CN115820468B - 一种高地芽孢杆菌ylb2-1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物学技术领域，具体涉及的是一种高地芽孢杆菌YLB2‑1及其应用。一种高地芽孢杆菌YLB2‑1，其分类学名高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)，于2022年6月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No.62524。本发明的YLB2‑1菌株于4μg/mL硒浓度下，对环境中硒的转化率达到最高为81.53％。该结果可为硒污染地区生物修复提供菌种资源，为硒资源的开发利用提供参考。

Description

一种高地芽孢杆菌YLB2-1及其应用

技术领域

本发明属于微生物学技术领域，具体涉及一种高地芽孢杆菌YLB2-1及其应用。

背景技术

硒在自然界中主要以四种形态存在，分别是硒化物(Se^2-)、单质硒(Se⁰)、亚硒酸盐(SeO₃ ^2-)和硒酸盐(SeO₄ ^2-)，而各种形态之间的价态的转化都与微生物息息相关。土壤中的硒安全值范围为0.1-3.0μg/g，小于或大于此值都会导致动物和人体出现明显的缺硒病或硒中毒病。近年来，硒污染问题全球屡见不鲜，在我国湖北恩施和陕西紫阳地区曾出现过因硒污染中毒的案例，其中最著名的是恩施鱼塘坝人群硒中毒事件，近年来硒污染地区的环境修复成为了研究的热点。

高硒环境是耐硒微生物菌种的潜在来源，研究表明高硒环境胁迫下细菌产生应激反应，将毒性较高的无机硒转化为毒性较低的硒单质。彭祚全等与王明义等曾经从湖北恩施富硒土壤中筛选出耐硒菌株，并能在含硒培养基中将无机硒还原为红色单质硒，在治理环境硒污染方面具有重要意义。

目前，国内对硒的研究主要集中于硒在土壤中的行为、植物富硒以及纳米硒材料，而对富硒土壤中的微生物研究较少，为此发明人从广西富硒地区采集土壤样品，对耐硒菌株进行鉴定，并进行耐硒菌株对硒的转化率测定，以期从微生物方向为硒资源的开发利用提供菌种资源。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高地芽孢杆菌YLB2-1及其应用。

本发明提供的高地芽孢杆菌YLB2-1是从广西玉林市寒山土壤中分离得来，经形态学和分子生物学鉴定为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)，于2022年6月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，(简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编：510070)，保藏号为GDMCC No.62524。

另外，本发明提供的高地芽孢杆菌YLB2-1的16S rRNA序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了所述的高地芽孢杆菌YLB2-1在转化环境中硒的用途。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明利用稀释平板法进行耐硒菌株筛选，通过形态学观察及16S rRNA序列测序对耐硒菌株进行鉴定，并进行耐硒菌株对硒的转化率测定。获得的YLB2-1鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)；对硒的转化率研究中，YLB2-1菌株于4μg/mL硒浓度下，对环境中硒的转化率达到最高为81.53％。该结果可为硒污染地区生物修复提供菌种资源，为硒资源的开发利用提供参考。

保藏信息说明

Bacillus altitudinis YLB2-1，保藏编号为GDMCC No.62524，保藏日期为2022年6月8日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

附图说明

图1为本发明耐硒菌株YLB2-1形态；

图2为本发明耐硒菌株YLB2-1革兰氏染色镜检；

图3为本发明分离出的部分菌落PCR产物凝胶电泳图；

图4为本发明耐硒菌株YLB2-1的16S rRNA基因序列系统发育树；

图5为本发明耐硒菌株YLB2-1的生长曲线图；

图6为本发明耐硒菌株YLB2-1在不同硒浓度下的硒转化率；

有关附图标记的说明：

图3中，Marker：Marker DL2000；1-3：部分菌株的PCR产物，其中3为菌株YLB2-1的PCR产物。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

下述实施例中所用的材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1筛菌土壤

筛菌土壤采自广西玉林市寒山富硒土壤样品。供试土壤采用五点混合法采集0-20cm地表土，去除表面杂质后放入无菌自封袋中置于冰盒保存，当天带回实验室放入4℃冰箱保存备用，土壤理化性质如表1所示。

