。此外，与GPC3 CAR-T细胞相比，GPC3 CAR-IC T细胞杀伤GPC3⁺靶细胞(HepG2细胞)的作用更强。

实施例6、体外检测GPC3 CAR-IC T细胞与靶细胞共培养分泌的IFN-α2对NK细胞的诱导作用

受试细胞为实施例1中制备的GPC3 CAR-IC T细胞和GPC3 CAR T细胞，以及CTR T细胞(即无病毒转染的T细胞)。检测步骤如下：

1)上述受试细胞培养至D10天，调整细胞密度至2×10⁶个/mL，取1mL加入96孔U底板中；

2)以受试细胞:靶细胞＝1:1的比例每孔加入1mL共2×10⁶个HepG2细胞共培养3天；

3)离心收集上清，同PBMC细胞共孵育，其中PBMC：2×10⁵/well，0.1mL/well；上清：0.1mL/well；

4)孵育过夜后，每孔加入Brefeldin A(Med Chem Express，HY-16592)至工作浓度5μg/mL，37℃孵育4h；

5)孵育完成后进行流式细胞染色，操作步骤如下：

(1)细胞离心(1500rpm×5min)后弃上清，每孔加入200μL FACS buffer(1×PBS含0.1％NaN₃和2％FBS)重悬，1500rpm离心5min；

(2)每孔加入40μL配制好的荧光抗体(荧光标记抗人CD3/CD56)重悬混匀，避光、室温孵育10min；

(3)每孔加入200μL FACS buffer，1500rpm离心5min后弃上清；

(6)每孔加入40μL配制好的荧光抗体(荧光标记抗人IFNγ/Granzyme B)重悬混匀，避光、室温孵育20min；

(7)每孔加入200μL Perm buffer，1500rpm离心5min。弃上清后，用400μL FACSbuffer重悬细胞转移至流式读数管中，流式细胞仪(BDCanto-II)读取细胞，分析效应分子IFN-γ和Granzyme B(颗粒酶B)在NK细胞中的百分比。

检测结果如图6所示，GPC3 CAR-IC T细胞分泌的IFN-α2能够诱导NK细胞分泌功能效应分子IFN-γ。

实施例7、移植瘤HepG2-NSG模型评估GPC3 CAR-IC T细胞的体内杀瘤作用和动物存活情况

采用HepG2皮下荷瘤NSG小鼠模型(HepG2-NSG模型)评估GPC3 CAR-IC T细胞的体内杀瘤作用和动物存活情况。具体步骤如下：

1)NSG小鼠(6-7周龄)右侧下肢背部皮下接种HepG2细胞，1×10⁷个细胞/只。

2)第12天，小鼠肿瘤长至80-100mm³后注射GPC3 CAR-IC T细胞，记为D0天。期间随机将荷瘤小鼠分为3组，5只/组，分组如下：

对照组(CTR T)：注射CTR T细胞，3×10⁶个细胞/只；

GPC3 CAR T组：注射GPC3 CAR-T细胞，3×10⁶个细胞/只；

GPC3 CAR-IC T组：注射GPC3-IC CAR-T细胞，3×10⁶个细胞/只。

3)分别在给药后的D7、D14、D21、D28、D35天用游标卡尺测量肿瘤大小。

4)并分别在小鼠给药前1天(D-1)和给药后的D4、D7、D12、D21、D28天颌下取血收集小鼠血清，并通过血清多重细胞因子法检测小鼠体内GPC3 CAR-IC T细胞和对照细胞分泌的IFN-γ和IFN-α2。

检测结果如图7所示，与GPC3 CAR-T细胞相比，D7/D14天GPC3 CAR-IC T细胞的抑瘤效应更快、更好。在GPC3 CAR-IC T细胞过继转移的小鼠血清中有高水平的IFN-α2分泌。与过继转移的GPC3 CAR-T小鼠相比，GPC3 CAR-IC T小鼠血清中有更高水平的IFN-γ分泌。表明GPC3 CAR-IC T细胞具有更强的体内杀瘤活性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims

1.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子自N端至C端依次由嵌合抗原受体的编码基因、P2A基因、IFNα基因、启动子元件基因和嵌合转换开关受体的编码基因组成，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，所述IFNα的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，所述嵌合转换开关受体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述P2A基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.3的第1474-1551位所示，所述启动子元件基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3的第2119-2661位所示。

3.根据权利要求1或2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQID No.3所示。

4.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：

E1）含有权利要求1-3中任一所述核酸分子的表达盒；

E2）含有权利要求1-3中任一所述核酸分子的重组载体、或含有E1）所述表达盒的重组载体；

E3）含有权利要求1-3中任一所述核酸分子的重组微生物、或含有E1）所述表达盒的重组微生物、或含有E2）所述重组载体的重组微生物；

E4）含有权利要求1-3中任一所述核酸分子的重组细胞、或含有E1）所述表达盒的重组细胞、或含有E2）所述重组载体的重组细胞。

5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，E4）中所述细胞为T细胞、NK细胞、巨噬细胞或干细胞。

6.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，E4）中所述细胞为γδT细胞或NKT细胞。

7.权利要求1-3中任一所述的核酸分子，和/或，权利要求4-6中任一所述生物材料的下述任一种应用：

F1）在制备用于预防或治疗肝癌的药物中的应用；

F2）在制备调节肝癌微环境的免疫抑制作用的产品中的应用。