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CN115803062A - 滋养层细胞表面抗原2(trop-2)抗体 - Google Patents

滋养层细胞表面抗原2(trop-2)抗体 Download PDF

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CN115803062A
CN115803062A CN202180038851.3A CN202180038851A CN115803062A CN 115803062 A CN115803062 A CN 115803062A CN 202180038851 A CN202180038851 A CN 202180038851A CN 115803062 A CN115803062 A CN 115803062A
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CN
China
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seq
antigen
trop
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包海峰
袁炜
刘定国
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Botaikang Pharmaceutical Co ltd
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Botaikang Pharmaceutical Co ltd
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Abstract

本申请提供了特异性结合滋养层细胞表面抗原2(Trop‑2)的分离的抗体及其抗原结合片段。这些Trop‑2抗体或其抗原结合片段对Trop‑2具有高结合亲和力，能够诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，具有良好的肿瘤穿透性，可以被表达Trop‑2的细胞内化，并且可用于诊断、预测和治疗与Trop‑2相关的人类疾病(例如，癌症、传染病、自身免疫性疾病、哮喘、移植排斥和炎性疾病)。

Description

滋养层细胞表面抗原2(TROP-2)抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求对2020年6月3日提交的美国临时申请63/034,055的优先权，其内容通过引用全文并入用于所有目的。
技术领域
本公开涉及抗滋养层细胞表面抗原2(Trop-2)抗体或抗原结合片段及其用途。
提交ASCII文本文件的序列表
以下以ASCII文本文件形式提交的内容通过引用整体并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名：227362000140SEQLIST.TXT，记录日期：2021年6月2日，大小：66KB)。
背景技术
滋养层细胞表面抗原-2(Trop-2)，也称为肿瘤相关钙信号转导子2(TACSTD1)、膜成分1号染色体表面标志物1(M1S1)、胃肠道抗原733-1(GA733-1)，以及上皮糖蛋白-1(EGP-1)，属于TACSTD家族，其包括至少两种I型膜蛋白。它转导细胞内钙信号并充当细胞表面受体。它有323个氨基酸，由一个大的胞外结构域、一个单一的跨膜结构域和一个短的胞质尾组成。
尽管它最初是作为滋养层细胞的细胞表面标志物被发现的，但随后的报道显示Trop-2在有限的正常组织中也有低水平表达，例如鼻、乳房、皮肤和支气管上皮细胞。进一步的研究表明，Trop-2在许多不同的癌症类型中有过度表达，包括口腔癌、头颈癌、甲状腺癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌和神经胶质瘤。Trop-2的过度表达与癌症患者的疾病进展和预后不良有关联。研究显示Trop-2在癌细胞中的过表达在体外和体内可刺激肿瘤生长。类似地，通过siRNA抑制Trop-2表达可抑制肿瘤细胞增殖。除了对肿瘤生长至关重要外，Trop-2还参与肿瘤恶化转移。至少包括IGF、ErbB3、ERK、MAPK、Notch-Wnt和Raf的六种主要信号通路都涉及Trop-2。然而，它在这些信号通路中的确切作用，以及哪些下游信号通路在不同的癌症和不同的治疗方法中是至关重要的仍有待阐明。
本文提及的所有出版物、专利、专利申请和公开的专利申请的公开内容通过引用整体并入本文。
发明内容
在本发明的一个方面，提供了特异性结合滋养层细胞表面抗原-2(Trop-2)的分离的抗体及抗原结合片段。这些Trop-2抗体或抗原结合片段对Trop-2具有高亲和力以及良好的肿瘤穿透性，能够诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，可被表达Trop-2的细胞内化，并可用于诊断、预测和治疗人类疾病(例如，癌症、传染病、自身免疫性疾病、哮喘、移植排斥和炎症性疾病)。
在各种实施方案中，抗体或抗原结合片段选自全人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、单链抗体、双抗体、三抗体、四抗体,Fab片段,Fab'片段,Fab2片段,F(ab)'2片段,结构域抗体,IgD抗体,IgE抗体,IgM抗体,IgG1抗体,IgG2抗体,IgG3抗体、IgG4抗体或在铰链区具有至少一个突变的IgG4抗体，该突变减轻了形成重链内二硫键的倾向。在各种实施方案中，抗体是嵌合抗体。在各种实施方案中，抗体是人源化抗体。在各种实施方案中，抗体是全人抗体。在各种实施方案中，提供了对SEQ ID NO：1的人Trop-2蛋白具有高亲和力的分离的抗体及其抗原结合片段。
在各种实施方案中，抗体或抗原结合片段和Trop-2蛋白的解离常数(KD)至少约为1x10-6M、1x10-7M、1x10-8M，1x10-9M，1x10-10M，1x10-11M，或1x10-12M。
在各种实施方案中，本发明的分离的抗体或其抗原结合片段结合人Trop-2并且包含：(a)轻链CDR3序列与选自SEQ ID NO:13-14的CDR3序列相同、或基本相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同)；(b)重链CDR3序列与选自SEQ ID NO:7-8的CDR3序列相同、或基本相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同；(c)(a)中轻链CDR3序列和(b)中重链CDR3序列。
在多个实施方案中，分离的抗体或抗原结合片段进一步包含选自以下的氨基酸序列：(d)与选自SEQ ID NO:9-10的CDR1序列相同的、基本上相同的(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)，或基本相似的轻链CDR1序列；(e)与选自SEQ ID NO:11-12的CDR2序列序列相同的、基本上相同的(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)，或基本相似的轻链CDR2序列；(f)与选自SEQ ID NO:3-4的CDR1序列序列相同的、基本上相同的(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)，或基本相似的重链CDR1序列；(g)与选自SEQ ID NO:5-6的CDR2序列序列相同的、基本上相同的(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)，或基本相似的重链CDR2序列；(h)(d)的轻链CDR1序列和(f)的重链CDR1序列；(i)(e)的轻链CDR2序列和(g)的重链CDR2序列。
在多个实施方案中，本发明的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段与人Trop-2结合并且包含：(a)与选自SEQ ID NO：9-10的CDR1序列相同、基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或基本相似的轻链CDR1序列；(b)与选自SEQ ID NO：11-12的CDR2序列相同、基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或基本相似的轻链CDR2序列；(c)与选自SEQ ID NO：13-14的CDR3序列相同、基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或基本相似的轻链CDR3序列；(d)与选自SEQ ID NO：3-4的CDR1序列相同、基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或基本相似的重链CDR1序列；(e)与选自SEQ ID NO：5-6的CDR2序列相同、基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或基本相似的重链CDR2序列；(f)与选自SEQ ID NO：7-8的CDR3序列相同、基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或基本相似的重链CDR3序列重链CDR3序列。
在多个实施方案中，本发明的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段与人Trop-2结合并包含：1)轻链可变区(VL)，其包含(a)轻链CDR1序列，其包含与SEQ ID NO:9相同、基本相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)或基本相似的序列；(b)轻链CDR2序列，其包含与SEQ ID NO:11相同的、基本上相同的(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列)或基本相似的序列；(c)轻链CDR3序列，其包含与SEQ ID NO:13相同的、基本上相同的(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列)或基本相似的序列；和2)重链可变区(VH)，其包含(a)重链CDR1序列，其包含与SEQ ID NO:3相同、基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或基本相似的序列；(b)重链CDR2序列，其包含与SEQ ID NO:5相同的、基本上相同的(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)的序列)或基本相似的序列；(c)重链CDR3序列，其包含与SEQ ID NO:7相同的、基本上相同的(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列)的序列识别)或基本上类似的序列。在一些实施方案中，轻链CDR1-3包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代。在一些实施方案中，重链CDR1-3包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代。在一些实施方案中，上述氨基酸取代限于本申请表1中所示的“示例性取代”。在一些实施方案中，氨基酸取代限于本申请表1中所示的“优选取代”。
在一些实施方案中，本发明的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段与人Trop-2结合并且是来源于的抗Trop-2抗体的嵌合或人源化抗体，包含1)轻链可变区(VL)，其包含(a)在SEQ ID NO：9中所是的轻链CDR1序列；(b)在SEQ ID NO：11中所示的轻链CDR2序列；(c)在SEQ ID NO:13中所示的轻链CDR3序列；2)重链可变区(VH)，其包含(a)在SEQ ID NO：3中所示的重链CDR1序列；(b)在SEQ ID NO:5所示的重链CDR2序列；(c)在SEQ ID NO:7中所示的重链CDR3序列。
在多个实施方案中，本发明的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段与人Trop-2结合并包含：1)轻链可变区(VL)，其包含(a)轻链CDR1序列，其包含与SEQ ID NO:10相同、基本相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)或基本相似的序列；(b)轻链CDR2序列，其包含与SEQ ID NO:12相同的、基本上相同的(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列)或基本相似的序列；(c)轻链CDR3序列，其包含与SEQ ID NO:14相同的、基本上相同的(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列)或基本相似的序列；2)重链可变区(VH)，其包含(a)重链CDR1序列，其包含与SEQ ID NO:4相同的、基本上相同的(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％的序列、97％、98％或99％序列同一性)或基本相似的序列；(b)重链CDR2序列，其包含与SEQ ID NO:6相同的、基本上相同的(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)的序列)或基本相似的序列；(f)重链CDR3序列，其包含与SEQ ID NO:8相同、基本上相同的序列(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列识别)或基本上类似的序列。在一些实施方案中，轻链CDR1-3包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代。在一些实施方案中，重链CDR1-3包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代。在一些实施方案中，上述氨基酸取代限于本申请表1中所示的“示例性取代”。在一些实施方案中，氨基酸取代限于本申请表1中所示的“优选取代”。
在一些实施方案中，本发明的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段与人Trop-2结合并且是来源于抗Trop-2抗体的嵌合或人源化抗体，包含1)轻链可变区(VL)，其包含(a)在SEQ ID NO：10所示的轻链CDR1序列；(b)在SEQ ID NO：12所示的轻链CDR2序列；(c)在SEQID NO:14所示的轻链CDR3序列；2)重链可变区(VH)，其包含(a)在SEQ ID NO：4所示的重链CDR1序列；(b)在SEQ ID NO:6中所示的重链CDR2序列；(c)在SEQ ID NO:8中所示的重链CDR3序列。
在各种实施方案中，本发明的分离的抗体或其抗原结合片段结合人Trop-2并且包含：(a)重链和/或轻链可变结构域，该可变结构域具有一组与SEQ ID NO:9-10、11-12和13-14相同、基本相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)或基本相似序列的三个轻链CDR1、CDR2和CDR3，和/或一组与SEQ ID NO：3-4、5-6和7-8相同、基本相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或基本相似序列的三个重链CDR1、CDR2和CDR3；(b)一组来自人免疫球蛋白(IgG)的四个可变区框架区。在各种实施方案中，抗体可以任选地包括铰链区。在各种实施方案中，框架区选自人种系外显子XH、JH、Vκ和Jκ序列。在各种实施方案中，抗体是完全人源化抗体。在各种实施方案中，抗体是完全人抗体。
在各种实施方案中，分离的抗体或抗原结合片段在与人Trop-2结合时：(a)以与参考抗体基本相同或更大的Kd结合人Trop-2；(b)与所述参考抗体竞争结合人Trop-2；(c)在人受试者中的免疫原性低于所述参考抗体，其中所述参考抗体包含分别选自SEQ ID NO：15/17和16/18的重链和轻链可变域序列的组合。
在多个实施方案中，本发明的分离的鼠单克隆抗体或其抗原结合片段与人Trop-2结合并包含与SEQ ID NO:15具有相同、基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或基本相似序列的重链可变区，并且包含与SEQID NO:17具有相同、基本相同的序列(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)或基本相似序列的轻链可变区。
在多个实施方案中，本发明的分离的鼠单克隆抗体或其抗原结合片段与人Trop-2结合并包含与SEQ ID NO:16具有相同、基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或基本相似序列的重链可变区，并且包含与SEQID NO:18具有相同、基本相同的序列(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)或基本相似序列的轻链可变区。
在各种实施方案中，本发明的分离的嵌合抗体或其抗原结合片段结合人Trop-2并包含与SEQ ID NO:47具有相同、基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或基本相似序列的重链，以及具有与SEQ ID NO:48相同、基本相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或基本相似序列的轻链。
在各种实施方案中，本发明的分离的嵌合抗体或其抗原结合片段结合人Trop-2并包含与SEQ ID NO:49具有相同、基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或基本相似的重链，以及具有与SEQ ID NO:50相同、基本相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或基本相似序列的轻链。
在多个实施方案中，本发明的分离的人源化抗体或其抗原结合片段与人Trop-2结合并包含与SEQ ID NO:23-26、29-33和40-44具有相同、基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或基本相似序列的重链可变区，并且具有序列与SEQ ID NO:27-28、34-39和45-46相同、基本相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)或基本相似的轻链可变区。
在多个实施方案中，本发明的分离的人源化抗体或其抗原结合片段与人Trop-2结合并包含SEQ ID NO：40所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:37所示的轻链可变区序列。
在多个实施方案中，本发明的分离的人源化抗体或其抗原结合片段与人Trop-2结合并包含SEQ ID NO:29所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:37所示的轻链可变区序列。
在多个实施方案中，本发明的分离的人源化抗体或其抗原结合片段与人Trop-2结合并包含SEQ ID NO：43所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:45所示的轻链可变区序列。
在各种实施方案中，本发明的分离的人源化抗体或其抗原结合片段结合人Trop-2并包含具有与SEQ ID NO:51、53和55相同、基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或基本相似序列的重链，并且具有与SEQ ID NO：52、54和56相同、基本相同的序列(例如，具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)或基本相似序列的轻链。
在多个实施方案中，本发明的分离的人源化抗体或其抗原结合片段与人Trop-2结合并包含SEQ ID NO：51所示的重链序列和SEQ ID NO：52所示的轻链序列。
在多个实施方案中，本发明的分离的人源化抗体或其抗原结合片段与人Trop-2结合并包含SEQ ID NO：53所示的重链序列和SEQ ID NO：54所示的轻链序列。
在多个实施方案中，本发明的分离的人源化抗体或其抗原结合片段与人Trop-2结合并包含SEQ ID NO：55所示的重链序列和SEQ ID NO：56所示的轻链序列。
在另一方面，本文公开的抗体或抗原结合片段可用于通过化学技术、通过“polydoma”技术或通过重组DNA技术产生双特异性抗体或异源抗体。在各种实施方案中，本公开的双特异性抗体可以具有针对至少两个不同表位的结合特异性，其中至少一个是肿瘤相关抗原。在各种实施方案中，抗体和片段也可以是异源抗体。异抗体是两种或更多种抗体，或连接在一起的抗体结合片段(例如，Fab)，每种抗体或片段具有不同的特异性。
在另一方面，提供了分离的免疫偶联物或融合蛋白，其包含偶联、连接(或稳定结合)效应分子的抗体或抗原结合片段。在各种实施方案中，效应分子是免疫毒素、细胞因子、趋化因子、治疗剂或化疗剂。根据本发明的一个实施方案的抗体药物偶联物(ADC)具有下公式：Ab-(L-D)n，其中Ab是Trop-2结合抗体，L是接头，D是药物部分，并且n是1-10的整数。
在另一个方面，本文公开的抗体或抗原结合片段可以共价连接(或以其他方式稳定缔合)另外的功能部分，例如标记或赋予所需药代动力学性质的部分。在各种实施方案中，标记选自由以下组成的组：荧光标记、放射性标记和具有独特核磁共振特征的标记。
在另一个方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含与药学上可接受的载体混合的本发明的分离的抗体或抗原结合片段。在各种实施方案中，药物组合物包含与药学上可接受的载体混合的分离的人抗体。在各种实施方案中，将药物组合物配制成通过选自皮下注射、腹膜内注射、肌肉内注射、胸骨内注射、静脉内注射、动脉内注射、鞘内注射、心室内注射、尿道内注射、颅内注射、滑膜内注射或通过输注的给药途径给药。
在另一个方面，本发明涉及治疗受试者的癌症的方法，包括向受试者施用治疗有效量(作为单一疗法或在联合疗法方案中)的本发明的分离的抗体或抗原结合片段发明。在各种实施方案中，癌症是与Trop-2表达升高相关的癌症。在各种实施方案中，癌症选自结肠直肠癌(CRC)、肾癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌和神经胶质瘤.在各种实施方案中，受试者先前对抗癌疗法的治疗有反应，但在停止治疗后，复发(下文称为“复发性癌症”)。在各种实施方案中，受试者患有抗性或难治性癌症。
在另一个方面，本发明涉及设计用于治疗受试者的癌症或传染病的联合疗法，包括向受试者施用治疗有效量的本发明的分离的抗体或抗原结合片段，并且b)一种或多种选自免疫疗法、化学疗法、小分子激酶抑制剂靶向疗法、手术、放射疗法、疫苗接种方案、干细胞移植和免疫细胞疗法(CAR-T、CAR-NK)的附加疗法，其中联合疗法增加了对肿瘤细胞的细胞杀伤，即，当共同施用时，分离的抗体或抗原结合片段与其他疗法之间存在协同作用。
另一方面，本发明提供了一种用于在体外或体内检测样品中人Trop-2抗原的存在的方法，例如用于诊断人Trop-2相关疾病的方法。
在另一个方面，提供了包含编码本文公开的抗体或抗原结合片段的多核苷酸序列的分离的核酸。还提供了包含本发明核酸的表达载体。还提供了包含本发明表达载体的分离细胞。在各种实施方案中，细胞是包含本发明的表达载体的宿主细胞。在各种实施方案中，细胞是杂交瘤，其中细胞的染色体包含本发明的核酸。进一步提供了制备本发明的抗体或抗原结合片段的方法，包括在允许细胞表达本发明的抗体或抗原结合片段的条件下培养或孵育细胞。
附图的简要说明
如图。图1描绘了所选嵌合IgG#118-2-5和#125-1-5对来自不同物种的Trop-2抗原的结合特异性。
如图。图2描述了#118-2-5人源化IgG对来自不同物种的Trop-2抗原的结合特异性。
如图。图3描绘了人源化抗Trop-2抗体对来自不同物种的Trop-2抗原的结合特异性。
如图。图4A-4C描绘了抗Trop-2抗体内化的流式细胞术分析的结果。结果表明抗Trop-2抗体可以被表达Trop-2的细胞内化。
如图。图5描绘了A1X4和A1，2X4在设计用于测量抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的测定法中，来自三种不同供体外周血单核细胞(PBMC)的效应细胞对SK-BR-3靶细胞的特异性裂解百分比.
如图。图6显示了含有不同DAR的ADC在具有不同Trop-2表达水平的肿瘤细胞中的体外细胞毒活性。结果表明，具有DAR4和DAR6的ADC比DAR2ADC更有效，并且在具有中/高Trop-2表达的细胞中差异更明显。
如图。图7显示了含有不同DAR的ADC在MDA-MB-468异种移植模型中的体内功效。
如图。图8A-8B显示Trop-2表达水平与A1，2X4-MMAE的体外效力之间的相关性。
如图。图9显示了A1，2X4-MMAE在共培养条件下的体外旁观者杀伤作用。
如图。图10A-10B显示了A1X4-MMAE和A1，2X4-MMAE在MDA-MB-468和NCI-N87异种移植模型中的体内功效。
如图。图11显示在MDA-MB-468异种移植模型中用A1X4-MMAE单次或分次给药后的体内抗肿瘤活性。
具体实施方式
本发明涉及特异性结合人Trop-2的抗原结合蛋白如抗体或其抗原结合片段。在一方面，提供了分离的抗体及其抗原结合片段，其特异性结合Trop-2，对Trop-2具有高或中等亲和力，能够诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，具有良好的肿瘤穿透性，可被表达Trop-2的细胞内化，可用于治疗人类疾病(如癌症)、感染和其他由Trop-2介导的疾病。
还提供了核酸分子及其衍生物和片段，其包含编码与Trop-2结合的全部或部分多肽的多核苷酸序列，例如编码抗Trop-2抗体、抗体片段或抗体衍生物的全部或部分的核酸。还提供了包含此类核酸的载体和质粒，以及包含此类核酸和/或载体和质粒的细胞或细胞系。还提供了制备、鉴定或分离结合人Trop-2的抗原结合蛋白的方法，例如抗Trop-2抗体，确定抗原结合蛋白是否结合Trop-2的方法，制备组合物的方法，例如药物组合物，其包含与人Trop-2结合的抗原结合蛋白，以及将结合Trop-2的抗体或其抗原结合片段施用至受试者的方法，例如，治疗由Trop-2介导的病症的方法。
基于Trop-2在肿瘤与正常组织中的差异表达、其在促进肿瘤生长和转移中的作用以及负预后价值，Trop-2已被提议作为一种有前途的诊断/治疗靶点。阻断Trop-2信号可能是治疗癌症的一种手段。已显示Trop-2靶向抗原结合片段(Fab)可诱导细胞凋亡并对乳腺癌细胞增殖具有抑制作用。尽管已经开发了几种抗Trop-2抗体，但没有一种适合作为裸抗体进行治疗。最近开发了Trop-2靶向抗体-药物偶联物(ADC)。Sacituzumab govitecan(IMMU-132)是人源化抗Trop-2抗体hRS7与伊立替康的活性代谢物SN-38的偶联物。
本申请提供的新型Trop-2抗体及其抗原结合片段。在一些情况下，本申请提供了与基准hRS7抗体相比表现出对Trop-2更高亲和力和/或更高内化率的Trop-2抗体。此类抗体或其片段显示出有前景的应用，用于诊断、预后和治疗将受益于使用本文所述的新型人类抗Trop-2抗体及其抗原结合片段调节Trop-2的病症(例如，癌症、持续性传染病、自身免疫性疾病、哮喘、移植排斥和炎性疾病)。
定义
除非本文另有定义，否则与本发明相关使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。通常，本文所述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质和核酸化学和杂交结合使用的命名法和技术是本领域常用和熟知的那些。除非另有说明，否则本发明的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行，并且如在整个本说明书中引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献中所述。参见，例如，Green andSambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(2012)，通过引用并入本文。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书进行，如本领域通常完成的或如本文所述。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及药物和药物化学结合使用的命名法以及实验室程序和技术是本领域常用和众所周知的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及对象的治疗。
多核苷酸和多肽序列使用标准的一或三字母缩写表示。除非另有说明，多肽序列的氨基末端在左侧，羧基末端在右侧，单链核酸序列和双链核酸序列的顶链在左侧具有它们的5'末端和他们的3'终点在右边。多肽的特定部分可以通过氨基酸残基编号，例如氨基酸80到119，或通过该位点的实际残基，例如Ser80到Ser119来指定。特定的多肽或多核苷酸序列也可以基于它与参考序列的不同来描述。特定轻链和重链可变结构域的多核苷酸和多肽序列称为L1(“轻链可变结构域1”)和H1(“重链可变结构域1”)。包含轻链和重链的抗体通过结合轻链名称和重链可变结构域名称来表示。例如，“L4H7”表示例如包含L4的轻链可变结构域和H7的重链可变结构域的抗体。
术语“抗体”在本文中用于指包含一种或多种多肽的蛋白质，该多肽基本上或部分由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码并且对抗原(例如，肿瘤抗原或在病理状态下过表达的分子)具有特异性。蛋白质不必是全长抗体并且可以是包含特异性识别抗原的抗体部分和第二部分(例如细胞毒剂)的融合蛋白。在一些实施方案中，蛋白质是抗体药物偶联物。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及这些基因的亚型和无数免疫球蛋白可变区基因。轻链(LC)分为kappa或lambda。重链(HC)分为gamma、mu、alpha、delta或epsilon，它们又分别依次定义了免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。典型的免疫球蛋白(例如抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N末端定义了一个由大约100到110个或更多个氨基酸组成可变区，其主要负责抗原识别。
在全长抗体中，每条重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成(在某些情况下，CH4)。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，穿插着更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。框架区和CDR的范围已经确定。不同轻链或重链的框架区序列在一个物种内相对保守，例如人类。抗体的框架区，即组成轻链和重链的组合框架区，用于在三维空间中定位和对齐CDR。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG 3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
CDR主要负责与抗原的表位结合。每条链的CDR通常称为CDR1、CDR2、CDR3，从N端开始依次编号，也通常由特定CDR所在的链标识。因此，VH CDR3位于发现它的抗体重链可变域中，而VL CDR1是来自发现它的抗体轻链可变域的CDR1。具有不同特异性(即不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。尽管CDR因抗体而异，但CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR中的这些位置称为特异性决定残基(SDR)。
Kabat定义是对抗体中的残基进行编号的标准，通常用于识别CDR区域。Kabat数据库现在在线维护，并且可以确定CDR序列，例如，参见IMGT/V-QUEST程序版本：2011年3月29日3.2.18，可在互联网上获得，以及Brochet,X.et al.,Nucl.Acids Res.36，W503-508，2008)。Chothia定义类似于Kabat定义，但Chothia定义考虑了某些结构环区域的位置。参见，例如，Chothia等人，J.Mol.Biol.，196：901-17，1986；Chothia et al.,Nature,342:877-83,1989。AbM定义使用由Oxford Molecular Group生产的模拟抗体结构的计算机程序的集成套件。参见，例如，Martin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：9268-9272，1989；“AbMTM，一种用于模拟抗体可变区域的计算机程序，”Oxford,UK；Oxford Molecular,Ltd.AbM定义使用知识数据库和ab initio方法的组合从一级序列模拟抗体的三级结构，例如Samudrala等人描述的那些，“Ab Initio Protein Structure Prediction Using aCombined Hierarchical Approach”，在PROTEINS,Structure,Function and GeneticsSuppl.,3:194-198,1999中。接触定义基于对可用复杂晶体结构的分析。参见，例如，MacCallum等人，J.Mol.Biol，5:732-45，1996。
术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，其可以通过完整抗体的木瓜蛋白酶消化产生。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定结构域，一个CH2结构域和一个CH3结构域，并且任选地包含一个CH4结构域。抗体的Fc部分介导几种重要的效应功能，例如细胞因子诱导、ADCC、吞噬作用、补体依赖性细胞毒性(CDC)以及抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率(例如，新生儿FcR(FcRn)结合在内体中酸性pH下与IgG的Fc区结合，并保护IgG不被降解，从而有助于延长IgG的血清半衰期)。替换Fc部分中氨基酸残基以改变抗体效应器功能是本领域已知的(参见例如Winter等人，美国专利号5,648,260和5,624,821)。
抗体以完整的免疫球蛋白或许多已充分表征的片段形式存在。这样的片段包括与靶抗原结合的Fab片段、Fab'片段、Fab2、F(ab)'2片段、单链Fv蛋白(“scFv”)和二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)。scFv蛋白是一种融合蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区通过接头结合，而在dsFv中，这些链已发生突变以引入二硫键以稳定链条的结合。虽然根据完整抗体的消化来定义各种抗体片段，但技术人员将理解，这些片段可以通过化学或利用重组DNA方法从头合成。因此，如本文所用，术语抗体涵盖例如单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体,嵌合抗体,单链Fvs(scFv),单链抗体,单域抗体,域抗体,Fab片段,F(ab')2片段,表现出所需生物活性的抗体片段,二硫键连接的Fvs(sdFv)、胞内抗体和任何上述的表位结合片段或抗原结合片段。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段都有一个抗原结合位点。一个“Fab片段”包含一条轻链和一条重链的CH1和可变区。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。一个“Fab'片段”包含一条轻链和一条重链的一部分，其包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的区域，使得可以在两个Fab'片段的两个重链之间形成链间二硫键从而形成一个F(ab')2分子。
