CN115806586B

CN115806586B - 美白短肽及其制备方法

Info

Publication number: CN115806586B
Application number: CN202211425296.2A
Authority: CN
Inventors: 杨霞; 兰小宾; 王玲玲
Original assignee: Shanxi Jinbo Bio Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Shanxi Jinbo Bio Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2022-06-15
Filing date: 2022-11-14
Publication date: 2023-10-20
Anticipated expiration: 2042-11-14
Also published as: CN115806586A

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及美白短肽及其制备方法。本发明提供了一种肽，其氨基酸序列包含如SEQ ID No.1所示的序列。本发明还提供了所述肽的编码多核苷酸、包含该多核苷酸的重组表达载体、包含该重组表达载体的重组宿主细胞、所述肽的制备方法和用途以及包含所述肽的具有美白、抑制黑色素母细胞或抑制黑色素生成的功能的产品。本发明提供的肽与MSH‑α的序列相似，水溶性好，稳定性强。本发明提供的肽的制备方法操作工艺简单，可以利用生物发酵进行大规模制备，拥有显著的成本优势。利用本发明提供的肽的制备方法所生产的产品，分子量准确，纯度高，无明显杂质成分。

Description

美白短肽及其制备方法

优先权和相关申请

本申请要求于2022年6月15日提交中国专利局、申请号为202210678931.1、发明名称为“美白短肽及其制备方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及美白短肽及其制备方法。

背景技术

皮肤美白是许多亚洲女性的执着追求，更有“一白遮百丑”的传统美学观念。从科学的角度而言，皮肤的颜色主要是由于皮肤中的色素含量决定的，最主要就是黑色素的含量。皮肤中黑色素的含量可以很大程度上决定皮肤颜色的深浅。黑色素是一种蛋白质，存在于每个人的皮肤、毛发、视网膜、软脑膜等组织中。黑色素的颗粒不全都是纯黑色的，也有黄棕色、红棕色、棕褐色、深棕色等等。他们共同起作用，决定了人类皮肤和毛发的不同颜色。

黑色素是由黑色素母细胞分泌而产生的。黑色素母细胞属于腺细胞，有很强的分泌能力，其主要分布于人的表皮基层细胞间。黑色素是一种生物色素，是酪氨酸或3,4-二羟苯丙氨酸(又称为多巴，DOPA)经过一连串化学反应所形成，动物、植物与原生生物都有这种相同色素。黑色素通常以聚合的方式存在。黑色素生成的越多，皮肤就越黑。所以只要让黑色素母细胞少生成黑色素，人体皮肤就可以变白。通常有两种思路来减少黑色素的生成，一种思路是降低黑色素母细胞内的酪氨酸酶的生物学活性，第二种思路是通过控制外源刺激信号来抑制黑色素母细胞的活性。

人体内各种细胞的活性普遍都受到了细胞因子的调节，黑色素母细胞也不例外。MSH全称为黑色素细胞刺激素(melanocyte-stimulating hormone)，或者促黑激素，是人体中非常重要的激素，是由垂体产生的多肽激素。MSH的功能很强大，即能刺激在头发和皮肤中的黑色素细胞产生黑色素，使皮肤变黑；又能游离脂肪组织的脂肪酸，改善人的视觉滞留，改变神经应激性，提高智力迟钝者的注意力和记忆力。黑色素母细胞表面表达一种黑素皮质素受体，叫做MSH-R，属于GPCR家族成员。MSH-R是MSH信号分子的受体。MSH激素从垂体分泌之后，结合到黑色素母细胞上的MSH-R受体上，开启信号通路，激活下游的黑色素的生成。只要能够干扰到MSH和MSH-R的相互作用，就可以阻断这个信号通路的激活，就可以抑制皮肤黑色素的生成。