表1玉林富硒土壤理化性质和硒含量

1.1.2培养基

液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1L，pH 7.4-7.6。

固体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1L，琼脂15g，pH 7.4-7.6。

1.1.3硒溶液的配置

称取22.35g亚硒酸钠，用去离子水定容至100mL，即得到的溶液硒浓度为100mg/mL，使用0.22μm的无菌滤头进行过滤备用。

1.2土壤微生物的分离纯化

称取10g土壤放入装有10颗玻璃珠以及90mL的无菌水的三角瓶中。30℃，200r/min，震荡30min，静置5min收集土壤悬液于5000r/min离心15min，沉淀用10mL无菌水悬浮。取2mL悬液加入到100mL含硒浓度为100μg/mL的液体培养基中，30℃，200r/min震荡培养2d筛选，然后用梯度稀释法制备成10^-2-10^-6的稀释液，取100μL的稀释液分别涂布到固体培养基中，于30℃进行培养，细菌培养1d。挑取颜色、形态、大小、光泽不同的单个菌落，采用平板划线法进行3次重复分离纯化，获得菌株纯培养物并用甘油进行保藏。

1.3耐硒菌株的筛选

将分离纯化得到的菌株接种到液体培养基中，培养24h后，取5μL培养液接种到不同含硒浓度的固体培养基中。细菌的含硒固体培养基中的硒浓度以1000μg/mL的梯度递增进行筛选，经耐硒平板筛选，获得一株耐硒浓度达11000μg/mL的菌株。

1.4耐硒菌株形态观察

对耐硒菌株的单菌落进行显微观察拍照，并且对菌落的形态结构进行描述。

细菌革兰氏染色镜检：

(1)涂布固定：在载玻片上滴上一滴超纯水，挑取单菌落放入生理盐水中均匀涂布，载玻片在酒精灯上间歇性接触使菌落固定；

(2)初染：将固定好的载玻片上滴加草酸铵结晶紫染色1min，之后用蒸馏水冲洗干净；

(3)煤染：再滴加碘液染色1min，然后用蒸馏水冲洗干净，用吸水纸吸去水分；

(4)脱色：滴加95％的酒精数滴并轻轻摇晃进行脱色，大约20秒后进行水洗，用吸水纸吸去水分；

(5)复染：再滴加番红染色液染色1min后用蒸馏水冲洗干净，用吸水纸将水分吸干，镜检。

1.5耐硒菌株的分子生物学鉴定

将筛选得到的耐硒细菌菌株纯培养物进行16S rRNA序列扩增：挑取单菌落于1.5mL的离心管中进行菌落PCR，选择细菌通用引物27F和1492R，引物序列如表2；PCR反应体系如表3。

表2 16S rRNA引物

表3 PCR反应体系

PCR程序为：94℃，3min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，循环35次；72℃，5min。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测后，按下表4配置反应体系：

表4反应体系

配制好体系后混匀，16℃连接6h，转化，再通过PCR进行反应，选择载体引物M13F(-47)和M13R(-48)，引物序列如表5；PCR反应体系如表6。

表5载体引物

表6 PCR反应体系

PCR程序为：94℃，5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，循环25次；72℃，5min。

挑选阳性单克隆送至广州擎科生物技术有限公司进行测序，测序序列通过登录NCBI数据库上的BLAST进行比对，从而确定种属信息。

1.6耐硒菌株系统发育树的构建

将筛选出的耐硒细菌的16S rRNA序列登录NCBI数据库进行BLAST对比，一个菌株挑选七个一致性较高的序列，构建系统发育树。

1.7耐硒菌株的生长状况

将筛选出的耐硒菌株进行生长曲线的绘制：配置牛肉膏蛋白胨细菌液体培养基，每个处理三个重复，取提前摇好的细菌悬浊液按5％接种量进行接种，于37℃、200r/min，震荡培养，分别在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20h取样进行测定OD值(600nm波长)，绘制细菌生长曲线。

1.8耐硒菌株对硒的转化率研究

耐硒菌株对硒的转化率研究参考宋照军等的研究方法，在牛肉膏蛋白胨液体培养基中加入已过滤除菌的亚硒酸钠溶液，使液体培养基中的含硒浓度为0、4、10、50、100μg/mL，每个处理设置三个平行，按5％的接种量接入到相应的液体培养基中，于37℃、200r/min，震荡培养14h。培养结束后，4000r/min离心10min，取上清液进行消解，利用原子荧光光度计测定溶液中的硒浓度，转化率按公式1-1进行计算：

转化率(％)＝(C_i-C_f)/C_i×100％ (1-1)

公式中，C_i为原培养液中硒的浓度，C_f为菌株培养后的硒浓度。

1.9水样硒含量的检测

收集水样25mL，放入100mL的锥形瓶中，加入2.5mL硝酸-高氯酸混合液(V：V＝1：1)于电热板上加热至冒白烟，待冷却后加入2.5mL的盐酸(50％)，加热至黄褐色烟冒尽，冷却后定容至25mL的容量瓶中，溶液用0.45μm滤膜过滤过滤后，利用原子荧光光度计上机检测。样品溶液浓度计算按功公式1-2计算：