抗体的胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原的F(ab')2片段。“F(ab')2片段”包含两条轻链和两条重链，两条重链在CH1和CH2结构域之间含有恒定区的一部分，从而在两条重链之间形成链间二硫键。因此，一个F(ab')2片段由两个Fab'片段组成，这两个片段通过两条重链之间的二硫键结合在一起。
“Fv区”包含来自重链和轻链的可变区，但缺少恒定区。
“单链抗体”是Fv分子，其中重链和轻链可变区已通过柔性接头连接以形成单个多肽链，该多肽链形成抗原结合区。在国际专利申请公开号WO 88/01649、美国专利号4,946,778和5,260,203中详细讨论了单链抗体，其公开内容通过引用并入。
如本文所用，术语“抗原结合片段”和“抗原结合蛋白”是指结合特定靶抗原的任何蛋白。“抗原结合片段”包括但不限于抗体及其结合部分，例如免疫功能片段。抗体的示例性抗原结合片段是重链和/或轻链CDR，或重链和/或轻链可变区。
如本文所用，术语抗体或免疫球蛋白链(重链或轻链)抗原结合蛋白的“免疫功能片段”(或简称“片段”)是一种抗原结合蛋白，其包含缺乏至少一些存在于全长链中的氨基酸的部分(无论该部分如何获得或合成)的抗体，但仍能够特异性结合抗原。此类片段具有生物活性，因为它们与靶抗原结合并且可以与包括完整抗体在内的其他抗原结合蛋白竞争结合给定表位。在一些实施方案中，片段是中和片段。在一方面，这样的片段将保留至少一个存在于全长轻链或重链中的CDR，并且在一些实施方案中将包含单个重链和/或轻链或其部分。这些生物活性片段可以通过重组DNA技术产生，或者可以通过抗原结合蛋白(包括完整抗体)的酶促或化学切割产生。具有免疫功能的免疫球蛋白片段包括但不限于Fab、双抗体、Fab'、F(ab')2、Fv、域抗体和单链抗体，并且可以衍生自任何哺乳动物来源，包括但不限于对人、小鼠、大鼠、骆驼或兔子。进一步预期本文公开的抗原结合蛋白的功能部分，例如，一个或多个CDR，可以与第二个蛋白质或小分子共价结合，以产生针对体内特定靶标的治疗剂，其具有双功能治疗特性，或具有延长的血清半衰期。
双抗体是包含两条多肽链的二价抗体，其中每条多肽链包含通过接头连接的VH和VL区，该接头太短而无法在同一链上的两个区域之间配对，因此允许每个区域与另一个区域上的互补区域配对多肽链(参见，例如，Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-48，1993；和Poljak等人，Structure，2：1121-23，1994)。如果双抗体的两条多肽链相同，则由它们配对产生的双抗体将具有两个相同的抗原结合位点。具有不同序列的多肽链可用于制备具有两个不同抗原结合位点的双抗体。类似地，三体和四体是分别包含三个和四个多肽链并分别形成三个和四个抗原结合位点的抗体，抗原结合位点可以相同或不同。
双特异性抗体或片段可以有几种构型。例如，双特异性抗体可能类似于单一抗体(或抗体片段)，但具有两个不同的抗原结合位点(可变区)。在各种实施方案中，抗体可以通过化学技术(Kranz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78:5807,1981；通过“polydoma”技术(参见例如美国专利号4,474,893)；或重组DNA技术生产。在各种实施方式中，本公开的双特异性抗体可以具有针对至少两种不同表位的结合特异性，其中至少一种是肿瘤相关抗原。在各种实施方式中，抗体和片段也可以是异抗体。异抗体是两种或更多的抗体，或连接在一起的抗体结合片段(例如，Fab)，每个抗体或片段具有不同的特异性。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即构成该群体的个体抗体是相同的，除了可能以少量存在的天然发生的突变之外。单克隆抗体具有高度特异性，针对单一抗原。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指具有来自一个物种例如人的框架残基和来自另一个物种的CDR(其通常赋予抗原结合)的抗体，例如特异性结合靶向抗原的鼠抗体。
如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本公开的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR，特别是CDR3中。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括其中源自另一哺乳动物物种例如小鼠的种系的CDR序列已移植到人框架序列上的抗体。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。人源化抗体与提供CDR的供体抗体结合相同的抗原。人源化免疫球蛋白或抗体的受体框架可具有从供体框架中提取的氨基酸的有限数量的取代。人源化或其他单克隆抗体可以具有额外的保守氨基酸取代，这些取代对抗原结合或其他免疫球蛋白功能基本上没有影响。在各种实施方案中，框架区选自人种系外显子XH、JH、Vκ和Jκ序列。例如，用于VH结构域的FR人源化的受体序列可以选自真正的VH外显子VH 1-18(Matsuda et al.,Nature Genetics3:88-94,1993)或VH 1-2(Shin et al.,EMBO J.10:3641-3645,1991)，对于铰链区(JH)，外显子JH-6(Mattila et al.,Eur.J.Immunol.25:2578-2582,1995)。在其他实例中，种系Vκ外显子B3(Cox et al.,Eur.J.Immunol.24:827-836,1994)和Jκ外显子Jκ-1(Hieter etal.,J.Biol.Chem.257:1516-1522,1982)可以选择作为VL域人源化的受体序列。
如本文所用，术语“重组人抗体”旨在包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体；从重组的组合人抗体文库中分离的抗体；从对人免疫球蛋白基因而言是转基因的动物(例如小鼠)中分离的抗体；或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在各种实施方案中，对此类重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，因此,虽然衍生自人种系VH和VL序列并与其相关的序列,但重组人抗体的VH和VL区的氨基酸序列可能不天然存在于体内人抗体种系库中。所有这些重组方式对于本领域普通技术人员来说都是众所周知的。
如本文所用，术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体或以其他方式与分子相互作用的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面组组成，例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位可以是“线性的”或“构象的”。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用点沿蛋白质的一级氨基酸序列线性发生。在构象表位中，相互作用点发生在蛋白质上彼此分离的氨基酸残基上。一旦确定了抗原上的所需表位，就有可能产生针对该表位的抗体，例如，使用本公开中描述的技术。或者，在发现过程中，抗体的产生和表征可以阐明有关所需表位的信息。根据该信息，可以竞争性地筛选与相同表位结合的抗体。实现此目的的一种方法是进行交叉竞争研究以发现彼此竞争性结合的抗体，例如抗体竞争结合抗原。
如果抗原结合蛋白(包括抗体)以高结合亲和力与抗原结合，则抗原结合蛋白(包括抗体)与抗原“特异性结合”，该高结合亲和力由解离常数(KD或相应的Kb，如下定义)值确定，至少为1x10-6M，或至少1x10-7M，或至少1x10-8M，或至少1x10-9M，或至少1x10-10M，或至少1x10-11M。特异性结合人类目标抗原的抗原结合蛋白可能也能够以相同或不同的亲和力结合来自其他物种的相同目标抗原。如本文所用，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数并且定义为比率Koff/Kon。Koff是药物与受体解离的速率常数，而Kon是药物与受体结合的速率常数。
本文使用的术语“生物层干涉测量法(BLI)”是指附着在光纤尖端的分子层，它在检测器处产生干涉图案，结合的分子数量的任何变化都会导致在模式。它允许实时分析以确定微孔板中生物分子相互作用的亲和力和动力学，例如使用Octet系统(ForteBio,Frement,CA)。
如本文所用，术语“免疫细胞”是指参与调节针对抗原(例如，自身抗原)的免疫应答的造血谱系的任何细胞。在各种实施方案中，免疫细胞是例如T细胞、B细胞、树突细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、朗格汉氏细胞或Kuffer细胞。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指氨基酸残基的聚合物。在各种实施方案中，“肽”、“多肽”和“蛋白质”是其α碳通过肽键连接的氨基酸链。因此，在链的一端(氨基末端)的末端氨基酸具有游离氨基，而在链的另一端(羧基末端)的末端氨基酸具有游离羧基。如本文所用，术语“氨基末端”(缩写为N-末端)是指α肽氨基末端的氨基酸上的肽内任何其他位置的氨基酸的游离-氨基或α-氨基(参与肽键时的亚氨基)。类似地，术语“羧基末端”是指肽羧基末端上的游离羧基或肽内任何其他位置的氨基酸羧基。肽还包括基本上任何聚氨基酸，包括但不限于肽模拟物，例如通过醚而不是酰胺键连接的氨基酸。
如本文所用，术语“重组多肽”旨在包括所有多肽，包括通过重组方式制备、表达、产生、衍生或分离的融合分子，例如使用重组表达载体转染入宿主细胞表达的多肽。
本公开的多肽包括已经以任何方式和出于任何原因被修饰的多肽，例如，以：(1)降低对蛋白水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和(5)赋予或改变其他物理化学或功能特性。例如，可以在天然存在的序列中(例如，在形成分子间接触的结构域之外的多肽部分)进行单个或多个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)。“保守氨基酸取代”是指多肽中的氨基酸被功能相似的氨基酸取代。以下六组中的每一个都包含相互保守替代的氨基酸：
丙氨酸(A)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)
天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)
天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)
精氨酸(R)和赖氨酸(K)
异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)和缬氨酸(V)
苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)
“非保守氨基酸取代”是指将这些类别之一的成员替换为来自另一类别的成员。在进行此类改变时，根据各种实施方案，可以考虑氨基酸的亲水指数。基于其疏水性和电荷特性，每种氨基酸都被指定了亲水指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本领域理解亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用的生物学功能中的重要性(参见，例如，Kyte等人，1982，J.Mol.Biol.157：105-131)。已知某些氨基酸可以替代具有相似亲水指数或分数的其他氨基酸并且仍然保留相似的生物活性。在基于亲水指数进行改变时，在各种实施方案中，包括其亲水指数在±2以内的氨基酸的取代。在各种实施例中，包括±1内的那些，并且在各种实施例中，包括±0.5内的那些。
如本文所公开的本领域还理解相似氨基酸的取代可以基于亲水性有效地进行，特别是在由此产生的生物学功能性蛋白质或肽意欲用于免疫学实施方案的情况下。在各种实施方案中，蛋白质的最大局部平均亲水性，由其相邻氨基酸的亲水性决定，与其免疫原性和抗原性相关，即与蛋白质的生物学特性相关。
以下亲水性值已分配给这些氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+-.1)；谷氨酸(+3.0.+-.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于相似的亲水性值进行改变时，在各种实施方式中，包括亲水性值在+2以内的氨基酸的取代，在各种实施方式中，包括±1以内的那些，并且在各种实施方式中，包括±0.5以内的那些被包含在内。示例性氨基酸取代列于表1。
表格1
原始氨基酸残基示例性取代氨基酸
首选取代氨基酸
Ala Val,Leu,Ile Val
Arg Lys,Gln,Asn Lys
Asn Gln
Asp Glu
Cys Ser,Ala Ser
Gln Asn Asn
Glu Asp Asp
Gly Pro,Ala Ala
His Asn,Gln,Lys,Arg Arg
Ile Leu,Val,Met,Ala,Leu
Phe,Norleucine
Leu Norleucine,Ile,Ile
Val,Met,Ala,Phe
Lys Arg,1,4Diamino-butyric Arg
Acid,Gln,Asn
Met Leu,Phe,Ile Leu
Phe Leu,Val,Ile,Ala,Tyr Leu
Pro Ala Gly
Ser Thr,Ala,Cys Thr
Thr Ser
Trp Tyr,Phe Tyr
Tyr Trp,Phe,Thr,Ser Phe
Val Ile,Met,Leu,Phe,Leu
Ala,Norleucine
如本文所用，术语“多肽片段”和“截短的多肽”是指与相应的全长蛋白质相比具有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽。在各种实施方案中，片段可以是，例如，至少5个、至少10个、至少25个、至少50个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、长度为至少400、至少450、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900或至少1000个氨基酸。在各种实施方案中，片段也可以是，例如，至多1000、至多900、至多800、至多700、至多600、至多500、至多450、至多400、至多350、至多300、至多250、至多200、至多150、至多100、至多50、至多25、至多10或至多5个氨基酸长度。片段可以在其任一端或两端进一步包含一个或多个附加氨基酸，例如来自不同天然存在的蛋白质(例如，Fc或亮氨酸拉链结构域)或人工氨基的氨基酸序列(例如，人工接头序列)。
如本文所用，术语“多肽变体”和“多肽突变体”是指包含氨基酸序列的多肽，其中一个或多个氨基酸残基插入、缺失和/或取代到相对于另一多肽的氨基酸序列中。在各种实施方案中，待插入、缺失或取代的氨基酸残基的数目可以是例如至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少25,至少50,至少75,至少100,至少125,至少150,至少175,至少200,至少225,至少250,至少275,至少300,至少350,至少长度至少400、至少450或至少500个氨基酸。本公开的变体包括融合蛋白。
多肽的“衍生物”是已经被化学修饰的多肽，例如，与另一化学部分例如聚乙二醇、白蛋白(例如，人血清白蛋白)、磷酸化和糖基化结合的多肽。
术语“％序列同一性”在本文中可与术语“％同一性”互换使用，是指比对时两个或多个肽序列之间的氨基酸序列同一性水平或两个或多个核苷酸序列之间的核苷酸序列同一性水平使用序列比对程序。例如，如本文所用，80％同一性是指与通过定义的算法确定的80％序列同一性相同的事物，并且是指给定序列与另一序列的另一长度至少80％同一性。在各种实施方案中，％同一性选自例如与给定序列有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，或至少99％或更多的序列同一性。在各种实施方案中，％同一性在例如约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％，或约95％至约99％的范围内。
术语“％序列同源性”在本文中与术语“％同源性”可互换使用，是指比对时两个或多个肽序列之间的氨基酸序列同源性水平或两个或多个核苷酸序列之间的核苷酸序列同源性水平使用序列比对程序。例如，如本文所用，80％同源性是指与通过定义的算法确定的80％序列同源性相同的事物，因此给定序列的同源物在给定序列的长度上具有大于80％的序列同源性。在各种实施方案中，同源性百分比选自例如至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，或至少99％或更多的与给定序列的序列同源性。在各种实施方案中，％同源性在例如约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％，或约95％至约99％的范围内。
可用于确定两个序列之间同一性的示例性计算机程序包括但不限于BLAST程序套件，例如BLASTN、BLASTX和TBLASTX、BLASTP和TBLASTN，可在互联网上的NCBI网站上公开获得。另见Altschul等人，J.Mol。生物学。215:403-10,1990(特别参考公布的默认设置，即参数w＝4,t＝17)和Altschul等人，Nucleic AcidsRes.,25:3389-3402,1997。通常在评估给定氨基酸序列相对于GenBank蛋白质序列和其他公共数据库中的氨基酸序列时使用BLASTP程序进行。BLASTX程序适用于在GenBank蛋白质序列和其他公共数据库中搜索已在所有阅读框中翻译的核酸序列。BLASTP和BLASTX都使用11.0的开放间隙惩罚和1.0的扩展间隙惩罚的默认参数运行，并使用BLOSUM-62矩阵。见ID。
除了计算序列同一性百分比之外，BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见例如，Karlin&Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,90:587 3-5787,1993)。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小和概率(P(N))，它提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸比较中的最小总概率为例如小于约0.1、小于约0.01或小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似.
在多肽序列的上下文中，术语“基本相似”或“基本相似”表示多肽区域具有至少70％、典型地至少80％、更典型地至少85％或至少90％或至少95％与参考序列的序列相似性。例如，一种多肽与第二种多肽基本相似，例如，其中两种肽因一个或多个保守取代而不同。
“多核苷酸”是指由核苷酸单元组成的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，例如脱氧核糖核酸(“DNA”)和核糖核酸(“RNA”)以及核酸类似物。核酸类似物包括那些包括非天然存在的碱基、与除天然存在的磷酸二酯键之外的其他核苷酸键合的核苷酸或包括通过除磷酸二酯键之外的键连接的碱基的那些。因此，核苷酸类似物包括，例如但不限于，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、硼酸磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)等。例如，可以使用自动化DNA合成仪合成这样的多核苷酸。术语“核酸”通常是指大的多核苷酸。术语“寡核苷酸”通常是指短多核苷酸，通常不超过约50个核苷酸。应当理解，当核苷酸序列由DNA序列(即A、T、G、C)表示时，这也包括其中“U”取代“T”的RNA序列(即A、U、G、C)
本文使用常规符号来描述多核苷酸序列：单链多核苷酸序列的左手端是5'端；双链多核苷酸序列的左手方向称为5'方向。将核苷酸从5'到3'添加到新生RNA转录物的方向称为转录方向。与mRNA具有相同序列的DNA链称为“编码链”；DNA链上与从该DNA转录的mRNA具有相同序列并且位于RNA转录物的5'端至5'端的序列称为“上游序列”；DNA链上具有与具有相同序列并且编码RNA转录物3'至3'末端的序列称为“下游序列”。
“互补”是指两个多核苷酸的相互作用表面的拓扑相容性或匹配在一起。因此，这两种分子可以说是互补的，而且接触面的特性是互补的。如果第一多核苷酸的核苷酸序列与第二多核苷酸的多核苷酸结合配偶体的核苷酸序列基本相同，或者如果第一多核苷酸可以在严格杂交条件下与第二多核苷酸杂交，则第一多核苷酸与第二多核苷酸互补。
“特异性杂交”或“特异性杂交”或“选择性杂交”是指当特定核苷酸序列存在于复杂混合物(例如，总细胞)DNA或RNA中时，核酸分子在严格条件下优先与特定核苷酸序列结合、形成双链体或杂交。术语“严格条件”是指探针将优先与它的靶子序列杂交并且在较小程度上与或根本不与其他序列杂交的条件。核酸杂交实验如Southern和Northern杂交中的“严格杂交”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。有关核酸杂交的详尽指南，请参见Tijssen，1993，生物化学和分子生物学实验室技术——与核酸探针杂交，第一部分，第2章，“杂交原理和核酸策略概述探针测定”，Elsevier，N.Y.；Sambrook等人，2001，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,3.sup.rd ed.,NY；和Ausubel等人，eds.，Current Edition，CurrentProtocolsin Molecular Biology，Greene Publishing Associates和WileyInterscience，NY。
通常，高度严格的杂交和洗涤条件选择为比特定序列在确定的离子强度和pH值下的热解链点(Tm)低约5℃。Tm是50％的靶序列与完美匹配的探针杂交的温度(在规定的离子强度和pH下)。选择非常严格的条件以等于特定探针的Tm。在Southern或Northern印迹中，滤膜上具有超过约100个互补残基的互补核酸杂交的严格杂交条件的一个例子是50％福尔马林与1mg肝素在42℃下进行杂交，杂交过夜。高度严格的洗涤条件的一个例子是0.15MNaCl在72℃下洗涤约15分钟。严格洗涤条件的一个例子是0.2x SSC在65℃洗涤15分钟。见Sambrook等人有关SSC缓冲区的说明。高严格性洗涤之前可以进行低严格性洗涤以去除背景探针信号。用于例如多于约100个核苷酸的双链体的示例性中等严格性洗涤是在45℃下1x SSC15分钟。对于例如多于约100个核苷酸的双链体的示例性低严格性洗涤是在40℃下4-6xSSC 15分钟。一般而言，在特定杂交测定中观察到的不相关探针的信噪比为2倍(或更高)则表明检测到特异性杂交。
“引物”是指能够与指定的多核苷酸模板特异性杂交并提供合成互补多核苷酸的起始点的多核苷酸。当将多核苷酸引物置于诱导合成的条件下时，即在核苷酸、互补多核苷酸模板和诸如DNA聚合酶的聚合试剂存在下，会发生这种合成。引物通常是单链的，但也可以是双链的。引物通常是脱氧核糖核酸，但多种合成和天然存在的引物可用于许多应用。引物与其设计杂交的模板互补，以作为起始合成的位点，但不需要反映模板的确切序列。在这种情况下，引物与模板的特异性杂交取决于杂交条件的严格程度。引物可以用例如显色、放射性或荧光部分标记并用作可检测部分。
“探针”在用于多核苷酸时是指能够与另一多核苷酸的指定序列特异性杂交的多核苷酸。探针与目标互补多核苷酸特异性杂交，但不需要反映模板的确切互补序列。在这种情况下，探针与靶标的特异性杂交取决于杂交条件的严格程度。探针可以用例如显色、放射性或荧光部分标记并用作可检测部分。在探针为互补多核苷酸的合成提供起始点的情况下，探针也可以是引物。
“载体”是可用于将与其连接的另一种核酸引入细胞中的多核苷酸。一种类型的载体是“质粒”，它指的是其中可以连接额外的核酸片段的线性或环状双链DNA分子。另一种类型的载体是其中可以将额外的DNA片段引入病毒基因组中的病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，包含细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。“表达载体”是一种可以指导所选多核苷酸表达的载体。
“调控序列”是影响与其可操作连接的核酸的表达(例如，表达的水平、时间或位置)的核酸。例如，调节序列可以直接作用于受调节的核酸，或通过一种或多种其他分子(例如，与调节序列和/或核酸结合的多肽)起作用。调节序列的例子包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。调节序列的其他实例描述于例如Goeddel，1990，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA和Baron等人，1995，Nucleic Acids Res.23:3605-06。如果调控序列影响核苷酸序列的表达(例如，表达的水平、时间或位置)，则核苷酸序列与调控序列为“可操作地连接”。
“宿主细胞”是可用于表达本公开的多核苷酸的细胞。宿主细胞可以是原核生物，例如大肠杆菌，或者它可以是真核生物，例如单细胞真核生物(例如酵母或其他真菌)、植物细胞(例如烟草或番茄)植物细胞)、动物细胞(例如人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤细胞。通常，宿主细胞是可以用编码多肽的核酸转化或转染的培养细胞，然后可以在宿主细胞中表达。短语“重组宿主细胞”可用于表示已经用待表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞也可以是包含核酸但不以所需水平表达它的细胞，除非将调节序列引入宿主细胞中以使其与核酸可操作地连接。应当理解，术语宿主细胞不仅指特定的受试细胞，而且指这种细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可能由于例如突变或环境影响而在后代中发生，所以这种后代实际上可能与亲代细胞不同，但仍包括在本文所用术语的范围内。
术语“分离的分子”(其中分子是，例如，多肽或多核苷酸)是这样的分子，由于其来源或衍生来源(1)，它不与天然相关的成分相关联状态，(2)基本上不含来自同一物种的其他分子(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)在自然界中不存在。因此，化学合成的或在不同于其天然来源的细胞的细胞系统中表达的分子将与其天然相关的成分“分离”。也可以使用本领域熟知的纯化技术通过分离使分子基本上不含天然缔合的成分。分子纯度或同质性可以通过本领域公知的许多方法来测定。例如，多肽样品的纯度可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶染色以使用本领域熟知的技术显现多肽来测定。出于某些目的，可以通过使用HPLC或本领域熟知的其他纯化手段来提供更高的分辨率。
当至少约60％至75％的样品显示单一种类的多肽时，蛋白质或多肽是“基本上纯的”、“基本上同质的”或“基本上纯化的”。多肽或蛋白质可以是单体或多聚体。基本上纯的多肽或蛋白质通常将含有蛋白质样品的约50％、60％、70％、80％或90％W/W，更通常为约95％，优选超过99％纯度。蛋白质纯度或同质性可以通过本领域公知的许多方法来指示，例如蛋白质样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后在用本领域公知的染料对凝胶染色后显现单个多肽条带。出于某些目的，可以通过使用HPLC或本领域熟知的其他纯化手段来提供更高的分辨率。
“接头”是指以共价键或通过离子键、范德华键或氢键连接两个其他分子的分子，例如，在5一个核酸分子在5'端与互补序列杂交并在3'末端与另一个互补序列杂交，从而连接两个非互补序列。“可切割接头”是指可以被降解或以其他方式分离由可切割接头连接的两个组分的接头。可切割接头通常被酶切割，通常是肽酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶等。可切割的接头也可以被环境因素切割，例如温度、pH、盐浓度等的变化。不可切割的接头是在内化后通过抗体的溶酶体降解释放附着的有效负载的接头。
如本文所用，术语“标记”或“标记的”是指在抗体中掺入另一个分子。在一个实施方案中，标记是可检测的标记物，例如放射性标记的氨基酸的掺入或生物素基部分与多肽的结合，可以通过标记的抗生物素蛋白(例如，可以通过光学或量热法来检测的含有荧光标记或酶活性的链霉抗生物素蛋白)来检测。在另一个实施方案中，标记或标记物可以是治疗性的，例如药物偶联物或毒素。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的并且可以使用。多肽标记的例子包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)，荧光标记(例如，FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记、生物素基团、由二级报告分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合结构域、表位标签)、磁性试剂(例如钆螯合物)、毒素例如百日咳毒素、紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米汀、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物s其中。在一些实施例中，标签通过各种长度的间隔臂连接以减少潜在的空间位阻。
如本文所用，术语“免疫疗法”是指癌症治疗，包括但不限于使用针对特定肿瘤抗原的消耗性抗体的治疗；使用抗体-药物偶联物进行治疗；使用针对PD-1、PD-L1、OX-40、CD137、GITR、LAG3、TIM-3和VISTA等共刺激或共抑制分子(免疫检查点)的激动、拮抗或阻断抗体进行治疗；使用双特异性T细胞结合抗体
Figure BDA0003968927430000261
(例如blinatumomab)进行治疗：涉及施用生物反应调节剂(例如IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、GM-CSF、IFN-IFN)的治疗-β和IFN-γ；使用治疗性疫苗如sipuleucel-T进行治疗；使用树突状细胞疫苗或肿瘤抗原肽疫苗进行治疗；使用嵌合抗原受体(CAR)-T细胞进行治疗；使用CAR-NK细胞进行治疗；使用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)进行治疗；使用过继转移的抗肿瘤T细胞(离体扩增和/或TCR转基因)进行治疗；使用TALL-104细胞治疗；以及使用免疫刺激剂如Toll样受体(TLR)激动剂CpG和咪喹莫特进行治疗。
术语“免疫偶联物”或“融合蛋白”是指包含直接或间接缀合(或连接)至效应分子的抗体或其抗原结合片段的分子。效应分子可以是可检测标记、免疫毒素、细胞因子、趋化因子、治疗剂或化疗剂。抗体或其抗原结合片段可以通过肽接头缀合至效应分子。免疫偶联物和/或融合蛋白保留抗体或抗原结合片段的免疫反应性，例如，抗体或抗原结合片段在偶联之后与偶联之前具有大致相同或仅略微降低的结合抗原的能力。如本文所用，免疫偶联物也可称为抗体药物偶联物(ADC)。因为免疫偶联物和/或融合蛋白最初是由两个具有不同功能的分子制备的，例如抗体和效应子分子，它们有时也被称为“嵌合分子”。
“药物组合物”是指适合用于动物的药物组合物。药物组合物包含药理学有效量的活性剂和药学上可接受的载体。“药理学有效量”是指有效产生预期药理学结果的药剂的量。“药学上可接受的载体”是指任何标准的药学载体、媒介物、缓冲剂和赋形剂，例如磷酸盐缓冲盐溶液、5％葡萄糖水溶液和乳剂，例如油/水或水/油乳剂，以及各种类型的润湿剂和/或助剂。合适的药物载体和制剂描述于Remington's Pharmaceutical Sciences，21stEd.2005,Mack Publishing Co,Easton。“药学上可接受的盐”是可配制成用于药用的化合物的盐，包括例如金属盐(钠、钾、镁、钙等)和氨或有机胺的盐。
术语“治疗”、“治疗”和“治疗”是指减轻或消除生物障碍和/或至少一种其伴随症状的方法。如本文所用，“减轻”疾病、病症或病症是指降低疾病、病症或病症的症状的严重性和/或发生频率。如本文所用，“治疗”是用于获得有益或期望的临床结果的方法。对于本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于以下任何一种或多种：减轻一种或多种症状、减轻疾病程度、预防或延迟扩散疾病(例如，转移，例如转移至肺或淋巴结)，预防或延缓疾病的复发，延缓或减缓疾病进展，改善疾病状态，和缓解(无论是部分的还是全部的)。“治疗”还包括减少增殖性疾病的病理后果。本发明的方法考虑了这些治疗方面的任何一个或多个方面。
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以治疗特定病症、病症或疾病例如改善、减轻、减轻和/或延迟一种或多种症状的化合物或组合物的量。关于NHL和其他癌症或其他不需要的细胞增殖，有效量包括足够的量可以：(i)减少癌细胞的数量；(ii)减小肿瘤大小；(iii)在一定程度上抑制、延缓、减缓和优选阻止癌细胞浸润到外周器官；(iv)抑制(即在一定程度上减缓并优选停止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延缓肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。有效量可以一次或多次给药。
抗性或难治性癌症”是指对先前的抗癌疗法(包括例如化学疗法、手术、放射疗法、干细胞移植和免疫疗法)没有反应的肿瘤细胞或癌症。肿瘤细胞在治疗开始时可能是耐药或难治的，或者在治疗期间它们可能变得耐药或难治。难治性肿瘤细胞包括在治疗开始时没有反应或最初在短时间内反应但对治疗没有反应的肿瘤。难治性肿瘤细胞还包括对抗癌疗法有反应但对随后的几轮疗法没有反应的肿瘤。对于本发明的目的，难治性肿瘤细胞还包括似乎被抗癌疗法治疗抑制但在停止治疗后长达五年、有时长达十年或更长时间复发的肿瘤。抗癌疗法可以使用单独的化学治疗剂、单独的放射治疗、单独的靶向治疗、单独的手术或它们的组合。为了便于描述而非限制，应理解难治性肿瘤细胞可与耐药性肿瘤互换。
应当理解，本文描述的本发明的方面和实施例包括“由……组成”和/或“基本上由……组成”方面和实施例。
本文提及“大约”一个值或参数包括(并描述)针对该值或参数本身的变化。例如，提及“关于X”的描述包括“X”的描述。
如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一”、“或”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。应当理解，本文描述的本发明的方面和变体包括“由……组成”和/或“基本上由……组成”的方面和变体。
Trop-2抗原
如本文所用，术语“Trop-2”包括人Trop-2(hTrop-2)、hTrop-2的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个与h Trop-2共同表位的类似物。在各种实施方案中，如本文所用的hTrop-2多肽可包含NCBI参考序列：NP_002344.2中列出的氨基酸序列(SEQ ID NO:1):
Figure BDA0003968927430000281
在各种实施方案中，Trop-2多肽包含具有与SEQ ID NO:1的人Trop-2序列，例如，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％观察到的同源性的氨基酸序列。Trop-2的多肽变体可通过参考在本文中描述存在于SEQ ID NO:1的223个氨基酸序列中给定位置的氨基酸残基的添加、缺失或替换。因此，例如，术语“P21W”表示SEQ ID NO：1中第21位的残基“P”(脯氨酸，在标准单字母代码)已被“W”(色氨酸，在标准单字母代码中)取代。
抗体
