CN115772480B

CN115772480B - 缓解土壤酸化的微生物的筛选方法、蒙氏假单胞菌及其应用

Info

Publication number: CN115772480B
Application number: CN202111043312.7A
Authority: CN
Inventors: 施河丽; 祁高富; 谭军; 王瑞; 向必坤; 柯侃; 尹忠春; 王刚
Original assignee: Enshi Co Ltd Hubei Tobacco Co ltd
Current assignee: Enshi Co Ltd Hubei Tobacco Co ltd
Priority date: 2021-09-07
Filing date: 2021-09-07
Publication date: 2024-09-20
Anticipated expiration: 2041-09-07
Also published as: CN115772480A

Abstract

本发明公开了缓解土壤酸化的微生物的筛选方法、蒙氏假单胞菌及其应用，筛选方法通过选用异养硝化细菌筛选培养基进行筛选，然后进行基因测序从而鉴定出缓解土壤酸化的微生物菌株，即蒙氏假单胞菌(Pseudomones monteilii)ZPP‑5。在烟草种植时，将这种特殊的菌株采用特殊的施加方法施加在土壤中，能够显著提升土壤pH值，有效降低土壤中交换性铝含量和增加土壤交换性盐基总量，缓解土壤酸化，提高土壤肥力；不会受到黄腐酸(烟草种植时常用的植物生长调节剂)的影响；对环境安全无公害，具有良好的开发前景和应用潜力。

Description

缓解土壤酸化的微生物的筛选方法、蒙氏假单胞菌及其应用

技术领域

本发明属于农业微生物学技术剂生物防治技术领域，特别是缓解土壤酸化的蒙氏假单胞菌及其应用。

背景技术

土壤酸化过程主要是因为土壤的酸碱平衡被打破。即土壤中输入的H⁺增加，超出土壤中和能力，导致土壤pH值下降的现象。

据统计，世界土壤总面积的30％的土壤pH值小于5，属于酸化土壤，而世界上潜在可耕地土壤有70％属于酸性土壤。我国土壤酸化现象普遍存在，现有的18.26亿亩耕地中，大概有7.3亿亩的耕地出现退化，其中东北地区土壤中有机质的含量下降，南方部分地区土壤酸化，对国内人民生存与农业可持续发展形成极大威胁。在1980-2000年，通过对全国各地土壤进行取样对比土壤pH值发现，我国的表层土壤显著酸化，pH值平均下降0.5单位，53.2％的土地土壤pH值下降超过0.5单位，37.1％的土地土壤pH值下降的幅度小于0.5单位，只有9.7％的土地土壤pH值是上升的。经分析，导致大量土壤pH值上升的主要原因是高氮肥料的大量使用和植物对土壤中碱性阳离子的减少。

我国烟草的种植范围很广泛，土壤的pH值对烟草的生长影响很大。虽然烟草在pH值为4.5-8.5的土壤上可以生长，但是优质烟草的种植pH值在6.5-7.5之间，其烟碱含量适中，化学成分协调，烟叶品质高，过高或过低的pH值都不利于烟叶的质量。烟草的长期种植会不断酸化土壤，持续对土壤产生负面影响，降低土壤的酸化缓冲能力，造成土壤板结和通透性变差。土壤的这种变化反过来又会对种植的烟草产生影响，结果就是烟草的产量与品质共同下降。近10年来，湖北烟区，特别是优质核心烟区的土壤退化明显加快，部分地区酸化严重。2012年的调查结果显示，湖北省烟区土壤的pH值变幅为4.1-8.2，平均pH值为6.2，属弱酸性土壤，仅有30.3％的土壤的pH值为5.5-6.5，适合烟草生长。

目前常规的缓解烟草土壤酸化的方法，广泛采用的是施加石灰，初期施用石灰可以中和土壤中氢离子，使pH值有明显的提高，能降低土壤中重金属的活性和对植物根系的抑制作用。适当添加碳酸钙对土壤的性质和细菌群落产生了积极影响，提高了土壤可溶性有机碳和可溶性有机氮，增加了土壤的呼吸作用和细菌群落的丰富度。然而，石灰对深层酸化土壤的pH值提升效果十分有限，长期、大量施用石灰会造成石灰板结田，破坏土壤中钙、镁、钾离子的平衡，不利于作物的生长而造成减产。

