CN115779150B - 抗钙化动物源性生物材料、制备方法及其在人工心脏瓣膜、生物补片的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抗钙化动物源性生物材料、制备方法及其在人工心脏瓣膜、生物补片的应用，其中抗钙化动物源性生物材料通过选用合适的透化液和处理参数，来适度增加细胞膜通透性，并在保证细胞膜通透性增加即更易于更完全的处理掉细胞内的糖蛋白的同时，减少对组织蛋白质的破坏；再选用能特异性降解Neu5Gc和αGal的酶，并选用合适的酶解参数，更大程度的减少这个过程对胶原纤维的影响，从而达到不影响组织的力学性能的前提下，完全去除细胞内的糖蛋白。本发明在原有抗钙化处理的基础上，去除组织免疫原性聚糖，减少了生物组织的钙化，延长了生物组织的使用寿命。

Description

抗钙化动物源性生物材料、制备方法及其在人工心脏瓣膜、生 物补片的应用

技术领域

本发明涉及医药生物材料技术领域，具体而言涉及一种抗钙化动物源性生物材料、制备方法及其在人工心脏瓣膜、生物补片的应用。

背景技术

生物医用材料(Biomedical Materials)是用来对生物体进行诊断、治疗、修复或替换其病损组织、器官或增进其功能的材料。它是研究人工器官和医疗器械的基础，已成为当代材料学科的重要分支，尤其是随着生物技术的蓬勃发展和重大突破，生物医用材料已成为各国科学家竞相进行研究和开发的热点。

生物医用材料应用广泛，可用于骨、牙、关节、肌腱等骨骼-肌肉系统修复材料，皮肤、乳食道、呼吸道、膀胱等软组织材料，人工心脏瓣膜、血管、心血管内插管等心血管系统材料，血液净化膜和分离膜、气体选择性透过膜、角膜接触镜等医用膜材料，等等。

生物医用材料按材料的组成和性质可以分为生物医用金属材料、生物医用无机非金属材料、生物医用高分子材料、生物医用复合材料以及生物衍生材料。其中，生物衍生材料是由经过特殊处理的天然生物组织形成的生物医用材料，也称为生物再生材料。生物组织可取自同种或异种动物体的组织，特殊处理包括维持组织原有构型而进行的固定、灭菌和消除抗原性的轻微处理，以及拆散原有构型、重建新的物理形态的强烈处理。由于经过处理的生物组织已失去生命力，生物衍生材料是无生命力的材料。但是，由于生物衍生材料或是具有类似于自然组织的构型和功能，或是其组成类似于自然组织，在维持人体动态过程的修复和替换中具有重要作用。

目前，临床上常用在人工心脏瓣膜、生物补片等领域的生物衍生材料取自动物源性胶原纤维组织，这类产品在植入后，易产生钙化，钙化会引起生物组织材料硬化、撕裂等，从而导致组织材料失效。

生物组织产生钙化的原因有很多，比如，许多生物组织材料使用如戊二醛和/或甲醛贮存，或用这些化学试剂进行交联固定处理，而瓣膜组织经过戊二醛交联后，在植入后残留的戊二醛会促进瓣膜的钙化，戊二醛交联不充分，残留的胺基、醛基、羧基等，形成钙化结合点，容易产生钙化。此外，戊二醛溶液保存生物组织，容易氧化生物组织，形成羧酸，产生钙化结合点，导致钙化。又如，生物组织内存在的某些物质可能会引起钙化

目前现有技术的抗钙化的方案中，更多的是集中在减少戊二醛等化学试剂的影响，或者通过去除组织内可能钙化的物质，如磷脂残留来减少甚至消除钙化的因素。

然而，动物组织中还包含有人体所不能产生的糖类，如Neu5Gc，如果不加以处理，这些组织在植入人体后，其中的非人类糖类会诱导受体产生有害免疫反应，产生的抗体会介导生物瓣膜的瓣叶的钙化。这些外来糖类的抗体反应最早出现在植入后一个月，并可能持续一定时长，最终影响瓣膜的使用寿命。