产生与Trop-2多肽结合的新抗体的方法是本领域技术人员已知的。例如，产生与Trop-2多肽特异性结合的单克隆抗体的方法可以包括给小鼠施用一定量的包含Trop-2多肽的免疫原性组合物以有效刺激可检测的免疫反应，获得从小鼠中提取的产生抗体的细胞(例如，来自脾脏的细胞)，并将产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合以获得产生抗体的杂交瘤，并测试产生抗体的杂交瘤以鉴定产生与Trop-2多肽特异性结合的单克隆抗体的杂交瘤。一旦获得，杂交瘤可以，任选地在杂交瘤衍生的细胞产生与Trop-2多肽特异性结合的单克隆抗体的培养条件下在细胞培养物中增殖。可以从细胞培养物中纯化单克隆抗体。然后有多种不同的技术可用于测试抗体：抗原相互作用以识别特别理想的抗体。
可以使用产生或分离具有所需特异性的抗体的其他合适的方法，包括例如从文库中选择重组抗体的方法，或者依赖于能够产生人类全部库的转基因动物(例如小鼠)的免疫的方法抗体。参见例如，Jakobovits等人，Proc。国家石油公司。学院派。科学。美国，90：2551-2555，1993；Jakobovits等人，Nature，362：255-258，1993；Lonberg等人，美国专利。第5,545,806号；Surani等人，美国专利号5,545,807。
可以通过多种方式设计抗体。它们可以制成单链抗体(包括小型模块化免疫药物或SMIPsTM)、Fab和F(ab')2片段等。抗体可以是人源化的、嵌合的、去免疫的或完全人源的。许多出版物阐述了许多类型的抗体和改造这些抗体的方法。例如，参见美国专利。第6,355,245号；6,180,370；5,693,762；6,407,213；6,548,640；5,565,332；5,225,539；6,103,889；和5,260,203。
嵌合抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术产生。例如，用限制性内切酶消化编码鼠(或其他物种)单克隆抗体分子的Fc恒定区的基因以去除编码鼠Fc的区域，并且替换编码人Fc恒定区的基因的等效部分(参见Robinson等人，国际专利公开PCT/US86/02269；Akira等人，欧洲专利申请184,187；Taniguchi,M.，欧洲专利申请171,496；Morrison等人，欧洲专利申请173,494；Neuberger等人.，国际申请WO86/01533；Cabilly等人，美国专利号4,816,567；Cabilly等人，欧洲专利申请125,023；Better等人，Science,240:1041-1043,1988；Liu等人，PNAS USA,84:3439-3443,1987；Liu et al.,J.Immunol.139:3521-3526,1987；Sun et al.,PNAS USA,84:214-218,1987；Nishimura et al.,Canc.Res.47:999-1005,1987；Wood等人,Nature 314:446-449,1985；和Shaw等人,J.Natl Cancer Inst.,80:1553-1559,1988)。
本领域已经描述了用于人源化抗体的方法。在实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些高变区残基和可能的一些框架区残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体，其中基本上少于完整的人可变区已被来自非人物种的相应序列取代。在某种程度上，这可以结合人性化技术和使用适当库的显示技术来实现。应当理解，鼠抗体或来自其他物种的抗体可以使用本领域众所周知的技术进行人源化或灵长类动物化(参见例如Winter等人，Immunol Today，14：43-46，1993；和Wright等人，Crit.Reviews in Immunol.,12125-168,1992)。感兴趣的抗体可以通过重组DNA技术进行工程改造，以用相应的人序列替换CH1、CH2、CH3、铰链结构域和/或框架结构域(参见WO 92/02190和美国专利号5,530,101、5,585,089，5,693,761、5,693,792、5,714,350和5,777,085)。此外，使用Ig cDNA构建嵌合免疫球蛋白基因是本领域已知的(Liu等人，PNAS 84：3439，1987；J.Immunol.139：3521，1987)。mRNA从杂交瘤或其他产生抗体的细胞中分离出来，用于产生cDNA。可以使用特异性引物通过聚合酶链式反应扩增感兴趣的cDNA(美国专利4,683,195和4,683,202)。或者，制作并筛选文库以分离感兴趣的序列。然后将编码抗体可变区的DNA序列与人恒定区序列融合。人类基因恒定区的序列可以在Kabat等人(1991)Sequence of Proteins of Immunological Interest,N.I.H.publication no.91-3242.中找到。人类C区基因很容易从已知的克隆中获得。同种型的选择将取决于所需的效应功能，例如补体固定，或抗体依赖性细胞毒性活性。在各种实施方案中，同种型选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。可以使用任何人轻链恒定区，κ或λ。然后通过常规方法表达嵌合的人源化抗体。
Queen等人的美国专利No.5,693,761公开了对Winter等人的改进。用于人源化抗体，并且基于将亲合力损失归因于人源化框架中的结构基序问题的前提，该结构基序由于空间或其他化学不相容性，干扰CDR的折叠成在小鼠抗体中发现的具有结合能力的构象。为了解决这个问题，Queen教导使用在线性肽序列中与待人源化的小鼠抗体的框架序列密切同源的人框架序列。因此，Queen的方法侧重于比较物种之间的框架序列。通常，将所有可用的人可变区序列与特定的小鼠序列进行比较，并计算相应框架残基之间的同一性百分比。选择具有最高百分比的人可变区为人源化项目提供框架序列。Queen还教导在人源化框架中保留来自小鼠框架的某些氨基酸残基对于支持具有结合能力的构象的CDR至关重要。从分子模型评估潜在的临界性。保留的候选残基通常是那些在线性序列中与CDR相邻的残基或物理上在任何CDR残基
Figure BDA0003968927430000301
范围内的残基。
在其他方法中，通过如Riechmann等，1988所述将单个残基恢复为小鼠序列并测定抗原结合，一旦获得低亲和力的人源化构建体，，，特定框架氨基酸残基的重要性可通过实验确定。另一个鉴定构架序列中重要氨基酸的方法例子是在Carter等人的美国专利No.5,821,337和Adair等人的美国专利No.5,859,205中公开的。这些参考文献公开了框架中特定的Kabat残基位置，在人源化抗体中，可能需要用相应的小鼠氨基酸取代以保持亲和力。
另一种人源化抗体的方法，称为“框架改组”，依赖于生成一个组合文库，其中非人CDR可变区在框架内融合到单个人种系框架库中(Dall'Acqua等人，方法，36:43，2005)。然后筛选文库以鉴定编码保留良好结合的人源化抗体的克隆。
选择用于制备所需人源化抗体的人可变区，包括轻链和重链，对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最佳拟合”方法，将啮齿动物抗体的可变区序列与已知人类可变域序列的整个文库进行筛选。然后接受与啮齿动物序列最接近的人序列作为人源化抗体的人框架区(框架区)(Sims等人，J.Immunol.，151:2296,1993；Chothia等人，J.Mol.Biol.,196:901,1987)。另一种方法使用源自特定轻链或重链可变区亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架区。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285,1992；Presta etal.,J.Immunol.,151:2623,1993)。
替代人可变区的非人残基的选择可能受到多种因素的影响。这些因素包括，例如，特定位置的氨基酸稀有度、与CDR或抗原相互作用的可能性，以及参与轻链和重链可变域界面之间界面的可能性。(参见，例如，美国专利号5,693,761、6,632,927和6,639,055)。分析这些因素的一种方法是使用非人类和人性化序列的三维模型。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并且为本领域技术人员所熟悉。计算机程序可用于说明和显示选定候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，例如分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以选择非人残基并用人可变区残基替代以实现所需的抗体特性，例如增加对靶抗原的亲和力。
本领域已经描述了制备完全人抗体的方法。例如，制备抗Trop-2抗体或其抗原结合片段的方法包括在噬菌体上合成人抗体文库、用Trop-2或其抗体结合部分筛选文库的步骤，分离结合Trop-2的噬菌体，并从噬菌体中获得抗体。作为另一个例子，制备用于噬菌体展示技术的抗体文库的一种方法包括以下步骤：用Trop-2或其抗原部分免疫包含人免疫球蛋白基因座的非人动物以产生免疫反应，提取来自免疫动物的产生抗体的细胞；从提取的细胞中分离编码本发明抗体的重链和轻链的RNA，逆转录RNA以产生cDNA，使用引物扩增cDNA，并将cDNA插入噬菌体展示载体，使得抗体在噬菌体上表达。本发明的重组抗Trop-2抗体可以以这种方式获得。
重组人抗Trop-2抗体也可以通过筛选重组组合抗体文库来分离。优选地，文库是scFv噬菌体展示文库，使用从B细胞分离的mRNA制备的人VL和VH cDNA产生。制备和筛选此类文库的方法是本领域已知的。用于生成噬菌体展示文库的试剂盒是可商购的(例如，Pharmacia Recombinant Phage Antibody System，目录号27-9400-01；和StratageneSurfZAP TM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。还有其他方法和试剂可用于生成和筛选抗体展示文库(参见，例如，美国专利号5,223,409；PCT公开号WO 92/18619、WO 91/17271、WO92/20791、WO 92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047、WO 92/09690；Fuchs等人，Bio/Technology 9：1370-1372(1991)；Hay等人，Hum.Antibod.Hybridomas 3：81-85,1992；Huse等人,Science 246:1275-1281,1989；McCafferty等人,Nature 348:552-554,1990；Griffiths等人,EMBOJ.12:725-734,1993；Hawkins等人.,J.Mol.Biol.226:889-896,1992；Clackson等人,Nature 352:624-628,1991；Gram等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3576-3580,1992；Garrad等人，Bio/Technology 9：1373-1377，1991；Hoogenboom等人，Nuc.AcidRes.19：4133-4137，1991；和Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7978-7982,1991，出于教导相展示文库的制备和筛选的目的，每篇文献通过引用并入本文。
人抗体也通过用人IgE抗原免疫非人转基因动物在其基因组中包含一些或全部人免疫球蛋白重链和轻链基因座来产生，例如XenoMouse TM动物(Abgenix,Inc./Amgen,公司——加利福尼亚州弗里蒙特)。XenoMouse TM小鼠是经过改造的小鼠品系，包含人免疫球蛋白重链和轻链基因座的大片段，并且缺乏小鼠抗体产生。参见，
例如，Green等人，Nature Genetics 7：13-21，1994；和美国专利号5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598、6,130,364、6,162,963和6,150,584。另见WO 91/10741、WO 94/02602、WO 96/34096、WO 96/33735、WO 98/16654、WO 98/24893、WO 98/50433、WO 99/45031、WO 99/53049、WO00/09560和WO 00/037504。XenoMouse TM小鼠可产生类似成人的完整人类抗体库，并产生抗原特异性人类抗体。在一些实施方案中，XenoMouse TM小鼠通过在酵母人工染色体(YAC)中引入人重链基因座和κ轻链基因座的兆碱基大小的种系构型片段而含有80％的人抗体V基因库的80％。。在其他实施方案中，XenoMouse TM小鼠还含有大约所有的人λ轻链基因座。参见Mendez et al.,NatureGenetics 15:146-156,1997,Green and Jakobovits,J.Exp.医学。188:483-495(1998)和WO 98/24893(为了教导制备完全人抗体的目的，每个都通过引用整体并入)。另一方面，本发明提供了一种通过用Trop-2抗原免疫包含人免疫球蛋白基因座的非人转基因动物从非人、非小鼠动物制备抗Trop-2抗体的方法。可以使用上述文献中描述的方法生产这种动物。
抗体与抗原结合的表征
本发明的抗体与Trop-2的结合可以通过例如标准ELISA测试。例如，用溶于PBS中的纯化Trop-2包被微量滴定板，然后用溶于PBS中的5％牛血清白蛋白封闭。将抗体稀释液(例如来自Trop-2免疫小鼠的血浆稀释液)添加到每个孔中并在37℃温育1-2小时。将板用PBS/Tween洗涤，然后与与碱性磷酸酶缀合的第二试剂(例如，对于人抗体，山羊抗人IgG Fc特异性多克隆试剂)在37℃温育1小时。洗涤后，将板用pNPP底物(1mg/ml)显色并在405-650的OD下进行分析。优选地，产生最高滴度的小鼠将用于融合。ELISA测定也可用于筛选与Trop-2免疫原呈阳性反应的杂交瘤。以高亲和力结合Trop-2的杂交瘤被亚克隆并进一步表征。选择来自每个杂交瘤的一个克隆保留了亲本细胞的反应性(通过ELISA)，可用于制作一个5-10瓶的细胞库，储存在-140℃，并用于抗体纯化。
为了确定所选的抗Trop-2单克隆抗体是否与独特的表位结合，可以使用可商购的试剂(Pierce,Rockford,IL)对每种抗体进行生物素化。如上所述，可以使用Trop-2包被的ELISA板进行使用未标记单克隆抗体和生物素化单克隆抗体的竞争研究。可以用链球菌-亲和素-碱性磷酸酶探针检测生物素化的mAb结合。为了确定纯化抗体的同种型，可以使用对特定同种型抗体特异的试剂进行同种型ELISA。例如，为了确定人单克隆抗体的同种型，可以在4℃下用1μg/ml的抗人免疫球蛋白包被微量滴定板的孔过夜。用1％BSA封闭后，将板与1μg/ml或更少的测试单克隆抗体或纯化的同种型对照在环境温度下反应1到2小时。然后孔可以与人IgG1或人IgM特异性碱性磷酸酶偶联探针反应。如上所述对板进行显影和分析。
可以通过Western blotting进一步测试抗Trop-2人IgG与Trop-2抗原的反应性。简而言之，可以制备Trop-2并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜上，用10％胎牛血清封闭，并用待测的单克隆抗体进行探测。可以使用抗人IgG碱性磷酸酶检测人IgG结合，并使用BCIP/NBT底物片剂(Sigma Chem.Co.,St.Louis,MO)显色。
人IgG与其抗原的结合亲和力可以通过基于生物层干涉(BLI)技术的Octet系统确定。BLI是附着在光纤尖端的一层分子，它在检测器处产生干涉图案，结合的分子数量的任何变化都会导致图案发生测量偏移。Octet系统可以实时分析96孔微孔板中生物分子相互作用的亲和力和动力学。简而言之，可以将目标抗原稀释并加载到96孔微孔板中。然后将抗体稀释并添加到指定的孔中。将板放入Octet系统并开始测定。可以使用Octet DataAcquisition Software(fortebio data analysis10.0)分析数据以计算结合速率常数Kon、解离速率常数Koff和解离常数Kd(Kd＝Koff/Kon)。
人IgG与其在细胞表面表达的抗原的结合可以通过流式细胞术进行测试。简而言之，可以将抗体添加到FACS缓冲液中的细胞中，并在4℃下孵育30分钟。孵育后，洗涤细胞以去除未结合的抗体。然后将细胞解离并在冰上用荧光偶联的二抗染色30分钟，然后使用beckman流式细胞术系统进行分析。荧光强度和细胞结合百分比可以通过Beckman流式细胞仪软件进行分析。
Anti-Trop-2抗体的鉴定
本发明提供与Trop-2抗原特异性结合的单克隆抗体及其抗原结合片段。
本发明还包括与本发明的抗Trop-2抗体结合相同表位的抗体。为了确定抗体是否可以与本发明的抗Trop-2抗体结合的表位竞争结合相同的表位，可以进行交叉阻断测定，例如竞争性ELISA测定。在示例性竞争性ELISA测定中，将包被在微量滴定板孔上的Trop-2与候选竞争性抗体一起或不与候选竞争性抗体一起预孵育，然后加入本发明的生物素标记的抗Trop-2抗体。使用抗生物素蛋白-过氧化物酶缀合物和适当的底物测量孔中与Trop-2抗原结合的标记抗Trop-2抗体的量。可以用放射性或荧光标记或一些其他可检测和可测量的标记来标记抗体。与抗原结合的标记抗Trop-2抗体的量将与候选竞争抗体(测试抗体)竞争结合相同表位的能力具有间接相关性，即测试抗体对于相同表位的亲和力越大，与抗原包被的孔结合的标记抗体就越少。如果候选抗体可以通过以下方式阻断Trop-2抗体的结合，则候选竞争抗体被认为是与本发明的抗Trop-2抗体基本上结合相同表位或竞争结合相同表位的抗体。如果候选抗体可以阻断至少20％、至少30％、至少40％或至少50％，则与在没有候选竞争抗体的情况下平行进行的对照相比。应当理解，可以进行该测定的变化以达到相同的定量值。在各种实施方案中，本发明的抗体包括与命名为#118-2-5的单克隆抗体结合相同表位的抗体。在各种实施方案中，本发明的抗体包括与命名为#125-1-5的单克隆抗体结合相同表位的抗体。
如本文所述产生的两种鼠抗体#118-2-5和#125-1-5的重链CDR和轻链CDR的氨基酸序列如下表2所示。
表2
Figure BDA0003968927430000351
在本发明的多个实施方案中，抗体或抗原结合片段是鼠抗体#118-2-5，其包含SEQID NO:15的重链可变区序列：
QVQLKQSGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVNWIRQPPGKGLEWLGVMWAGGST NYNSALMRSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTGMYYCARDENWDGAWFAYWGQGT LVTVS(SEQ ID NO:15)
以及SEQ ID NO:17的轻链可变区序列：
DIQMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLISWAS SRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLFTFGGGTKLELK(SEQ ID NO:17)
在本发明的多个实施方案中，抗体或抗原结合片段是鼠抗体#125-1-5，其包含SEQID NO:16的重链可变区序列：
QIQLVQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTTYVIHWVKQKPGQGLEWIGYINPNNDGT KYNEKFKGKATLISDKSSTTAYMEVRGLTSEDSAVYYCARPHFETHAMDYWGQGTSVT VSS(SEQ ID NO:16)
以及SEQ ID NO:18的轻链可变区序列：
DIQMTQSPSSFSVSLGDSVTITCKASEDIFNRLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGVP SRFSGGGSGKEYTLSITSLQNEDVATYYCQQYWNTWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:18)
在本发明的多个实施方案中，抗体或抗原结合片段是来源于鼠#118-2-5的鼠-人嵌合抗体，包含SEQ ID NO:47的重链序列：
QVQLKQSGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVNWIRQPPGKGLEWLGVMWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTGMYYCARDENWDGAWFAYWGQGTLVTVSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQAYICNVNHKPSNTKVDKKVGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIERTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELAKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*(SEQ ID NO:47)
以及SEQ ID NO:48的轻链序列：
DIQMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLISWASSRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLFTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*(SEQ ID NO:48)
在某些替代实施方案中，抗体是鼠-人嵌合抗体，其包含重链和轻链，其中重链包含具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、与SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列具有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％的同一性，并且其中轻链包含具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％的序列与如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列具有98％、98％或至少约99％的同一性。
在本发明的多个实施方案中，抗体或抗原结合片段是来源于鼠#125-1-5的鼠-人嵌合抗体，包含SEQ ID NO:49的重链序列：
QIQLVQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTTYVIHWVKQKPGQGLEWIGYINPNNDGTKYNEKFKGKATLISDKSSTTAYMEVRGLTSEDSAVYYCARPHFETHAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQAYICNVNHKPSNTKVDKKVGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIERTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELAKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*(SEQ ID NO:49)
以及SEQ ID NO:50的轻链序列：
DIQMTQSPSSFSVSLGDSVTITCKASEDIFNRLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGVPSRFSGGGSGKEYTLSITSLQNEDVATYYCQQYWNTWTFGGGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*(SEQID NO:50)
在某些替代实施方案中，抗体是鼠-人嵌合抗体，其包含重链和轻链，其中重链包含具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％与SEQ ID NO:49所示氨基酸序列的同一性，并且其中轻链包含具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％的序列与如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列有98％、或至少约99％的同一性。
在本发明的多个实施方案中，抗体是人源化IgG A1，2X4，包含SEQ ID NO:51的重链序列：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVNWIRQPPGKGLEWIGVMWAGGST NYNSALMSRLTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDENWDGAWFAYWGQGTL VTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQAYICNVNHKPSNTKVDKKVGPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIERTISKAKGQPR EPQVYTLPPSRDELAKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*(SEQ ID NO:51)
以及SEQ ID NO:52的轻链序列：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYNLFTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*(序列号：
在某些替代实施方案中，抗体是包含重链和轻链的抗体，其中重链包含具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％与SEQ ID NO:51所示氨基酸序列的同一性，并且其中轻链包含具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％的序列,或与SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列具有至少约99％的同一性。
在本发明的多个实施方案中，抗体是人源化IgG A1X4，其包含SEQ ID NO:53的重链序列：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVNWIRQPPGKGLEWIGVMWAGGST NYNSALMSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDENWDGAWFAYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQAYICNVNHKPSNTKVDKKVGPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIERTISKAKGQPR EPQVYTLPPSRDELAKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*(SEQ ID NO:53)
以及SEQ ID NO:54的轻链序列：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWAS SRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYNLFTFGGGTKVEIKRTVAA PSVFIFPPSDEQLKSSGTASVVCLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV54TKSFNRGEC*(SEQ)
在某些替代实施方案中，抗体是包含重链和轻链的抗体，其中重链包含具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％与SEQ ID NO:53所示氨基酸序列的同一性，
并且其中轻链包含具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％的同一性，如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。
在本发明的多个实施方案中，抗体是人源化IgG#125-1-5Hu3/Lu5，包含SEQ IDNO:55的重链序列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYVIHWVRQAPGQRLEWMGYINPNNDG TKYNEKFKGKATLTSDKSSTTAYMEVRGLTSEDSAVYYCARPHFETHAMDYWGQGTL VTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQAYICNVNHKPSNTKVDKKVGPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIERTISKAKGQP R EPQVYTLPPSRDELAKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*(SEQ ID NO:55)
以及SEQ ID NO:56的轻链序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASEDIFNRLAWYQQKPGKAPKLLLYGATSLETGVP SRF SGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYWNTWTFGQGTKVEIK RTVAAPSVFIFP PSDEQLKSSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*(序列号：
在某些替代实施方案中，抗体是包含重链和轻链的抗体，其中重链包含具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％与SEQ ID NO:55所示氨基酸序列的同一性，并且其中轻链包含序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或与SEQ ID NO:56中所示的氨基酸序列具有至少约99％的同一性。
在本公开的各种实施方案中，抗体可以是具有与包含如SEQ ID NO：51、53、55中任一个所示的重链序列的抗体相同或更高的抗原结合亲和力的抗Trop-2抗体。在各种实施方案中，该抗体可以是与包含如SEQ ID NO：51、53、55中任一个所示的重链序列的抗体结合相同表位的抗Trop-2抗体。在多个实施方案中，该抗体是与包含如SEQ ID NO：51、53、55中任一个所示的重链序列的抗体竞争的抗Trop-2抗体。在各种实施方案中，抗体可以是包含如SEQ ID NO：51、53、55中任一个所示的重链序列的至少一个(例如两个或三个)CDR的抗Trop-2抗体。
在各种实施方案中，该抗体包含的重链氨基酸序列，具有与SEQ ID NO:51、53、55中任何一个有例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少9
5％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的可观察到的同源性。
在本公开的各种实施方案中，抗体可以是具有与包含如SEQ ID NO：52、54、56中任一个所示的轻链序列的抗体相同或更高的抗原结合亲和力的抗Trop-2抗体。在各种实施方案中，该抗体可以是与如SEQ ID NO：52、54、56中任一个所示的轻链序列的抗体结合相同表位的抗Trop-2抗体。在多个实施方案中，该抗体是与包含如SEQ ID NO：52、54、56中任一个所示的轻链序列的抗体竞争的抗Trop-2抗体。在各种实施方案中，抗体可以是包含如SEQID NO：52、54、56中任一个所示的轻链序列的至少一个(例如两个或三个)CDR的抗Trop-2抗体。
在各种实施方案中，抗体含有的轻链氨基酸序列，具有与SEQ ID NO:52、54、56中任何一个有例如，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的可观察到的同源性。
在多个实施方案中，本发明的分离的人源化抗体或其抗原结合片段与人Trop-2结合并包含SEQ ID NO：51所示的重链序列和SEQ ID NO：52所示的轻链序列。
在多个实施方案中，本发明的分离的人源化抗体或其抗原结合片段与人Trop-2结合并包含SEQ ID NO：53所示的重链序列和SEQ ID NO：54所示的轻链序列。
在多个实施方案中，本发明的分离的人源化抗体或其抗原结合片段与人Trop-2结合并包含SEQ ID NO：55所示的重链序列和SEQ ID NO：56所示的轻链序列。
在一些实施方案中，本申请提供的抗Trop-2抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中V H包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。
在一些实施方案中，本申请提供的抗Trop-2抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中V H包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。
在一些实施方案中，本申请提供的抗Trop-2抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。
在一些实施方案中，本申请提供的抗Trop-2抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。
在一些实施方案中，本申请提供的抗Trop-2抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。
在一些实施方案中，本申请提供的抗Trop-2抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。
在一些实施方案中，本申请提供的抗Trop-2抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。
在一些实施方案中，本申请提供的抗Trop-2抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。
在一些实施方案中，本申请提供的抗Trop-2抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％中的任一个的氨基酸序列的变体，97％、98％或99％)序列同一性；并且VL包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQID NO:36的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任何一个的氨基酸序列的变体)、96％、97％、98％或99％)序列同一性。
在一些实施方案中，本申请提供的抗Trop-2抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ IDNO:30的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。
在一些实施方案中，本申请提供的抗Trop-2抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQID NO:31的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任何一个的氨基酸序列的变体)、96％、97％、98％或99％)序列同一性。
在一些实施方案中，本申请提供的抗Trop-2抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ IDNO:32的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任何一个的氨基酸序列的变体)、96％、97％、98％或99％)序列同一性。
在一些实施方案中，本申请提供的抗Trop-2抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQID NO:36的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任何一个的氨基酸序列的变体)、96％、97％、98％或99％)序列同一性。