发明内容

针对以上现有技术的不足，本发明提供了缓解土壤酸化的蒙氏假单胞菌及其筛选方法和应用，具体通过以下技术实现。

缓解土壤酸化的微生物的筛选方法，包括以下步骤：

S1、取土样加水振荡(例如加无菌水用涡旋振荡器进行振荡)20min，制成质量分数为10％的混合液；

S2、稀释涂布于异养硝化细菌筛选培养基，25-30℃恒温培养，直至有菌落出现；

所述异养硝化细菌筛选培养基的原料中含有：(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L、维氏盐溶液50ml、去离子水；

维氏盐溶液的原料为K₂PO₄ 5g/L，MgSO₄·7H₂O 2.5g/L，NaCl 2.5g/L，FeSO₄·7H₂O0.05g/L，MnSO₄·4H₂O 0.05g/L，去离子水；

S3、挑取单菌落划线保藏接种于异养硝化细菌筛选培养基中，25-30℃、180r/min振荡培养48h；菌液样品此时还进行硝酸盐含量初步检测；

S4、提取菌液样品中细菌的基因组DNA为模板，PCR扩增16S rDNA基因片段，PCR扩增、纯化后测序；

S5、对步骤S4的测序结果进行序列BLAST比对，构建待筛选微生物的系统发育树，结合菌落图进行待筛选微生物的菌株鉴定，筛选得到缓解土壤酸化的微生物菌株。

通过采用上述方法，能够筛选出具有缓解烟草种植土壤酸化，降低土壤中交换性铝含量，增加土壤中交换性盐基总量的微生物菌株。

优选地，步骤S4中，PCR扩增16S rDNA基因片段的具体条件为：超纯水6μl，2×EasyTaq PCR super Mix 10μl；正、反向引物和模板各1μl；

正向引物核苷酸序列16SF为：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA；

反向引物核苷酸序列16SR为：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；

PCR扩增反应程序为：94℃ 3min；94℃ 45s，57℃ 45s，72℃ 45s；共30个循环；72℃ 10min。

更优选地，步骤S5中，通过NCBI数据库进行序列BLAST比对，采用MEGA 5.2软件构建待筛选微生物的系统发育树。BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)比对是一种常用的生物大分子序列比对搜索工具，是生物信息学常用的工具软件，可将输入的核酸或蛋白质序列与数据库中的已知序列进行比对，获得序列相似度等信息，从而判断序列的来源或进化关系(源于百度百科内容)。MEGA 5.2软件是一种常见的进化树绘制软件。

本发明还提供了一种蒙氏假单胞菌(Pseudomones monteilii)ZPP-5，这种蒙氏假单胞菌是采用上述筛选方法筛选获得，并于2021年08月06日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC No.M2021982。本发明的发明人通过就近取样种植烟株的土壤，并采用上述筛选方法进行筛选，得到了一种蒙氏假单胞菌(Pseudomones monteilii)的菌株ZPP-5。经过在实验室和试验田的数次试验充分验证，发明人发现将该菌株制备成菌液施加到酸化土壤中，能够有效提升土壤pH值，降低土壤中交换性铝含量和增加土壤交换性盐基总量，最终缓解土壤酸化，提高土壤肥力；该菌株对环境安全无公害，具有良好的开发前景和应用潜力。

上述蒙氏假单胞菌(Pseudomones monteilii)ZPP-5可以应用于缓解土壤酸化中。

优选地，上述蒙氏假单胞菌应用于缓解土壤酸化中的具体应用方法为：

P1、将蒙氏假单胞菌ZPP-5的菌种(按照常规接种方法)接种在LB培养基中，置于180r/min、37℃的摇床里，隔夜活化；以1％的接种量接入LB培养基中，在180r/min、37℃的摇床中培养48h，得菌液；

P2、将步骤P1的菌液稀释5倍制成菌液稀释液，按200L/亩的用量均匀施加在酸化土壤上，保持土壤湿润(一般相对湿度为55-65％)；

P3、每隔21天，按照步骤P2的方式重复施加菌液稀释液；定期检测土壤pH值，直至土壤pH值达到烟株生长要求。

优选地，上述蒙氏假单胞菌(Pseudomones monteilii)ZPP-5在采用上述应用方法缓解土壤酸化时，步骤P2中，将菌液稀释液施加在酸化土壤的具体方式为：取菌液稀释液按200-300ml/株的用量灌根施加在烟株周围的土壤上；在第21天补加相同量的菌液稀释液。