目前人类还没有解析得到MSH蛋白结合MSH-R受体的晶体结构，因此二者结合的具体方式尚不明确。但是，人们仍然可以通过设计MSH的序列类似物，来达到阻止MSH结合MSH-R的目的。人体中有α与β两种MSH，其中MSH-α的氨基酸序列为SYSMEHFRWGKPV，以往人们设计了许多类似多肽来模仿这个信号分子的生物学功能，通过结合MSH-R受体来阻止人体自身的MSH信号分子发挥激活作用。比如Nonapeptide-1，又称为melanostatine-5，就是一种MSH-α的类似物，已被证实具有美白的功能。其氨基酸序列和MSH-α的氨基酸序列极为相似。但是，melanostatine-5的序列里面含有2个D型的氨基酸，不易通过生物发酵的方法进行制备，因此，其制备方法还都是局限于化学合成，其高额的成本限制了这类产品的广泛使用。

因此，开发一种能够通过生物合成的较低成本的美白肽是本领域亟待解决的问题。

发明内容

发明要解决的问题

目前，MSH-α类似多肽的制备方法局限于化学合成，高额的制造成本阻碍了此类产品的广泛应用。对此，本发明拟提供一种美白短肽及其制备方法，在保证肽的氨基酸序列与MSH-α相似的基础上，利用生物合成实现大规模制备，以便大规模应用。

用于解决问题的方案

本发明的第一方面提供了一种肽，其中，所述肽的氨基酸序列包含如下(i)-(iii)中的任一项：

(i)如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；

(ii)在如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或修饰1个或多个氨基酸残基并且保留如SEQ ID No.1所示序列的美白或抑制黑色素母细胞或抑制黑色素生成的活性的氨基酸序列；

(iii)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码如SEQ ID No.1所示序列的多核苷酸序列在严格条件下杂交，并且所述氨基酸序列保留如SEQ ID No.1所示序列的美白或抑制黑色素母细胞或抑制黑色素生成的活性，所述严格条件是中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件或非常高严格条件。

本发明的第二方面提供了一种多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码根据本发明第一方面所述的肽。

进一步的，所述多核苷酸的序列包含如SEQ ID No.2所示的序列。

本发明的第三方面提供了一种重组表达载体，其种，所述重组表达载体包含根据本发明第二方面所述的多核苷酸的n个重复，n为大于等于1的整数，当n为大于等于2的整数时，各重复多核苷酸之间直接连接；

优选的，n为2；

优选的，所述重组表达载体包括pET系列载体、穿梭载体、噬菌体或病毒载体；

更优选的，所述重组表达载体为pET-32a。

进一步的，所述重组表达载体还包含编码能够被TEV蛋白酶切除的氨基酸序列的多核苷酸；

优选的，所述编码能够被TEV蛋白酶切除的氨基酸序列的多核苷酸的3’端与首个所述重复多核苷酸的5’端直接连接。

本发明的第四方面提供了一种重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞包含根据本发明第三方面所述的重组表达载体；

优选的，所述重组宿主细胞为原核细胞、酵母或真核细胞；

更优选的，所述重组宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的第五方面提供了根据本发明第一方面所述的肽的制备方法，其中，所述方法包括如下S1～S2所示的步骤：

S1：发酵培养根据权利要求6所述的重组宿主细胞，诱导肽的表达；

S2：收集并纯化所述肽。

进一步的，在步骤S2中包括使用Ni亲和层析柱和/或离子交换层析柱纯化所述肽，以及任选的包括对所述肽进行酶切；

优选用TEV蛋白酶酶切所述肽。

本发明的第六方面提供了根据本发明第一方面所述的肽在如下(a)～(c)中至少一项中的用途：

(a)作为或制备美白产品；

(b)作为或制备抑制黑色素母细胞的产品；

(c)作为或制备抑制黑色素生成的产品。

本发明的第七方面提供了一种产品，其中，所述产品包含根据本发明第一方面所述的肽，并且所述产品具有美白、抑制黑色素母细胞或抑制黑色素生成的功能。

发明的效果

通过以上技术方案的实施，本发明提供了一种肽，其与人体天然蛋白MSH-α更相似，水溶性好，稳定性强，具有良好的美白、抑制黑色素母细胞及抑制黑色素生成的功能。同时本发明提供了上述肽的制备方法，利用大肠杆菌表达系统，实现了大规模生产，通过多肽基因的串联表达可以进一步提高产量，且操作工艺简单，相对传统多肽的化学合成工艺，本发明提供的制备方法具有显著的成本优势，具有广阔的市场应用前景。利用本发明提供的肽的制备方法所生产的产品，分子量准确，纯度高，无明显杂质成分。