在一些实施方案中，本申请提供的抗Trop-2抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，抗Trop2抗体包含重链，该重链包含SEQID NO:51的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％中的任一个)的氨基酸序列的变体、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性；以及包含SEQID NO:52的氨基酸序列的轻链，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任何一个的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。
在一些实施方案中，本申请提供的抗Trop-2抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，抗Trop2抗体包含包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重链，或包含具有至少约80％(例如至少约80％中的任何一个的氨基酸序列的变体)、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性；以及包含SEQ IDNO:54的氨基酸序列的轻链，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。
在一些实施方案中，本申请提供的抗Trop-2抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。
在一些实施方案中，本申请提供的抗Trop-2抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。
在一些实施方案中，本申请提供的抗Trop-2抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％中的任一个的氨基酸序列的变体，97％、98％或99％)序列同一性；并且VL包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。
在一些实施方案中，本申请提供的抗Trop-2抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，本申请提供了包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗Trop2抗体，其中VH包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任一个)的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施方案中，抗Trop2抗体包含包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的重链，或包含具有至少约80％(例如至少约80％中的任何一个的氨基酸序列的变体)、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性；以及包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的轻链，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％中的任何一个的氨基酸序列的变体、96％、97％、98％或99％)序列同一性。
本发明的抗体或其抗原结合片段可包含本领域已知的任何恒定区。轻链恒定区可以是例如κ或λ型轻链恒定区，例如人κ或λ型轻链恒定区。重链恒定区可以是例如α-、δ-、ε-、γ-或mu-型重链恒定区，例如IgA-、IgD-、IgE-、IgG-和IgM-型重链恒定区。在各种实施方案中，轻链或重链恒定区是天然存在的恒定区的片段、衍生物、变体或突变蛋白。
在一些实施方案中，本文所述的抗Trop-2抗体包含选自以下的Fc恒定区组的Fc恒定区：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其组合和杂合体。在一些实施方案中，与相应的野生型Fc恒定区相比，Fc恒定区具有降低的效应子功能。在一些实施方案中，与相应的野生型Fc恒定区相比，Fc片段具有增强的效应子功能。在一些实施方案中，Fc恒定区具有延长的血清半衰期。在一些实施方案中，Fc恒定区具有降低的血清半衰期。
在一些实施方案中，本文所述的抗Trop-2抗体包含IgG1Fc恒定区(例如，野生型IgG1Fc恒定区)。
已知用于从感兴趣的抗体衍生不同亚类或同种型的抗体的技术，即亚类转换。因此，例如，IgG抗体可以衍生自IgM抗体，反之亦然。此类技术允许制备具有给定抗体(亲本抗体)的抗原结合特性的新抗体，但也表现出与不同于亲本抗体的抗体同种型或亚类相关的生物学特性。可以使用重组DNA技术。编码特定抗体多肽的克隆DNA可用于此类程序，例如，编码所需同种型抗体恒定结构域的DNA。另见Lanitto等人，Methods Mol。生物学。178:303-16,2002。
本发明的抗体也可以根据它们的交叉反应性进行描述或说明。本发明包括的结合Trop-2多肽的抗体，其具有与人Trop-2至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％和至少50％的同一性(如使用本领域已知的和本文描述的方法计算的)。
本发明还包括与本发明的抗Trop-2抗体结合相同表位的抗体。为了确定抗体是否可以与本发明的抗Trop-2抗体结合的表位竞争结合相同的表位，可以进行交叉阻断测定，例如竞争性ELISA测定。在示例性竞争性ELISA测定中，将包被在微量滴定板孔上的Trop-2与候选竞争性抗体一起或不与候选竞争性抗体一起预孵育，然后加入本发明的生物素标记的抗Trop-2抗体。使用抗生物素蛋白-过氧化物酶缀合物和适当的底物测量孔中与Trop-2抗原结合的标记抗Trop-2抗体的量。可以用放射性或荧光标记或一些其他可检测和可测量的标记来标记抗体。与抗原结合的标记抗Trop-2抗体的量将与候选竞争抗体(测试抗体)竞争结合相同表位的能力具有间接相关性，即相同表位的测试抗体的亲和力越大，与抗原包被的孔结合的标记抗体就越少。如果候选抗体可以通过以下方式阻断Trop-2抗体的结合，则候选竞争抗体被认为是与本发明的抗Trop-2抗体基本上结合相同表位或竞争结合相同表位的抗体。如果候选抗体可以阻断至少20％、至少30％、至少40％或至少50％，则与在没有候选竞争抗体的情况下平行进行的对照相比。应当理解，可以进行该测定的变化以达到相同的定量值。
在某些替代实施方案中，本发明的抗体可以通过修饰一个或两个可变区(即，VH和/或VL)内的一个或多个残基，或通过修饰恒定区内的残基来工程化，例如，改变抗体的效应器功能。在各种实施方案中，抗体的可变区将通过使用从公共DNA数据库或包括种系抗体基因序列的公开参考文献中获得(例如，Tomlinson，IM等，J.Mol.Biol.227:776-798,1992；和Cox,JPL et al.,Eur.J.Immunol.24:827-836,1994；每篇的内容通过引用明确并入本文)的框架序列进行CDR移植来修饰，。在各种实施方案中，可以使用定点诱变或PCR介导的诱变来修饰抗体以在VH和/或VL中引入突变，从而提高结合亲和力和/或降低免疫原性。在各种实施方案中，为了改变抗体的血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性，可以在Fc区中修饰抗体。在各种实施方案中，为了修饰抗体的糖基化，可以修饰抗体。用于执行本文所述的每个修改的方法以及其他方法对本领域技术人员来说是众所周知的。
药物组合物
在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如上所述的抗体或其抗原结合片段。本发明的药物组合物、方法和用途因此还包括与其他活性剂组合(共同给药)的实施方案，如下文详述。
通常，本发明的抗体或其抗原结合片段抗体适合作为与一种或多种药学上可接受的辅料联合的制剂施用。术语“辅料”在本文中用于描述除本发明化合物之外的任何成分。辅料的选择在很大程度上取决于诸如特定给药方式、辅料对溶解度和稳定性的影响以及剂型的性质等因素。如本文所用，“药学上可接受的辅料”包括生理相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的辅料的一些实例是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及它们的组合。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。药学上可接受的物质的其他例子是润湿剂或少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，它们可提高抗体的保质期或有效性。本发明的药物组合物及其制备方法对于本领域技术人员来说将是显而易见的。这样的组合物及其制备方法可以在例如Remington's PharmaceuticalSciences，第19版(Mack Publishing Company，1995)中找到。药物组合物优选在GMP条件下制造。
本发明的药物组合物可以作为单一单位剂量或作为多个单一单位剂量批量制备、包装或销售。如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将给予受试者的活性成分的剂量或该剂量的方便分数，例如该剂量的二分之一或三分之一。
本领域接受的用于施用肽、蛋白质或抗体的任何方法都可以适当地用于本发明的抗体和部分。
本发明的药物组合物通常适用于肠胃外给药。如本文所用，药物组合物的“肠胃外给药”包括任何给药途径，其特征在于个体组织的物理破裂和通过组织中的破裂给药药物组合物，因此通常导致直接给药到血液中，进入肌肉，或进入内部器官。因此，肠胃外给药包括但不限于通过注射组合物、通过手术切口施用组合物、通过组织穿透性非手术伤口施用组合物等.特别地，肠胃外给药包括但不限于皮下、腹膜内、肌肉内、胸骨内、静脉内、动脉内、鞘内、心室内、尿道内、颅内、滑膜内注射或输注；和肾透析输液技术。各种实施方案包括静脉内和皮下途径。
适用于肠胃外给药的药物组合物的制剂通常包含与药学上可接受的载体组合的活性成分，例如无菌水或无菌等渗盐水。此类制剂可以以适合于推注给药或连续给药的形式制备、包装或销售。可注射制剂可以以单位剂型制备、包装或出售，例如在安瓿中或在含有防腐剂的多剂量容器中。用于肠胃外给药的制剂包括但不限于混悬剂、溶液、油性或水性赋形剂中的乳剂、糊剂等。此类制剂还可包含一种或多种附加成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外给药的制剂的一个实施方案中，活性成分以干燥(即粉末或颗粒)形式提供，用于在肠胃外给药重构的组合物之前用合适的载体(例如无菌无热原水)重构。肠胃外制剂还包括水溶液，其中可能含有赋形剂，例如盐、碳水化合物和缓冲剂(优选pH为3至9)，但对于某些应用，它们可能更适合配制成无菌的非水溶液或作为干燥形式与合适的载体(例如无菌、无热原水)一起使用。示例性的肠胃外给药形式包括无菌水溶液中的溶液或悬浮液，例如丙二醇水溶液或葡萄糖溶液。如果需要，可以适当地缓冲这种剂型。其他可用的肠胃外给药制剂包括那些包含微晶形式或脂质体制剂中的活性成分的制剂。用于肠胃外给药的制剂可以配制成立即释放和/或改良释放。改良释放制剂包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放和程序释放。
例如，在一方面，可以通过将所需量的抗Trop-2抗体掺入适当的溶剂中来制备无菌注射溶液，该溶剂具有上面列举的一种成分或成分的组合，根据需要，然后过滤灭菌。通常，分散体是通过将活性化合物掺入无菌载体中来制备的，该载体含有基本分散介质和来自上面列举的那些所需的其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何其他所需成分的粉末。溶液的适当流动性可以例如通过使用包衣例如卵磷脂、通过在分散体的情况下保持所需的粒度和通过使用表面活性剂来保持。可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶来延长可注射组合物的吸收。
本发明的抗体也可以通过鼻内或通过吸入给药，通常以来自干粉吸入器的干粉的形式(单独、作为混合物或作为混合组分颗粒，例如，与合适的药学上可接受的赋形剂混合)，以来自加压容器、泵、喷雾器、雾化器(最好是使用电流体动力学产生细雾的雾化器)或喷雾器的气溶胶喷雾剂，使用或不使用合适的推进剂，或作为滴鼻剂。
加压容器、泵、喷雾器、雾化器或雾化器通常含有本发明抗体的溶液或悬浮液，其包含例如用于分散、溶解或延长活性物质释放的合适试剂、推进剂如溶剂。
在用于干粉剂或混悬剂制剂之前，药物产品通常被微粉化至适合通过吸入递送的尺寸(通常小于5微米)。这可以通过任何合适的粉碎方法来实现，例如螺旋喷射研磨、流化床喷射研磨、超临界流体加工以形成纳米颗粒、高压均化或喷雾干燥。
用于吸入器或吹入器的胶囊、泡罩和药筒可配制成含有本发明化合物、合适的粉末基质和性能改进剂的粉末混合物。
可以将合适的调味剂，例如薄荷醇和左薄荷醇，或甜味剂，例如糖精或糖精钠，添加到意在用于吸入/鼻内给药的本发明的那些制剂中。
用于吸入/鼻内给药的制剂可以配制成立即释放和/或改良释放。改良释放制剂包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放和程序释放。
在干粉吸入器和气雾剂的情况下，剂量单位是通过一个阀门来确定的，该阀门提供一个计量的量。根据本发明的单元通常布置成施用计量剂量或“本发明抗体的喷发”。总的日剂量通常以单剂量给药，或者更通常地，作为全天的分剂量给药。
本发明的抗体和抗体部分也可以配制用于口服途径给药。口服给药可以包括吞咽，以使化合物进入胃肠道，和/或颊、舌或舌下给药，化合物由此直接从口腔进入血流。
适合口服给药的制剂包括固体、半固体和液体系统，例如片剂；含有多颗粒或纳米颗粒、液体或粉末的软胶囊或硬胶囊；锭剂(包括液体)；咀嚼；凝胶；快速分散剂型；电影；胚珠；喷雾剂；和颊/粘膜粘附贴片。
旨在用于口服的药物组合物可根据本领域已知的用于制备药物组合物的任何方法制备，并且此类组合物可包含一种或多种选自甜味剂的试剂以提供药学上优雅和可口的制剂.例如，为了制备可口服递送的片剂，将抗体或其抗原结合片段与至少一种药用赋形剂混合，并根据已知方法将固体制剂压制成片剂，用于递送至胃肠道。片剂组合物通常与添加剂例如糖或纤维素载体、粘合剂例如淀粉糊或甲基纤维素、填充剂、崩解剂或通常用于制造药物制剂的其他添加剂一起配制。为了制备可口服递送的胶囊，将DHEA与至少一种药物赋形剂混合，并将固体制剂置于适合递送至胃肠道的胶囊容器中。包含抗体或其抗原结合片段的组合物可以按照Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版中的一般描述来制备。1990(Mack Publishing Co.Easton Pa.18042)在第89章，通过引用将其并入本文。
在各种在一些实施方案中，药物组合物配制成含有抗体或其抗原结合片段的口服可递送片剂，并与适合制备片剂的无毒药学上可接受的赋形剂混合。这些赋形剂可以是惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉、明胶或阿拉伯胶，以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂可以是未包衣的，或者它们可以用已知技术进行包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而在更长的时间段内提供持续的作用。例如，可以单独或与蜡一起使用诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的延时材料。
在各种实施方案中，将药物组合物配制成硬明胶胶囊，其中抗体或其抗原结合片段与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或配制成软明胶胶囊，其抗原结合片段与水性或油性介质混合，例如花生油、花生油、液体石蜡或橄榄油。
液体制剂包括悬浮液、溶液、糖浆和酏剂。此类制剂可用作软胶囊或硬胶囊(例如，由明胶或羟丙基甲基纤维素制成)中的填充剂，并且通常包含载体，例如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甲基纤维素或合适的油，并且一种或多种乳化剂和/或悬浮剂。液体制剂也可以通过例如从小袋中重构固体来制备。
治疗用途
在另一个方面，本发明提供了治疗受试者癌症的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的(作为单一疗法或在联合疗法方案中)本发明的抗体或其抗原结合片段。此类疾病包括但不限于实体瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门癌、胃癌癌症，睾丸癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，外阴癌，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，食道癌，小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病，包括急性髓性白血病,慢性粒细胞白血病,急性淋巴细胞白血病,慢性淋巴细胞白血病,儿童实体瘤,淋巴细胞淋巴瘤,膀胱癌,肾癌或输尿管癌,肾癌肾盂、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤，以及所述癌症的组合。在各种实施方案中，受试者先前对抗癌疗法的治疗有反应，但在停止治疗后，复发(下文称为“复发性癌症”)。在各种实施方案中，受试者患有抗性或难治性癌症。在各种实施方案中，癌细胞是免疫原性肿瘤(例如，使用肿瘤本身进行疫苗接种的那些肿瘤可导致对肿瘤攻击的免疫力)。在各种实施方案中，癌症选自结肠直肠癌(CRC)、肾癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌和神经胶质瘤.
在各种实施方案中，本发明的抗体及其抗原结合片段在体内直接杀死或消融癌细胞。直接杀伤包括将抗体(其任选地与细胞毒性药物融合)施用于需要这种治疗的受试者。在各种实施方案中，癌症包括比可比组织的非癌细胞更高水平表达Trop-2的癌细胞。由于抗体识别癌细胞上的Trop-2，因此抗体结合的任何此类细胞都会被破坏。在抗体单独用于杀死或消融癌细胞的情况下，这种杀死或消融可以通过启动内源性宿主免疫功能如CDC和/或ADCC来影响。确定抗体是否以这种方式杀死细胞的测定在本领域技术人员的能力范围内。
在各种实施方案中，本发明的抗体及其抗原结合片段可用于促进癌性肿瘤细胞的生长抑制和/或增殖。这些方法可以抑制或阻止所述受试者的癌细胞生长，例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。结果，在癌症是实体瘤的情况下，调节可以将实体瘤的大小减小至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
癌细胞增殖的抑制可以通过基于细胞的测定来测量，例如溴脱氧尿苷(BRDU)掺入(Hoshino et al.,Int.J.Cancer 38,369,1986；Campana et al.,J.Immunol.Meth.107:79,1988；[3H]-胸苷掺入(Chen,J.,Oncogene 13:1395-403,1996；Jeoung,J.,J.Biol.Chem.270:18367-73,1995；染料Alamar Blue(可获自Biosource International)(Voytik-Harbin et al.,In Vitro Cell Dev Biol Anim 34:239-46,1998).癌细胞的不依赖贴壁的生长通过在软琼脂中的集落形成测定来评估，例如通过计算在软琼脂顶部形成的癌细胞集落的数量(参见示例和Sambrook等人，分子克隆，冷泉港，1989)。
对象中癌细胞生长的抑制可以通过监测对象中的癌症生长来评估，例如在动物模型中或在人类对象中。一种示例性监测方法是致瘤性测定。在一个实例中，异种移植物包含来自预先存在的肿瘤或来自肿瘤细胞系的人类细胞。肿瘤异种移植物测定是本领域已知的并在本文中描述(参见例如Ogawa等人，Oncogene 19:6043-6052,2000)。在另一个实施方案中，使用中空纤维测定法监测致瘤性，该测定法描述于美国专利号5,698,413中，该专利通过引用以其整体并入本文。
抑制百分比可通过比较调节剂处理下的癌细胞增殖、不依赖贴壁的生长或癌细胞生长与阴性对照条件下(通常没有调节剂处理)下的来计算。例如，当癌细胞或癌细胞集落的数量(集落形成测定)或PRDU或[3H]-胸苷掺入为A(在调节剂处理下)和C(在阴性对照条件下)时，抑制为(C-A)/Cx100％。
源自人类肿瘤并可用于体外和体内研究的肿瘤细胞系的实例包括但不限于白血病细胞系(例如，CCRF-CEM、HL-60(TB)、K-562、MOLT-4、RPM1-8226、SR、P388和P388/ADR、H292、MV-411)；非小细胞肺癌细胞系(例如，A549/ATCC、EKVX、HOP-62、HOP-92、NCI-H226、NCI-H23、NCI-H322M、NCI-H460、NCI-H522和LXFL 529)；小细胞肺癌细胞系(例如，DMS 114和SHP-77)；结肠癌细胞系(例如，COLO205、HCC-2998、HCT-116、HCT-15、HT29、KM12、SW-620、DLD-1和KM20L2)；中枢神经系统(CNS)癌细胞系(例如，SF-268、SF-295、SF-539、SNB-19、SNB-75、U251、SNB-78和XF 498)；黑色素瘤细胞系(例如LOX I MVI、MALME-3M、M14、SK-MEL-2、SK-MEL-28、SK-MEL-5、UACC-257、UACC-62、RPMI-7951和M19-MEL)；卵巢癌细胞系(例如，IGROV1、OVCAR-3、OVCAR-4、OVCAR-5、OVCAR-8和SK-OV-3)；肾癌细胞系(例如，786-0、A498、ACHN、CAKI-1、RXF 393、SN12C、TK-10、UO-31、RXF-631和SN12K1)；前列腺癌细胞系(例如，PC-3和DU-145)；乳腺癌细胞系(例如，MCF7、NCI/ADR-RES、MDA-MB-231/ATCC、HS 578T、MDA-MB-435、BT-549、T-47D和MDA-MB-468)；和甲状腺癌细胞系(例如，SK-N-SH)。
在另一个方面，本发明提供用于治疗受试者的传染病的方法，包括向受试者施用治疗有效量(作为单一疗法或在联合疗法方案中)的本发明的分离的抗体或抗原结合片段发明。在各种实施方案中，受试者患有由病原病毒引起的传染病。在各种实施方案中，受试者患有由病原菌引起的传染病。在各种实施方案中，受试者患有由病原真菌引起的传染病。在各种实施方案中，受试者患有由病原寄生虫引起的传染病。在各种实施方案中，受试者患有对使用常规疫苗的治疗有抗性或被使用常规疫苗治疗无效的传染病。
“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指将在一定程度上缓解所治疗疾病的一种或多种症状的所施用治疗剂的量。
治疗有效剂量可以通过最初从细胞培养测定中确定的IC 50来估计。然后可以在动物模型中制定剂量以达到包括在细胞培养中确定的IC 50的循环血浆浓度范围。此类信息可用于更准确地确定人体的有用剂量。血浆中的水平可以例如通过HPLC来测量。个体医生可以根据受试者的状况选择确切的组合物、给药途径和剂量。
可以调整剂量方案以提供最佳所需反应(例如，治疗或预防反应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用几个分开的剂量(多次或重复或维持)，并且可以根据治疗情况的紧急情况按比例减少或增加剂量。将非肠道组合物配制成剂量单位形式是特别有利的，以便于给药和剂量的均匀性。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗哺乳动物受试者的单位剂量的物理离散单位；每个单元含有预定量的活性化合物，经计算可产生所需的治疗效果以及所需的药物载体。本公开的剂量单位形式的规格将主要由抗体的独特特征和要实现的特定治疗或预防效果决定。
因此，本领域技术人员将理解，基于本文提供的公开内容，剂量和给药方案根据治疗领域中众所周知的方法进行调整。也就是说，可以容易地确定最大可耐受剂量，并且还可以确定为受试者提供可检测的有治疗益处的有效量，也可以确定施用每种药剂以向受试者提供可检测的有治疗益处的时间要求。因此，虽然本文举例说明了某些剂量和给药方案，但这些实施例绝不限制在实施本公开时可提供给受试者的剂量和给药方案。
需要注意的是，剂量值可能会随着要缓解的病症的类型和严重程度而变化，并且可能包括单次或多次剂量。应进一步理解，对于任何特定受试者，应根据个体需要和施用或监督组合物施用的人的专业判断随时间调整具体的剂量方案，并且本文所述的剂量范围仅是示例性的且不旨在限制要求保护的组合物的范围或实践。此外，本公开的组合物的给药方案可以基于多种因素，包括疾病类型、年龄、体重、性别、受试者的医学状况、状况的严重性、给药途径、和使用的特定抗体。因此，给药方案可以有很大差异，但可以使用标准方法常规确定。例如，可以根据药代动力学或药效学参数调整剂量，这些参数可能包括临床效应，如毒性效应和/或实验室值。因此，本公开内容包括由技术人员确定的受试者内剂量递增。确定合适的剂量和方案在相关领域中是众所周知的，并且一旦提供本文公开的教导，本领域技术人员将会理解。
对于施用于人类受试者，本公开的抗体或其抗原结合片段的总月剂量可以在每名受试者0.5-1200mg、每名受试者0.5-1100mg、每名受试者0.5-1000mg、0.5mg的范围内-900mg/受试者，0.5-800mg/受试者，0.5-700mg/受试者，0.5-600mg/受试者，0.5-500mg/受试者，0.5-400mg/受试者，0.5-300mg/受试者，0.5-每位受试者200毫克，每位受试者0.5-100毫克，每位受试者0.5-50毫克，每位受试者1-1200毫克，每位受试者1-1100毫克，每位受试者1-1000毫克，每位受试者1-900毫克，1-800mg/受试者，1-700mg/受试者，1-600mg/受试者，1-500mg/受试者，1-400mg/受试者，1-300mg/受试者，1-200mg/受试者，1-100mg每名受试者，或每名受试者1-50毫克，当然，取决于给药方式。例如，静脉内每月剂量可能需要约1-1000mg/受试者。在各种实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以约1-200mg/受试者、1-150mg/受试者或1-100mg/受试者施用。每月总剂量可以单次或分次给药，并且可以根据医生的判断落在本文给出的典型范围之外。
本公开的抗体或其抗原结合片段的治疗或预防有效量的示例性非限制性每日给药范围可以是0.001至100mg/kg、0.001至90mg/kg、0.001至80mg/kg,0.001至70mg/kg,0.001至60mg/kg,0.001至50mg/kg,0.001至40mg/kg,0.001至30mg/kg,0.001至20mg/kg,0.001至10mg/kg,0.001至5mg/kg、0.001至4mg/kg、0.001至3mg/kg、0.001至2mg/kg、0.001至1mg/kg、0.010至50mg/kg、0.010至40mg/kg、0.010至30mg/kg、0.010至20mg/kg、0.010至10mg/kg、0.010至5mg/kg、0.010至4mg/kg、0.010至3mg/kg、0.010至2mg/kg、0.010至1毫克/公斤、0.1至50毫克/公斤、0.1至40毫克/公斤、0.1至30毫克/公斤、0.1至20毫克/公斤、0.1至10毫克/公斤、0.1至5毫克/公斤、0.1至4毫克/公斤、0.1至3毫克/公斤、0.1至2毫克/公斤、0.1至1毫克/公斤、1至50毫克/公斤、1至40毫克/公斤、1至30毫克/公斤、1至20毫克/kg、1至10mg/kg、1至5mg/kg、1至4mg/kg、1至3mg/kg、1至2mg/kg或1至1mg/kg体重。需要注意的是，剂量值可能会随着要缓解的病症的类型和严重程度而变化。应进一步理解，对于任何特定受试者，应根据个体需要和施用或监督组合物施用的人的专业判断随时间调整具体的剂量方案，并且本文所述的剂量范围仅是示例性的且不旨在限制要求保护的组合物的范围或实践。
在各种实施方案中，施用的总剂量将达到例如约1至1000μg/ml、约1至750μg/ml、约1至500μg/ml、约1至250μg/ml，约10至1000μg/ml，约10至750μg/ml，约10至500μg/ml，约10至250μg/ml，约20至1000μg/ml，约20至750μg/ml、约20至500μg/ml、约20至250μg/ml、约30至1000μg/ml、约30至750μg/ml、约30至500μg/ml、约30至250μg/ml范围内的血浆抗体浓度。
本发明的药物组合物的毒性和治疗指数可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药物程序来确定，例如，用于确定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(剂量对50％的人群有治疗效果)。毒性剂量与治疗有效剂量的剂量比即为治疗指标，可用LD50/ED50比值表示。表现出大治疗指数的组合物通常是优选的。
在各种实施方案中，药物组合物的单次或多次给药取决于受试者需要和耐受的剂量和频率。在任何情况下，组合物应提供足够量的至少一种本文公开的抗体或其抗原结合片段以有效治疗受试者。该剂量可以一次给药，但可以定期应用，直到达到治疗结果或直到副作用需要停止治疗。
抗体或其抗原结合片段药物组合物的给药频率取决于治疗的性质和所治疗的特定疾病。受试者可以定期治疗，例如每周或每月，直到达到所需的治疗结果，或以负荷剂量治疗，然后定期接受维持剂量。示例性给药频率包括但不限于：每周一次，不间断；每周一次，每隔一周一次；每两周一次；每3周一次；弱每周一次无间断共2周，然后每月一次；每周一次无间断共3周，然后每月一次；每月一次；每隔一个月一次；每三个月一次；每四个月一次；每五个月一次；或每六个月一次，或每年一次。
联合疗法
如本文所用，术语“共同施用”、“共同施用”和“组合”旨在表示本公开的抗体或其抗原结合片段和一种或多种其他治疗剂，并且确实指并包括以下内容：将本公开的抗体或其抗原结合片段与治疗剂的此类组合同时给予需要治疗的受试者，当此类组分一起配制成单一剂型时基本上同时向所述对象释放所述成分；基本上同时向需要治疗的受试者施用本公开的抗体或其抗原结合片段和治疗剂的这种组合，当这些组分彼此分开配制成单独的剂型时，该剂型向所述受试者基本上同时释放，因此所述组分基本上同时释放到所述受试者；将本公开的抗体或其抗原结合片段和治疗剂的此类组合顺序给予需要治疗的受试者，当此类组分彼此分开配制成单独的剂型时，通过以下方式连续服用所述受试者在每次给药之间具有显着的时间间隔，因此所述组分在基本上不同的时间释放到所述受试者；当这些组分一起配制成以受控方式释放所述组分的单一剂型时，将本公开的抗体或其抗原结合片段和治疗剂的此类组合和治疗剂顺序施用至需要治疗的受试者因此它们在相同和/或不同时间同时、连续和/或重叠地释放到所述受试者，其中每个部分可以通过相同或不同途径施用。
在另一个方面，本发明涉及设计用于治疗受试者的癌症或传染病的联合疗法，包括向受试者施用治疗有效量的本发明的分离的抗体或抗原结合片段，和b)一种或多种选自免疫疗法、化学疗法、小分子激酶抑制剂靶向疗法、手术、放射疗法、疫苗接种方案和干细胞移植的额外疗法，其中联合疗法提供增加的肿瘤细胞杀伤，即，当共同施用时，分离的抗体或抗原结合片段与其他疗法之间存在协同作用。
在各种实施方案中，免疫疗法选自：使用针对共刺激或共抑制分子(免疫检查点)如PD-1、PD-L1、OX-40的激动、拮抗或阻断抗体进行的治疗，CD137、GITR、LAG3、TIM-3和VISTA；使用双特异性T细胞结合抗体
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如blinatumomab进行治疗：涉及施用生物反应调节剂如IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、GM-CSF和IFN-IFN的治疗-β和IFN-γ；使用治疗性疫苗(如sipuleucel-T)进行治疗；使用树突状细胞疫苗或肿瘤抗原肽疫苗进行治疗；使用嵌合抗原受体(CAR)-T细胞进行治疗；使用CAR-NK细胞进行治疗；使用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)进行治疗；使用过继转移的抗肿瘤T细胞(离体扩增和/或TCR转基因)进行治疗；使用TALL-104细胞治疗；以及使用免疫刺激剂如Toll样受体(TLR)激动剂CpG和咪喹莫特进行治疗。
许多常规化合物已被证明具有抗肿瘤活性。这些化合物已被用作化学疗法中的药剂以缩小实体瘤、防止转移和进一步生长，或减少白血病或骨髓恶性肿瘤中恶性T细胞的数量。尽管化学疗法在治疗各种类型的恶性肿瘤方面是有效的，但许多抗肿瘤化合物会引起不良的副作用。已经显示当两种或更多种不同的治疗组合时，这些治疗可以协同作用并允许减少每种治疗的剂量，从而减少每种化合物在较高剂量下产生的有害副作用。在其他情况下，对治疗无效的恶性肿瘤可能会对两种或多种不同治疗的联合治疗产生反应
当本文公开的抗体或抗原结合片段与另一种常规抗肿瘤剂联合给药时，无论是同时还是依次给药，这种抗体或抗原结合片段可以增强抗肿瘤剂的治疗效果或克服细胞对这样的抗肿瘤剂的抗药性。这允许减少抗肿瘤剂的剂量，从而减少不希望的副作用，或恢复抗肿瘤剂在抗性T细胞中的有效性。
可用于联合抗肿瘤治疗的药物化合物包括，仅用于说明：氨基谷氨酰胺、安吖啶、阿那曲唑、天冬酰胺酶、bcg、比卡鲁胺、博来霉素、布舍瑞林、白消安、喜树碱、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸盐、秋水仙碱、环磷酰胺、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素、柔红霉素、二烯雌酚、己烯雌酚、多西紫杉醇、多柔比星、表柔比星、雌二醇、雌莫司汀、依托泊苷、依西美坦、非格司亭、氟达拉滨、氟氢可的松、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、氟他胺、戈舍瑞林、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、干扰素、伊立替康、铁替康、来曲唑、亚叶酸、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、甲氯乙胺、甲羟孕酮、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼康唑、奥曲肽、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸盐、戊糖他汀类药物、普卡霉素、porfimer、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔单抗、链脲佐菌素、苏拉明、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睾酮、硫鸟嘌呤、噻替哌、二氯二茂钛、拓扑替康、曲妥珠单抗、维甲酸、长春碱、长春新碱、长春瑞滨。