C＝C₁×F×V₁/V (1-2)

公式中，C为样溶液浓度(μg/L)，C₁为上机检测的浓度(μg/L)，F为样品稀释倍数，V₁为定容的体积(mL)，V为取样的体积(mL)。

1.10数据处理

利用MEGA 5.22的邻位相连法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，利用Excel2007进行作图。

2.结果与分析

2.1菌株的分离

将土壤样品加入含硒浓度为100μg/mL液体培养基中进行初筛，挑取颜色、形态等不同的单菌落进行平板划线纯化，共筛选出细菌菌株4株，将初筛的单菌落进行下一步的耐硒能力的筛选。

2.2耐硒菌株的筛选

将分离纯化得到的菌株在不同含硒浓度的固体培养基中的生长情况如下表7所示。

表7菌株在不同硒含量浓度下生长状况

注：+表示生长；-表示不生长

从表7可以看出，菌株YLB2-1、YLB2-2、YLB2-3和YLB2-4最高耐受硒含量分别为11000μg/mL、5000μg/mL、9000μg/mL和6000μg/mL。四株菌株中，菌株YLB2-1对硒的耐受性最强。

2.3耐硒菌株YLB2-1的鉴定

2.3.1形态学观察

纯培养的耐硒菌株YLB2-1，于30℃培养24h后，菌株的形态如图1所示。

从图1中可以看出，YLB2-1菌株乳白色，不透明，扁平，圆形或近圆形，直径1.0-3.0mm，表面干燥呈褶皱状，边缘整齐。

2.3.2革兰氏染色

革兰氏染色是在细胞学中广泛运用的一种鉴别方法。革兰氏阳性菌经过染色后显现为蓝紫色，革兰氏阴性菌经过染色后呈现红色。本实验对获得的耐硒菌株YLB2-1进行革兰氏染色，结果如图2所示。

从图2可以看出，YLB2-1菌株呈杆状，被染色后呈现紫色，为革兰氏阳性菌。

2.3.3分子生物学鉴定

将分离纯化的耐硒菌株YLB2-1进行菌落PCR扩增，PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，PCR产物电泳检测如图3所示。

从图3可以看出，PCR产物条带出现在1500bp左右，条带清晰，说明成功PCR产物扩增成功。

将剩下的PCR产物经过切胶回收后克隆于pMD19-T载体中，挑选单克隆送至广州擎科生物技术有限公司进行测通测序，测序序列通过登录NCBI数据库上的BLAST进行比对，对比结果如表8所示。

表8菌株BLAST比对结果

从表8可以看出，菌株YLB2-1和Bacillus altitudinis strain 11-1-1有较高的相似度。

2.4.3耐硒菌株的系统发育树构建

将筛选出耐硒菌株YLB2-1的16S rRNA序列与NCBI数据库进行对比，每一个菌株挑选七个一致性较高的序列，利用MEGA 5.22构建系统发育树，构建的发育树如图4所示。

从图4可以看出，YLB2-1菌与芽孢杆菌属(Bacillus)的相似性较高，确定YLB2-1菌株为芽孢杆菌属，将其命名为Bacillus altitudinis YLB2-1。

2.5生长曲线

将筛选出耐硒菌株YLB2-1接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，每隔2h测一次菌液的OD₆₀₀值，绘制生长曲线，结果如图5所示。

从图5可以看出，YLB2-1菌株2到14h为其对数期，生长迅速；14到20h为稳定期。

2.6耐硒细菌对硒的转化率

设置不同硒浓度的液体培养基，震荡培养至14h后，测定培养基中残留的硒浓度，结果如图6所示。

从图6可以看出，菌株均能在0-100μg/mL硒浓度下生长，其中，YLB2-1菌株于4μg/mL硒浓度下其转化率达到最高为81.53％。

在图6中，菌株的转化率表现出先上升后下降再趋向平衡的趋势，这可能由于相对较低硒浓度时菌株具有较高的吸附能力，随着液体培养基中硒浓度的升高，菌体的吸附达到饱和状态。

综上所述，本发明筛选出的耐硒菌株具有硒高效转化效果。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (2)

1.一种高地芽孢杆菌YLB2-1，其分类学名为高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis），于2022年6月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No.62524。

2.根据权利要求1所述的高地芽孢杆菌YLB2-1在转化环境中硒的用途。

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