同时，实验数据显示，本发明提供的肽可以有效抑制酪氨酸酶的活性，并可有效抑制细胞生成黑色素，具有良好的美白作用，为美白产品的开发和生产提供了有效帮助。

附图说明

图1为多肽Trx-1T9和多肽1T9的SDS-PAGE检测结果。

图2为多肽1T9的质谱检测结果。

图3为pET-32a-1T9载体图谱。

图4为多肽1T9对细胞黑色素生成的影响的检测结果；其中，#表示与空白对照组进行对比，差异具有统计学意义(p<0.05)；*表示与模型对照组进行对比，差异具有统计学意义(p<0.05)；TA表示待测物质即多肽1T9。

图5为多肽1T9对酪氨酸酶活性的影响的检测结果；其中，#表示与空白对照组进行对比，差异具有统计学意义(p<0.05)；*表示与模型对照组进行对比，差异具有统计学意义(p<0.05)；TA表示待测物质即多肽1T9。

具体实施方式

以下对本发明的实施方式进行说明，但本发明不限定于此。

在本发明中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。

在本发明中，术语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”可以指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。与此同时，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”也可以表示封闭式的，排除额外的、未引述的元件或方法步骤。

在本发明中，术语“肽”、“短肽”、“多肽”、“蛋白”可互换地指通过共价键(例如肽键)相互连接的一串至少两个氨基酸残基，可以是重组肽、天然肽或合成肽。肽可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。

在本发明中，术语“氨基酸”可以包括天然氨基酸、非天然氨基酸、氨基酸类似物以及所有它们的D和L立体异构体。

在本发明中，“杂交”意指多核苷酸或寡核苷酸在严格条件下与大体互补的序列结合的能力，而在这些条件下不发生与非互补对象之间的非特异性结合。对此，所述序列优选为90～100％互补的。将能够互相特异性结合的互补序列的特性应用于例如Northern或Southern印迹技术中，或是PCR或RT-PCR的引物结合中。根据本发明，杂交在中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件条件下发生。此类杂交条件描述于描述于Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中。例如，具体的杂交条件如下：(1)低严格性杂交条件在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，在约45℃，然后在至少50℃，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤2次(对于低严格性条件，可以将洗涤温度升高到55℃)；(2)中等严格性杂交条件在6×SSC，在约45℃，然后在60℃，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤1次或多次；(3)高严格性杂交条件在6×SSC，在约45℃，然后在65℃，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤1次或多次且优选；(4)非常高的严格性杂交条件是0.5M磷酸钠，7％SDS，在65℃，然后在65℃，在0.2×SSC，1％SDS中洗涤1次或多次。

本发明的肽1T9，由10个L型氨基酸所组成。其氨基酸序列为：GMPFRWFKPV(SEQ IDNo.1)。1T9的理论分子量为1264.55Da。

可以通过多种生产工艺进行制备本发明的肽。可以通过传统的化学合成的工艺进行制备，还可以通过发酵的工艺进行重组表达制备，例如利用大肠杆菌发酵。

本发明的肽可以由核苷酸序列编码，例如由SEQ ID No.2(具体序列为GGTATGCCATTTCGTTGGTTTAAACCGGTA)所示的核苷酸序列编码。应当理解，由于密码子简并性，本领域技术人员容易在保留初始氨基酸序列的前提下改变核苷酸序列。可以通过常规技术将核苷酸序列克隆到表达载体中，然后将表达载体转化到宿主细胞中。转化方法包括但不限于电穿孔、CaCl₂转化等等。在本发明中，表达载体可以是pET-26，pET-32，pGEX-6p等常用载体。