优选地，上述蒙氏假单胞菌(Pseudomones monteilii)ZPP-5在采用上述应用方法缓解土壤酸化时，烟株周围的土壤是以烟株为圆心，半径不超过10cm的圆形范围的土壤区域。

优选地，上述蒙氏假单胞菌(Pseudomones monteilii)ZPP-5在采用上述应用方法缓解土壤酸化时，步骤P3中，检测土壤pH值的方法为每隔7天对土壤取样进行土壤pH值检测。

与现有技术相比，本发明的有益之处在于：本发明提供了一种缓解土壤酸化的微生物的筛选方法，并根据该筛选方法得到了一种蒙氏假单胞菌菌株，将这种蒙氏假单胞菌的菌株制成菌液施加在土壤中，能够显著提升土壤pH值，有效降低土壤中交换性铝含量和增加土壤交换性盐基总量，缓解土壤酸化，提高土壤肥力；不会受到黄腐酸(烟草种植时常用的植物生长调节剂)的影响；对环境安全无公害，具有良好的开发前景和应用潜力。

附图说明

图1为实施例1的筛选的微生物(即蒙氏假单胞菌ZPP-5)的单菌落照片；

图2为实施例1的筛选的微生物(即蒙氏假单胞菌ZPP-5)的16S rDNA聚类分析图；

图3为实施例2的蒙氏假单胞菌ZPP-5的结晶紫染色后的图片；

图4为实施例2的硝酸盐标准曲线图；

图5为实施例2的菌液中硝酸根离子浓度变化曲线图；

图6为实施例3的蒙氏假单胞菌ZPP-5的菌液和菌体对酸化土壤样品的pH值的变化曲线图；

图7为实施例4的蒙氏假单胞菌ZPP-5的菌液对有机酸模拟酸化土壤pH的影响；

图8为实施例5的蒙氏假单胞菌ZPP-5的菌液对添加有氮磷钾肥料的烟草盆栽土壤pH的影响；

图9为实施例6的蒙氏假单胞菌ZPP-5的菌液与含有黄腐酸培养基共同使用时对烟草盆栽土壤pH的影响；

图10为实施例7的铝离子标准曲线图；

图11为实施例7的土壤中交换性铝含量的影响的检测结果；

图12为实施例8的蒙氏假单胞菌ZPP-5对土壤中交换性盐基总量的影响的检测结果。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：缓解土壤酸化的细菌的筛选及鉴定

S1、随机选取10g种植烟株的田块中的土样，加90ml去离子水置于锥形瓶中，振荡20min，制成质量分数为10％的混合液；

S2、取混合液依次稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7后，取10^-5、10^-6、10^-7的混合稀释液涂布于异养硝化细菌筛选培养基中，置于恒温培养箱中28℃恒温培养，直至有菌落出现；

所述异养硝化细菌筛选培养基的原料中含有：(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L、维氏盐溶液50ml，用去离子定容至1L；

维氏盐溶液按重量比例选用K₂PO₄ 5g/L，MgSO₄·7H₂O 2.5g/L，NaCl 2.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.05g/L，MnSO₄·4H₂O 0.05g/L，用去离子水定容至1L并混合均匀即得；

S3、挑取单菌落划线保藏接种于异养硝化细菌筛选培养基的PA瓶中，置于28℃、180r/min的摇床中振荡培养48h，取菌液样品进行硝酸盐含量初步检测；单菌落照片如图1所示；

PCR扩增16S rDNA基因片段的具体条件为：超纯水6μl，2×Easy Taq PCR superMix 10μl；正、反向引物和模板各1μl；

正向引物核苷酸序列16SF为：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA；

反向引物核苷酸序列16SR为：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；

PCR扩增反应程序为：94℃ 3min；94℃ 45s，57℃ 45s，72℃ 45s；共30个循环；72℃ 10min；

S5、通过NCBI数据进行序列BLAST比对，采用MEGA 5.2软件构建待筛选微生物的系统发育树；如图1、图2所示，结合菌落图进行待筛选微生物的菌株鉴定，确认筛选得到微生物菌株为蒙氏假单胞菌(Pseudomones monteilii)ZPP-5。

