CN115785005A - 环（酪氨酸-亮氨酸）的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种环(酪氨酸‑亮氨酸)的制备方法，其特征是：采用如下步骤：步骤A：以黄水为原料，制备原料提取液；步骤B：将经步骤A制得的原料提取液进行稀释和过滤，制备膜过滤液；步骤C：将经步骤B制得的膜过滤液进行层析、浓缩、结晶，制备环(酪氨酸‑亮氨酸)粗品；步骤D：将经步骤C制得的环(酪氨酸‑亮氨酸)粗品进行反相柱分离和浓缩，制备环(酪氨酸‑亮氨酸)纯品。本发明创造性地将膜过滤、大孔树脂柱层析、反相制备色谱等多种分离技术相结合，从成分复杂的黄水中分离得到了纯度在95％以上的环(酪氨酸‑亮氨酸)，原料易得，方法简便，产物纯度高，可以为黄水中其他肽类化合物的分离制备提供技术依据。

Description

环(酪氨酸-亮氨酸)的制备方法

技术领域

本发明涉及物质的分离和提纯领域，具体涉及环(酪氨酸-亮氨酸)的制备方法。

背景技术

环(酪氨酸-亮氨酸)，英文名Cyclo(Tyr-Leu)，CAS:82863-65-8，是由酪氨酸和亮氨酸通过肽键环合而成的环二肽类化合物。

环二肽是稳定的六元环结构，同时具有两个氢键受体和两个氢键给体，而氢键是药物与受体相互作用的主要方式之一，因而环二肽在药物化学中是一个重要的药效团，表现出抗菌、抗肿瘤等多方面的生物活性。环二肽多来源于蛋白质水解、微生物菌体及动植物，原料不易得，制备成本较高。

黄水是固态酿造白酒起糟滴窖过程中产生的黄色或棕黄色粘稠状液体，是微生物以粮食为原料的发酵产物，也是白酒酿造的副产物，富含糖类、蛋白及白酒风味成份，黄水风味成份通过蒸馏方式得到回收利用，而剩余的底锅黄水则作为废液处理后排放，其中植物蛋白、微生物蛋白等在白酒酿造发酵过程中水解产生的大量肽类化合物未得到回收利用。提取、分离、纯化黄水活性肽，鉴定其结构，并进一步进行活性研究，以明确五粮液黄水活性肽的活性，一是可以提高五粮液黄水的循环利用价值，具有一定的经济效益。二是可以减轻废液处理负担，具有一定的环保效益。

本发明从白酒酿造副产物黄水中分离纯化制备环(酪氨酸-亮氨酸)，目前未见相关报道。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种环(酪氨酸-亮氨酸)的制备方法，其特征是：采用如下步骤：

步骤A：制备原料提取液：以黄水为原料，向黄水中加入有机溶剂制得混合溶液并静置，抽取所述混合溶液的上清液，对所述上清液进行过滤得滤液1，所述滤液1为原料提取液；

步骤B：制备膜过滤液：将经步骤A制得的原料提取液用去离子水稀释得稀释液，用滤膜对所述稀释液进行过滤得滤液2，所述滤液2为膜过滤液；

步骤C：制备环(酪氨酸-亮氨酸)粗品：将经步骤B制得的膜过滤液进行树脂柱层析得到层析液，对所述层析液进行浓缩、结晶，制得环(酪氨酸-亮氨酸)粗品；

步骤D：制备环(酪氨酸-亮氨酸)纯品：将经步骤C制得的环(酪氨酸-亮氨酸)粗品进行反相柱分离得分离液，对所述分离液进行浓缩，制得环(酪氨酸-亮氨酸)纯品。

进一步地，步骤A中，所述黄水为固态酿造白酒起糟滴窖过程产生的黄色或棕黄色粘稠液体，优选地，所述黄水为酿造五粮浓香型白酒产生的副产物；所述有机溶剂与黄水的体积比为3:2～4:1。

