CN115774075B - 一种基于RP-HPLC分析体外转录产物成分circRNA的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于RP‑HPLC分析体外转录产物成分circRNA的方法。本发明利用RP‑HPLC将circRNA、包含nicked RNA、pre‑mRNA的线性RNA分离开，以峰面积的百分比来计算circRNA的比例，即成环率。本发明对不同有机相梯度改变探索，筛选获得适合circRNA分离的RP‑HPLC分离梯度程序，从而能有效分离IVT产物中环状RNA的特征峰，进一步计算IVT产物中成环率，并通过电泳实验验证其准确性。本发明所述方法分离效果好，分离获得的circRNA、线性RNA可进一步大规模纯化用于工业。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物检测方法，具体涉及一种基于RP-HPLC分析circRNA体外转录产物成分的方法，特别是产物中circRNA比例。
背景技术
反相高效液相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatogra，RP-HPLC）是由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，它正好与由极性固定相和弱极性流动相所组成的液相色谱体系（正相色谱）相反。RP-HPLC的典型的固定相是十八烷基键合硅胶，典型的流动相是甲醇和乙腈。RP-HPLC是当今液相色谱的最主要的分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物的分离。反相色谱法适于分离非极性、极性或离子型化合物，大部分的分析任务皆由反相色谱法完成。
mRNA疫苗是将含有编码抗原蛋白的mRNA导入人体,直接进行翻译,形成相应的抗原蛋白,从而诱导机体产生特异性免疫应答,达到预防免疫的作用。而环状RNA（circRNAs，circular RNAs）是一类单链、闭环的新型RNA。虽然最初大家认为circRNAs是异常剪接的罕见副产品，随着研究的深入，人们发现circRNAs是普遍表达的，并且在细胞中发挥着重要的功能。与线性mRNA相比，circRNAs具有更好的稳定性和更高的表达效率。为实现目标蛋白的表达并减少天然免疫刺激性，circRNA的纯化是必不可少的。体外转录（In vitrotranscription product，IVT）和环化反应体系包括双链RNA（dsRNA）、三磷酸化RNA、开环的circRNA、前体RNA等。体外转录产物（IVT）中除了circRNA以外，还包含nicked RNA、pre-mRNA等线性RNA，为了后续进一步利用纯的circRNA，本领域有需求将其从IVT体系中分离纯化出来。
本领域已知一些采用HPLC纯化RNA的方法，CN101563457A（公开日期2009年10月21日）公开了用于制备型纯化RNA的方法，该方法的特征在于使用多孔反相作为固定相利用HPLC来纯化RNA，该发明的一个重要因素是使用多孔反相。CN111812230A（公开日期2020年10月23日）公开了一种半定量测定DNA中RNA含量的SEC-HPLC检测方法，该方法通过将样品色谱图与含一定量RNA的质粒DNA标准品的色谱图作叠图分析，比较两者在RNA位置的出峰情况，从而判断样品的RNA百分含量。
虽然RP-HPLC是本领域分离RNA的常规方法，但是为了提高产率，大规模分析纯化circRNA，本领域亟需提供一种优化的分离程序、circRNA分离度更好的基于RP-HPLC分析circRNA体外转录产物成分的方法。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种分离效果好、基线平稳的基于RP-HPLC分析circRNA体外转录产物成分的方法。本发明进一步提供一种依据RP-HPLC结果，计算获得IVT产物中circRNA比例的高效液相色谱检测方法。本发明对不同有机相梯度改变探索，筛选获得适合circRNA分离的RP-HPLC分离梯度程序，从而能有效分离IVT产物中环状RNA的特征峰，特别适合16h IVT产物分离。
本发明的一方面，提供一种基于RP-HPLC分析circRNA体外转录产物（IVT）成分的方法，其特征在于，包含如下步骤：
（1）样品制备：制备用于RP-HPLC的体外转录产物；
（2）流动相配制：流动相A液为100 mM 醋酸三乙胺，pH 7.0；流动相B液为100%乙腈；
（3）色谱分离：分离梯度程序如下：起始：90% A液+10% B液；10min: 88.4% A液+11.6% B液；20min: 88% A液+12% B液；40min: 87.4% A液+12.6% B液；50min: 86.4% A液+13.6% B液；55min: 86.4% A液+13.6% B液；55.1min：90% A液+10% B液；65min：90% A液+10% B液；