这些化学治疗性抗肿瘤化合物可以根据它们的作用机制分类为例如以下组：抗代谢物/抗癌剂，例如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、卡培他滨、吉西他滨和阿糖胞苷)和嘌呤类似物、叶酸拮抗剂和相关抑制剂(巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨))；抗增殖/抗有丝分裂剂，包括天然产物，如长春花生物碱(长春碱、长春新碱和长春瑞滨)，微管破坏剂，如紫杉烷(紫杉醇、多西他赛)、长春新碱、长春花素、诺考达唑、埃坡霉素和纳维滨、表鬼臼毒素(依托泊苷、替尼泊苷)、DNA损伤药物(放线菌素、安吖啶、蒽环类、博来霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、环磷酰胺、胞嘧啶、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、六甲基三聚氰胺奥沙利铂、异磷酰胺、美法仑、甲基氯卡他明、丝裂霉素、米托蒽醌、普罗霉素、硝基脲紫杉醇、泰索帝、替尼泊苷、三亚乙基硫代磷酰胺和依托泊苷(VP16))；抗生素如更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、伊达比星、蒽环类、米托蒽醌、博来霉素、普卡霉素(光神霉素)和丝裂霉素；酶(L-天冬酰胺酶，它系统地代谢L-天冬酰胺并剥夺没有能力合成自己的天冬酰胺的细胞)；抗血小板药物；抗增殖/抗有丝分裂烷化剂，例如氮芥(甲氯乙胺、环磷酰胺和类似物、美法仑、苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(六甲基三聚氰胺和噻替哌)、烷基磺酸盐-白消安、亚硝基脲(卡莫司汀(BCNU)和类似物、链脲佐菌素)、三氮杂萘-达卡巴嗪(DTIC)；抗增殖/抗有丝分裂抗代谢物，例如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂配位络合物(顺铂、卡铂)、丙卡巴肼、羟基脲、米托坦、氨基谷氨酰胺；激素、激素类似物(雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡鲁胺、尼鲁米特)和芳香酶抑制剂(来曲唑、阿那曲唑)；抗凝剂(肝素、合成肝素盐和其他凝血酶抑制剂)；纤维蛋白溶解剂(如组织纤溶酶原激活剂、链激酶和尿激酶)、阿司匹林、双嘧达莫、噻氯匹定、氯吡格雷、阿昔单抗；抗迁移剂；抗分泌剂(breveldin)；免疫抑制剂(环孢素、他克莫司(FK-506)、西罗莫司(雷帕霉素)、硫唑嘌呤、霉酚酸酯)；抗血管生成化合物(TNP-470、染料木黄酮)和生长因子抑制剂(血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；血管紧张素受体阻滞剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗)；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维甲酸)；mTOR抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(多柔比星(阿霉素)、安吖啶、喜树碱、柔红霉素、放线菌素、依尼泊苷、表柔比星、依托泊苷、伊达比星和米托蒽醌、拓扑替康、伊立替康)、皮质类固醇(可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、强的松和泼尼松龙)；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导剂和半胱天冬酶激活剂；和染色质破坏物。
在各种实施方案中，化学疗法包含选自以下的化学治疗剂：柔红霉素、放线菌素、多柔比星、博来霉素、丝裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、苯达莫司汀、阿糖胞苷(CA),5-氟尿嘧啶(5-FU),氟尿嘧啶(5-FUdR),甲氨蝶呤(MTX),秋水仙碱,长春新碱,长春碱,依托泊苷,替尼泊苷,顺铂,卡铂,奥沙利铂,喷司他丁,克拉屈滨,阿糖胞苷,吉西他滨,普拉曲沙,米托蒽醌,己烯雌酚(DES)、氟拉达滨、异环磷酰胺、羟基脲紫杉烷(例如紫杉醇和多西紫杉醇)和/或蒽环类抗生素，以及药剂组合，例如但不限于DA-EPOCH、CHOP、CVP或FOLFOX。
在各种实施方案中，小分子激酶抑制剂靶向治疗包含选自布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)抑制剂、SYK抑制剂(例如，entospletinib)、AKT的小分子激酶抑制剂抑制剂、mTOR抑制剂、Src抑制剂、JAK/STAT抑制剂、Ras/Raf/MEK/ERK抑制剂和Aurora抑制剂(参见D'Cruz等人，Expert Opin Pharmacother,14(6):707-21,2013)。
在各种实施方案中，联合疗法包括同时施用抗体或其抗原结合片段和一种或多种另外的疗法。在各种实施方案中，抗体或其抗原结合片段组合物和一种或多种额外疗法依次施用，即抗体或其抗原结合片段组合物在一种或多种额外疗法施用之前或之后施用.
在各种实施方案中，抗体或其抗原结合片段组合物和一种或多种额外疗法的施用是同时的，即抗体或其抗原结合片段组合物和一种或多种额外疗法的施用期彼此重叠。
在各种实施方案中，抗体或其抗原结合片段组合物和一种或多种额外疗法的施用是非同时的。例如，在各种实施方案中，在施用一种或多种另外的疗法之前终止施用抗体或其抗原结合片段组合物。在各种实施方案中，在施用抗体或其抗原结合片段组合物之前终止一种或多种额外疗法的施用。
当本文所公开的抗体或其抗原结合片段与一种或多种额外疗法联合施用时，伴随或相继地，此类抗体或其抗原结合片段可增强一种或多种额外疗法的治疗效果或克服细胞对一种或多种附加疗法产生抗药性。这允许减少一种或多种附加疗法的剂量或持续时间，从而减少不希望的副作用，或恢复一种或多种附加疗法的有效性。
诊断用途
另一方面，本发明提供了一种用于在体外或体内检测样品中人Trop-2抗原的存在的方法，例如用于诊断人Trop-2相关疾病的方法。在一些方法中，这通过将待测样品连同对照样品与本发明的人序列抗体或人单克隆抗体或其抗原结合部分(或双特异性或多特异性分子)接触来实现，在允许抗体和人Trop-2之间形成复合物的条件下。然后在两个样品中检测(例如，使用ELISA)复合物形成，并且样品之间复合物形成的具有任何统计学显着的差异表明测试样品中存在人Trop-2抗原。
在各种实施方案中，提供了用于在受试者中检测癌症或确认癌症诊断的方法。该方法包括将来自受试者的生物样品与本发明的分离的抗体或其抗原结合片段接触并检测分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段与样品的结合。与分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段与对照样品的结合相比，分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段与样品的结合增加检测受试者中的癌症或证实受试者癌症的诊断。对照可以是来自已知未患有癌症的受试者的样品或标准值。样品可以是任何样品，包括但不限于来自活组织检查、尸检和病理标本的组织。生物样品还包括组织切片，例如，用于组织学目的的冷冻切片。生物样品还包括体液，例如血液、血清、血浆、痰液和脊髓液。
在一个实施方案中，提供了一种用于检测生物样品例如血液样品中的Trop-2的试剂盒。用于检测多肽的试剂盒通常包含特异性结合Trop-2的人抗体，例如本文公开的任何抗体。在一些实施方案中，试剂盒中包括抗体片段，例如Fv片段。对于体内用途，抗体可以是scFv片段。在另一个实施例中，抗体被标记(例如，用荧光、放射性或酶标记)。
在一个实施方案中，试剂盒包括说明使用特异性结合Trop-2的抗体的方法的说明材料。教学材料可以以电子形式(例如计算机软盘或光盘)编写，也可以是可视的(例如视频文件)。套件还可以包括附加组件，以促进套件设计的特定应用。因此，例如，该试剂盒可以另外包含检测标记的工具(例如用于酶标记的酶底物、用于检测荧光标记的过滤器组、合适的第二标记例如第二抗体等)。试剂盒可以另外包括缓冲液和其他常规用于实施特定方法的试剂。这样的试剂盒和适当的内容是本领域技术人员熟知的。
在一个实施方案中，诊断试剂盒包括免疫测定。尽管免疫测定的细节可能随所采用的特定形式而变化，但在生物样品中检测Trop-2的方法通常包括将生物样品与在免疫反应条件下与Trop-2特异性反应的抗体接触的步骤.使抗体在免疫反应条件下特异性结合形成免疫复合物，直接或间接检测免疫复合物(结合抗体)的存在。
在各种实施方案中，抗体或抗原结合片段可以被标记或未标记以用于诊断目的。通常，诊断测定需要检测由抗体与Trop-2结合产生的复合物的形成。可以直接标记抗体。可以使用多种标记，包括但不限于放射性核素、荧光剂、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂和配体(例如，生物素、半抗原)。许多合适的免疫测定是本领域技术人员已知的(参见，例如，美国专利号3,817,827；3,850,752；3,901,654；和4,098,876)。当未标记时，抗体可用于测定，例如凝集测定。未标记的抗体也可以与另一种(一种或多种)可用于检测抗体的合适试剂组合使用，例如与第一抗体(例如抗独特型抗体或对未标记的免疫球蛋白特异的其他抗体)或其他合适的试剂(例如，标记的蛋白A)起反应的标记的抗体(例如，一个第二抗体)。
本文提供的抗体或抗原结合片段还可用于检测哺乳动物对某些疾病的易感性的方法。为了说明，该方法可用于检测哺乳动物对基于细胞上存在的Trop-2的量和/或哺乳动物中Trop-2阳性细胞的数量而进展的疾病的易感性。在一个实施例中，本申请提供了一种检测哺乳动物对肿瘤的易感性的方法。在该实施方案中，待测试样品与结合Trop-2或其部分的抗体在适合与所述抗体结合的条件下接触，其中所述样品包含在正常个体中表达Trop-2的细胞。检测抗体的结合和/或结合量，这表明个体对肿瘤的易感性，其中较高水平的受体与个体对肿瘤的易感性增加相关。
在各种实施方案中，抗体或抗原结合片段与能够被检测的标记物连接(例如，标记物可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。活性部分可以是放射性试剂，例如：放射性重金属如铁螯合物、钆或锰的放射性螯合物、氧、氮、铁、碳或镓的正电子发射体，43K、52Fe、57Co、67Cu、67Ga、68Ga、123I、125I、131I、132I或99Tc。附着在这样的部分上的结合剂可以用作显像剂，并以对哺乳动物如人的诊断用途有效的量给药，然后检测显像剂的定位和积累。显像剂的定位和积累可以通过放射闪烁照相术、核磁共振成像、计算机断层扫描或正电子发射断层扫描来检测。
使用针对Trop-2的抗体或抗原结合片段的免疫闪烁扫描可用于检测和/或诊断癌症和脉管系统。例如，针对用99锝、111铟或125碘标记的Trop-2标记的单克隆抗体可有效用于此类成像。正如熟练技术人员显而易见的，待施用的放射性同位素的量取决于放射性同位素。本领域普通技术人员可以根据用作活性部分的给定放射性核素的比活度和能量容易地制定待施用的显像剂的量。通常，每剂显像剂施用0.1-100毫居里，或1-10毫居里，或2-5毫居里。就这样所公开的组合物可用作显像剂，包括一个0.1-100毫居里的与放射性部分偶联的靶向部分，在一些实施例中为1-10毫居里，在一些实施例中为2-5毫居里，在一些实施例中为1-5毫居里。
免疫偶联物
本申请进一步提供了包含直接或间接偶联(或连接)至效应分子的本发明的抗体或其抗原结合片段的免疫偶联物。在这方面，术语“偶联的”或“连接的”是指将两个多肽制成一个连续的多肽分子。连接可以通过化学或重组方式进行。在一个实施方案中，连接是化学的，其中抗体部分和效应分子之间的反应产生了在两个分子之间形成的共价键以形成一个分子。肽连接子(短肽序列)可以任选地包含在抗体和效应分子之间。在各种实施方案中，抗体或抗原结合片段与效应分子连接。在其他实施方案中，与效应分子结合的抗体或抗原结合片段进一步与脂质、蛋白质或肽结合以增加其在体内的半衰期。因此，在各种实施方案中，本公开的抗体可用于递送多种效应分子。
效应分子可以是可检测标记、免疫毒素、细胞因子、趋化因子、治疗剂或化疗剂。
免疫毒素的特异非限制性实例包括但不限于相思豆毒蛋白、蓖麻毒素、假单胞菌外毒素(PE，例如PE35、PE37、PE38和PE40)、白喉毒素(DT)、肉毒杆菌毒素、胆汁毒素或其修饰的毒素，或直接或间接抑制细胞生长或杀死细胞的其他毒剂。
“细胞因子”是由一个细胞群释放的一类蛋白质或肽，它们作为细胞间介质作用于另一个细胞。细胞因子可以作为免疫调节剂。细胞因子的例子包括淋巴因子、单核因子、生长因子和传统的多肽激素。因此，实施方案可以利用干扰素(例如，IFN-α、IFN-β和IFN-γ)；肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)成员；人类生长激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素前体；促卵泡激素(FSH)；促甲状腺激素(TSH)；黄体生成素(LH)；肝生长因子；前列腺素，成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素，OB蛋白；肿瘤坏死因子-α；肿瘤坏死因子-β；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，例如NGF-β。血小板生长因子；转化生长因子-α；转化生长因子-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；集落刺激因子(CSF)，例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL-1至IL-21)、试剂盒配体或FLT-3、血管抑制素、血小板反应素或内皮抑素。这些细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物活性等效物。
趋化因子也可以与本文公开的抗体偶联。趋化因子是小(约4至约14kDa)、可诱导和分泌的促炎细胞因子的超家族，主要作为特定白细胞亚型的化学引诱剂和激活剂。趋化因子的产生是由炎性细胞因子、生长因子和致病刺激诱导的。趋化因子蛋白根据保守的氨基酸序列基序分为亚家族(α、β和δ)，并根据前两个与氨基末端相邻的半胱氨酸的位置分为四个高度保守的组——CXC、CC、C和CX3C。迄今为止，已发现50多种趋化因子，其中至少有18种人类七跨膜结构域(7TM)趋化因子受体。使用的趋化因子包括但不限于RANTES、MCAF、MCP-1和fractalkine。
治疗剂可以是化疗剂。本领域技术人员可以容易地识别使用的化学治疗剂(例如，参见Slapak和Kufe，Princes of Cancer Therapy，第86章，Harrison的内科医学原理，第14版；Perry等人，Chemotherapy，第17章，Abeloff,Clinical Oncology第2版
Figure BDA0003968927430000671
.2000Churchill Livingstone,Inc；Baltzer L.,Berkery R.(eds):Oncology PocketGuide to Chemotherapy,第2版St.Louis,Mosby-Year Book,1995；Fischer DS,Knobf MF,Durivage HJ(eds):The Cancer Chemotherapy Handbook,4th ed.St.Louis,Mosby-YearBook,1993)。用于制备免疫偶联物的有用化学治疗剂包括奥瑞他汀、多拉他汀、MMAE、MMAF、AFP、DM1、AEB、多柔比星、柔红霉素、甲氨蝶呤、美法仑、苯丁酸氮芥、长春花生物碱、5-氟尿苷、丝裂霉素-C、紫杉醇、L-天冬酰胺酶、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、羟基脲、阿糖胞苷、环磷酰胺、异环磷酰胺、亚硝基脲、顺铂、卡铂、丝裂霉素、达卡巴嗪、丙卡巴肼、托泊替康、氮芥、环磷酰胺、依托泊苷、BCNU、伊立替康、喜树碱、博来霉素、伊达比星、放线菌素、普卡霉素、米托蒽醌、天冬酰胺、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、紫杉醇和多西他赛及其盐、溶剂和衍生物。在各种实施方案中，化学治疗剂是auristatin E(在本领域中也称为dolastatin-10)或其衍生物以及其药学盐或溶剂化物。典型的auristatin衍生物包括DM1、AEB、AEVB、AFP、MMAF和MMAE。auristatin E及其衍生物以及接头的合成和结构描述于例如美国专利申请公开号20030083263；美国专利申请公开号20050238629；和美国专利第6,884,869号(每一个都通过引用整体并入本文)。在各种实施方案中，治疗剂是auristatin或auristatin衍生物。在不同的实施方案中，auristatin衍生物是dovaline-valine-dolaisoleunine-dolaproine-苯丙氨酸(MMAF)或monomethyauristatin E(MMAE)。在各种实施方案中，治疗剂是类美登木素或美登醇类似物。在各种实施例中，类美登素是DM1。
可以使用本领域技术人员已知的任何数量的手段将效应分子连接至本发明的抗体或抗原结合片段。可以使用共价和非共价连接方式。将效应分子连接到抗体的过程根据效应分子的化学结构而变化。多肽通常含有多种功能团；例如羧酸(COOH)、游离胺(-NH 2)或巯基(-SH)基团，它们可用于与抗体上的合适功能团反应以导致效应分子结合。或者，衍生抗体以暴露或连接额外的反应性官能团。衍生化可以涉及连接许多接头分子中的任何一个，例如可从伊利诺伊州罗克福德的Pierce Chemical Company获得的那些。连接子可以是用于将抗体连接到效应分子的任何分子。连接子能够与抗体和效应分子都形成共价键。合适的连接子是本领域技术人员熟知的并且包括但不限于直链或支链碳连接子、杂环碳连接子或肽连接子。在抗体和效应分子是多肽的情况下，连接子可以通过其侧基(例如通过与半胱氨酸的二硫键)连接到组成氨基酸或连接到末端氨基酸的α碳氨基和羧基。
在某些情况下，当免疫偶联物到达其靶位点时，需要将效应分子从抗体中释放出来。因此，在这些情况下，免疫偶联物将包含在靶位点附近可切割的键。可以通过酶活性或免疫偶联物在靶细胞内部或靶位点附近所经受的条件促进连接子的切割以从抗体中释放效应分子。
用于将抗体与效应分子偶联的程序先前已经描述并且在本领域技术人员的范围内。例如，用于制备免疫毒素的酶活性多肽的程序描述于WO84/03508和WO85/03508中，出于其具体教导的目的，将其通过引用并入本文。Shih et al.,Int.中描述了其他技术。J.Cancer 41:832-839(1988)；Shih等人，诠释。J.Cancer 46:1101-1106(1990)；Shih等人，美国专利。第5,057,313号；施癌症研究中心。51:4192，国际公布WO 02/088172；美国专利。第6,884,869号；国际专利公开WO 2005/081711；美国公开申请2003-0130189A；和美国专利申请No.20080305044，为了教导这种技术的目的，每一个都通过引用并入本文。
本发明的免疫缀合物保留抗体或抗原结合片段的免疫反应性，例如，抗体或抗原结合片段在偶联后与偶联前具有大致相同或仅略微降低的结合抗原的能力。如本文所用，免疫偶联物也称为抗体药物偶联物(ADC)。根据本发明的一个实施方案的抗体药物偶联物(ADC)具有下式：Ab-(L-D)n，其中Ab是Trop-2结合抗体，L是连接子，D是药物部分，并且n是2、4、6或7中的整数。
在另一方面，提供了分离的免疫偶联物或融合蛋白，其包含偶联、连接(或稳定结合)效应分子的抗体或抗原结合片段。在各种实施方案中，效应分子是免疫毒素、细胞因子、趋化因子、治疗剂或化疗剂。
双特异性分子
在另一个方面，本发明的特征在于包含本发明的抗Trop-2抗体或其抗原结合片段的双特异性分子。本发明的抗体或其抗原结合片段可以衍生或连接至另一种功能分子，例如另一种肽或蛋白质(例如，另一种抗体或受体的配体)以产生结合至少两个不同的结合位点或靶分子。本发明的抗体实际上可以衍生或连接到多于一种的其他功能性分子以产生结合多于两个不同结合位点和/或靶分子的多特异性分子；这样的多特异性分子也意在被本文所用的术语“双特异性分子”所涵盖。为了产生本发明的双特异性分子，本发明的抗体可以功能性连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式)到一个或多个其他结合分子，例如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，从而产生双特异性分子。在各种实施方案中，本发明包括能够结合表达FcγR或FcαR的效应细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))和表达Trop-2的靶细胞的双特异性分子。在此类实施方案中，双特异性分子靶向Trop-2表达细胞并触发Fc受体介导的效应细胞活性，例如Trop-2表达细胞的吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放、或产生超氧阴离子。制备本发明的双特异性分子的方法是本领域众所周知的。
在各种实施方案中，与抗Trop-2抗体连接的另一种功能性分子，例如受体的另一种抗体或配体，可以选自：针对信号分子的激动性、拮抗性或阻断性抗体，例如如Her-2、Her-3、EGFR、IGF-R、c-Met、EphA2、EphB2和MUC16；对共刺激或共抑制分子(免疫检查点)如PD-1、PD-L1、OX-40、CS137、GITR、LAG3、TIM-3和VISTA的激动、拮抗或阻断抗体；在T细胞上发现的CD3。
多核苷酸和抗体表达
本申请进一步提供了包含编码抗Trop-2抗体或其抗原结合片段(例如本文所述的任何抗Trop-2抗体或其抗原结合片段)的核苷酸序列的多核苷酸。
在一些实施方案中，本申请提供编码任何SEQ ID Nos：15-18和23-56的多核苷酸。
在一些实施方案中，本申请提供了一种多核苷酸，其包含在SEQ ID Nos：19-22中的任一个中列出的核酸序列。
由于遗传密码的简并性，各种核酸序列编码每个抗体氨基酸序列。本申请进一步提供了在例如本文定义的严格或较低严格杂交条件下与编码结合人Trop-2的抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸。
严格的杂交条件包括但不限于，在约45℃的6xSSC中与过滤器结合的DNA杂交，然后在约50-65℃的0.2xSSC/0.1％SDS中进行一次或多次洗涤，高度严格的条件如在约45℃在6xSSC中与过滤器结合的DNA杂交，然后在约60℃或任何其他严格的杂交条件(参见，例如，参见,Ausubel,FM et al.,eds.1989Current Protocols in Molecular Biology,vol.1,Green Publishing Associates,Inc.和John Wiley and Sons,Inc.,NY，第6.3.1至6.3.6和2.10.3页)。
可以通过本领域已知的任何方法获得多核苷酸，并确定多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果抗体的核苷酸序列是已知的，则编码抗体的多核苷酸可以由化学合成的寡核苷酸组装而成(例如，如Kutmeier等人，BioTechniques 17:242(1994)中所述)，简而言之，这涉及合成包含部分编码抗体的序列的重叠寡核苷酸，这些寡核苷酸的退火和连接，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。在一个实施方案中，使用的密码子包括人或小鼠的典型密码子(参见例如，Nakamura,Y.，Nucleic Acids Res.28:292(2000))。
编码抗体的多核苷酸也可以由来自合适来源的核酸产生。如果含有编码特定抗体的核酸的克隆不可用，但抗体分子的序列是已知的，则编码免疫球蛋白的核酸可以化学合成或从合适的来源(例如，抗体cDNA文库，或cDNA文库，或核酸，优选polyA+RNA，分离自表达抗体的任何组织或细胞，例如选择表达抗体的杂交瘤细胞)通过PCR扩增使用可与3'和5'杂交的合成引物或通过使用对特定基因序列特异的寡核苷酸探针进行克隆，以鉴定例如来自编码抗体的cDNA文库的cDNA克隆。然后可以使用本领域熟知的任何方法将通过PCR产生的扩增核酸克隆到可复制的克隆载体中。
本发明还涉及表达本发明的Trop-2多肽和/或抗Trop-2抗体的宿主细胞。本领域已知的多种宿主表达系统可用于表达本发明的抗体，包括原核(细菌)和真核表达系统(例如酵母、杆状病毒、植物、哺乳动物和其他动物细胞、转基因动物和杂交瘤细胞)，以及噬菌体展示表达系统。
本发明的抗体可以通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链和重链基因来制备。为了重组表达抗体，宿主细胞用一种或多种重组表达载体转化、转导、感染或类同，该一个或多个重组表达载体携带编码抗体的免疫球蛋白轻链和/或重链的DNA片段，使得轻链和/或重链被在宿主细胞中表达。重链和轻链可以独立地从不同启动子表达并可操作地连接在一个载体中，或者，重链和轻链可以独立地从不同启动子表达并可操作地连接在两个载体中，一个表达重链，一个表达轻链。任选地，重链和轻链可以在不同的宿主细胞中表达。
此外，重组表达载体可以编码促进抗体轻链和/或重链从宿主细胞分泌的信号肽。可以将抗体轻链和/或重链基因克隆到载体中，使得信号肽在读码框内可操作地连接到抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽。优选地，重组抗体被分泌到培养宿主细胞的培养基中，从该培养基中可以回收或纯化抗体。
通过将编码HCVR的DNA可操作地连接到另一个编码重链恒定区的DNA分子上，可以将编码HCVR的分离的DNA转化为全长重链基因。人类以及其他哺乳动物重链恒定区基因的序列是本领域已知的。包括这些区域的DNA片段可以例如通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是任何类型(例如，IgG、IgA、IgE、IgM或IgD)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)或亚类恒定区及其任何同种异型变体如Kabat(supra)中所述。
通过将编码LCVR的DNA与另一个编码轻链恒定区的DNA分子可操作地连接，可以将编码LCVR区的分离的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人类以及其他哺乳动物轻链恒定区基因的序列是本领域已知的。可以通过标准PCR扩增获得包含这些区域的DNA片段。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
除了抗体重链和/或轻链基因之外，本发明的重组表达载体携带调控序列，所述调控序列控制抗体链基因在宿主细胞中的表达。根据需要，术语“调控序列”意在包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多聚腺苷酸化信号)，其控制抗体链基因的转录或翻译。表达载体的设计，包括调节序列的选择，可能取决于诸如要转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等因素。哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括指导哺乳动物细胞中蛋白质高水平表达的病毒元件，例如源自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒)的启动子和/或增强子主要晚期启动子(AdMLP))和/或多瘤病毒。
此外，本发明的重组表达载体可以携带额外的序列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起点)和一种或多种选择标记基因。选择标记基因有助于选择已引入载体的宿主细胞。例如，通常选择标记基因赋予已引入载体的宿主细胞对药物如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。优选的可选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(dhfr)基因(用于具有甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr-负宿主细胞)、neo基因(用于G418选择)和GS阴性细胞系中的谷氨酰胺合成酶(GS)(例如NSO)用于选择/放大。
对于轻链和/或重链的表达，编码重链和/或轻链的表达载体通过标准技术例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染、转导、感染和类似被引入到一个宿主细胞内。尽管理论上可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但优选真核细胞，最优选哺乳动物宿主细胞，因为这样的细胞更可能组装和分泌适当折叠且具有免疫活性的抗体。用于表达本发明的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)[包括dhfr减去CHO细胞，如Urlaub和Chasin，Proc.国家石油公司。学院派。科学。USA 77:4216-20,1980，与DHFR选择标记一起使用，例如在Kaufman和Sharp,J.Mol.生物学。159:601-21,1982]，NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2/0细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞在本领域已知的适当条件下生长的培养基中培养一段足以使抗体在宿主细胞中表达或更优选抗体分泌到宿主细胞中的时间来产生抗体。。抗体可以使用标准纯化方法从宿主细胞和/或培养基中回收。
本发明提供了包含本发明的核酸分子的宿主细胞。优选地，本发明的宿主细胞包含一种或多种包含本发明的核酸分子的载体或构建体。例如，本发明的宿主细胞是其中已引入本发明的载体的细胞，所述载体包含编码本发明抗体的LCVR的多核苷酸和/或编码本发明的HCVR的多核苷酸。本发明还提供了一种宿主细胞，其中引入了本发明的两种载体；一种包含编码本发明抗体的LCVR的多核苷酸和一种包含编码存在于本发明抗体中的HCVR的多核苷酸并且各自可操作地连接到增强子/启动子调节元件(例如，衍生自SV40、CMV、腺病毒和诸如CMV增强子/AdMLP启动子调控元件或SV40增强子/AdMLP启动子调控元件)来驱动基因的高水平转录。
一旦表达，本发明的完整抗体、单独的轻链和重链或其他免疫球蛋白形式可以根据本领域的标准程序进行纯化，包括硫酸铵沉淀、离子交换、亲和(例如蛋白A)、反相、疏水相互作用柱层析、羟基磷灰石层析、凝胶电泳等。例如，Feng L1、Joe X.Zhou、XiaomingYang、Tim Tressel和Brian Lee在题为“Current Therapeutic Antibody Production andProcess Optimization”(BioProcessing Journal,September/2005年10月)(出于教导治疗性抗体纯化的目的，通过引用将其全部并入)。此外，用于从重组表达的抗体制剂中去除病毒的标准技术也是本领域已知的(参见例如Gerd Kern和Mani Krishnan，“ViralRemoval by Filtration:Points to Consider”(Biopharm International，2006年10月))。已知过滤从治疗性抗体制剂中去除病毒的有效性至少部分取决于待过滤溶液中蛋白质和/或抗体的浓度。本发明的抗体纯化方法可以包括过滤步骤以从一种或多种色谱操作的主流中去除病毒。优选地，在通过药物级纳米过滤器过滤以去除病毒之前，稀释或浓缩含有本发明抗体的色谱主流以产生约1g/L至约3g/L的总蛋白质和/或总抗体浓度.甚至更优选地，纳米过滤器是DV20纳米过滤器(例如，Pall Corporation；East Hills，NY)。对于药物用途，优选至少约90％、约92％、约94％或约96％同质性的基本上纯的免疫球蛋白，并且最优选约98至约99％或更高的同质性。一旦根据需要部分纯化或纯化至同质，无菌抗体随后可用于治疗，如本文所述。
鉴于上述讨论，本发明进一步涉及可通过包括培养宿主细胞的步骤的方法获得的抗体，所述宿主细胞包括但不限于哺乳动物、植物、细菌、转基因动物或转基因植物细胞，其具有被包含编码本发明抗体的核酸分子的多核苷酸或载体转化，从而表达核酸，并且任选地从宿主细胞培养基中回收抗体。
在某些方面，本申请提供了杂交瘤细胞系，以及由这些杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体。所公开的细胞系具有除了用于生产单克隆抗体之外的用途。例如，细胞系可以与其他细胞(例如适当药物标记的人骨髓瘤、小鼠骨髓瘤、人-小鼠异种骨髓瘤或人淋巴母细胞)融合以产生额外的杂交瘤，从而提供编码基因的转移。单克隆抗体。此外，细胞系可以用作编码抗Trop-2免疫球蛋白链的核酸的来源，其可以被分离和表达(例如，在使用任何合适的技术转移到其他细胞时(参见例如Cabilly等人).，美国专利号4,816,567；Winter，美国专利号5,225,539))。例如，可以分离包含重排的抗Trop-2轻链或重链的克隆(例如，通过PCR)，或者可以从分离自细胞系的mRNA制备cDNA文库，以及编码抗Trop-2免疫球蛋白的cDNA克隆链可以被分离。因此，可以在多种宿主T细胞或在体外翻译系统中根据重组DNA技术获得和使用编码抗体或其部分的重链和/或轻链的核酸，以产生特异性免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其变体(例如，人源化免疫球蛋白)。例如，核酸，包括cDNA，或其编码变体例如人源化免疫球蛋白或免疫球蛋白链的衍生物，可以被置于合适的原核或真核载体(例如，表达载体)中，并通过合适的方法(例如，转化、转染、电穿孔、感染)，使得核酸与一种或多种表达控制元件可操作地连接(例如，在载体中或整合到宿主T细胞基因组中)。对于生产，宿主T细胞可以维持在适合表达的条件下(例如，在存在诱导剂、补充有适当盐、生长因子、抗生素、营养补充剂等的适当培养基的情况下)，由此产生编码的多肽。如果需要，可以回收和/或分离编码的蛋白质(例如，从宿主T细胞或培养基)。应当理解，生产方法包括在转基因动物的宿主T细胞中表达(参见例如WO 92/03918，GenPharm International，1992年3月19日出版)(通过引用整体并入)。
宿主细胞也可用于通过常规技术产生完整抗体的部分或片段，例如Fab片段或scFv分子。例如，可能需要用编码本发明抗体的轻链或重链的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可用于去除一些或所有编码轻链和重链中的一个或两个的DNA，这些DNA对于与人Trop-2的结合不是必需的。从这种截短的DNA分子表达的分子也包括在本发明的抗体中。
用于从细菌如大肠杆菌表达单链抗体和/或重折叠成合适的活性形式，包括单链抗体的方法已经被描述并且是众所周知的并且适用于本文公开的抗体(参见，例如，Buchner等人，Anal.Biochem.205:263-270,1992；Pluckthun,Biotechnology 9:545,1991；Huse等人,Science 246:1275,1989和Ward等人,Nature 341:544,1989,均以引用方式并入本文)。
大肠杆菌或其他细菌的功能性异源蛋白是从包涵体中分离出来的，需要使用强变性剂进行溶解，然后再进行重折叠。在增溶步骤期间，如本领域所熟知的，必须存在还原剂以分离二硫键。具有还原剂的示例性缓冲液是：0.1M Tris pH 8、6M胍、2mM EDTA、0.3M DTE(二硫赤藓糖醇)。二硫键的再氧化可以在还原和氧化形式的低分子量硫醇试剂存在下发生，如Saxena等，Biochemistry 9:5015-5021,1970中所述，通过引用并入本文，尤其是如Buchner所述等，同上。
复性通常通过将变性和还原的蛋白质稀释(例如，100倍)到重折叠缓冲液中来完成。示例性缓冲液是0.1M Tris、pH 8.0、0.5M L-精氨酸、8mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)和2mMEDTA。
作为对双链抗体纯化方案的修改，重链和轻链区域分别溶解和还原，然后在重折叠溶液中结合。当这两种蛋白质以摩尔比混合使得一种蛋白质相对于另一种蛋白质不超过5倍摩尔过量时，获得了示例性产率。在完成氧化还原改组后，可以将过量的氧化型谷胱甘肽或其他氧化性低分子量化合物添加到重折叠溶液中。
除了重组方法之外，本文公开的抗体、标记抗体及其抗原结合片段也可以使用标准肽合成来全部或部分构建。长度小于约50个氨基酸的多肽的固相合成可以通过将序列的C-末端氨基酸连接到不溶性支持物上，然后顺序添加序列中的剩余氨基酸来完成。Barany&Merrifield,The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology描述了固相合成技术。卷。2：肽合成中的特殊方法，A部分，第3-284页；Merrifield等人，J.Am.化学。社会党。85:2149-2156,1963和Stewart等人，Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，Pierce Chem.Co.,Rockford,IL.,1984。更长的蛋白质可以通过缩合更短片段的氨基和羧基末端来合成。通过激活羧基末端(例如通过使用偶联剂N，N'-二环己基碳二亚胺)形成肽键的方法是本领域公知的。
提供以下实施例以更全面地说明本发明，但不解释为限制其范围。
示例1
产生特异性靶向人类Trop-2的单克隆抗体