实施例2：实施例1筛选获得的蒙氏假单胞菌ZPP-5的硝化效果的测定

1、对菌液中的硝酸盐含量进行初步判断

取实施例1步骤S3得到的菌液500μl置于1.5ml离心管中，向离心管中加入二苯胺-硫酸溶液50μl，出现蓝色沉淀，表明溶液中有硝酸根离子或者亚硝酸根离子；再另取相同的菌液500μl置于1.5ml离心管中加入格里斯试剂的A液50μl，振荡混匀，再加入格里斯试剂的B液50μl，溶液出现红色，表明溶液中存在亚硝酸根离子，出现的红色颜色越深表明溶液中的亚硝酸根离子的浓度越高。

格里斯试剂的配制方法为：

溶液A：称取对氨基苯磺酸0.5g，溶于150ml 30％的醋酸溶液中，保存于棕色瓶中；

溶液B：称取1-萘胺0.5g加入50ml H2O中煮沸后，缓缓加入30％的醋酸溶液150ml，保存于棕色瓶中。

2、蒙氏假单胞菌ZPP-5的硝化能力检测

取蒙氏假单胞菌ZPP-5以1％的接种量接入装有异养硝化细菌筛选培养基的锥形瓶中，置于28℃、180r/min的摇床中振荡培养；在振荡培养的过程中，每次取样菌液50ml，进行稀释。

按照硝酸盐检测的步骤进行检测：图3为蒙氏假单胞菌ZPP-5的结晶紫染色图片，选用紫外可见分光光度法，用石英比色皿装入待测菌液在波长220nm和275nm下测定其吸光度，根据校准吸光度和硝酸盐标准曲线计算样品中硝酸盐的含量，硝酸盐标准曲线如图如图4所示，硝酸根离子浓度变化趋势如图5所示。

实施例3：蒙氏假单胞菌菌株ZPP-5对酸化的烟株田块的土壤样品的pH值的影响

1、土壤处理

将酸化的烟株田块的土壤过3.5mm的筛网并混合均匀，分装到若干250ml锥形瓶中，每个锥形瓶中称取150g酸化土壤样品。

2、菌液处理

将蒙氏假单胞菌ZPP-5菌种接入LB培养基的PA瓶中，置于180r/min、37℃的摇床里，过夜活化。以1％的接种量接入LB培养基中，在180r/min、37℃的摇床中培养48h。

3、菌液与菌体对土壤pH的影响试验

(1)蒙氏假单胞菌ZPP-5的菌液对土壤pH的影响

将培养48h的菌液以酸化土壤样品质量10％的用量均匀施加在酸化土壤样品中，将锥形瓶瓶口用纸包好，保持土壤的相对湿度为(60±5)％；

每隔7天取样检测酸化土壤样品的pH值，具体方法为：称取10g风干处理后的酸化土壤样品，加至50ml离心管中，再加入去离子水25ml，利用涡旋仪震荡1min；静置2h取上清液，再用pH计检测上清液的pH值，即为酸化土壤样品的pH值；

(2)蒙氏假单胞菌ZPP-5的菌体对土壤pH的影响

将培养48h的菌液在8000g下离心10min，去掉上清液，以与上清液相同体积的去离子水重悬，得到菌体悬液；将菌体悬液以酸化土壤样品质量10％的用量均匀施加于酸化土壤样品中，最后将锥形瓶瓶口用纸包好，保持土壤的相对湿度为(60±5)％；

每隔7天取样检测酸化土壤样品的pH值，具体方法为：称取10g风干处理后的酸化土壤样品，加至50ml离心管中，再加入去离子水25ml，利用涡旋仪震荡1min；静置2h，再用pH计检测上清液的pH值，即为酸化土壤样品的pH值。

如图6所示，图中，曲线“ZPP-5 broth”即对应的蒙氏假单胞菌ZPP-5的菌液，曲线“ZPP-5 cell”即对应的蒙氏假单胞菌ZPP-5的菌体，CK(H₂O)和CK(LB)分别为去离子水空白对照和LB培养基阴性对照。从图5可以看出，蒙氏假单胞菌ZPP-5配制成菌液后能够显著提升酸化土壤样品的pH值，而选用蒙氏假单胞菌ZPP-5的菌体，则对酸化土壤样品的pH值几乎没有影响。而施加阴性对照的LB培养基的酸化土壤样品的pH值上升，经分析可能是因为培养基中的养分促进了土壤中固有的细菌生长与代谢，分解了土壤中的有机酸，以及导致碱性离子如NH⁴⁺的形成，最终促使了土壤pH的增加。