（4）分别收集circRNA、线性RNA的目标色谱峰。
进一步地，还包含步骤（5）获得色谱图谱。
进一步地，还包含步骤（6）计算circRNA的比例。
进一步地，步骤（6）以峰面积的百分比来计算circRNA的比例。
进一步地，步骤（6）包含：将经过凝胶电泳表征过的液相色谱图上的circRNA色谱峰和线性RNA色谱峰作为样品的有效成分，其他峰为杂质峰；以circRNA、线性RNA两种峰的峰面积之和作为分母，以各自的峰面积作为分子，计算出各自的百分比，将circRNA色谱峰的面积百分比定义为circRNA比例，即成环率。
进一步地，步骤（3）色谱条件如下：色谱柱为反相色谱柱；流动相流速为：0.5~1ml/min；色谱的柱温为50℃；样品盘温度为2-8℃；检测器的检测波长为260nm；待测样品的进样体积为5-100微升。
进一步地，步骤（3）色谱条件如下：色谱柱为C18反相色谱柱；流动相流速为：0.5ml/min；色谱柱的柱温为50℃；样品盘温度为5℃；检测器的检测波长为260nm；待测样品的进样体积为10微升。
进一步地，步骤（2）中，流动相A配制方法为：4.42 ml冰醋酸，11.45 ml 三乙胺，350 ml RNase free 水，调节pH至7.0。按照上述冰醋酸、三乙胺、RNase free 水的体积比例，可以扩大体积配置。
进一步地，步骤（1）中体外转录产物为任意时间的体外转录产物，优选为2h-16h体外转录产物，最优选为16h体外转录产物。
进一步地，步骤（1）中体外转录产物为任意的mRNA体外转录产物，优选为eGFPmRNA体外转录产物。
进一步地，所述方法还包含将分离获得的circRNA、线性RNA进一步纯化的步骤。
本发明提供的基于RP-HPLC分析circRNA体外转录产物成分的方法具有以下多种优异的技术效果。
（1）将反相HPLC技术应用到环状RNA与线性RNA的分析中，能够很好地将二者分离开来，且所得色谱图基线平稳。
（2）本发明利用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）将环状RNA、包含nicked RNA、pre-mRNA的线性RNA分离开，以峰面积的百分比来计算环状RNA的比例，即成环率。
（3）本发明建立了基于RP-HPLC分析circRNA体外转录产物成分的方法学，本发明所述的高效液相色谱法分析方法在16h IVT产物含量8.25-27.5μg范围内，线性良好，精密度良好，重复性良好，符合《中国药典》相关规定。
（4）通过本发明的RP-HPLC方法，计算circRNA与线性RNA的分离度，在分离梯度程序3条件下，分离度为1.9。在分离梯度程序1条件下，分离度为1.0。在分离梯度程序2条件下，分离度为0.5。由此可见，在优化的分离梯度程序3下，目标产物circRNA与非目标产物线性RNA的分离度有明显提升。
（5）对于筛选获得的优化分离梯度程序3，RP-HPLC计算成环率为54.5%。采用电泳实验验证，其成环率计算结果与RP-HPLC计算结果相同，证明了本发明优化的分离梯度程序3条件下，RP-HPLC方法计算IVT产物中成环率的准确性。
附图说明
图1A-图1B，其中图1A为本发明空白对照溶液的RP-HPLC色谱图原图；图1B为本发明空白对照溶液的RP-HPLC色谱图放大图。
图2为本发明分离梯度程序1条件下，15μg 16h IVT产物的高效液相色谱图。
图3为本发明分离梯度程序1条件下，重复运行的3针16h IVT产物的高效液相色谱叠图。
图4为本发明不同含量的16h IVT产物的高效液相色谱图。
图5A-图5B，图5A为本发明不同含量的16h IVT产物的高效液相色谱法的主峰1（circRNA）方程式，图5B为本发明不同含量的16h IVT产物的高效液相色谱法的主峰2（线性RNA）线性方程式。
图6为本发明分离梯度程序2条件下，15μg的16h IVT产物的高效液相色谱图-全局图。
图7为本发明分离梯度程序3条件下，15μg的16h IVT产物的高效液相色谱图-全局图。
图8为本发明分离梯度程序3条件下，15μg的16h IVT产物的高效液相色谱图-局部放大图。
图9为本发明分离梯度程序3条件下，收集的峰1、峰2进行的SDS-PAGE检测电泳图。
图10为本发明分离梯度程序3条件下，luciferase mRNA样品的高效液相色谱图。
图11为本发明分离梯度程序3条件下，mCherry mRNA样品的高效液相色谱图。
具体实施方式
实施例1 RP-HPLC分析circRNA体外转录产物成分
通过RP-HPLC法检测16h IVT产物中circRNA的比例。
1.1 样品制备
空白对照溶液（稀释剂）：纯化水；