发明内容

本发明目的在于针对生物组织中免疫原性聚糖诱导受体产生有害免疫反应，产生的抗体会介导生物瓣膜的瓣叶钙化的问题，提供一种抗钙化动物源性生物材料的其制备方法，在原有抗钙化处理的基础上，去除组织免疫原性聚糖，以延长瓣膜使用寿命。

本发明第一方面涉及一种抗钙化动物源性生物材料的制备方法，通过去除生物组织中的免疫原性聚糖，减少生物组织植入后受体产生的抗体反应，从而减少免疫糖类抗体介导钙化，提高生物组织的抗钙化能力。

作为可选的实施方式，所述制备方法包括如下步骤：

对获取的新鲜生物组织进行处理，清除表面残留脂肪、血渍、血管，并清洗干净；

将处理后的生物组织进行交联固定处理，得到第一生物组织；

将第一生物组织进行透化处理，在不改变细胞形态的前提下，增加细胞膜的通透性，促进外来溶液的渗透，得到第二生物组织；

将第二生物组织进行解离处理，在维持生物组织骨架结构的前提下，分解细胞外基质中、细胞膜上和细胞内的免疫原性聚糖，得到第三生物组织；

将第三生物组织进行物理处理，进一步分解细胞表面和细胞内免疫原性聚糖，得到第四生物组织；

清洗第四生物组织，去除解离液，得到抗钙化动物源性生物材料。

作为可选的实施方式，所述免疫原性聚糖包括Neu5Gc和αGal。

作为可选的实施方式，生物组织包括牛/猪/马的心包/瓣膜/肠膜/血管/韧带中的一种。

作为可选的实施方式，透化处理采用的透化液为采用表面活性剂、螯合剂或膜渗透增强剂中的至少一种所配制获得的缓冲溶液。

作为可选的实施方式，当透化液中含有表面活性剂时，表面活性剂的质量百分比为0.1％～2％。其中，所述表面活性剂包括Tween80、Triton X-100、十二烷基麦芽糖苷、洋地黄皂苷、SDS、脱氧胆酸钠、胆酸钠或肌氨酸中的至少一种。

作为可选的实施方式，当透化液中含有螯合剂时，螯合剂的质量百分比为0.01％～4％。其中，所述螯合剂包括EDTA、STPP、NTA、DTPA、CA、TA、GA或DEG中的至少一种。

作为可选的实施方式，当透化液中含有膜渗透增强剂时。膜渗透增强剂的质量百分比为6％～10％。其中，所述膜渗透增强剂包括二甲基亚砜。

作为可选的实施方式，透化液中还含有有机溶剂，有机溶剂的质量百分比为0％～40％，即采用表面活性剂、螯合剂或膜渗透增强剂中的至少一种中，与有机溶剂混合配制所述的透化液。其中，有机溶剂为甲醇、乙醇、己烷、甲苯或氯仿中的至少一种。

作为可选的实施方式，对第一生物组织进行透化处理，包括：

处理温度为4～14℃，处理时长为6～24h。

作为可选的实施方式，解离处理采用的解离液为含有具有解离作用的酶类的缓冲溶液。

作为可选的实施方式，解离液中的酶类的质量百分比为0.6％～10％。其中，所述酶类为蜜二糖酶，菊粉酶，麦芽糖酶或β-半乳糖苷酶中的至少一种。

作为可选的实施方式，解离液中还含有有机酸，有机酸的质量百分比为0％～3％。即采用具有解离作用的酶类与有机酸的混合，配制所述的解离液。其中，所述有机酸为柠檬酸、醋酸、乳酸、葡萄糖酸、酒石酸、甘草次酸、草酸、山梨酸或苯甲酸中的至少一种。

作为可选的实施方式，对第二生物组织进行解离处理，包括：

解离液的pH调节为4.5～6.3；

处理温度为20～42℃，处理时长为3～17h。

作为可选的实施方式，对第三生物组织进行物理处理的方法包括振荡处理、微波处理，超声波处理中的一种或多种。

作为可选的实施方式，交联固定处理采用含戊二醛的缓冲溶液，浓度为0.6～0.7(w/v)％。

本发明第二方面涉及一种根据前述制备方法制备的抗钙化动物源性生物材料。

由以上本发明的技术方案，提供的抗钙化动物源性生物材料的制备方法，对交联固定好的组织，首先采用透化处理，在减少对组织蛋白质破坏以不改变细胞形态的前提下，增加细胞膜通透性，促进液体渗透，从而为后续的解离过程提供基础，提升解离液的处理效果。