本发明的肽可以由不同生物体表达，所述生物体包括但不限于动物细胞、植物细胞、微生物细胞，诸如原核生物和真核生物。优选地，在本发明中使用微生物细胞发酵产生本发明的肽。微生物细胞可以是肠杆菌科细胞，例如大肠杆菌细胞，例如BL21(DE3)。应当理解，本领域技术人员可以选择适当的细胞来表达本发明的肽。

可以通过常规方法制备并生成本发明的肽。例如，可以在培养基中在适当的条件下培养转化有本发明的多核苷酸的宿主细胞，如大肠杆菌；然后通过常规的分离和纯化技术分离本发明的肽。分离和纯化技术包括但不限于透析、硫酸铵沉淀、高效液相层析。

本发明的肽包含以SEQ ID No.1所示的序列或以SEQ ID No.1所示的序列中取代、缺失和/或添加一个或数个氨基酸的序列，所述肽显示抑制黑色素母细胞或黑色素生成的活性或美白的活性。“数个”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个。

氨基酸添加指在氨基酸序列，例如SEQ ID No.1的序列的内部添加或者在氨基酸序列的C端或N端添加氨基酸，添加的氨基酸可以全部或部分彼此相邻，或添加的氨基酸之间都不彼此相邻，只要所述肽显示抑制黑色素母细胞或黑色素生成的活性或美白的活性。

氨基酸取代指在氨基酸序列，例如SEQ ID No.1的序列的某个位置的某个氨基酸残基被其他氨基酸残基替代，只要所述肽显示抑制黑色素母细胞或黑色素生成的活性或美白的活性。

氨基酸缺失指可以从氨基酸序列，例如SEQ ID No.1的序列中删除1、2或3个以上氨基酸，只要所述肽显示抑制黑色素母细胞或黑色素生成的活性或美白的活性。

本领域技术人员已知，本发明所述的肽可以在氨基酸序列之间的一个或多个位置进行翻译后修饰。翻译后修饰的例子可以包括磷酸化作用、乙酰化作用和脱酰氨基作用。

本发明还提供SEQ ID No.1所示的肽的类似物，只要类似物显示抑制黑色素母细胞或黑色素生成的活性或美白的活性。这些类似物与天然的肽差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。

在本发明中，取代可以是保守氨基酸取代，指与SEQ ID No.1的氨基酸序列相比，有3个，更佳地2个氨基酸或1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成肽。这些保守性变异肽可以根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1氨基酸取代表

本发明还提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括编码本发明的肽的核酸序列。核酸可以是DNA或cDNA。核酸分子可以主要由编码本发明所述肽的核酸序列组成，或可以仅由编码本发明所述的肽的核酸序列组成。此类核酸分子可以用本领域已知的方法合成。由于遗传密码的简并性，本领域技术人员应理解，不同核酸序列的核酸分子可以编码相同的氨基酸序列。

本发明还提供了载体，所述载体中包括本发明所述的核酸序列。合适的载体是载体构建领域已知的，包括启动子的选择和其他调控元件，例如增强子元件。本发明所述的载体包括适合引入细胞的序列。例如，载体可以是表达载体，在该载体中，所述肽的编码序列受到它自身顺式作用调控元件的控制，载体的设计便于宿主细胞的基因整合或基因替换等。

本领域普通技术人员应理解，在本发明中，术语“载体”包括DNA分子，例如，质粒、噬菌体、病毒或其他载体，它含有一个或多个异源的或重组的核酸序列。合适的噬菌体和病毒载体包括，但不限于：λ子噬菌体、EMBL噬菌体、猿猴病毒、牛疣病毒、Epstein-Barr病毒、腺病毒、疱疹病毒、小鼠肉瘤病毒、鼠类乳癌病毒、慢病毒等。

本发明的肽的生产方法可以包括如下步骤：

(1)基因工程菌，例如大肠杆菌基因工程菌的构建；

(2)基因工程菌的发酵培养和诱导表达；

(3)多肽的纯化与酶切。

以大肠杆菌基因工程菌为例，在步骤(1)中的构建步骤如下：优化选择肽1T9的DNA片段，利用PCR的方法将片段进行密码子优化和拼接重组，得到完整的重组DNA序列；将重组DNA序列转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌。