样品：1.5μg/μl的eGFP mRNA体外16小时体外转录产物（IVT产物）。以下实施例中采用的样品均是eGFP mRNA IVT产物。eGFP mRNA IVT产物仅是作为示例，本发明的方法适用于任意的mRNA体外转录产物，不限于eGFP mRNA IVT产物。16小时体外转录产物仅是作为示例，本发明的方法适用于任意时间的体外转录产物，不限于16小时体外转录产物。
1.2 流动相配制
流动相A: 100 mM 醋酸三乙胺（pH 7.0）；
配制方法为：4.42 ml冰醋酸+11.45 ml 三乙胺+ 350 ml RNase free 水 ，调节pH至7.0。
流动相B:100%乙腈
1.3 色谱条件
色谱柱为Sepax Bio-C18（4*250mm；粒径5μm，孔径300A）的反相色谱柱（C18柱）；
流动相流速为：0.5ml/min;
色谱柱的柱温为50℃;
样品盘温度为5℃;
检测器的检测波长为260nm;
待测样品的进样体积为10微升。
1.4 分离梯度程序1如下：
起始：90% A液+10% B液
36min: 86.4% A液+13.6% B液
38min: 86.4% A液+13.6% B液
38.1min: 90% A液+10% B液
46min: 90% A液+10% B液
1.5 试验结果
（1）空白对照溶液的RP-HPLC色谱图结果如图1A-图1B所示。其中图1A为本发明空白对照溶液的RP-HPLC色谱图原图；图1B为本发明空白对照溶液的RP-HPLC色谱图放大图，其分离梯度为程序1，图1A为空白对照基线图（原图），以及图1B为空白对照基线图（放大图）。
（2）分离梯度程序1条件下，15μg 16h IVT产物的高效液相色谱图如图2所示，其中主峰1为circRNA，主峰2为线性RNA。
（3）分离梯度程序1条件下，重复运行的3针16h IVT产物的高效液相色谱叠图如图3所示，该结果表明：3次重复进样具有很好的重复性，说明该分离系统具有良好的稳定性。
实施例2 RP-HPLC分析circRNA体外转录产物成分的方法学研究
采用实施例1相同的实验条件，进行方法学研究。
2.1 不同含量的16h IVT产物RP-HPLC分析
依据分离梯度为程序1，不同含量的16h IVT产物的高效液相色谱图如图4所示，图4中：
16h IVT 2: IVT产物含量为8.25μg；
16h IVT 3: IVT产物含量为11.00μg；
16h IVT 4: IVT产物含量为13.75μg；
16h IVT 5: IVT产物含量为27.50μg；
2.2 线性数据：高效液相色谱法方法学线性数据如表1所示。
表1 RP-HPLC检测体外转录产物中circRNA方法学线性数据
本方法的适用的测试范围是将样品稀释不同的倍数，注射相同体积的样品进行测试的。线性公式是以16h IVT产物的总含量作为自变量X、以峰1（Peak1）或者峰2（Peak2）的面积作为因变量Y进行线性拟合的。相关系数是研究变量之间线性相关程度的量，一般用字母 R 表示，R2约接近1，说明二者的相关程度越高。
从表1数据可知，本发明所述的高效液相色谱法分析方法在16h IVT产物含量8.25-27.5μg范围内，线性良好。不同含量的16h IVT产物的高效液相色谱法的主峰1（circRNA）方程式如图5A，不同含量的16h IVT产物的高效液相色谱法的主峰2（线性RNA）线性方程式如图5B。
2.3 系统精密度数据
表2 高效液相色谱法方法学系统精密度数据
| 编号 | 组分1（主峰1）保留时间（min） | 组分2（主峰2）保留时间（min） |
| 1 | 30.07 | 31.76 |
| 2 | 30.10 | 31.92 |
| 3 | 30.00 | 31.89 |
| 平均值 | 30.06 | 31.85 |
| 相对标准偏差RSD% | 0.17 | 0.27 |
| 编号 | 组分1峰（主峰1）面积 | 组分2峰（主峰2）面积 |
| 1 | 1963941 | 2658260 |
| 2 | 2049447 | 2598793 |
| 3 | 1876388 | 2620279 |
| 平均值 | 1963259 | 2625777 |
| 相对标准偏差RSD% | 4.41 | 1.15 |
从表2数据可知，本发明的高效液相色谱法分析方法学精密度良好。
2.4 重复性数据
表3 高效液相色谱法方法学重复性数据
| 编号 | 主峰1含量（%） | 主峰2含量（%） |
| 1 | 39.54 | 53.53 |
| 2 | 41.13 | 52.15 |
| 3 | 38.46 | 53.71 |
| 平均值 | 39.71 | 53.13 |
| 相对标准偏差RSD% | 3.38 | 1.61 |
从表3数据可知，本发明的高效液相色谱法分析方法学重复性良好，符合《中国药典》四部9101分析方法验证指导原则相关表述。
实施例3不同的分离程序用于RP-HPLC分析circRNA体外转录产物成分
3.1 样品制备