在上述基础上，再采用解离液催化分解免疫原性聚糖，并最大程度的减少解离过程对细胞外基质中胶原纤维的影响，维持生物组织的骨架结构，从而保证生物组织力学性能，在此前提下，将细胞外基质中、细胞膜上，尤其是细胞内的免疫原性聚糖完全催化水解，从而减少免疫糖类抗体介导钙化，提高生物组织的抗钙化能力。

附图说明

图1是本发明的抗钙化动物源性生物材料的制备方法的工艺流程图。

图2是中本发明实施例1新鲜生物组织的组织显微图。

图3是本发明实施例1新鲜生物组织交联固定处理后的组织显微图。

图4是本发明实施例2透化处理后的生物组织的组织显微图。

图5是本发明实施例2解离及物理处理后的生物组织的组织显微图。

图6是本发明实施例1-3及对比例的样品钙化测试烘干后的组织图片。

具体实施方式

为了更了解本发明的技术内容，特举具体实施例并配合所附图式说明如下。

在本公开中参照附图来描述本发明的各方面，附图中示出了许多说明的实施例。本公开的实施例不必定意在包括本发明的所有方面。应当理解，上面介绍的多种构思和实施例，以及下面更加详细地描述的那些构思和实施方式可以以很多方式中任意一种来实施。

糖蛋白是分支的寡糖链与多肽链共价相连所构成的复合糖，Neu5Gc、αGal是人以外多数食肉动物自身会合成的糖蛋白，因此在含有糖蛋白的动物组织植入人体后，身体会产生相应的抗体，而产生的抗体会介导生物瓣膜的瓣叶的钙化，因此也可以称为免疫原性聚糖或非人类聚糖。

在动物组织中，糖蛋白存在于细胞外基质，还存在于细胞膜上以及细胞内。

细胞膜上的糖蛋白位于细胞膜外表面，即朝细胞外基质的一面，因此细胞膜上的糖蛋白和细胞外基质中的糖蛋白均暴露在细胞外，在使用溶剂处理时，更容易处理，而受细胞膜的影响，细胞内的糖蛋白比细胞膜上和细胞外基质里的糖蛋白更难去除。

在考虑脱除细胞内部糖蛋白时，一方面需要考虑是否会改变细胞形态，细胞形态改变会造成细胞裂解、坏死，并以碎片的形式存在于细胞外基质中，碎片会引起免疫反应，从而形成钙化点；同时，裂解坏死的细胞会使基质中形成空缺，影响力学性能的同时也会形成钙化点。另一反面，需要考虑是否会影响细胞外基质中胶原纤维形成的组织骨架，胶原纤维的破坏会影响骨架的结构，从而影响整个生物组织的力学性能。

细胞膜上及细胞内的糖蛋白可以通过脱细胞的方法去除，但是目前常用的脱细胞方法，在脱细胞的同时也会对纤维结构造成破坏，且破坏程度随脱细胞的干净程度而加剧，还容易造成生物组织吸水肿胀、挠曲度下降、生物组织力学性能下降，不利于使用。

因此，本发明提出一种抗钙化动物源性生物材料的制备方法，通过选用合适的透化液和处理参数，来适度增加细胞膜通透性，并在保证细胞膜通透性增加即更易于更完全的处理掉细胞内的糖蛋白的同时，减少对组织蛋白质的破坏。

通过透化液适度增加细胞膜通透性，使后续解离液可以更好的渗透到细胞内的基础上，再选用能特异性降解Neu5Gc和αGal的酶，并选用合适的酶解参数，更大程度的减少这个过程对胶原纤维即组织骨架的影响，从而达到不影响组织的力学性能的前提上，完全去除细胞内的糖蛋白。

如图1所示，在本发明示例性的实施例中，提出一种抗钙化动物源性生物材料的制备方法，通过去除生物组织中的免疫原性聚糖，减少生物组织植入后受体产生的抗体反应，从而减少免疫糖类抗体介导钙化，提高生物组织的抗钙化能力。