人Trop-2(NP_002344.2,Met 1-Ala 275)在C端具有6x His标签(称为Trop-2-ECD-6His融合蛋白),在人293细胞系中表达,通过纯化蛋白A柱并用作免疫原。Trop-2-ECD-6His蛋白的估计纯度在还原条件下基于SDS-PAGE高于95％，并通过银染显示。Trop-2-ECD-6His的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
雌性BaIb/c和C57BI/6小鼠在第0周用每只小鼠100μg Trop-2-ECD-6His腹膜内(ip)免疫3次(每两周一次)，在第2周和第4周用50μg Trop-2-ECD-6His免疫。在第一次免疫中，抗原与完全弗氏佐剂(Sigma,St.Louis,MO)以1:1的混合物形式注射，。第二和第三剂与不完全弗氏佐剂(Sigma,St.Louis,MO)以1:1的混合物形式注射。小鼠在第6周接受50μgTrop-2-ECD-6His的最后一次加强免疫，7天后收获脾细胞与骨髓瘤细胞系SP2/0融合。使用电融合方法获得杂交瘤细胞，然后筛选杂交瘤上清液的抗原结合、配体阻断、IgG分箱、参考抗体结合和FACS结合。最终从初始筛选中选择了10个mAb用于亚克隆(有限稀释法)和进一步评估。BD Cell MAb培养基用于在滚瓶中培养杂交瘤，以收集用于抗体生产的上清液。用蛋白A亲和层析纯化mAb。根据SDS-PAGE考马斯染色，估计的mAb纯度高于90％。hRS7是一种用于sacituzumab govitecan(IMMU-132)的抗Trop2抗体，这是一种经FDA批准用于治疗三阴性乳腺癌的抗体-药物偶联物。它被用作我们研究的基准抗体。20种纯化mAb与基准hRS7mAb的二次筛选包括：人Trop-2-ECD-6His结合测定(ELISA)、流式细胞术(FACS)分析的内化测定。
根据分析的累积结果，选择了2个mAb进行测序。按照
Figure BDA0003968927430000751
Reagent的技术手册从冷冻的杂交瘤细胞中提取总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳分析总RNA。按照PrimeScript TM1st Strand cDNA Synthesis Kit的技术手册，使用同种型特异性反义引物或通用引物将总RNA逆转录为cDNA。然后进行PCR以扩增抗体的可变区(重链和轻链)，然后将其分别克隆到标准克隆载体中并测序。
mAb#118-2-5包含SEQ ID NO:15所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:17所示的轻链可变区序列。mAb#125-1-5包含重链可变区SEQ ID NO:16所示的区域序列和SEQ ID NO:18所示的轻链可变区序列。
示例2
产生特异性靶向人Trop-2的嵌合IgG
使用mAb#118-2-5和#125-1-5的HCVR序列和LCVR序列，制备了两个鼠-人嵌合IgG1(下文称为“嵌合IgG1”)，其包含SEQ ID NO中列出的重链序列:47和49，以及SEQ ID NO:48和50中列出的轻链序列。由SEQ ID NO:19、20和SEQ ID NO:21、22编码的核酸被扩增并插入pTT5以进行表达全长IgG的质粒。重链和轻链表达质粒用于共转染100mL HEK293-6E细胞。使用蛋白A亲和力纯化分泌到培养基中的重组IgG。在非还原条件下，纯化的IgG在SDS-PAGE中迁移为～150kDa条带，在还原条件下迁移为～55kDa和～30kDA条带。嵌合IgG的纯度>90％。通过ELISA确定嵌合IgG与人Trop-2-ECD-6His融合蛋白(SEQ ID NO：2)之间的结合亲和力。将Trop-2-ECD-6His融合蛋白固定在微孔板孔的表面，并与嵌合IgG一起孵育。然后加入二级酶标记的山羊抗小鼠IgG-AP。洗涤后，加入底物测定微孔板结合酶的活性。显色并读取405nm的吸光度。
下面表3总结了抗原结合测定数据。如图所示，两种抗体(#118-2-5和#125-1-5)与Trop 2的结合亲和力高于基准参考抗体hRS7。参见表3中的OD值。数据表明嵌合IgG#118-2-5和#125-1-5mAb识别Trop-2-ECD-6His融合蛋白优于基准hRS7IgG。
表3
Figure BDA0003968927430000761
Figure BDA0003968927430000771
使用Trop-2阳性乳腺癌细胞系MDA-MB-468对嵌合IgG1#118-2-5和#125-1-5通过内化试验进一步评估。MDA-MB-468细胞以1x10 5细胞/孔接种。接下来，将嵌合或基准IgG添加到FACS缓冲液中的细胞中，并在4℃下孵育2小时。孵育后，洗涤细胞以去除未结合的抗体。然后将细胞在37℃下孵育。2小时后，将细胞解离并用荧光缀合的山羊抗小鼠IgG二抗在黑暗中在冰上染色30分钟，然后使用Beckman流式细胞术系统进行分析。通过Beckman流式细胞仪软件分析每个时间点的荧光强度和细胞结合百分比。使用以下公式确定内化到细胞中的嵌合IgG的量：％内化率＝100x(MFI 4℃–MFI 37℃)/MFI 4℃。
#118-2-5显示出比基准IgG更好的内化率。内化测定数据总结于下表4中。
表4
<u>克隆</u> <u>内吞率</u>
<u>#118-2-5</u> <u>40.44％</u>
<u>#125-1-5</u> <u>4.70％</u>
<u>Benchmark</u> <u>17.62％</u>
Internalization Rat
ELISA评估嵌合IgG#118-2-5和#125-1-5对来自不同物种的Trop-2抗原的交叉反应性。在该实验中，将1μg/mL人Trop-2ECD-6His、小鼠Trop-2-His、食蟹猴Trop-2-His、人EPCAM-His、和不相关的蛋白质以50μL/孔涂层在微量滴定板上并在4℃下过夜。将板在37℃洗涤和封闭1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤。将在PBS中适当稀释的纯化嵌合IgG添加到孔中，并在37℃下孵育1小时。洗涤后，使用HRP缀合的山羊抗人IgG Ab检测结合的抗体。读取OD450nm的显色和吸光度。包括非特异性模拟小鼠IgG和非特异性模拟人IgG作为阴性对照，而抗His抗体用作阳性对照。
#118-2-5、#125-1-5和基准IgG能够结合人和食蟹猴Trop-2抗原。他们不识别小鼠Trop-2、hEPCAM和非相关蛋白。交叉反应性结合测定数据总结在图1中。
示例3
特异性靶向人类Trop-2的人源化Abs的生成
使用CDR移植和回复突变方法制备源自mAb#118-2-5的人源化抗Trop-2mAb。简而言之，将鼠单克隆抗体的HCVR序列和LCVR序列针对人种系数据库进行BLAST搜索。为VH和VL选择的人类受体分别是GenBank 28401和28908。人类受体的CDR和HV环被它们的小鼠对应区(CDR移植)替换，这给出了移植抗体的序列。
选择被认为对结合活性很重要的移植抗体中CDR、框架区和VH-VL界面上的典型残基，用于和亲本抗体对应区替换。进行了Trop-2抗体Fv片段的同源建模。针对PDB_Antibody数据库对Trop-2序列进行BLAST搜索，以识别Fv片段的最佳模板，尤其是用于构建域接口。选择结构模板1I3G(氨苄青霉素单链fv的晶体结构，形式1)，同一性＝48.78％。总共有34个氨基酸，其中21个来自HCVR(K5Q、Q6E、A13K、Q16E、S17T、I20L、L48I、S68T、K71V、N73T、S76N、V78F、F79S、M82L、N83S、L85V、Q86T、T87A、D88A、G91A、M92V)和13个来自LCVR(Q3V、S9D、A15L、K18R、V19A、M21I、S22N、S49P、T68S、V84L、L89V、L109V、L111I)已确定更换。然后在HEK293细胞中表达回复突变的抗体并进行评估。根据评估，构建用于筛选先导人源化抗体的人源化重链被命名为#118-2-5HuA、#118-2-5HuB、#118-2-5HuC和#118-2-5HuD并分别包含SEQ ID NO:23-26所示的重链可变区序列，而所得人源化轻链命名为#118-2-5LuX和#118-2-5LuY并包含轻链可变区序列分别在SEQ ID NO：27-28中列出。
使用HA-HD和LX-LY的各种组合，八个人源化抗体在HEK 293-6E细胞中表达。简言之，编码SEQ ID NO：23(HuA)、24(HuB)、25(HuC)或26(HuD)的任何一种重链可变区氨基酸序列和任何一种轻链可变区的核酸SEQ ID NO：27(LuX)或28(LuY)的氨基酸序列被扩增并插入pTT5以制备全长IgG的表达质粒。重链和轻链表达质粒用于共转染100mL HEK293-6E细胞。使用蛋白A亲和力纯化分泌到培养基中的重组IgG。使用PD-10脱盐柱将纯化的抗体缓冲交换到PBS中。纯化的IgG在非还原条件下在SDS-PAGE中呈～150kDa条带迁移，100mL培养物的产量超过20mg/L。八个人源化Trop-2抗体的HC和LC可变区氨基酸序列总结在表5中：
表5
人源化IgG 重链(HC) 轻链(LC)
1(HuA/LuX) 序列号：23 序列号：27
2(HuB/LuX) 序列号：24 序列号：27
3(HuC/LuX) 序列号：25 序列号：27
4(HuD/LuX) 序列号：26 序列号：27
5(HuA/LuY) 序列号：23 序列号：28
6(HuB/LuY) 序列号：24 序列号：28
7(HuC/LuY) 序列号：25 序列号：28
8(HuD/LuY) 序列号：26 序列号：28
在实施例3中描述的抗原结合测定和内化测定中评估了八种人源化IgG。结果总结在表6和7中。
表6
Figure BDA0003968927430000801
表7
Figure BDA0003968927430000802
用在实施例3中描述的ELISA评估八种人源化IgG对来自不同物种的Trop-2抗原的交叉反应性。所有八种IgG和基准IgG都能够结合人和食蟹猴Trop-2抗原。他们不识别小鼠Trop-2、hEPCAM和非相关蛋白。交叉反应性结合测定数据总结在图2中。
根据结合亲和力和内化率的排名，选择IgG HuA/LuX进行第二轮人源化。在重链HuA Framework 3上进行了五个单独的突变以与轻链LuX配对。这5条新的重链被命名为#118-2-5Hu(A1)、#118-2-5Hu(A2)、#118-2-5Hu(A3)、#118-2-5Hu(A4)和#118-2-5Hu(A5)，并且分别包含在SEQ ID Nos：29-33中列出的可变区序列。在轻链LuX Framework 1/2/3上进行了六个单独的突变，以与重链HuA配对。这6条新的轻链被命名为#118-2-5Lu(X1)、#118-2-5Lu(X2)、#118-2-5Lu(X3)、#118-2-5Lu(X4))、#118-2-5Lu(X5)和#118-2-5Lu(X6)，并分别包含在SEQ ID Nos:34-39中列出的可变区序列。在实施例3中描述的抗原结合测定和内化测定中评估所得的11种人源化抗体。结果分别总结在表8和9中。
表8
抗体 EC50nM
HuD/LuY 0.06
HuA/LuX 0.39
HuA/Lu(X1) 0.26
HuA/Lu(X2) 0.36
HuA/Lu(X3) 0.45
HuA/Lu(X4) 0.12
HuA/Lu(X5) 0.31
HuA/Lu(X6) 0.26
Hu(A1)/LuX 0.28
Hu(A2)/LuX 0.37
Hu(A3)/LuX 0.31
Hu(A4)/LuX 0.39
Hu(A5)/LuX 0.34
Benchmark 0.09
表9
抗体 内吞率
HuD/LuY 57.34％
HuA/LuX 96.77％
HuA/Lu(X1) 48.93％
HuA/Lu(X2) 43.24％
HuA/Lu(X3) 13.22％
HuA/Lu(X4) 61.53％
HuA/Lu(X5) 19.66％
HuA/Lu(X6) 46.43％
Hu(A1)/LuX 56.01％
Hu(A2)/LuX 14.59％
Hu(A3)/LuX 55.81％
Hu(A4)/LuX 52.81％
Hu(A5)/LuX 11.48％
Benchmark 10.87％
对#118-2-5抗体进行第三轮人源化步骤，其中在重链可变区HuA框架3(命名为#118-2-5HuA(1，2)(SEQ ID N0：40)的X和Y点同时引入2个突变，然后与轻链可变区LuX4(SEQID N0：37)配对得到IgG HuA(1，2)/Lu(X4)(以下也称为“A1，2X4”)和从第二轮人源化产生的IgG Hu(A1)/Lu(X4)(包含SEQ ID NO：29/37)(下文也称为“A1X4”)被选择用于在HEK293细胞培养物中表达。重组IgGs分泌到培养基中并使用蛋白A亲和层析纯化。纯化的IgG在非还原条件下在SDS-PAGE中呈～150kDa条带迁移，100mL培养物的产量超过20mg/L。从SDS-PAGE评估，人源化IgG的纯度均在90％以上。
使用上述相同的CDR移植和回复突变方法制备衍生自mAb#125-1-5的人源化抗Trop-2mAb。构建用于筛选先导人源化抗体的人源化重链被命名为#125-1-5Hu1、#125-1-5Hu2、#125-1-5Hu3和#125-1-5Hu4并且包含分别在SEQ ID NO：41-44中列出的序列，而所得人源化轻链被命名为#125-1-5Lu5和#125-1-5Lu6并分别包含在SEQ ID NO：中列出的序列45-46。
人源化#125-1-5抗体在实施例3中描述的抗原结合测定和内化测定中进行了评估。结果分别总结在表10和11中。
表10
Figure BDA0003968927430000831
表11
Figure BDA0003968927430000841
基于结合亲和力和内化率的排名，IgG Hu3/Lu5被选为最终的人源化#125-1-5抗体。Hu3/Lu5的HC和LC序列总结在表12中：
表12
Figure BDA0003968927430000842
示例4
人源化Trop-2IgG的生产和表征
两种人源化Trop-2结合剂，包括A1、2X4、A1X4和基准hRS7，用于全长IgG表达、纯化和亲和力测量。
将编码A1，2X4和A1X4的DNA序列，包括前导序列，扩增并插入载体，制成全长IgG的表达质粒。重链和轻链表达质粒用于共转染293细胞(100ml细胞培养物)。的重组IgG分泌到培养基中并使用蛋白A亲和层析纯化。在非还原条件下，纯化的IgG在SDS-PAGE中迁移为约150kDa条带，在还原条件下迁移为约55kDa和约30kDa条带。
A1X4和A1,2X4的HC和LC序列总结在表13中：
表13
IgG 重链(HC) 轻链(LC)
A1X4 序列号：53 序列号：54
A1,2X4 序列号：51 序列号：52
示例5
人源化Trop-2IgG的结合亲和力
纯化的抗Trop-2IgG对人Trop-2蛋白的结合亲和力通过基于生物层干涉(BLI)技术的Octet系统测定。BLI是附着在光纤尖端的一层分子，它在检测器处产生干涉图案，结合的分子数量的任何变化都会导致图案发生测量偏移。Octet系统可以实时分析96孔微孔板中生物分子相互作用的亲和力和动力学。简而言之，将Trop-2抗原(人Trop-2ECD-6His)稀释至50、25、12.5、6.25和3.125nM的浓度，并加载到96孔微孔板中。将A1X4或A1,2X4抗体稀释并以8μg/ml的终浓度添加到指定的孔中。将板放入Octet系统并开始测定。使用OctetData Acquisition Software(fortebio data analysis 10.0)分析数据以计算结合速率常数Kon、解离速率常数Koff和解离常数Kd(Kd＝Koff/Kon)。
表14总结了来自Octet动力学测定的选定抗Trop-2抗体A1X4、A1、2X4和基准hRS7的Kd和Koff。结果表明，本发明的A1X4和A1，2X4抗体可以与人Trop-2抗原结合，与基准hRS7抗体相比，对huTrop-2具有中等的结合亲和力。
表14
IgG Kd(nM) Koff(1/S)
hRS7 0.78 2.44E-04
A1X4 2.11 5.69E-04
A1,2X4 4.09 8.44E-04
先前的研究表明，具有较慢Koff速率的高亲和力抗体更可能与靶细胞发生二价相互作用，用一个Fc占据2个抗原。相比之下，具有更快Koff速率的抗体可能会更快地解离每个结合臂，因此导致单价结合。单价结合可能反过来增加靶细胞调理作用并导致效应细胞募集和ADDC活性的改善。同样，另一项研究也表明具有高Kd亲和力的抗体具有快速内化和降解，这可能会限制其肿瘤穿透，而具有更快Koff的低亲和力抗体更有效地穿透肿瘤，因为抗体-抗原解离的速率高于抗原内化的速率。参见例如，Rudnick等人，Cancer Res。2011年3月15日；71(6)：2250-2259。鉴于A1X4和A1,2X4抗体具有相对较低的亲和力但比基准hRS7更快的解离率，这两种抗体，特别是A1,2X4可能比hRS7具有更有效的ADCC作用和更好的肿瘤穿透性。
例6
人源化Trop-2IgG的特异性
通过ELISA测试纯化的IgG与来自不同物种的Trop-2抗原的交叉反应性。在该实验中，将1μg/mL人Trop-2ECD-6His、小鼠Trop-2-His、食蟹猴Trop-2-His、人EPCAM-His、和不相关的蛋白质以50uL/孔涂在微量滴定板表面，在4℃孵育过夜。将板在37℃洗涤和封闭1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤。将在PBS中适当稀释的纯化抗Trop-2抗体添加到孔中，并在37℃下孵育1小时。洗涤后，使用HRP缀合的山羊抗人IgG抗体检测结合的抗体。读取OD450nm的显色和吸光度。包括非特异性人IgG1作为阴性对照，而hRS7用作阳性对照。
如图。图3显示来自实验的结果，其证明A1X4和A1，2X4抗体能够以与hRS7抗体(“BM”)相似的高效率结合人和食蟹猴Trop-2抗原。它不识别小鼠Trop-2、hEPCAM和非相关蛋白，而基准hRS7抗体显示出与小鼠Trop-2、hEPCAM和非相关蛋白的一些非特异性结合。
例7
Trop-2mAb的内化
受体介导的抗体内化可以提供细胞特异性药物递送。对于使用ADC的一些靶向治疗，内化是必要的。ADC内化的速度和程度对其有效性至关重要。先前的研究表明，在某些情况下，未偶联抗体及其相应的ADC以相同的速率内化，而在其他情况下，ADC内化受有效负载偶联的影响。
通过流式细胞术测量抗Trop-2抗体的内化和降解。在这项研究中，荧光标记的二抗用于检测内化后留下的一抗。
Trop-2阳性乳腺癌细胞MDA-MB-468以1×105细胞/孔接种。接下来，将hRS7、A1X4或A1,2X4抗体分别以400、1000、3000或10000ng/ml的浓度添加到FACS缓冲液中的细胞中，并在4℃下孵育30分钟。孵育后，将细胞用FACS缓冲液洗涤3次以去除未结合的抗体。然后将细胞在37℃和5％CO2下孵育以进行抗体内化。2小时后，细胞用胰蛋白酶解离，并在黑暗中在冰上用荧光缀合的山羊抗人IgG二抗染色30分钟，然后使用Beckman流式细胞术系统进行分析。通过Beckman流式细胞仪软件分析每个时间点的荧光强度和细胞结合百分比。使用以下公式确定在每个浓度下内化到细胞中的抗Trop-2抗体的量：％内化率＝100x(MFI4℃–MFI37℃)/MFI4℃
如图。图4描述了研究结果。结果表明本发明的抗Trop-2抗体可以被表达Trop-2的细胞内化，其中A1X4抗体是最有效的抗体。与基准抗体hRS7相比，A1X4和A1,2X4抗体都具有更高的内化率。鉴于A1X4和A1,2X4抗体与hRS7基准相比具有略低的结合亲和力，我们的观察结果与早期研究的已发表结果一致，表明具有中等亲和力的抗体表现出最高水平的肿瘤积累，表明良好肿瘤穿透。
例8
Trop-2mAb的ADCC活性
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定旨在测试抗Trop-2抗体介导效应细胞对靶细胞裂解的能力。从混合的健康人血(来自20多名健康供体)中纯化外周血单个核细胞(PBMC)，并将其作为效应细胞进行测试。Trop-2阳性人卵巢癌细胞系SK-BR-3用作靶细胞系。SK-BR-3靶细胞与连续稀释的A1X4抗体或A1,2X4抗体或A1,2X4ADC在室温下孵育0.5小时，然后添加效应细胞。效应物与目标物(E:T)的比率为25:1。在37℃孵育6小时后，将上清液转移到另一块板上，并在室温下与乳酸脱氢酶(LDH)工作溶液一起孵育30分钟。使用PHERAStarPlus测量LDH活性。对每个数据点进行了3次重复。将数据拟合到4参数逻辑(4PL)非线性回归模型以获得剂量反应曲线，并使用GraphPad Prism 6软件计算EC50。误差线：±SEM。赫赛汀抗体用作阳性对照，而人IgG1用作阴性对照。
根据以下公式计算细胞裂解百分比：
％细胞裂解＝100x(OD样品-OD靶细胞加效应细胞)/(OD最大释放-OD最小释放)
如图所示。如图5所示，A1,2X4抗体ADC以抗体剂量依赖性方式对SK-BR-3细胞表现出强烈的ADCC活性。ADCC活性与用阳性对照赫赛汀观察到的活性相当。阴性对照显示没有活性。
例9
Anti-Trop-2-vc-MMAE和Anti-Trop-2-SMCC-DM1偶联物的制备
人源化抗Trop-2抗体，包括A1、2X4、A1X4和基准hRS7，与MMAE偶联形成ADC，并评估它们抑制表达不同水平Trop-2的多种癌细胞系生长的能力。Monomethyl auristatin E(MMAE)是一种抗肿瘤药；它通过阻断微管蛋白的聚合来抑制细胞分裂。它来源于海洋无壳软体动物(海藻毒素)中的肽。MMAE已被证明是ADC的有用有效载荷。
ADC中的连接子可能对生物活性产生重大影响。例如，体内研究表明，肽连接的缀合物诱导已建立的肿瘤异种移植物的消退和治愈，治疗指数高达60倍。这些偶联物说明了连接子技术、药物效力和偶联方法在开发用于癌症治疗的安全有效的ADC中的重要性。
本发明的一些实施方案涉及通过溶酶体可切割二肽、缬氨酸-瓜氨酸(vc)与抗体连接的MMAE，或通过不可切割的胺-巯基交联剂与抗体连接的DM1，其已被证明可提高ADC功效。在这个例子中，通过将抗体添加到溶解在pH值调节的PBS EDTA缓冲液中的TCEP(Tris(2-羧乙基)膦)中，来减少抗Trop-2抗体。将抗体/TCEP溶液在37℃下孵育2-3小时。将还原的抗体缓冲液交换到缀合反应缓冲液中。将溶解在DMSO中的mc-vc-PABA-MMAE auristatin或SMCC-DM1maytasinoid有效负载添加到还原型抗Trop-2单克隆抗体(A1、2X4或A1X4)溶液中，有效负载/抗体比为5:1-7:1以实现不同的药物与抗体比率(DAR)。将有效负载/抗体溶液在20℃下孵育1-2小时。偶联完成后，将反应混合物脱盐并浓缩以产生抗Trop-2-vc-MMAEADC。所得ADC的生化特性使用尺寸排阻色谱高压液相色谱(SEC-HPLC)确定纯度和聚集物含量，并使用疏水相互作用色谱HPLC(HIC-HPLC)确定药物：抗体比(DAR)。最终的ADC产品A1,2X4-MMAE或A1X4-MMAE或A1,2X4-DM1由两个或四个或六个MMAE连接分子组成。
例10
具有不同DAR的ADC的体外细胞毒性和体内抗肿瘤活性
本发明的含有细胞毒性有效载荷的ADC可用于杀死靶细胞，例如杀死癌细胞。对于体外测定，测试了MDA-MB-468、SK-BR-3、NCI-N87、Colo205、A549。所有细胞系均在合适的培养基中于37℃在5％CO2的湿润培养箱气氛中培养。将细胞接种在96孔平底板中。细胞接种数范围从500个细胞/100μl/孔到6,000个细胞/100μl/孔。使细胞在37℃在5％CO 2的湿润气氛中贴壁过夜。A1X4-MMAE与DAR2、或DAR4或DAR6从储备溶液中制备，并在细胞接种后24小时稀释成适当的工作浓度。用培养基连续十倍稀释七个点。最终浓度范围为1000nM至0.001nM。将细胞与ADC一起孵育72小时。将Cell Counting Kit-8溶液(Dojindo ChinaCo.,Ltd,lot#PL701)加入孔中，在37℃下放置1-4小时，并使用酶标仪(SpectraMaxM5，Molecular Devices)测量450nm处的吸光度)和SoftMax Pro5.4.1软件。通过以下公式计算抑制百分比：(处理样品的平均吸光度/对照样品的平均吸光度)×100。对于所有细胞测定，使用GraphPad Prism 7三参数曲线拟合生成剂量反应曲线。
为了比较具有不同DAR的ADC的体内抗肿瘤活性，在MDA-MB-468异种移植模型中测试了A1X4-MMAE DAR2、A1X4-MMAE DAR4、A1X4-MMAE DAR6。从培养瓶中收获MDA-MB-468细胞并与基质胶(1:1)混合。将500万个细胞皮下植入6至7周龄BALB/c裸鼠的右侧。肿瘤建立后，根据肿瘤体积将小鼠随机分组。ADCs以1.5mg/kg作为单次推注剂量静脉内给药。在整个研究过程中每周测量两次肿瘤，使用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝(长×宽2)/2。数据由GraphPad Prism 7分析并以平均值+标准偏差表示。使用单因素方差分析进行统计分析。
这些测定的结果显示在图6和图7中.结果表明，DAR4和DAR6的ADC的体外细胞毒性比DAR2ADC更强，并且在具有中/高Trop-2表达的细胞(即MDA-MB-468、SK-BR-3，NCI-N87)。在中/高Trop-2水平的肿瘤模型中，具有DAR4和DAR6的ADC能够实现持久的肿瘤消退，而DAR2ADC实现了一段时间的消退，但随后肿瘤开始再生。
例11
Trop-2表达水平与ADC体外细胞毒性的相关性
为了确定Trop-2表达水平是否影响ADC活性，针对代表高Trop-2表达的BxPC-3胰腺癌细胞和MDA-MB-468乳腺癌细胞(MFI 161823,74943),SK-BR-3卵巢癌细胞和N87胃癌细胞并代表中度Trop-2表达(分别为MFI 53526,40400),Colo205结肠癌细胞代表低Trop-2表达(MFI 19444),和MDA-MB-231乳腺癌细胞，Trop-2水平检测不到，测试了A1、2X4ADC、A1X4ADC和基准hRS7ADC。。根据实施例9中描述的程序进行体外细胞毒性测定。
如图。图8A总结了BxPC-3、MDA-MB-468、NCI-N87、SK-BR-3、Colo205和MDA-MB-231细胞中的Trop-2表达水平以及每个测试的ADC的最大抑制百分比和IC50。结果表明Trop-2表达水平与抗Trop-2ADC的体外效力总体上有清楚的相关性。A1X4-MMAETrop-2-高BxPC-3细胞最有效产生小于1nM的IC50值。它还诱导中等表达的MDA-MB-468、SK-BR-3和NCI-N87细胞的有效细胞毒性(IC50值在个位数nM范围内)，并且对Trop-2低水平的Colo-205细胞的活性最弱热。另一方面，A1,2X4-MMAE对所有表达不同水平Trop-2的细胞都非常有效(IC50值小于1nM)。A1X4-MMAE和A1,2X4-MMAE的体外活性与使用基准hRS7ADC观察到的活性相当。在Trop-2阴性MDA-MB-231细胞中，3种抗体都不能计算出IC50，表明没有达到特异性杀伤活性。
如图。图8B显示Trop-2表达水平与A1，2X4-MMAE的体外效力之间的相关性。
例12
Anti-Trop-2-vc-MMAE ADC的旁观者杀伤效应
在临床前研究中已经观察到一些ADC的旁观者杀伤效应。通过将释放的有效载荷从抗原表达细胞转移到相邻的抗原阴性细胞，它不仅可以影响抗原表达的肿瘤细胞，还可以影响相邻的抗原阴性细胞。为了确认A1,2X4-MMAE是否诱导旁观者杀伤，进行了transwell共培养细胞杀伤试验。将Trop-2阳性MDA-MB-468细胞以3,000个细胞/500μl/孔的密度铺板在板底部。插入细胞培养插入物(Thermo，cat#140627)，并将Trop-2阴性MDA-MB-231细胞以与MDA-MB-468相同的密度接种在插入物中。孵育24小时后，将浓度为1、10和100nM的A1,2X4-MMAE添加到底部孔中的MDA-MB-468细胞中，并孵育72小时。MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞的细胞毒性通过实施例7中所述的Cell Counting Kit-8测量。抑制百分比通过以下公式计算：(处理样品的平均吸光度/对照样品的平均吸光度)×100。
如图9所示，如预料之中，A1,2X4-MMAE有效抑制Trop-2阳性MDA-MB-468细胞增殖，但对Trop-2阴性MDA-MB-231细胞没有影响。在MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞体外共培养条件下，A1,2X4-MMAE杀死了两种细胞。由于A1,2X4-MMAE具有Trop-2特异性细胞毒性，对MDA-MB-231细胞的杀伤有可能是释放的有效载荷导致，表明A1,2X4-MMAE具有旁观者杀伤作用。该测定的结果表明A1,2X4-MMAE具有强大的旁观者杀伤作用，因为它具有高膜渗透性有效载荷，同时A1,2X4具有靶向Trop-2异质性肿瘤的潜力。
例13
Anti-Trop-2-vc-MMAE ADC的体内表征
使用Trop-2阳性MDA-MB-468和NCI-N87异种移植模型在小鼠受试者中评估抗Trop-2-vc-MMAE ADC的抗肿瘤活性。从培养瓶中收获500万个NCI-N87细胞，并将其皮下植入6至7周龄BALB/c裸鼠的右侧。在整个实验过程中每周测量两次肿瘤，使用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝(长x宽2)/2。
在NCI-N87模型中测试的ADC偶联不同的DAR值：基准hRS7-MMAE的DAR为4.33，A1X4-MMAE的DAR为6.1，A1,2X4-MMAE的DAR为5.8。因此，调整了每个ADC的给药剂量以确保相同数量的有效载荷。因此，基准hRS7-MMAE、A1X4-MMAE或A1,2X4-MMAE以0.5mg/kg、1.0mg/kg和1.5mg/kg给药。ADCs作为单次推注剂量静脉内给药。
图10A显示体内N87异种移植研究的结果。如图所示，以5.0mg/kg单次施用本发明的ADC(A1X4-MMAE、A1,2X4-MMAE)诱导持久的肿瘤消退。1.5mg/kg的ADC剂量导致显着的肿瘤生长抑制，而0.5mg/kg的最低剂量仅导致轻微的肿瘤生长抑制。A1X4-MMAE和A1,2X4-MMAE在该模型中表现出与基准hRS-7-MMAE(BM-MMAE)相似的抗肿瘤活性。
为了进一步比较不同ADC的抗肿瘤活性，A1X4-MMAE和A1,2X4-MMAE在MDA-MB-468异种移植模型中进行了头对头测试。所有ADC均以1.5mg/kg单剂量给药。
图10B描绘了体内MDA-MB-468异种移植研究的结果。结果表明，所有ADC都能够通过单次给药1.5mg/kg剂量实现持久的肿瘤消退。A1,2X4-MMAE比A1X4-MMAE更有效。
例14
Anti-Trop-2-vc-MMAE ADC不同给药方案的抗肿瘤活性比较
通过比较Trop-2阳性MDA-MB-468异种移植模型中A1,2X4-MMAE的单次和分次给药方案，评估给药方案对抗Trop-2ADC抗肿瘤活性的影响。测试了三种给药方案，包括1)1.5mg/kg的单剂量；2)每7天给予两剂0.75mg/kg；3)4剂0.375mg/kg，每周两次。
如图11所示，结果表明1.5mg/kg的单剂量是最有效的，比分次给药方案更有效，导致显著的抗肿瘤活性持续到研究的第28天。每周两次分次剂量0.375mg/kg比每周分次剂量0.75mg/kg产生更好的肿瘤生长抑制作用。在相同的总剂量下，更短的给药间隔(例如，3-4天)产生更好的结果这一事实是出乎意料的。这可能表明对于抗Trop-2-vc-MMAE ADC，较高的AUC可能比较高的Cmax更重要。
鉴于本公开，本文公开和要求保护的所有物品和方法可以在不进行过度实验的情况下制造和执行。尽管本发明的物品和方法已根据优选实施例进行了描述，但对于本领域技术人员来说，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对物品和方法应用变化是显而易见的。对本领域技术人员来说显而易见的所有这些变化和等效物，无论是现在存在的还是以后开发的，都被认为在所附权利要求限定的本发明的精神和范围内。说明书中提及的所有专利、专利申请和出版物都表明了本发明所属领域的普通技术人员的水平。所有专利、专利申请和出版物出于所有目的以引用的方式整体并入本文，并且其程度如同每个单独的出版物被具体地和单独地指示以引用的方式整体并入用于任何和所有目的一样。此处示例性描述的本发明可以在没有此处未具体公开的任何元素的情况下实施。因此，应当理解，虽然本发明已经通过优选实施例和可选特征具体公开，但是本领域技术人员可以对这里公开的概念进行修改和变化，并且这些修改和变化被认为是在所附权利要求限定的本发明范围内。
序列表
如37CFR 1.822中定义的，随附序列表中列出的核酸和氨基酸序列使用标准字母缩写表示核苷酸碱基，使用三字母代码表示氨基酸。
SEQ ID NO：1是人TROP-2氨基酸序列
SEQ ID NO:2是人TROP-2-ECD-6His抗原氨基酸序列
SEQ ID NO：3和4是特异性结合Trop-2的鼠单克隆抗体中重链CDR1的氨基酸序列
SEQ ID NO：5和6是特异性结合Trop-2的鼠单克隆抗体中重链CDR2的氨基酸序列
SEQ ID NO：7和8是特异性结合Trop-2的鼠单克隆抗体中重链CDR3的氨基酸序列
SEQ ID NO：9和10是特异性结合Trop-2的鼠单克隆抗体中轻链CDR1的氨基酸序列
SEQ ID NO：11和12是特异性结合Trop-2的鼠单克隆抗体中轻链CDR2的氨基酸序列
SEQ ID NO：13和14是特异性结合Trop-2的鼠单克隆抗体中轻链CDR3的氨基酸序列
SEQ ID NO：15是鼠单克隆抗体#118-2-5重链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:16是鼠单克隆抗体#125-1-5重链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO：17是鼠单克隆抗体#118-2-5轻链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO：18是鼠单克隆抗体#125-1-5轻链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:1 9是嵌合抗体#118-2-5重链可变区核酸序列
SEQ ID NO：20是嵌合抗体#118-2-5轻链可变区核酸序列
SEQ ID NO：21是嵌合抗体#125-1-5重链可变区核酸序列
SEQ ID NO：22是嵌合抗体#125-1-5轻链可变区核酸序列
SEQ ID NO：23是人源化抗体#118-2-5重链HuA可变区氨基酸序列
SEQ ID NO：24是人源化抗体#118-2-5重链HuB可变区氨基酸序列
SEQ ID NO：25是人源化抗体#118-2-5重链HuC可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:26是人源化抗体#118-2-5重链HuD可变区氨基酸序列
SEQ ID NO：27是人源化抗体#118-2-5轻链HuX可变区氨基酸序列
SEQ ID NO：28是人源化抗体#118-2-5轻链HuY可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:29是人源化抗体#118-2-5重链Hu(A1)可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:30是人源化抗体#118-2-5重链Hu(A2)可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:31是人源化抗体#118-2-5重链Hu(A3)可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:32是人源化抗体#118-2-5重链Hu(A4)可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:33是人源化抗体#118-2-5重链Hu(A5)可变区氨基酸序列
SEQ ID NO：34是人源化抗体#118-2-5轻链Lu(X1)可变区氨基酸序列
SEQ ID NO：35是人源化抗体#118-2-5轻链Lu(X2)可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:36是人源化抗体#118-2-5轻链Lu(X3)可变区氨基酸序列
SEQ ID NO：37是人源化抗体#118-2-5轻链Lu(X4)可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:38是人源化抗体#118-2-5轻链Lu(X5)可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:39是人源化抗体#118-2-5轻链Lu(X6)可变区氨基酸序列