进一步地，步骤A中，所述有机溶剂为甲醇或乙醇。

进一步地，步骤A中，所述静置的温度为-10℃～20℃，静置时间为1～2天。

进一步地，步骤B中，所述原料提取液与去离子水的体积比为1:1～1:3。

进一步地，步骤B中，所述滤膜的规格为：分子截留范围150Da～10KDa。

进一步地，步骤C中，所述树脂柱为DA201和/或DA301大孔吸附树脂。

进一步地，步骤C中，所述树脂柱层析的洗脱剂为乙醇和水组成的混合溶液，所述树脂柱层析采用洗脱剂中乙醇含量0％，20％，40％，60％，80％和100％进行梯度洗脱得层析液。

进一步地，步骤C中，所述浓缩的温度为40℃～60℃，所述结晶的温度为-10℃～20℃。

进一步地，步骤D中，所述反相柱为制备色谱，所述反相柱的固定相为C18柱，所述反相柱的洗脱剂为甲醇和/或乙醇与水的混合溶液，所述反相柱分离采用梯度洗脱得分离液，所述制备色谱的流速为1～10mL/min，进样量为1～10mL，优选地，所述制备色谱的流速为3mL/min，进样量为5mL。

本发明的有益效果是：第一，本发明提供了一种制备环(酪氨酸-亮氨酸)的新方法：从五粮浓香型白酒副产物黄水中分离得到。发明人在探索黄水中健康功能因子的过程中，首次发现酿酒副产物黄水中存在环二肽，为从黄水中分离制备环(酪氨酸-亮氨酸)提供了可能，也为该类化合物的大量获得提供了新的方法。第二，黄水是白酒酿造的副产物，通常作为废液处理后排放，一方面为废液处理造成了负担，另一方面黄水中的大量肽类化合物未得到循环利用，造成了资源浪费。本发明从黄水中探究并制备环(酪氨酸-亮氨酸)，既可提高黄水的应用价值，增大黄水用途，又可以减轻废液处理负担，具有一定的环保效益。第三，本发明首次从黄水中制备分离得到环(酪氨酸-亮氨酸)，原料易得，制备方法简便，产物纯度高。本发明创造性地将膜过滤、大孔树脂柱层析、反相制备色谱等多种分离技术相结合，从成分复杂的黄水中首次分离得到了纯度在95％以上的环(酪氨酸-亮氨酸)，可以为黄水中其他肽类化合物的分离制备提供技术依据。

附图说明

图1为实施例1所得12#洗脱液的总离子流TIC图和环(酪氨酸-亮氨酸)提取离子流EIC图。

图2为实施例1所得粗品的总离子流TIC图和220nm波长紫外吸收色谱图。

图3为实施例1所得纯品的总离子流TIC图和环(酪氨酸-亮氨酸)提取离子流EIC图。

图4为实施例1所得纯品的环(酪氨酸-亮氨酸)二级质谱图。

具体实施方式

本发明的目的在于提供环(酪氨酸-亮氨酸)的制备方法，以解决现有制备方法存在的原料不易得到、制备工艺复杂等问题。

本发明提供了环(酪氨酸-亮氨酸)的制备方法，包括如下步骤：

步骤A：制备原料提取液：以黄水为原料，向黄水中加入有机溶剂制得混合溶液并静置，抽取所述混合溶液的上清液，对所述上清液进行过滤得滤液1，所述滤液1为原料提取液；

步骤B：制备膜过滤液：将经步骤A制得的原料提取液用去离子水稀释得稀释液，用滤膜对所述稀释液进行过滤得滤液2，所述滤液2为膜过滤液；

步骤C：制备环(酪氨酸-亮氨酸)粗品：将经步骤B制得的膜过滤液进行树脂柱层析得到层析液，对所述层析液进行浓缩、结晶，制得环(酪氨酸-亮氨酸)粗品；

步骤D：制备环(酪氨酸-亮氨酸)纯品：将经步骤C制得的环(酪氨酸-亮氨酸)粗品进行反相柱分离得分离液，对所述分离液进行浓缩，制得环(酪氨酸-亮氨酸)纯品。

本发明首先选用合适醇系有机试剂将黄水中的大分子多糖、蛋白等通过醇沉除去，而分子量相对较小的肽类化合物溶解于提取液中，得到肽提取液。

再采用不同规格的膜，通过循环过滤，得到不同分子截留段的膜过滤液。

然后，采用大孔树脂柱层析分离，其原理是根据树脂的吸附作用，使有机化合物根据吸附力及其分子量大小可以经一定的溶剂洗脱分开而达到分离、纯化、除杂的目的。

最后采用制备色谱反相柱分离，其原理是根据化合物的极性不同进行分离，从而达到分离纯化环(酪氨酸-亮氨酸)的目的。本发明方法中，为实现从黄水中分离和提纯环(酪氨酸-亮氨酸)的目的，需同时满足步骤A,B,C,D或步骤A,C,D。