作为可选的实施方式，所述制备方法包括如下步骤：

对获取的新鲜生物组织进行处理，清除表面残留脂肪、血渍、血管，并清洗；其中，生物组织可以选自牛/猪/马的心包/瓣膜/肠膜/血管/韧带中的一种；

将处理后的生物组织进行交联固定处理，得到第一生物组织；

对第一生物组织进行透化处理，在不改变细胞形态的前提下，增加细胞膜的通透性，得到第二生物组织；

对第二生物组织进行解离处理，在维持生物组织骨架结构的前提下，分解细胞外基质中、细胞膜上和细胞内的免疫原性聚糖，得到第三生物组织；

对第三生物组织进行物理处理，进一步分解细胞表面和细胞内免疫原性聚糖，得到第四生物组织；

清洗第四生物组织，去除解离液，得到抗钙化动物源性生物材料。

下面，我们结合附图所示，更加具体的描述本发明的前述方法的各个方面的实施过程和/或取得的结果。

对获取的新鲜生物组织进行处理，其中清除残留脂肪、血渍、血管的方式和过程可以按照本领域常规手段处理即可，详细过程在此不再赘述。清洗干净之后，备用。

在前述方法中，通过解离处理/物理处理，所分解和去除的免疫原性聚糖为Neu5Gc和αGal。

作为可选的实施方式，透化处理采用的透化液为采用表面活性剂、螯合剂或膜渗透增强剂中的至少一种所配制的缓冲溶液。应当理解，缓冲溶液中所采用的缓冲溶剂可以采用现有的商用缓冲溶剂。包括但不限于PBS、HEPES等。

在另外的实施例中，前述的透化液还可以采用表面活性剂、螯合剂或膜渗透增强剂中的至少一种，与有机溶剂混合配制。其中，有机溶剂的质量百分比为0％～40％。

作为可选的示例，有机溶剂为甲醇、乙醇、己烷、甲苯或氯仿中的至少一种。

其中，透化液中含有质量百分比为0％～40％的有机溶剂，是指透化液中可以不含有有机溶剂，或者最多含有40wt.％的有机溶剂。

例如，在其中一个实施例中，透化液为含有表面活性剂的缓冲溶液；在另一个实施例中，透化液为含有表面活性剂和有机溶剂的缓冲溶液。

作为可选的示例，透化液同时含有有机溶液，以及表面活性剂/螯合剂/膜渗透中的至少一种时，可以在保持细胞形态的同时，通过协同作用加强促渗透作用。

作为可选的示例，由于磷脂对钙离子有转运和富集作用，并提供形成和保护磷酸钙微晶的微环境，当透化液含有表面活性剂时，还可起到阻止磷脂渗入生物组织的屏障作用，从而可协助更好的减轻钙化。

作为可选的实施方式，当透化液中含有表面活性剂时，表面活性剂的质量百分比为0.1％～2％，其中，表面活性剂为Tween80、Triton X-100、十二烷基麦芽糖苷、洋地黄皂苷、SDS、脱氧胆酸钠、胆酸钠或肌氨酸中的至少一种。

作为可选的实施方式，当透化液中含有螯合剂时，螯合剂的质量百分比为0.01％～4％，其中，螯合剂为EDTA、STPP、NTA、DTPA、CA、TA、GA或DEG中的至少一种。