在步骤(2)中所述大肠杆菌基因工程菌的发酵培养和诱导表达步骤如下：

a.从LB平板中挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落，置于10ml的LB培养基中，220rpm，37℃培养12h-16h；

b.将菌液按照1:100的比例接种到LB培养基中放大培养，220rmp，37℃培养3小时，待菌液的OD₆₀₀约为0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导，16℃继续培养20小时，离心收集菌体。

在步骤(3)中，肽的纯化步骤如下：

a.用Tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；

b.利用亲和柱从上清液中纯化得到重组1T9的融合蛋白；

c.用TEV酶解法去除融合蛋白，释放出游离的1T9肽；

d.通过透析、反相柱等方法纯化溶液中的1T9肽。

实施例

本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购的常规产品。为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便凸显本发明的主旨。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。如无特殊说明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值和数值范围，均应当理解为包含了不可避免的系统性误差。

实施例1：pET-32a-1T9基因表达载体的构建及表达

(1)大肠杆菌基因工程菌的构建

根据1T9的氨基酸序列(SEQ ID No.1：GMPFRWFKPV)，优化选择其大肠杆菌密码子偏好的基因，也即GGTATGCCATTTCGTTGGTTTAAACCGGTA(SEQ ID No.2)。委托北京盛元科盟基因科技有限公司将1T9基因片段连接上TEV蛋白酶切位点之后通过KpnI(NEB公司货号：R0136L)和XhoI(NEB公司，货号：R0146L)的酶切位点插入pET-32a表达载体(北京盛元科盟基因科技有限公司)，构建得到pET-32a-1T9表达载体(载体的具体结构如图3所示，其中包含Trx标签的编码序列)。

将重组表达载体pET-32a-1T9转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)(Merck公司)，筛选得到大肠杆菌基因工程菌。具体过程为：

1：取1μl的该质粒于100μl的大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，冰上静置30min。

2：将该混合物于42℃水浴锅中热激90s，然后迅速置于冰上静置2min。

3：向该混合物中加入600μl无抗性的LB培养基，37℃，220rpm条件下培养1h。

4：取200μl该菌液均匀的涂布在含有氨苄青霉素抗性的LAB平板上(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，15g/L琼脂，100μg/ml氨苄抗生素)。

5：将平板倒置培养于37℃温箱中，培养约20h待长出清晰可见的菌落。

(2)大肠杆菌基因工程菌的发酵培养和诱导表达

收菌：从LB平板中挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌1T9单菌落，置于10ml的LB培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠)中，220rpm，37℃培养12h-16h。

诱导表达：将菌液按照1:100的比例接种到LB培养基中放大培养，220rmp，37℃培养3小时，待菌液的OD₆₀₀约为0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导，16℃继续培养20小时，离心收集菌体。

均质并离心收集上清液：将收集的菌体用平衡工作液重悬，将菌液降温至≤15℃，进行均质，高压均质两次，完成后收集菌液。将均质后的菌液分装至离心瓶中，于17000rpm、4℃离心30min，收集上清液，取上清液和沉淀进行电泳检测。

(3)重组多肽的纯化与酶切

粗纯：a.水洗柱材，5个CV。b.平衡液(200mM氯化钠，25mM Tris，20mM咪唑)平衡柱材。c.上样：将离心后的上清液加入柱材中，直至液体流完后。d.清洗杂蛋白：添加洗杂液25mL(200mM氯化钠，25mM Tris，20mM咪唑)至液体流完。e.收集目的蛋白：添加25mL洗脱液(200mM氯化钠，25mM Tris，250mM咪唑)，并收集流穿液得到目的多肽Trx-1T9，流穿液样品的名称记作“洗脱”。

酶切：如果需要切除Trx标签的目的多肽，可以加入适量具有His标签的TEV蛋白酶，于4℃孵育16h后，收集流穿液，即为去除载体蛋白Trx的多肽1T9，酶切后样品的名称记作“切后”。