本发明采用醇系溶剂作为提取溶剂，能将黄水中的大分子多糖、蛋白等通过醇沉除去，减少提取液中的大分子杂质成分。甲醇和乙醇的沸点较低，减压浓缩时无需设置太高的温度，既能避免目标化合物被高温破坏，又能节省时间，便于溶剂回收。因此，在本发明制备方法步骤A中，所述有机溶剂为醇系溶剂，优选地，所述醇系溶剂为甲醇或乙醇。

经过考察，甲醇或乙醇与黄水体积比为3:2～4:1时，既能充分实现黄水中大分子多糖和蛋白的沉淀，又不至于造成溶剂的浪费。为保证沉淀效果，静置温度为-10～20℃，特别是提取温度为-10～-4℃最佳，低温下大分子物质更能充分地沉淀出来，也不会造成溶剂挥发严重、损失过多。静置时间为1～2天最佳，既能实现静置状态下固液充分分离，又能够避免杂质过多地进入提取液，给后续的分离纯化带来困难。

当使用甲醇或乙醇作为醇沉溶剂时，黄水中大分子的多糖和蛋白可以得到充分沉淀，但仍有一定分子量范围的杂质溶解于醇系溶剂中，即原料提取液中，由此，根据环(酪氨酸-亮氨酸)的分子量范围，再利用不同规格的膜进行循环过滤处理，拦截不需要的分子量段，收集需要的分子量段。因黄水中酸含量高达5％，有机溶剂含量高，直接过膜处理会影响膜的使用效果和寿命，所以需要将醇系提取液以去离子水稀释后再进行膜过滤处理。先以10KDa的超滤膜过滤除去提取液中分子量在10KDa以上的部分，再以150Da的超滤膜过滤除去提取液中分子量在150Da以下的部分，得到分子量范围在150Da～10KDa之间的部分，即为环(酪氨酸-亮氨酸)所在的目标膜过滤液部分。提取液中分子量在150Da以下的部分，主要为水、醇系溶剂及乳酸成分，是膜过滤液的主要成分，除去这一部分，可以大大降低后处理的除杂难度，提高环(酪氨酸-亮氨酸)纯化效率。

目标膜过滤液中仍然还有大量杂质成分需要除去，由此利用大孔树脂根据膜过滤液中各化合物吸附力和分子量大小的不同实现进一步分离化合物的原理，除去杂质部分，收集环(酪氨酸-亮氨酸)所在的部分，得到环(酪氨酸-亮氨酸)粗品。

环(酪氨酸-亮氨酸)粗品，甲醇溶解，进样高效液相色谱检测，220nm波长下的紫外吸收峰不仅有目标化合物环(酪氨酸-亮氨酸)，还有少量的杂峰，因此进一步利用制备色谱，反相C18柱，以甲醇和/或乙醇与水为洗脱试剂，梯度洗脱，收集220nm波长下的紫外吸收峰。

制备色谱收集样品，经高分辨的高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱，以化合物质荷比、同位素相对丰度、同位素比例等的相似度以及二级质谱特征离子为依据进行鉴定，最终确定为目标化合物环(酪氨酸-亮氨酸)。

实施例1

步骤A：制备原料提取液：取五粮液浓香型白酒酿造过程中的副产物黄水20L，静置1天，得黄水上清液18L，将27L无水乙醇加入黄水上清液，搅匀得到混合溶液，将该混合溶液于-4℃静置1天后，抽取该混合溶液的上清液，用0.45μm的滤膜过滤该混合溶液的上清液得到滤液40L，该40L滤液即为原料提取液。