实施例4：蒙氏假单胞菌ZPP-5对有机酸模拟酸化土壤的pH值的影响

1、土壤处理：

与实施例3的土壤处理方法相同。

2、菌液处理

蒙氏假单胞菌ZPP-5的处理与实施例3的菌液处理方法相同。

3、试验处理

向锥形瓶中的酸化土壤样品加入10ml有机酸溶液(苯甲酸45mg、3-苯丙酸45mg、延胡索酸45mg、琥珀酸21mg、溶于250ml的水中、pH值＝3.2)；每隔7天补加一次等量的有机酸溶液，以此模拟烟草在种植时持续向土壤分泌有机酸的过程；

先将培养48h的蒙氏假单胞菌ZPP-5菌液用去离子水稀释5倍，以酸化土壤样品质量10％的用量均匀施加于酸化土壤样品中，将锥形瓶瓶口用纸包好，保持土壤的相对湿度为(60±5)％；

每隔7天取样检测土壤pH值；每隔21天向土壤里补充等量的菌液；称取10g风干后的土壤加至50ml离心管中，再加入去离子水25ml，利用涡旋仪震荡1min；静置2h，再用pH计检测上清液的pH值，即为酸化土壤样品的pH值。

如图7所示，曲线“ZPP-5”是施加蒙氏假单胞菌ZPP-5菌液对应的土壤的pH值变化情况，曲线“CK(H₂O)”是空白对照。从图7中可以看到，虽然不断在酸化土壤样品中补充有机酸，但是施加了蒙氏假单胞菌ZPP-5菌液的酸化土壤样品的pH值显著上升；而空白对照的酸化土壤样品的pH值基本保持不变，经分析可能是因为土壤中施加的有机酸成为了土壤中固有微生物的碳源被利用，因而继续施加有机酸并没有导致土壤pH的持续下降。

实施例5：蒙氏假单胞菌ZPP-5对模拟施用氮磷钾肥料的烟草盆栽土壤的pH值的影响

1、烟苗处理

将酸化土壤样品搅拌均匀，装满若干高10cm，直径12cm的圆形塑料花盆，将有6片真叶的烟草苗移栽到每个塑料花盆中，用去离子水浇透土壤，注意烟草苗移栽的成活情况。

2、菌液处理

与实施例3的蒙氏假单胞菌ZPP-5的菌液处理方式相同。

3、试验处理

将移栽成活的烟苗分为6组，每组6个重复；其中每株烟草中添加9.75g烟草专用复合肥(氮磷钾各占肥料的15％，采购自湖北香青化肥有限公司)，用以模拟烟株的实际种植环境；

试验组将蒙氏假单胞菌ZPP-5菌液用去离子水稀释5倍制成菌液稀释液后，在每株烟草的酸化土壤样品中施加20ml菌液稀释液，在第21天补加等量的菌液稀释液；对照组采用相同方法施加去离子水；每隔7天对花盆中的酸化土壤样品进行取样，每次取样10g，每个花盆中取样重复三次；将每次取样的酸化土壤样品加入25ml的去离子水(采购自XXX公司)，在涡旋仪上震荡1min，在静置2h后，使用pH计检测上清液的pH值，即为土壤pH值。

如图8所示，曲线“ZPP-5”是施加蒙氏假单胞菌ZPP-5菌液对应的土壤的pH值变化情况，曲线“CK(H₂O)”是空白对照。从图7可以看到，在添加了氮磷钾肥料的烟草盆栽土壤中，施加了蒙氏假单胞菌ZPP-5菌液的土壤样品的pH值先上升后下降，而对照组的酸化土壤样品的pH值持续缓慢下降，经分析可能是因为ZPP-5随着时间的延长，在土壤中的数量一般也会呈一定的趋势下降，从而导致其缓解土壤酸化作用的减弱。