空白对照溶液（稀释剂）：纯化水；
样品：1.5μg/μl的eGFP mRNA体外16小时体外转录产物（IVT产物）。
3.2 流动相配制
流动相A: 100 mM 醋酸三乙胺（pH 7.0）
配制方法为：4.42 ml冰醋酸+11.45 ml 三乙胺+ 350 ml RNase free 水，调节pH至7.0。
流动相B:100%乙腈
3.3 色谱条件如下：
色谱柱为Sepax Bio-C18（4*250mm；粒径5μm，孔径300A）的反相色谱柱（C18柱）；
流动相流速为：0.5ml/min;
色谱柱的柱温为50℃;
样品盘温度为5℃;
检测器的检测波长为260nm;
待测样品的进样体积为10微升。
3.4 通过不同分离梯度程序筛选优化，选择分离梯度程序2如下：
起始：90% A液+10% B液
5min:90% A液+10% B液
45min: 80% A液+20% B液
50min: 80% A液+20% B液
51min:90% A液+10% B液
61min:90% A液+10% B液
3.5 实验结果
在分离梯度程序2条件下，15μg的16h IVT产物的高效液相色谱图-全局图如图6。
实施例4优化的分离程序用于RP-HPLC分析circRNA体外转录产物成分
4.1 样品制备
空白对照溶液（稀释剂）：纯化水；
样品：1.5μg/μl的eGFP mRNA体外16小时体外转录产物（IVT产物）。
4.2 流动相配制
流动相A: 100 mM 醋酸三乙胺（pH 7.0）
配制方法为：4.42 ml冰醋酸+11.45 ml 三乙胺+ 350 ml RNase free 水 ，调节pH至7.0。
流动相B:100%乙腈
4.3 色谱条件如下：
色谱柱为Sepax Bio-C18（4*250mm；粒径5μm，孔径300A）的反相色谱柱（C18柱）；
流动相流速为：0.5ml/min;
色谱柱的柱温为50℃;
样品盘温度为5℃;
检测器的检测波长为260nm;
待测样品的进样体积为10微升。
4.4 通过不同分离梯度程序筛选优化，选择分离梯度程序3如下：
起始：90% A液+10% B液
10min: 88.4% A液+11.6% B液
20min: 88% A液+12% B液
40min: 87.4% A液+12.6% B液
50min: 86.4% A液+13.6% B液
55min: 86.4% A液+13.6% B液
55.1min：90% A液+10% B液
65min：90% A液+10% B液
4.5 实验结果
在分离梯度程序3条件下，15μg的16h IVT产物的高效液相色谱图-全局图如图7，15μg的16h IVT产物的高效液相色谱图-局部放大图如图8。
实施例5各分离梯度程序下分离度、circRNA成环率计算
对于circRNA与线性RNA的分离度，其计算公式：R=2（tR2-tR1）/（Y1+Y2），其中tR1代表1号峰的保留时间，tR2代表2号峰的保留时间，Y1代表1号峰峰宽，Y2代表2号峰峰宽。分离度R又称分辨率，为了判断分离物质对色谱柱在色谱柱中的分离情况，常用分离度作为柱的总分离效能指标，用R表示。R等于相邻色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比，表示相邻两峰的分离程度，R越大，表明相邻两组分分离越好。
计算circRNA与线性RNA的分离度，在分离梯度程序3条件下，分离度为1.9。在分离梯度程序1条件下，分离度为1.0。在分离梯度程序2条件下，分离度为0.5。由此可见，在优化的分离梯度程序3下，目标产物circRNA与非目标产物线性RNA的分离度有明显提升。
将经过凝胶电泳表征过的液相色谱图上的1号峰和2号峰作为样品的有效成分，其他峰为杂质峰。以两种峰的峰面积之和作为分母，以各自的峰面积作为分子，计算出各自的百分比，将主峰1号峰的面积百分比定义为circRNA比例。计算出circRNA（主峰1）在IVT产物中所占比例（即成环率）。在分离梯度程序1条件下，计算结果为41.5%。在分离梯度程序2条件下，计算结果为50.8%。在分离梯度程序3条件下，计算结果为54.5%。
对于获得的优化分离梯度程序3，采用电泳实验验证其成环率。将RP-HPLC收集的峰1、峰2进行SDS-PAGE检测，结果如图9所示，其中M为marker，泳道2为峰1（circRNA）；泳道4为峰2（线性RNA）。利用电泳图分析软件对峰1、峰2的量进行测量，计算峰1（circRNA）与峰1（circRNA）加峰2（线性RNA）的比值，其成环率计算结果与上述RP-HPLC计算结果相同，证明了本发明优化的分离梯度程序3条件下，RP-HPLC方法计算IVT产物中成环率的准确性。
本发明可将RP-HPLC分离的circRNA主峰1、线性RNA主峰2，各自收集，用于后续进一步纯化。
实施例6优化的分离程序用于RP-HPLC分析其他circRNA体外转录产物成分