步骤B：制备膜过滤液：将步骤A制备得到的原料提取液与去离子水按照体积比1:1混合得到稀释液80L，用10KDa的卷式膜对稀释液进行循环过滤处理，得到10KDa分子量以内的膜过滤液72L；再以150Da卷式膜对该72L膜过滤液进行循环过滤处理，得到150Da～10KDa分子量截留段的膜过滤液6L。

步骤C：制备环(酪氨酸-亮氨酸)粗品：所述大孔树脂柱为2Kg吸附树脂DA201，用无水乙醇浸泡4h，湿法装柱，去离子水清洗至流出液以3倍水稀释后不浑浊为止，洗净待用。将经步骤B得到的150Da分子量截留段的膜过滤液6L，以去离子水12L稀释，上样已洗净的大孔树脂柱，流速为10mL/min。以乙醇-水为洗脱剂，乙醇含量0％，20％，40％，60％，80％，100％的比例各12L依次进行梯度洗脱层析，收集各段洗脱所得的层析液，各段层析液分别上样高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱，220nm波长紫外检测器，质谱检测器同时检测，确定目标化合物环(酪氨酸-亮氨酸)所在的20％乙醇洗脱段(12#层析液)，12#层析液的总离子流图(TIC)和环(酪氨酸-亮氨酸)提取离子流图(EIC)如图1所示，根据图1可知，12#层析液中仍含有大量杂质，40℃浓缩12#层析液，浓缩液于20℃放置，结晶，得结晶体138mg，即为环(酪氨酸-亮氨酸)粗品。

步骤D：制备环(酪氨酸-亮氨酸)纯品：将步骤C所得到的粗品溶解于50％甲醇水溶液中，高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱，220nm波长紫外检测器，质谱检测器同时检测，以确定粗品中杂质成分，粗品的总离子流图(TIC)和220nm波长紫外吸收色谱图如图2所示。检测结果表明，粗品中仍含有其他杂质成分，由此将粗品溶解液进样制备色谱，反相C18柱的规格为

XB-C18,21.2×250mm，5μm，流速为3mL/min，进样量5mL，以液相色谱级乙醇与超纯水为洗脱剂梯度洗脱，收集波长220nm下的紫外吸收峰，浓缩，干燥，得到环(酪氨酸-亮氨酸)纯品82mg。

称取步骤D所得到的环(酪氨酸-亮氨酸)纯品1mg，以甲醇配制成浓度为0.1mg/mL的混合溶液，上样高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱，以环(酪氨酸-亮氨酸)标准品进行定性定量分析。结果显示：纯品中环(酪氨酸-亮氨酸)含量为97.21％，纯品检测的总离子流图(TIC)和环(酪氨酸-亮氨酸)提取离子流图如图3所示，环(酪氨酸-亮氨酸)二级质谱图如图4所示。

实施例2

步骤A：制备原料提取液：取五粮液浓香型白酒酿造过程中的副产物黄水20L，静置1天，得上清液18L，60℃旋蒸浓缩，得到8L黄水浓缩液，将32L无水乙醇加入黄水浓缩液，搅匀得到混合溶液，将该混合溶液于20℃静置1天后，抽取该混合溶液的上清液，用0.45μm的滤膜过滤该混合溶液的上清液得到滤液36L，该36L滤液即为原料提取液。

步骤B：所述大孔树脂柱为2Kg吸附树脂DA301，用无水乙醇浸泡4h，湿法装柱，去离子水清洗至流出液以3倍水稀释后不浑浊为止，洗净待用。将步骤A得到的原料提取液于60℃旋蒸浓缩，得浓缩浸膏780g，以去离子20L分散浸膏，分散液上样已洗净的大孔树脂柱，流速为10mL/min。以乙醇-水为洗脱剂，乙醇含量0％，20％，40％，60％，80％，100％的比例各12L依次进行梯度洗脱层析，收集各段层析液，各段层析液分别上样高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱，220nm波长紫外检测器，质谱检测器同时检测，确定目标化合物环(酪氨酸-亮氨酸)所在的20％乙醇洗脱段(22#洗脱液)，浓缩22#洗脱液，浓缩液于-4℃低温结晶，得结晶体117mg。