实施例2：肽1T9的电泳检测

实施例1中所得多肽Trx-1T9和多肽1T9利用SDS-PAGE检测分子量和纯度。具体过程为：取纯化和酶切后的多肽液40μl，加入10μl 5×的蛋白上样缓冲液(250mM的Tris-HCl(pH:6.8)，10％SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油，5％β-巯基乙醇)，置于100℃沸水中煮10min，然后每孔10μl加入SDS-PAGE蛋白胶中，电压80V跑2h后，用考马斯亮蓝染色液(0.1％考马斯亮蓝R-250，25％异丙醇，10％冰醋酸)进行蛋白染色20min，再利用蛋白脱色液(10％醋酸，5％乙醇)进行脱色。检测结果如图1所示，Trx-1T9表观分子量在18kDa，分子量对应Trx-1T9多肽，表明多肽Trx-1T9得到正确的表达；酶切后分子量小于Trx-1T9表观分子量，表明蛋白酶切完全。

实施例3：肽1T9的质谱检测

因短肽1T9理论分子量较小，无法通过常规的SDS-PAGE进行检测并显示。因而对纯化后的美白短肽1T9进行蛋白分子量测定：样品经ziptipC18脱盐，然后与基质(CHCA)混合并点板。最后用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪MALDI-TOF/TOFUltraflextremeTM，Brucker，Germany在反射模式下进行分析。

1T9多肽的理论分子量为1264.55Da，无法通过常规的SDS-PAGE进行检测，需要利用质谱方法进行鉴定。如图2所示，根据质谱方法鉴定，本发明的1T9多肽的实际分子量为1264.753Da，与理论分子量一致，且无明显杂质，没有发生降解。

实施例4：多肽体外美白功效评估

方法：人黑色素细胞黑色素生成实验。

实验原理：酪氨酸酶是黑色素合成途径中的限速酶，它主要通过影响酪氨酸转化成多巴，以及多巴氧化为多巴醌来影响黑色素的生成。一些美白剂如曲酸及其衍生物和熊果苷等，通过抑制酪氨酸酶的活性来抑制黑色素的生成。促黑激素MSH-α可以有效促进黑色素细胞的酪氨酸酶的活性，从而促进黑色素的合成。本方法通过MSH-α诱导黑色素细胞，利用比色法检测多肽样品(1T9多肽)对酪氨酸酶的抑制结果和黑色素生成的影响，来评价其功效。