SEQ ID NO:40是人源化抗体#118-2-5重链HuA(1,2)可变区氨基酸序列
SEQ ID NO：41是人源化抗体#125-1-5重链Hu1可变区氨基酸序列
SEQ ID NO：42是人源化抗体#125-1-5重链Hu2可变区氨基酸序列
SEQ ID NO：43是人源化抗体#125-1-5重链Hu3可变区氨基酸序列
SEQ ID NO：44是人源化抗体#125-1-5重链Hu4可变区氨基酸序列
SEQ ID NO：45是人源化抗体#125-1-5轻链Lu5可变区氨基酸序列
SEQ ID NO：46是人源化抗体#125-1-5轻链Lu6可变区氨基酸序列
SEQ ID NO：47和49是特异性结合Trop-2的嵌合抗体重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：48和50是特异性结合Trop-2的嵌合抗体轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：51、53、55是特异性结合Trop-2的人源化抗体重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：52、54、56是特异性结合Trop-2的人源化抗体轻链的氨基酸序列。
序列表
SEQ ID NO：1-人TROP-2氨基酸序列
MARGPGLAPPPLRLPLLLLVLAAVTGHTAAQDNCTCPTNKMTVCSPDGPGGRCQCALGSGMAVDCSTLTSKCLLLKARMSAPKNARTLVRPSEHALVDNDGLYDPDCDPEGRFKARQCNQTSVCWCVNSVGVRRTDKGDLSLRCDELVRTHHILIDLRHRPTAGAFNHSDLDAELRRLFRERYRLHPKFVAAVHYEQPTIQIELRQNTSQKAAGDVDIGDAAYYFERDIKGESLFQGRGGLDLRVRGEPLQVERTLIYYLDEIPPKFSMKRLTAGLIAVIVVVVVALVAGMAVLVITNRRKSGKYKKVEIKELGELRKEPSL*
SEQ ID NO:2–人TROP-2-ECD-6His抗原氨基酸序列
MARGPGLAPPPLRLPLLLLVLAAVTGHTAAQDNCTCPTNKMTVCSPDGPGGRCQCRALG SGMAVDCSTLTSKCLLLKARMSAPKNARTLVRPSEHALVDNDGLYDPDCDPEGRFKARQ CNQTSVCWCVNSVGVRRTDKGDLSLRCDELVRTHHILIDLRHRPTAGAFNHSDLDAELRRLFRERYRLHPKFVAAVHYEQPTIQIELRQNTSQKAAGDVDIGDAAYYFERDIKGESLFQGRGGLDLRVRGEPLQVERTLIYYLDEIPPKFSMKRLTAHHHHHH
SEQ ID NO:3–鼠单克隆抗体#118-2-5重链CDR1氨基酸序列
SYGVN
SEQ ID NO:4–鼠单克隆抗体#125-1-5重链CDR1氨基酸序列
TYVIH
SEQ ID NO:5-鼠单克隆抗体#118-2-5重链CDR2氨基酸序列
VMWAGGSTNYNSALMS
SEQ ID NO:6-鼠单克隆抗体#125-1-5重链CDR2氨基酸序列
YINPNNDGTKYNEKFKG
SEQ ID NO:7-鼠单克隆抗体#118-2-5重链CDR3氨基酸序列
DENWDGAWFAY
SEQ ID NO:8-鼠单克隆抗体#125-1-5重链CDR3氨基酸序列
PHETHAMDY
SEQ ID NO:9-鼠单克隆抗体#118-2-5轻链CDR1氨基酸序列
KSSQSLLNSGTRKNYLA
SEQ ID NO:10-鼠单克隆抗体#125-1-5轻链CDR1氨基酸序列
KASEDIFNRLA
SEQ ID NO：11-鼠单克隆抗体#118-2-5轻链CDR2氨基酸序列
WASSRES
SEQ ID NO:12-鼠单克隆抗体#125-1-5轻链CDR2氨基酸序列
GATSLET
SEQ ID NO:13-鼠单克隆抗体#118-2-5轻链CDR3氨基酸序列
KQSYNLFT
SEQ ID NO:14-鼠单克隆抗体#125-1-5轻链CDR3氨基酸序列
QQYWNTWT
SEQ ID NO:15–鼠单克隆抗体#118-2-5重链可变区氨基酸序列
QVQLKQSGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVNWIRQPPGKGLEWLGVMWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTGMYYCARDENWDGAWFAYWGQGTLVTVS
SEQ ID NO:16–鼠单克隆抗体#125-1-5重链可变区氨基酸序列
QIQLVQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTTYVIHWVKQKPGQGLEWIGYINPNNDGTKYNEKFKGKATLISDKSSTTAYMEVRGLTSEDSAVYYCARPHFETHAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO：17-鼠单克隆抗体#118-2-5轻链可变区氨基酸序列
DIQMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLISWASSRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLFTFGGGTKLELK
SEQ ID NO:18-鼠单克隆抗体#125-1-5轻链可变区氨基酸序列
DIQMTQSPSSFSVSLGDSVTITCKASEDIFNRLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGVPSRFSGGGSGKEYTLSITSLQNEDVATYYCQQYWNTWTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:19-嵌合抗体#118-2-5重链可变区核酸序列
caggtgcagctgcaggagtccggccccggcctggtgaagccctccgagaccctgtccctgacctgcaccgtgtccggcggctccatctcctcctacggcgtgaactggatccgccagccccccggcaagggcctggagtggatcggcgtgatgtgggccggcggctccaccaactacaactccgccctgatgtcccgcgtgaccatctccgtggacacctccaagaaccagttctccctgaagctgtcctccgtgaccgccgccgacaccgccgtgtactactgcgcccgcgacgagaactgggacggcgcctggttcgcctactggggccagggcaccctggtgaccgtctcgagt
SEQ ID NO：20-嵌合抗体#118-2-5轻链可变区核酸序列
gacatcgtgatgacccagtcccccgactccctggccgtgtccctgggcgagcgcgccaccatcaactgcaagtcctcccagtccctgctgaactccggcacccgcaagaactacctggcctggtaccagcagaagcccggccagccccccaagctgctgatctactgggcctcctcccgcgagtccggcgtgcccgaccgcttctccggctccggctccggcaccgacttcaccctgaccatctcctccctgcaggccgaggacgtggccgtgtactactgcaagcagtcctacaacctgttcaccttcggccagggcaccaagctcgaggtcgacataaaa
SEQ ID NO:21-嵌合抗体#125-1-5重链可变区核酸序列
caggtgcagctggtgcagtccggcgccgaggtgaagaagcccggcgcctccgtgaaggtgtcctgcaaggcctccggctacaccttcaccacctacgtgatccactgggtgcgccaggcccccggccagcgcctggagtggatgggctacatcaaccccaacaacgacggcaccaagtacaacgagaagttcaagggccgcgtgaccatcacccgcgacacctccgcctccaccgcctacatggagctgtcctccctgcgctccgaggacaccgccgtgtactactgcgcccgcccccacttcgagacccacgccatggactactggggccagggcaccctggtgaccgtctcgagt
SEQ ID NO：22-嵌合抗体#125-1-5轻链可变区核酸序列
gacatccagatgacccagtccccctcctccctgtccgcctccgtgggcgaccgcgtgaccatcacctgcaaggcctccgaggacatcttcaaccgcctggcctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgctgtacggcgccacctccctggagaccggcgtgccctcccgcttctccggctccggctccggcaccgactacaccctgaccatctcctccctgcagcccgaggacttcgccacctactactgccagcagtactggaacacctggaccttcggcgccggcaccaaggtcgacataaaa
SEQ ID NO:23-人源化抗体#118-2-5重链可变区HuA氨基酸序列
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVNWIRQPPGKGLEWIGVMWAGGSTNYNSALMSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDENWDGAWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:24-人源化抗体#118-2-5重链可变区HuB氨基酸序列
QVQLKQSGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVNWIRQPPGKGLEWIGVMWAGGSTNYNSALMSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDENWDGAWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:25-人源化抗体#118-2-5重链可变区HuC氨基酸序列
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVNWIRQPPGKGLEWIGVMWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTGMYYCARDENWDGAWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:26-人源化抗体#118-2-5重链可变区HuD氨基酸序列
QVQLKESGPGLVAPSETLSITCTTVSGFSLTSYGVNWIRQPPGKGLEWLGVMWAGGSTNYNSALMSRLTISKDTSKNQVSLKLSSVQAADTAMYYCARDENWDGAWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:27-人源化抗体#118-2-5轻链可变区LuX氨基酸序列
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYNLFTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:28–人源化抗体#118-2-5轻链可变区LuY氨基酸序列
DIVMTQSPSSLAVSLGERATMSCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFLTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLFTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:29–人源化抗体#118-2-5重链Hu(A1)可变区氨基酸序列
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVNWIRQPPGKGLEWIGVMWAGGSTNYNSALMSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDENWDGAWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:30–人源化抗体#118-2-5重链Hu(A2)可变区氨基酸序列
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVNWIRQPPGKGLEWIGVMWAGGSTNY NSALMSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDENWDGAWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:31–人源化抗体#118-2-5重链Hu(A3)可变区氨基酸序列
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVNWIRQPPGKGLEWIGVMWAGGSTNYNSALMSRVTISVDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARDENWDGAWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:32–人源化抗体#118-2-5重链Hu(A4)可变区氨基酸序列
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVNWIRQPPGKGLEWIGVMWAGGSTNYNSALMSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVQAADTAVYYCARDENWDGAWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:33–人源化抗体#118-2-5重链Hu(A5)可变区氨基酸序列
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVNWIRQPPGKGLEWIGVMWAGGSTNYNSALMSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAMYYCARDENWDGAWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:34–人源化抗体#118-2-5轻链Lu(X1)可变区氨基酸序列
DIVMTQSPSSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYNLFTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:35–人源化抗体#118-2-5轻链Lu(X2)可变区氨基酸序列
DIVMTQSPDSLAVSLGERATMNCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYNLFTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:36–人源化抗体#118-2-5轻链Lu(X3)可变区氨基酸序列
DIVMTQSHKFISTSVGDRVSITCKASQDVDTAVAWYQQKPGQSSPKLLIHWASTRHTGVPDRFTGGGSGTDFTLTLSNVQSEDLADYFCQQYSTFPWTFGGGTRLEIK
SEQ ID NO:37–人源化抗体#118-2-5轻链Lu(X4)可变区氨基酸序列
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYNLFTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:38–人源化抗体#118-2-5轻链Lu(X5)可变区氨基酸序列
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASSRE SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCKQSYNLFTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:39–人源化抗体#118-2-5轻链Lu(X6)可变区氨基酸序列
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDLAVYYCKQSYNLFTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:40–人源化抗体#118-2-5重链HuA(1,2)可变区氨基酸序列
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVNWIRQPPGKGLEWIGVMWAGGSTNYNSALMSRLTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDENWDGAWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:41–人源化抗体#125-1-5重链Hu1可变区氨基酸序列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYVIHWVRQAPGQRLEWMGYINPNNDGTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPHFETHAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:42–人源化抗体#125-1-5重链Hu2可变区氨基酸序列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYVIHWVKQKPGQGLEWIGYINPNNDGTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPHFETHAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:43–人源化抗体#125-1-5重链Hu3可变区氨基酸序列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYVIHWVRQAPGQRLEWMGYINPNNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSTTAYMEVRGLTSEDSAVYYCARPHFETHAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:44–人源化抗体#125-1-5重链Hu4可变区氨基酸序列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTTYVIHWVRQAPGQRLEWIGYINPNNDGTKYNEKFKGRATLTSDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPHFETHAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:45–人源化抗体#125-1-5轻链Lu5可变区氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASEDIFNRLAWYQQKPGKAPKLLLYGATSLETGVPSRF SGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYWNTWTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:46–人源化抗体#125-1-5轻链Lu6可变区氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASEDIFNRLAWYQQKPGKAPKLLISGATSLETGVPSRF SGSGSGKDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYWNTWTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:47–嵌合抗体#118-2-5重链氨基酸序列
QVQLKQSGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVNWIRQPPGKGLEWLGVMWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTGMYYCARDENWDGAWFAYWGQGTLVTVSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQAYICNVNHKPSNTKVDKKVGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIERTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELAKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
SEQ ID NO:48–嵌合抗体#118-2-5轻链氨基酸序列
DIQMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLISWASSRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLFTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
SEQ ID NO:49–嵌合抗体#125-1-5重链氨基酸序列
QIQLVQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTTYVIHWVKQKPGQGLEWIGYINPNNDGTKYNEKFKGKATLISDKSSTTAYMEVRGLTSEDSAVYYCARPHFETHAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQAYICNVNHKPSNTKVDKKVGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIERTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELAKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
SEQ ID NO:50–嵌合抗体#125-1-5轻链氨基酸序列
DIQMTQSPSSFSVSLGDSVTITCKASEDIFNRLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGVPSRFSGGGSGKEYTLSITSLQNEDVATYYCQQYWNTWTFGGGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
SEQ ID NO:51–人源化抗体A1,2X4重链氨基酸序列
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVNWIRQPPGKGLEWIGVMWAGGSTNYNSALMSRLTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDENWDGAWFAYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQAYICNVNHKPSNTKVDKKVGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIERTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELAKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
SEQ ID NO:52–人源化抗体A1,2X4轻链氨基酸序列
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYNLFTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
SEQ ID NO:53–人源化抗体A1X4重链氨基酸序列
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVNWIRQPPGKGLEWIGVMWAGGSTNYNSALMSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDENWDGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQAYICNVNHKPSNTKVDKKVGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIERTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELAKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
SEQ ID NO:54–人源化抗体A1X4轻链氨基酸序列
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYNLFTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
SEQ ID NO:55–人源化抗体#125-1-5Hu3/Lu5重链氨基酸序列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYVIHWVRQAPGQRLEWMGYINPNNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSTTAYMEVRGLTSEDSAVYYCARPHFETHAMDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQAYICNVNHKPSNTKVDKKVGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIERTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELAKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
SEQ ID NO:56–人源化抗体#125-1-5轻链氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASEDIFNRLAWYQQKPGKAPKLLLYGATSLETGVPSRF SGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYWNTWTFGQGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
序列表
<110> 博泰康医药公司（BIONECURE THERAPEUTICS, INC.）
<120> 滋养层细胞表面抗原2(TROP-2)抗体
<130> 22736-20001.40
<150> US 63/034,055
<151> 2020-06-03
<160> 56
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 322
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Ala Arg Gly Pro Gly Leu Ala Pro Pro Pro Leu Arg Leu Pro Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Val Leu Ala Ala Val Thr Gly His Thr Ala Ala Gln Asp
20 25 30
Asn Cys Thr Cys Pro Thr Asn Lys Met Thr Val Cys Ser Pro Asp Gly
35 40 45
Pro Gly Gly Arg Cys Gln Cys Ala Leu Gly Ser Gly Met Ala Val Asp
50 55 60
Cys Ser Thr Leu Thr Ser Lys Cys Leu Leu Leu Lys Ala Arg Met Ser
65 70 75 80
Ala Pro Lys Asn Ala Arg Thr Leu Val Arg Pro Ser Glu His Ala Leu
85 90 95
Val Asp Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Pro Glu Gly Arg
100 105 110
Phe Lys Ala Arg Gln Cys Asn Gln Thr Ser Val Cys Trp Cys Val Asn
115 120 125
Ser Val Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser Leu Arg Cys
130 135 140
Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His Arg
145 150 155 160
Pro Thr Ala Gly Ala Phe Asn His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu Arg
165 170 175
Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg Leu His Pro Lys Phe Val Ala Ala
180 185 190
Val His Tyr Glu Gln Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn Thr
195 200 205
Ser Gln Lys Ala Ala Gly Asp Val Asp Ile Gly Asp Ala Ala Tyr Tyr
210 215 220
Phe Glu Arg Asp Ile Lys Gly Glu Ser Leu Phe Gln Gly Arg Gly Gly
225 230 235 240
Leu Asp Leu Arg Val Arg Gly Glu Pro Leu Gln Val Glu Arg Thr Leu
245 250 255
Ile Tyr Tyr Leu Asp Glu Ile Pro Pro Lys Phe Ser Met Lys Arg Leu
260 265 270
Thr Ala Gly Leu Ile Ala Val Ile Val Val Val Val Val Ala Leu Val
275 280 285
Ala Gly Met Ala Val Leu Val Ile Thr Asn Arg Arg Lys Ser Gly Lys
290 295 300
Tyr Lys Lys Val Glu Ile Lys Glu Leu Gly Glu Leu Arg Lys Glu Pro
305 310 315 320
Ser Leu
<210> 2
<211> 281
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Met Ala Arg Gly Pro Gly Leu Ala Pro Pro Pro Leu Arg Leu Pro Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Val Leu Ala Ala Val Thr Gly His Thr Ala Ala Gln Asp
20 25 30
Asn Cys Thr Cys Pro Thr Asn Lys Met Thr Val Cys Ser Pro Asp Gly
35 40 45
Pro Gly Gly Arg Cys Gln Cys Arg Ala Leu Gly Ser Gly Met Ala Val
50 55 60
Asp Cys Ser Thr Leu Thr Ser Lys Cys Leu Leu Leu Lys Ala Arg Met
65 70 75 80
Ser Ala Pro Lys Asn Ala Arg Thr Leu Val Arg Pro Ser Glu His Ala
85 90 95
Leu Val Asp Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Pro Glu Gly
100 105 110
Arg Phe Lys Ala Arg Gln Cys Asn Gln Thr Ser Val Cys Trp Cys Val
115 120 125
Asn Ser Val Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser Leu Arg
130 135 140
Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His
145 150 155 160
Arg Pro Thr Ala Gly Ala Phe Asn His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu
165 170 175
Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg Leu His Pro Lys Phe Val Ala
180 185 190
Ala Val His Tyr Glu Gln Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn
195 200 205
Thr Ser Gln Lys Ala Ala Gly Asp Val Asp Ile Gly Asp Ala Ala Tyr
210 215 220
Tyr Phe Glu Arg Asp Ile Lys Gly Glu Ser Leu Phe Gln Gly Arg Gly
225 230 235 240
Gly Leu Asp Leu Arg Val Arg Gly Glu Pro Leu Gln Val Glu Arg Thr
245 250 255
Leu Ile Tyr Tyr Leu Asp Glu Ile Pro Pro Lys Phe Ser Met Lys Arg
260 265 270
Leu Thr Ala His His His His His His
275 280
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 3
Ser Tyr Gly Val Asn
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 4
Thr Tyr Val Ile His
1 5
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 5
Val Met Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser
1 5 10 15
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 6
Tyr Ile Asn Pro Asn Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 7
Asp Glu Asn Trp Asp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 8