步骤C：将步骤B所得到的结晶溶解于50％甲醇水溶液中，高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱，220nm波长紫外检测器，质谱检测器同时检测，以确定粗品中杂质成分，检测结果表明，粗品中仍含有其他杂质成分，由此将粗品溶解液进样制备色谱，进样制备色谱，反相C18柱的规格为

XB-C18,21.2×250mm，5μm，流速为3mL/min，进样量5mL，以液相色谱级乙醇与超纯水为洗脱剂梯度洗脱，收集波长220nm下的紫外吸收峰，浓缩，干燥，得到环(酪氨酸-亮氨酸)纯品67mg。

称取步骤C所得到的环(酪氨酸-亮氨酸)纯品1mg，以甲醇配制成浓度为0.1mg/mL的混合溶液，上样高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱，以环(酪氨酸-亮氨酸)标准品进行定性定量分析，结果是纯品中环(酪氨酸-亮氨酸)含量为96.88％。

Claims (10)

1.环(酪氨酸-亮氨酸)的制备方法，其特征是：采用如下步骤：

步骤A：制备原料提取液：以黄水为原料，向黄水中加入有机溶剂制得混合溶液并静置，抽取所述混合溶液的上清液，对所述上清液进行过滤得滤液1，所述滤液1为原料提取液；

步骤B：制备膜过滤液：将经步骤A制得的原料提取液用去离子水稀释得稀释液，用滤膜对所述稀释液进行过滤得滤液2，所述滤液2为膜过滤液；

步骤C：制备环(酪氨酸-亮氨酸)粗品：将经步骤B制得的膜过滤液进行树脂柱层析得到层析液，对所述层析液进行浓缩、结晶，制得环(酪氨酸-亮氨酸)粗品；

步骤D：制备环(酪氨酸-亮氨酸)纯品：将经步骤C制得的环(酪氨酸-亮氨酸)粗品进行反相柱分离得分离液，对所述分离液进行浓缩，制得环(酪氨酸-亮氨酸)纯品。

2.根据权利要求1所述的环(酪氨酸-亮氨酸)的制备方法，其特征是：步骤A中，所述黄水为固态酿造白酒起糟滴窖过程产生的黄色或棕黄色粘稠液体，优选地，所述黄水为酿造五粮浓香型白酒产生的副产物；所述有机溶剂与黄水的体积比为3:2～4:1。

3.根据权利要求1所述的环(酪氨酸-亮氨酸)的制备方法，其特征是：步骤A中，所述有机溶剂为甲醇或乙醇。

4.根据权利要求1所述的环(酪氨酸-亮氨酸)的制备方法，其特征是：步骤A中，所述静置的温度为-10℃～20℃，静置时间为1～2天。

5.根据权利要求1所述的环(酪氨酸-亮氨酸)的制备方法，其特征是：步骤B中，所述原料提取液与去离子水的体积比为1:1～1:3。

6.根据权利要求1所述的环(酪氨酸-亮氨酸)的制备方法，其特征是：步骤B中，所述滤膜的规格为：分子截留范围150Da～10KDa。

7.根据权利要求1所述的环(酪氨酸-亮氨酸)的制备方法，其特征是：步骤C中，所述树脂柱为DA201和/或DA301大孔吸附树脂。

8.根据权利要求1所述的环(酪氨酸-亮氨酸)的制备方法，其特征是：步骤C中，所述树脂柱层析的洗脱剂为乙醇和水组成的混合溶液，所述树脂柱层析采用洗脱剂中乙醇含量0％，20％，40％，60％，80％和100％进行梯度洗脱得层析液。

9.根据权利要求1所述的环(酪氨酸-亮氨酸)的制备方法，其特征是：步骤C中，所述浓缩的温度为40℃～60℃，所述结晶的温度为-10℃～20℃。

10.根据权利要求1所述的环(酪氨酸-亮氨酸)的制备方法，其特征是：步骤D中，所述反相柱为制备色谱，所述反相柱的固定相为C18柱，所述反相柱的洗脱剂为甲醇和/或乙醇与水的混合溶液，所述反相柱分离采用梯度洗脱得分离液，所述制备色谱的流速为1～10mL/min，进样量为1～10mL，优选地，所述制备色谱的流速为3mL/min，进样量为5mL。

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