实验材料：

细胞系：人黑色素瘤细胞，来源：昆明细胞库。

培养液：含有10％FBS的DMEM培养基(来自索莱宝)。

培养条件：37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下培养。

促黑色素细胞生长激素(α-MSH)：0.1μM。

DOPA：2mg/mL(来自Sigma)。

阳性对照：熊果苷(0.1mg/mL)(广州万利隆公司)。

PBS：137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM NaHPO₄，2mM KH₂PO₄。

实验步骤：

·美白功效评估黑色素含量

1、将人黑色素瘤细胞接种到6孔板里，密度为1×10⁵个/2mL/孔，培养18-24h；

2、更换含10％FBS的DMEM培养基，培养12h；

3、将细胞分为如下6组，并进行相应处理：

空白对照组：去掉原培养液，加入2mL培养液，连续培养3天。

模型对照组：去掉原培养液，加入2mL含0.1μM MSH-α的培养液，连续培养3天。

阳性对照组：去掉原培养液，加入2mL含0.1μM MSH-α、0.1mg/mL熊果苷的培养液，连续培养3天。

样品组：

0.50mg/mL组：去掉原培养液，加入2mL含0.1μM MSH-α、0.50mg/mL 1T9多肽的培养液，连续培养3天。

0.05mg/mL组：去掉原培养液，加入2mL含0.1μM MSH-α、0.05mg/mL 1T9多肽的培养液，连续培养3天。

0.01mg/mL组：去掉原培养液，加入2mL含0.1μM MSH-α、0.01mg/mL 1T9多肽的培养液，连续培养3天。

4、暴露结束，去除培养液，用PBS清洗2次，用细胞刮收集各孔细胞，作细胞计数，10000rpm/min，4℃离心收集细胞；

5、加入1M的NaOH溶液，冰上溶解细胞，获得细胞液；

6、将细胞液置于80℃下加热10min，裂解黑色素小体；

7、取裂解黑色素小体后的各组细胞液在405nm波长下测定吸光度值。

·美白功效评估酪氨酸酶活性

1、将人黑色素瘤细胞接种到6孔板里，密度为l×10⁵个/2mL/孔，培养18-24h；

2、更换含10％FBS的DMEM培养基，培养12h；

3、将细胞分为如下6组，并进行相应处理：

空白对照组：去掉原培养液，加入2mL培养液，连续培养3天。

样品组：

4、暴露结束，去除培养液，用PBS清洗2次，用细胞刮收集各孔细胞，10000rpm/min，4℃离心收集细胞；

5、加入细胞裂解液200μL，采用反复冻融的方式处理，裂解细胞，10000rpm/min，4℃离心20min获得上清液；

6、在96孔板中加入各组上清液150μL，迅速加入20μL DOPA溶液，振荡后在475nm波长下测定吸光度值。37℃反应30min后，再次测定吸光度值。

数据分析：

黑色素相对含量：

酪氨酸酶相对活性：

实验结果：

1、黑色素含量分析

结果如图4所示，在黑色素含量测试结果中，与模型对照组相比，阳性对照组的黑色素相对含量明显降低(p<0.05)，样品在0.50mg/mL、0.05mg/mL、0.01mg/mL三个1T9多肽测试浓度下，黑色素含量均明显降低(p<0.05)。

2、酪氨酸酶活性结果分析

结果如图5所示，在酪氨酸酶活性测试结果中，与模型对照组相比，阳性对照组酪氨酸酶相对活性明显降低(p<0.05)，样品在0.50mg/mL、0.05mg/mL、0.01mg/mL三个1T9多肽测试浓度下，酪氨酸酶相对活性均明显降低(p<0.05)。

因此，可以证明，在本次测试条件下，1T9多肽在0.50mg/mL、0.05mg/mL、0.01mg/mL三个测试浓度时，均具有一定的美白功效作用。

Claims

1.一种肽，其特征在于，所述肽的氨基酸序列为如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

2.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码根据权利要求1所述的肽。

3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列为如SEQ IDNo.2所示的序列。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含根据权利要求2或3所述的多核苷酸的n个重复，n为1。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括pET系列载体、穿梭载体或病毒载体。

6.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为噬菌体。

7.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为pET-32a。

8.根据权利要求4~7中任一项所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体还包含编码能够被TEV蛋白酶切除的氨基酸序列的多核苷酸。

9.根据权利要求8所述的重组表达载体，其特征在于，所述编码能够被TEV蛋白酶切除的氨基酸序列的多核苷酸的3’端与权利要求2或3所述的多核苷酸的5’端直接连接。

10.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞包含根据权利要求4~9中任一项所述的重组表达载体。

11.根据权利要求10所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

12.根据权利要求10所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞为酵母。

13.根据权利要求10所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

14.根据权利要求1所述的肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下S1~S2所示的步骤：

S1：发酵培养根据权利要求10~13中任一项所述的重组宿主细胞，诱导肽的表达；

S2：收集并纯化所述肽。

15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，在步骤S2中包括使用Ni亲和层析柱和/或离子交换层析柱纯化所述肽，以及任选的包括对所述肽进行酶切。

16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，使用TEV蛋白酶酶切所述肽。

17.根据权利要求1所述的肽在如下（a）~（c）中至少一项中的用途：

（a）制备美白产品；

（b）制备抑制黑色素母细胞的产品；

（c）制备抑制黑色素生成的产品。

18.一种产品，其特征在于，所述产品包含根据权利要求1所述的肽，并且所述产品具有美白、抑制黑色素母细胞和/或抑制黑色素生成的功能。