作为可选的实施方式，当透化液中含有膜渗透增强剂时，膜渗透增强剂的质量百分比为6％～10％，其中，膜渗透增强剂为二甲基亚砜。

应当理解为，表面活性剂还可以为上述列出的两种及以上物质的混合，本领域技术人员可根据实际情况调解混合的各物质之间比例关系。

当然，螯合剂和有机溶剂的种类也可以为上述列出的两种及以上物质的混合，比例关系可根据实际情况调节。

作为可选的实施方式，对第一生物组织进行透化处理，包括：

处理温度为4～14℃，处理时长为6～24h。

作为可选的实施方式，解离处理采用的解离液为含有具有解离作用的酶类的缓冲溶液。

作为可选的实施方式，解离液中含有有机酸，有机酸的质量百分比为0％～3％，有机酸为柠檬酸、醋酸、乳酸、葡萄糖酸、酒石酸、甘草次酸、草酸，山梨酸或苯甲酸。

作为可选的实施方式，解离液中酶类的质量百分比为0.6％～10％，酶类为蜜二糖酶，菊粉酶，麦芽糖酶或β-半乳糖苷酶。

解离液中含有质量百分比为0％～3％的有机酸，是指解离液中可以不含有有机酸，或者最多含有3wt.％的有机酸。

例如，在其中一个实施例中，解离液为含有蜜二糖酶的缓冲溶液；在另一个实施例中，解离液为含有蜜二糖酶和有机酸的缓冲溶液。

当解离液中同时含有酶类和有机酸时，在酶类的基础上加有机酸，可以在保持生物组织结构的同时，增强糖蛋白的分解效果，提高分解效率。

应当理解为，具有解离作用的酶类还可以为上述列出的两种及以上的组合，本领域技术人员可根据实际情况调解混合的各物质之间比例关系。

以此类推，有机酸的种类也可以为上述列出的两种及以上物质的混合，比例关系可根据实际情况调节。

作为可选的实施方式，对第二生物组织进行解离处理，包括：

解离液的pH调节为4.5～6.3，在低的pH范围内，解离液能发挥更好的解离作用效果；

处理温度为20～42℃，处理时长为3～17h。

作为可选的实施方式，对第三生物组织进行物理处理的方法包括振荡处理、微波处理，超声波处理中的一种或多种。

物理处理本身有一定的分解糖类的作用，在解离处理的基础上加入物理处理，可以进一步有效提高分解效果。

作为可选的实施方式，交联固定处理采用含戊二醛的缓冲溶液，浓度为0.6～0.7(w/v)％，尤其优选为0.625(w/v)％。

前述所用的缓冲溶液中选用20mmol/L HEPES作为缓冲溶剂，pH调节皆采用常规的盐酸水溶液和氢氧化钠水溶液进行调节，盐酸和氢氧化钠的浓度可根据实际选择，在此不做限定。

应当理解为，缓冲溶液的作用为维持体系的稳定，作为平衡性盐溶液，本领域技术人员可根据实际情况进行选择，例如，在一些实施例中，还可以采用磷酸盐缓冲液(PBS)。

由此，根据本发明前述方法对动物的新鲜生物组织进行处理，实现抗钙化处理，获得抗钙化动物源性生物材料，减少生物瓣膜植入后受体产生的抗体反应，可提高生物瓣膜的抗钙化能力，具有优秀的耐久性。

根据本发明的实施例，还提出一种根据本前述制备的抗钙化动物源性生物材料，用来制备成人工心脏瓣膜或者生物补片，例如提高人工心脏瓣膜或者生物补片的抗钙化性能，减少其注入人体或者在人体上应用时引起生物组织材料硬化、撕裂等缺陷。

为了便于更好的理解，下面结合具体实例对本发明进行进一步说明，但制备方法不限于此，且本发明内容不限于此。

以下实施例所用试剂、设备的生产厂家分别如下：

戊二醛：Sigma-Aldrich

生理盐水：华仁药业

异丙醇：沪试

Triton X-100：沪试

蜜二糖酶：Sigma-Aldrich

乙醇：沪试

吐温80：沪试

菊粉酶：Sigma-Aldrich

EDTA：Sigma-Aldrich

SDS：Sigma-Aldrich

柠檬酸：ALFA AESAR

生化培养箱：上海一恒LRH-150

超声波清洗机：上海科岛SK3310HP

恒温振荡器：上海精其CHA-2

实施例1

[样品的前处理]