6.1 样品制备
空白对照溶液（稀释剂）：纯化水；
样品1：1.5μg/μl的luciferase mRNA体外16小时体外转录产物（IVT产物）。
样品2：1.5μg/μl的mCherry mRNA体外16小时体外转录产物（IVT产物）。
6.2 流动相配制
流动相A: 100 mM 醋酸三乙胺（pH 7.0）
配制方法为：4.42 ml冰醋酸+11.45 ml 三乙胺+ 350 ml RNase free 水 ，调节pH至7.0。
流动相B:100%乙腈
6.3 色谱条件如下：
色谱柱为Sepax Bio-C18（4*250mm；粒径5μm，孔径300A）的反相色谱柱（C18柱）；
流动相流速为：0.5ml/min;
色谱柱的柱温为50℃;
样品盘温度为5℃;
检测器的检测波长为260nm;
待测样品的进样体积为10微升。
6.4 通过不同分离梯度程序筛选优化，选择分离梯度程序3如下：
起始：90% A液+10% B液
10min: 88.4% A液+11.6% B液
20min: 88% A液+12% B液
40min: 87.4% A液+12.6% B液
50min: 86.4% A液+13.6% B液
55min: 86.4% A液+13.6% B液
55.1min：90% A液+10% B液
65min：90% A液+10% B液
6.5 实验结果
在分离梯度程序3条件下，样品1（luciferase mRNA）的高效液相色谱图如图10所示，样品2（mCherry mRNA）的高效液相色谱图如图11所示。实验结果表明，本发明优化的分离梯度程序3对于其他体外转录产物mRNA样品，例如luciferase mRNA、mCherry mRNA，同样具有良好的分离效果，具有一定普适性。
本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种基于 RP-HPLC 分析体外转录产物成分circRNA的方法，其特征在于，包含如下步骤：
（1）样品制备：制备用于RP-HPLC的体外转录产物；
（2）流动相配制：流动相A液为100 mM 醋酸三乙胺，pH 7.0；流动相B液为100%乙腈；
（3）色谱分离：分离梯度程序如下：起始：90% A液+10% B液；10min: 88.4% A液+11.6%B液；20min: 88% A液+12% B液；40min: 87.4% A液+12.6% B液；50min: 86.4% A液+13.6%B液；55min: 86.4% A液+13.6% B液；55.1min：90% A液+10% B液；65min：90% A液+10% B液；
（4）分别收集circRNA、线性RNA的目标色谱峰；
（5）获得色谱图谱；
（6）计算circRNA在体外转录产物中的比例，以峰面积的百分比来计算circRNA在体外转录产物中的比例，具体包含：将经过凝胶电泳表征过的液相色谱图上的circRNA色谱峰和线性RNA色谱峰作为样品的有效成分，其他峰为杂质峰；以circRNA、线性RNA两种峰的峰面积之和作为分母，以各自的峰面积作为分子，计算出各自的百分比，将circRNA色谱峰的面积百分比定义为circRNA比例，即成环率；
其中，步骤（3）色谱条件如下：色谱柱为反相色谱柱；流动相流速为：0.5~1ml/min；色谱柱的柱温为50℃；样品盘温度为2-8℃；检测器的检测波长为260nm；待测样品的进样体积为5-100微升。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）色谱条件如下：色谱柱为C18反相色谱柱；流动相流速为：0.5ml/min；色谱柱的柱温为50℃；样品盘温度为5℃；检测器的检测波长为260nm；待测样品的进样体积为10微升。
3.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，流动相A配制方法为：4.42 ml冰醋酸，11.45 ml 三乙胺，350 ml RNase free 水，调节pH至7.0。
4.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其特征在于，步骤（1）中体外转录产物为任意的mRNA体外转录产物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（1）中体外转录产物为eGFP mRNA体外转录产物。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中体外转录产物为2h-16h体外转录产物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（1）中体外转录产物为16h体外转录产物。
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