Pro His Phe Glu Thr His Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 9
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 10
Lys Ala Ser Glu Asp Ile Phe Asn Arg Leu Ala
1 5 10
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 11
Trp Ala Ser Ser Arg Glu Ser
1 5
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 12
Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr
1 5
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 13
Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Phe Thr
1 5
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 14
Gln Gln Tyr Trp Asn Thr Trp Thr
1 5
<210> 15
<211> 118
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 15
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Met Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Glu Asn Trp Asp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser
115
<210> 16
<211> 119
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 16
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Asn Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Ile Ser Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Val Arg Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro His Phe Glu Thr His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 17
<211> 112
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 18
<211> 106
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Phe Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Phe Asn Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Lys Glu Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Asn
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Asn Thr Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 19
caggtgcagc tgcaggagtc cggccccggc ctggtgaagc cctccgagac cctgtccctg 60
acctgcaccg tgtccggcgg ctccatctcc tcctacggcg tgaactggat ccgccagccc 120
cccggcaagg gcctggagtg gatcggcgtg atgtgggccg gcggctccac caactacaac 180
tccgccctga tgtcccgcgt gaccatctcc gtggacacct ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgtcct ccgtgaccgc cgccgacacc gccgtgtact actgcgcccg cgacgagaac 300
tgggacggcg cctggttcgc ctactggggc cagggcaccc tggtgaccgt ctcgagt 357
<210> 20
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 20
gacatcgtga tgacccagtc ccccgactcc ctggccgtgt ccctgggcga gcgcgccacc 60
atcaactgca agtcctccca gtccctgctg aactccggca cccgcaagaa ctacctggcc 120
tggtaccagc agaagcccgg ccagcccccc aagctgctga tctactgggc ctcctcccgc 180
gagtccggcg tgcccgaccg cttctccggc tccggctccg gcaccgactt caccctgacc 240
atctcctccc tgcaggccga ggacgtggcc gtgtactact gcaagcagtc ctacaacctg 300
ttcaccttcg gccagggcac caagctcgag gtcgacataa aa 342
<210> 21
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 21
caggtgcagc tggtgcagtc cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgcctc cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc acctacgtga tccactgggt gcgccaggcc 120
cccggccagc gcctggagtg gatgggctac atcaacccca acaacgacgg caccaagtac 180
aacgagaagt tcaagggccg cgtgaccatc acccgcgaca cctccgcctc caccgcctac 240
atggagctgt cctccctgcg ctccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgcccccac 300
ttcgagaccc acgccatgga ctactggggc cagggcaccc tggtgaccgt ctcgagt 357
<210> 22
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 22
gacatccaga tgacccagtc cccctcctcc ctgtccgcct ccgtgggcga ccgcgtgacc 60
atcacctgca aggcctccga ggacatcttc aaccgcctgg cctggtacca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gctgtacggc gccacctccc tggagaccgg cgtgccctcc 180
cgcttctccg gctccggctc cggcaccgac tacaccctga ccatctcctc cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tactggaaca cctggacctt cggcgccggc 300
accaaggtcg acataaaa 318
<210> 23
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 23
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Met Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Glu Asn Trp Asp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 24
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Met Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Glu Asn Trp Asp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 25
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 25
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Met Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Glu Asn Trp Asp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 26
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Met Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Gln Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Glu Asn Trp Asp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 27
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 28
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 28
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 29
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 29
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Met Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Glu Asn Trp Asp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 30
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 30
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Met Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Glu Asn Trp Asp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 31
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Met Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Glu Asn Trp Asp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 32
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Met Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Gln Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Glu Asn Trp Asp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 33
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Met Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Glu Asn Trp Asp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 34
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 34
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 35
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 35
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 36
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 36
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Ile Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asp Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Leu Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 37
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 37
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 38
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 38
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 39
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 39
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 40
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 40
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Met Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Glu Asn Trp Asp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 41
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 41
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Asn Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro His Phe Glu Thr His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 42
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Asn Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro His Phe Glu Thr His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 43
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 43
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Asn Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Val Arg Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro His Phe Glu Thr His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 44
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 44
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Asn Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro His Phe Glu Thr His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 45
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Phe Asn Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Asn Thr Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 46
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 46
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Phe Asn Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Asn Thr Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 47
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 47
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Met Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Glu Asn Trp Asp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Ala Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Gly Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Ala Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 48
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 49
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 49
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Asn Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Ile Ser Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Val Arg Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro His Phe Glu Thr His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Ala Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Gly Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Ala Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 50
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 50
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Phe Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Phe Asn Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Lys Glu Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Asn
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Asn Thr Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 51
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 51
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Met Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Glu Asn Trp Asp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Ala Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Gly Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Ala Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 52
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 52
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 53
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 53
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Met Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Glu Asn Trp Asp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Ala Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Gly Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Ala Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 54
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 54
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 55
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 55
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Asn Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Val Arg Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro His Phe Glu Thr His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Ala Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Gly Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Ala Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 56
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构造
<400> 56
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Phe Asn Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Asn Thr Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims (34)

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，可特异性结合人滋养层细胞表面抗原2(Trop-2)(a)与选自SEQ ID NO：13-14的CDR3序列相同、基本相同或基本相似的轻链CDR3序列；(b)与选自SEQ ID NO：7-8的CDR3序列相同、基本相同或基本相似的重链CDR3序列；(c)(a)的轻链CDR3序列和(b)的重链CDR3序列。
2.根据权利要求1所述的一种分离的抗体或其抗原结合片段，进一步包含选自以下的氨基酸序列：(d)与选自SEQ ID NO：9-10的CDR1序列相同、基本相同或基本相似的轻链CDR1序列；(e)与选自SEQ ID NO：11-12的CDR2序列相同、基本相同或基本相似的轻链CDR2序列；(f)与选自SEQ ID NO:3-4的CDR1序列相同、基本相同或基本相似的重链CDR1序列；(g)与选自SEQ ID NO：5-6的CDR2序列相同、基本相同或基本相似的重链CDR2序列；(h)(d)的轻链CDR1序列和(f)的重链CDR1序列；(i)(e)的轻链CDR2序列和(g)的重链CDR2序列。
3.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人Trop-2并且包含：(a)与选自SEQ ID NO：9-10的CDR1序列相同、基本相同或基本相似的轻链CDR1序列；(b)与选自SEQ IDNO：11-12的CDR2序列相同、基本相同或基本相似的轻链CDR2序列；(c)与选自SEQ ID NO：13-14的CDR3序列相同、基本相同或基本相似的轻链CDR3序列；(d)与选自SEQ ID NO：3-4的CDR1序列相同、基本相同或基本相似的重链CDR1序列；(e)与选自SEQ ID NO：5-6的CDR2序列相同、基本相同或基本相似的重链CDR2序列；(f)与选自SEQ ID NO：7-8的CDR3序列相同、基本相同或基本相似的重链CDR3序列。
4.根据权利要求3所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其(a)与SEQ ID NO:9相同、基本相同或基本相似的轻链CDR1序列；(b)与SEQ ID NO:11相同、基本相同或基本相似的轻链CDR2序列；(c)与SEQ ID NO:13相同、基本相同或基本相似的轻链CDR3序列；(d)与SEQ IDNO:3相同、基本相同或基本相似的重链CDR1序列；(e)与SEQ ID NO:5相同、基本相同或基本相似的重链CDR2序列；(f)与SEQ ID NO:7相同、基本相同或基本相似的重链CDR3序列。
5.根据权利要求3所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其(a)与SEQ ID NO:10相同、基本相同或基本相似的轻链CDR1序列；(b)与SEQ ID NO:12相同、基本相同或基本相似的轻链CDR2序列；(c)与SEQ ID NO:14相同、基本相同或基本相似的轻链CDR3序列；(d)与SEQ IDNO:4相同、基本相同或基本相似的重链CDR1序列；(e)与SEQ ID NO:6相同、基本相同或基本相似的重链CDR2序列；(f)与SEQ IDNO:8相同、基本相同或基本相似的重链CDR3序列。
6.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人Trop-2，并且包含：(a)重链和/或轻链可变结构域，该可变结构域具有一组三个轻链CDR1、CDR2和CDR3与SEQ ID NO：9-10、11-12和13-14相同、基本相同或基本相似，和/或一组三个重链CDR1、CDR2和CDR3相同、基本相同或基本相同类似于SEQ ID NO：3-4、5-6和7-8；(b)一组来自人免疫球蛋白(IgG)的四个可变区框架区。
7.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其以与参考抗体基本相同或更强的Kd结合人PD-L1；(b)与所述参考抗体竞争结合人PD-L1；(c)在人受试者中的免疫原性低于所述参考抗体，其中所述参考抗体包含SEQ ID NO:15的重链可变域序列和SEQ ID NO:17的轻链可变域序列。
8.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其以与参考抗体基本相同或更强的Kd结合人PD-L1；(b)与所述参考抗体竞争结合人PD-L1；(c)在人受试者中的免疫原性低于所述参考抗体，其中所述参考抗体包含SEQ ID NO:16的重链可变域序列和SEQ ID NO:18的轻链可变域序列。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其以至少约1x10-6M、至少约1x10-7M,，至少约1x10-8M，至少约1x10-9M，至少约1x10-10M，至少约1x10-11M，或至少约1x10-12M的解离常数(KD)结合Trop-2蛋白。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段选自人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体。抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、双抗体、三抗体、四抗体、Fab片段、Fab'片段、Fab 2片段、F(ab)'2片段、域抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体、或在铰链区具有至少一个突变的IgG4抗体，可减轻形成H-链内二硫键的趋势。
11.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人Trop-2并包含具有与SEQ IDNO：23-26、29-33和40-44相同、基本相同或基本相似的序列的重链可变区，以及具有与SEQID NO：27-28、34-39和45-46相同、基本相同或基本相似的序列的轻链可变区。
12.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人Trop-2并且包含SEQ ID NO:40所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:37所示的轻链可变区序列。
13.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人Trop-2并且包含SEQ ID NO:29所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:37所示的轻链可变区序列。
14.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人Trop-2并包含SEQ ID NO:43所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:45所示的轻链可变区序列。
15.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人Trop-2并且包含具有与SEQID NO：51、53和55相同、基本相同或基本相似的序列的重链和具有与SEQ ID NO：52、54和56相同，基本相同或基本相似的序列的轻链。
16.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人Trop-2并包含SEQ ID NO:51所示的重链序列和SEQ ID NO:52所示的轻链序列。
17.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人Trop-2并包含SEQ ID NO:53所示的重链序列和SEQ ID NO:54所示的轻链序列。
18.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其以与参考抗体基本相同或更大的Kd结合人Trop-2；(b)与所述参考抗体竞争结合人Trop-2；或(c)比所述参考抗体具有更好的被Trop-2表达细胞内化，其中所述参考抗体包含SEQ ID NO:51的重链序列和SEQ IDNO:52的轻链序列。
19.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其以与参考抗体基本相同或更高的Kd结合人Trop-2；(b)与所述参考抗体竞争结合人Trop-2；或(c)比所述参考抗体具有更好的Trop-2表达细胞内化，其中所述参考抗体包含SEQ ID NO:53的重链序列和SEQ ID NO:54的轻链序列。
20.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-19中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体的混合物。
21.一种治疗患有Trop-2相关癌症的受试者的方法，包括根据权利要求1-19中任一项，向所述受试者施用治疗有效剂量的所述抗体或其抗原结合片段。
22.一种治疗患有Trop-2相关癌症的受试者的方法，包括：a)根据权利要求1-19中任一项，向所述受试者施用治疗有效剂量的所述抗体或其抗原结合片段；b)一种或多种选自免疫疗法、化学疗法、小分子激酶抑制剂靶向疗法、手术、放射疗法、疫苗接种方案和干细胞移植的额外疗法；其中，当共同施用时，分离的抗体或抗原结合片段与附加疗法之间存在协同作用，并且联合疗法提供更强的肿瘤细胞的细胞杀伤。
23.一种分离的免疫偶联物或融合蛋白，其包含根据权利要求1-19中任一项所述的一个抗体或其抗原结合片段与效应分子偶联。
24.一种分离的核酸，其包含根据权利要求1-19中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列编码。
25.一种重组表达载体，包含根据权利要求24所述的分离的核酸。
26.一种宿主细胞，包含根据权利要求25所述的载体。
27.一种特异性结合Trop-2的抗体-药物偶联物(ADC)，包括：抗Trop-2抗体或其结合片段，以及治疗剂，其中ADC具有公式：Ab-(L-D)n，其中Ab是抗Trop-2抗体或其结合片段，L是连接子或直接键，D是细胞毒素弹头，n是2至6的整数。
28.根据权利要求27所述的ADC，其中，所述抗体是包含IgG1同种型的单克隆抗体。
29.根据权利要求27所述的ADC，其中，所述抗体是人源化抗体。
30.根据权利要求27所述的ADC，其中，所述治疗剂是细胞毒剂。
31.根据权利要求30所述的ADC，其中，所述细胞毒剂是单甲基奥瑞他汀E(MMAE)。
32.根据权利要求30所述的ADC，其中所述细胞毒剂是类美登素(DM1)。
33.一种治疗癌症的方法，包括：根据权利要求27-32中的任一项，向有需要的受试者施用所述的ADC的药物组合物。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述癌症是与Trop-2表达相关的上皮细胞癌。
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