实施例6：蒙氏假单胞菌ZPP-5与含有黄腐酸培养基共同使用对酸化土壤的pH值的影响

1、土壤处理

将酸化的烟株田块的土壤过3.5mm的筛网并混合均匀，搅拌均匀，分装到10cm×10cm×10cm的方形小花盆中，每个花盆中称取150g酸化土壤样品。

2、菌液处理

将蒙氏假单胞菌ZPP-5菌种接入LB培养基，置于180r/min、37℃的摇床里过夜活化；然后以1％的接种量分别接入含有黄腐酸的FA培养基(即黄腐酸培养基，原料含有葡萄糖80g、硝酸钠20g、L-谷氨酸钠20g、柠檬酸钠20g、黄腐酸20g、磷酸氢二钾0.7g、H₂O 1L、pH值＝6.5)中；37℃，180r/min的摇床中培养48h，得到蒙氏假单胞菌ZPP-5的培养液备用。

3、试验处理

将蒙氏假单胞菌ZPP-5的培养液用去离子水稀释5倍制成稀释培养液，以土壤质量10％的用量向酸化土壤样品中施加稀释培养液，每组5个重复；对照组分别为CK1(施加等量去离子水)和CK2(施加等量的稀释5倍的FA培养基)；施用后每隔7天取样，检测土壤的pH值，具体方法为：每隔7天称取10g酸化土壤样品加至50ml离心管中，再加入去离子水25ml，利用涡旋仪震荡1min；静置2h后，用pH计检测上清液的pH值，即为酸化土壤样品的pH。

如图9所示，图中，曲线“ZPP-5”是同时施用蒙氏假单胞菌ZPP-5的菌液和含有黄腐酸培养基时不同时段的酸化土壤样品的pH值变化情况，CK(H₂O)和CK(FA)分别是去离子水的空白对照和稀释FA培养基的阴性对照。从图9中可以看到，ZPP-5和CK(FA)的酸化土壤样品的pH值变化曲线基本相同，经分析可能是因为CK中的黄腐酸(FA)为腐殖酸的一种，本身也具有一定的改良土壤理化性质包括对土壤pH的作用；此外，CK中还含有一定量的其他有机酸阴离子，被土壤里面的微生物作为碳源消耗后，留下的阳离子可以提升土壤pH。

实施例7：蒙氏假单胞菌ZPP-5对土壤中交换性铝含量的影响

1、待测液提取方法

称取风干的土壤样品1g，将其放入100ml的离心管中，加入浸提液(1mol/L的氯化钾溶液)50ml；将离心管放入震荡器中180r/min，震荡30min；静置5min后，再以3000r/min离心10min，过滤得到待测液。

2、分光光度法检测

吸取待测液2ml加入10ml的试管中，加入1ml抗坏血酸，4ml显色剂，补充去离子水至10ml，40℃水浴10min后取出，使用分光光度计在530nm波长下测吸光度，利用标准曲线法求得待测液中铝离子的含量。

(3)标准曲线的测定

吸取5mg/L的标准溶液，以0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml添加到10ml的试管中，用移液枪吸取去离子水补齐至2ml；然后使用与待测液相同的方法(即加入1ml抗坏血酸，4ml显色剂，补充去离子水至10ml)显色测定，即可获得0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L的铝离子标准曲线。

如图10、11所示，图10为铝离子标准曲线，图11为土壤中交换性铝含量的影响的检测结果。从图11可以看到，蒙氏假单胞菌ZPP-5能够显著降低土壤中的交换性铝含量，CK(FA)的铝离子含量比ZPP-5的更低，经分析可能是因为CK当中有未被利用的有机酸以及黄腐酸，都能固定一部分铝离子，因此交换性铝含量甚至低于ZPP-5。

实施例8：蒙氏假单胞菌ZPP-5对土壤中交换性盐基总量的影响

1、试剂

(1)1.0g/L甲基红指示剂；

(2)0.05mol/L氢氧化钠标准溶液

称取氢氧化钠2.0g，用无二氧化碳的水定容至1L，摇匀过夜；用邻苯二甲酸氢钾标定；

称取经110℃烘干的邻苯二甲酸氢钾(KHC₈H₄O₄)2.5528g溶于水，定容至250ml得0.0500mol/L的邻苯二甲酸氢钾标准溶液；吸取该溶液25ml至150ml锥形瓶中，加入5g/L酚酞指示剂1-2滴，用待标定的0.05mol/L氢氧化钠溶液滴定至溶液由无色变为浅红色，并在30s内不褪色为终点；同时做空白试验；