新鲜组织处理：获取新鲜生物组织，清除表面残留脂肪、血渍、血管等，并清洗干净。

组织固定：将处理好的新鲜组织放入浓度为0.625(w/v)％的戊二醛的缓冲溶液(20mmol/L的HEPES)中固定。

将交联后的牛心包选取厚薄均匀的部分裁剪成50mmx50mm的小片，并用生理盐水在室温下进行充分清洗。

实施例2

配制透化液：浓度0.45(w/v)％的Triton X-100的缓冲溶液(20mmol/L的HEPES)。

配制解离液：浓度7.0(w/v)％的蜜二糖酶的缓冲溶液(20mmol/L的HEPES)，pH调节为6.3。

将按照实施例1的方法完成交联的心包浸泡到200mL透化液中，放入生化培养箱中，设定4℃，处理9h。

将完成透化的心包加入200mL解离液中，连同溶液放入超声波清洗机中，设定功率40％，处理3h。

将组织小片从溶液中取出，在异丙醇水溶液和蒸馏水中分别清洗30min，充分清洗去除残留的解离液，处理结束，得到样品1。

实施例3

配制透化液：浓度35.0(w/v)％的乙醇+2.0(w/v)％的吐温80的缓冲溶液(20mmol/L的HEPES)。

配制解离液：浓度5.3(w/v)％的菊粉酶的缓冲溶液(20mmol/L的HEPES)，调节溶液pH至5.5。

将按照实施例1的方法完成交联的小样浸泡到200mL透化液中，放入生化培养箱中，设定10℃，处理6h。

将完成透化的小样加入200mL解离液中，连同溶液放入恒温振荡器中，设定37℃和500rpm，处理9h。

将组织小片从溶液中取出，在异丙醇水溶液和蒸馏水中分别清洗30min，充分清洗去除残留的解离液，处理结束，得到样品2。

实施例4

配制透化液：浓度2.9(w/v)％的EDTA+0.8(w/v)％的SDS的缓冲溶液(20mmol/L的HEPES)。

配制解离液：浓度3.7(w/v)％的蜜二糖酶+0.6(w/v)％的柠檬酸的缓冲溶液(20mmol/L的HEPES)，调节溶液pH至4.5。

将按照实施例1的方法完成交联的小样浸泡到200mL透化液中，放入生化培养箱中，设定14℃，处理20h。

将完成透化的小样加入200mL解离液中，连同溶液放入恒温振荡器中，设定20℃和300rpm，处理17h。

将组织小片从溶液中取出，在异丙醇水溶液和蒸馏水中分别清洗30min，充分清洗去除残留的解离液，处理结束，得到样品3。

对照例1

取按照实施例1的方法处理的90份小样，浸泡到200mL生理盐水中，放入生化培养箱中，设定14℃，处理24h。

将经过24h处理完的心包转移到新的200mL生理盐水中，室温下放置17h。

结束处理后，将心包从溶液中取出，在异丙醇水溶液和蒸馏水中分别清洗30min，充分清洗去除残留的生理盐水，得到对照样品。

组织显微图

对实施例1中的新鲜生物组织(新鲜生物组织)、交联固定处理后的组织(第一生物组织)，以及实施例2中的透化处理后的生物组织(第二生物组织)、解离及物理处理后的生物组织(第四生物组织)进行显微观察，其结果如图2、图3、图4和图5所示。

从图中可以看出，与新鲜生物组织(图2)相比，第一生物组织(图3)经过交联固定后，纤维排列规则，第二生物组织(图3)、第四生物组织(图4)的心包组织纤维仍呈波浪状平行排列，连续性好，无明显断裂，且与第一生物组织相比，结构无明显松散，无明显细胞减少或细胞结构破坏。由此可见，透化液、解离液及物理处理对心包的组织强度无显著影响。

性能测定

钙含量测定

将对照样品分别植入90只大鼠左侧皮下，作为对照组，90天后处死大鼠并应用原子火焰吸收法测定心包钙含量，并计算平均值。

将样品1植入其中30只已植入对照组样品的大鼠的右侧皮下，90天后处死大鼠并应用原子火焰吸收法测定心包钙含量，并计算平均值。

将样品2植入另外30只已植入对照组样品的大鼠的右侧皮下，90天后处死大鼠并应用原子火焰吸收法测定心包钙含量，并计算平均值。

将样品3植入另外30只已植入对照组样品的大鼠的右侧皮下，90天后处死大鼠并应用原子火焰吸收法测定心包钙含量，并计算平均值。

同时，测试对照样品和样品1-3的力学性能。

其结果如下表所示

由测试结果，可知：

样品1-样品3的大鼠皮下植入结果均明显优于对照样品，其钙含量可降低99％以上。

结合图5，从大鼠皮下取出的心包片，对照样品出现明显钙化，样品1、样品2、样品3无肉眼可见的钙沉积。因此，可以说明通过本发明的方法去除生物组织糖类能够起到抗钙化作用。