按下式计算氢氧化钠溶液的浓度，取3次标定结果的平均值。

式中：

C₁——氢氧化钠溶液的浓度(mol/L)；

V₁——标定时用去氢氧化钠溶液的体积(mL)；

V₀——空白试验用去的氢氧化钠溶液的体积(mL)；

C₂——邻苯二甲酸氢钾的浓度(mol/L)；

V₂——邻苯二甲酸氢钾的体积(mL)；

(3)0.1mol/L盐酸标准溶液。

取12mol/L浓盐酸9ml，用水定容至1L；吸取该溶液15ml，以酚酞作为指示剂，用标定好的0.05mol/L氢氧化钠标准溶液标定其准确浓度：

式中：

C₃——盐酸标准溶液的浓度(mol/L)；

V₃——盐酸标准溶液的体积(ml)；

C₁——氢氧化钠标准溶液的浓度(mol/L)；

V₁——标定时用去标准氢氧化钠溶液的体积(ml)。

2、测定方法

吸取1mol/L乙酸铵处理土壤的浸出液100ml放入瓷蒸发皿中，在水浴锅上蒸干。蒸干后的瓷蒸发皿放入480-500℃高温电炉中灼烧15min，冷却后加0.1mol/L盐酸标准溶液10.00ml，用橡皮头玻璃棒小心擦洗瓷蒸发皿的内壁并搅匀，使残留物溶解，慎防产生的二氧化碳气体溅失溶液，低温加热5min，冷却后，加甲基红指示剂1滴，用标定的0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至突变为黄色。

3、计算结果

交换性基盐总量的计算公式为：

式中：

C₁——盐酸标准溶液的浓度(mol/L)；

V₁——盐酸标准溶液的体积(ml)；

C₂——氢氧化钠标准溶液的浓度(mol/L)；

V₂——氢氧化钠标准溶液的体积(ml)；

Ts——分取倍数，Ts＝浸出液总体积/吸取浸出液体积＝250/100＝2.5；

m₁——风干土样质量(g)；

k₂——将风干土换算成烘干土的水分换算系数。

如图12所示，蒙氏假单胞菌ZPP-5能够有效提升酸化土壤样品中交换性盐基的总量。

综上所述，采用本发明的上述筛选方法，筛选得到的蒙氏假单胞菌ZPP-5能够显著提升土壤pH值，有效降低土壤中交换性铝含量和增加土壤交换性盐基总量，缓解土壤酸化，提高土壤肥力；不会受到黄腐酸(烟草种植时常用的土壤改良)的影响；对环境安全无公害，具有良好的开发前景和应用潜力。

Claims

1.蒙氏假单胞菌（Pseudomones monteilii）ZPP-5，其特征在于，所述蒙氏假单胞菌于2021年08月06日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M2021982。

2.权利要求1所述的蒙氏假单胞菌（Pseudomones monteilii）ZPP-5在缓解土壤酸化上的应用。

3.根据权利要求2所述的蒙氏假单胞菌（Pseudomones monteilii）ZPP-5在缓解土壤酸化上的应用，其特征在于，具体应用方法为：

P1、将蒙氏假单胞菌ZPP-5的菌株接种在LB培养基中，于180r/min、37℃隔夜活化；再以1%的接种量接入LB培养基中，180r/min、37℃培养48h，得菌液；

P2、将步骤P1的菌液稀释5倍制成菌液稀释液，按200L/亩的用量均匀施加在酸化土壤上，保持土壤湿润；

4.根据权利要求3所述的蒙氏假单胞菌（Pseudomones monteilii）ZPP-5在缓解土壤酸化上的应用，其特征在于，步骤P2中，将菌液稀释液施加在酸化土壤的具体方式为：取菌液稀释液按200-300ml/株的用量灌根施加在烟株周围的土壤上；在第21天补加相同量的菌液稀释液。

5.根据权利要求4所述的蒙氏假单胞菌（Pseudomones monteilii）ZPP-5在缓解土壤酸化上的应用，其特征在于，烟株周围的土壤是以烟株为圆心，半径不超过10cm的圆形范围的土壤区域。

6.根据权利要求3所述的蒙氏假单胞菌（Pseudomones monteilii）ZPP-5在缓解土壤酸化上的应用，其特征在于，步骤P3中，检测土壤pH值的方法为每隔7天对土壤取样进行土壤pH值检测。