样品1-样品3的的拉伸强度及延伸率与对照样品无明显差别，结合组织显微图可以说明通过本发明的方法去糖对生物组织的力学性能无明显影响。

虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。

Claims (14)

1.一种抗钙化动物源性生物材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

对获取的新鲜生物组织进行处理，清除表面残留脂肪、血渍、血管，并清洗；

将处理后的生物组织进行交联固定处理，得到第一生物组织；

对第一生物组织进行透化处理，在不改变细胞形态的前提下，增加细胞膜的通透性，得到第二生物组织；其中，透化处理采用的透化液为含有表面活性剂、螯合剂或膜渗透增强剂中的任意一种配制的缓冲溶液；

对第二生物组织进行解离处理，在维持生物组织骨架结构的前提下，分解细胞外基质中、细胞膜上和细胞内的免疫原性聚糖，得到第三生物组织；其中，解离处理采用的解离液为含有具有解离作用的酶类的缓冲溶液，所述酶类为蜜二糖酶，菊粉酶，麦芽糖酶或β-半乳糖苷酶中的至少一种；

对第三生物组织进行物理处理，进一步分解细胞表面和细胞内免疫原性聚糖，得到第四生物组织；其中，物理方法包括振荡处理、微波处理、超声波处理中的一处或多种；

清洗第四生物组织，去除解离液，得到抗钙化动物源性生物材料。

2.根据权利要求1所述的抗钙化动物源性生物材料的制备方法，其特征在于，所述免疫原性聚糖包括Neu5Gc和αGal。

3.根据权利要求1所述的抗钙化动物源性生物材料的制备方法，其特征在于，生物组织包括牛/猪/马的心包/瓣膜/肠膜/血管/韧带中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的抗钙化动物源性生物材料的制备方法，其特征在于，所述透化液中含有表面活性剂时，所述表面活性剂的质量百分比为0.1%~2%。

5.根据权利要求4所述的抗钙化动物源性生物材料的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂包括Tween80、Triton X-100、十二烷基麦芽糖苷、洋地黄皂苷、SDS、脱氧胆酸钠、胆酸钠或肌氨酸中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的抗钙化动物源性生物材料的制备方法，其特征在于，所述透化液中含有螯合剂时，螯合剂的质量百分比为0.01%~4%。

7.根据权利要求6所述的抗钙化动物源性生物材料的制备方法，其特征在于，所述螯合剂包括EDTA、STPP、NTA、DTPA、CA、GA或DEG中的至少一种。

8.根据权利要求1所述的抗钙化动物源性生物材料的制备方法，其特征在于，所述透化液中含有膜渗透增强剂时，所述膜渗透增强剂的质量百分比为6%~10%。

9.根据权利要求8所述的抗钙化动物源性生物材料的制备方法，其特征在于，所述膜渗透增强剂包括二甲基亚砜。

10.根据权利要求1所述的抗钙化动物源性生物材料的制备方法，其特征在于，对第一生物组织进行透化处理，包括：

透化处理温度为4~14℃，透化处理时长为6~24h。

11.根据权利要求1所述的抗钙化动物源性生物材料的制备方法，其特征在于，所述解离液中所包含的具有解离作用的酶类的质量百分比为0.6%~10%。

12.根据权利要求1所述的抗钙化动物源性生物材料的制备方法，其特征在于，对第二生物组织进行解离处理，包括：

解离液的pH调节为4.5~6.3；

解离处理温度为20~42℃，解离处理时长为3~17h。

13.根据权利要求1所述的抗钙化动物源性生物材料的制备方法，其特征在于，交联固定处理采用含戊二醛的缓冲溶液，浓度为0.6~0.7 w/v%。

14.一种根据权利要求1-13中任意一项所述的制备方法制备的抗钙化动物源性生物材料。