CN115768784A

CN115768784A - 用于检测抗弹状病毒抗体的多肽

Info

Publication number: CN115768784A
Application number: CN202180024921.XA
Authority: CN
Inventors: D·安斯特罗姆; E·M·沃恩; A·V·耶尔; M·B·鲁夫
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Priority date: 2020-02-06
Filing date: 2021-02-05
Publication date: 2023-03-07
Also published as: US11858962B2; EP4100420A1; JP2023513135A; WO2021158878A1; US20210246171A1

Abstract

本发明涉及用于分析测定的重组构建的蛋白质，特别是用于确定从个体获得的生物样品中是否存在弹状病毒特异性抗体。更具体地，本发明涉及包含弹状病毒糖蛋白的胞外结构域和与所述胞外结构域连接的异源多聚化结构域的多肽。在一个实施例中，提供了式x‑y‑z的融合蛋白，其中x包含任选地不含弗林蛋白酶切割位点的此类胞外结构域或由其组成，y是接头部分，并且z是异源多聚化结构域，任选地选自免疫球蛋白序列、卷曲螺旋序列、链霉抗生物素蛋白序列、纤维蛋白(fibritin)序列和抗生物素蛋白序列。

Description

用于检测抗弹状病毒抗体的多肽

技术领域

本发明涉及用于分析测定的重组构建的蛋白质，特别是用于确定从个体获得的生物样品中是否存在弹状病毒特异性抗体。

背景信息

弹状病毒是属于弹状病毒科的具有包膜的负链RNA病毒。弹状病毒病毒体包含源自产生病毒的细胞的外膜和包含非分段基因组RNA和N蛋白(nucleocapsid protein，核衣壳蛋白)的内部核糖核蛋白核心。弹状病毒糖蛋白(glycoprotein，G)跨越外膜并在病毒颗粒表面形成刺突。已知弹状病毒糖蛋白对病毒传播至关重要，因为它在病毒入胞过程中具有受体结合和膜融合的功能。病毒基质蛋白(matrix protein，M)分子位于病毒包膜内，并形成在膜和核衣壳核心之间的层。非结构蛋白包括L蛋白(large protein，大蛋白)和P蛋白(phosphoprotein，磷蛋白)，它们形成病毒转录酶-复制酶复合物。

弹状病毒广泛分布于自然界中，可以感染脊椎动物、无脊椎动物和植物。原型弹状病毒是狂犬病毒(rabies virus，RV)和水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)，它们被认为是该病毒家族中研究最多的病毒。2014年，据报道发现了一种能够感染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda，Sf)细胞的新型弹状病毒，被称为Sf-弹状病毒(Sf-rhabdovirus，SfRV)(Ma等人，J Virol，88(12)：6576-6585)。在WO2015051255A1中，描述了通过PCR测定来检测这种病毒。

事实上，对于诸如ELISA的固相测定，需要将一定量的抗原固定在固体支持物上，需要在细胞培养中以尽可能高的产率生产的抗原，以降低每次测定的成本并减少不经济的浪费。

因此，关于用于检测弹状病毒特异性抗体的固相测定的生产，需要多肽，其在细胞培养中以尽可能高的产率生产，同时在进行测定时保留充分结合所述抗体所必需的抗原性。

发明详述

上述技术问题的解决方案通过说明书和权利要求书中的实施方案来实现。

因此，本发明在其不同方面是根据权利要求书来实施的。

本发明基于以下出人意料的发现：将SfRV糖蛋白的胞外结构域的C-端，优选在第306位和第333位氨基酸处具有取代的SfRV糖蛋白的胞外结构域的C-端，融合到IgG Fc结构域，使得当与具有野生型序列的相应胞外结构域的表达相比时，具有显著更高摩尔产率的抗原表达，该抗原可用于检测血清样品中对SfRV特异的抗体。与使用野生型序列的比对测试生产相比，这种有益效果还允许以相同的蛋白质表达成本进行显著更多数量的ELISA测试。

因此，在第一方面，本发明涉及一种多肽，其包含

弹状病毒糖蛋白的胞外结构域和

与所述胞外结构域连接的异源多聚化结构域。

所述多肽，在下文中也称为“本发明的多肽”，优选用于确定从个体获得的生物样品中是否存在对弹状病毒具有特异性的抗体。

如本文所用，术语“胞外结构域”旨在涵盖位于病毒包膜外表面上的蛋白质部分。例如，弹状病毒糖蛋白的胞外结构域是弹状病毒糖蛋白延伸到病毒外空间的那部分。更具体地，弹状病毒糖蛋白的胞外结构域是其中跨膜螺旋和细胞质结构域已被去除的弹状病毒糖蛋白。更优选地，弹状病毒糖蛋白的胞外结构域是其中跨膜螺旋、细胞质结构域和N-端信号肽已被去除的弹状病毒糖蛋白。

如在本发明的上下文中使用的术语“多聚化结构域”特别涉及能够特异性结合或缔合一个或多个进一步的多聚化结构域以形成多聚体的氨基酸序列。在一个实施例中，多聚化结构域是一种氨基酸序列，其能够结合或分别与另一个具有相同氨基酸序列的多聚化结构域同源缔合以形成同源二聚体。多聚化结构域可以包含一个或多个半胱氨酸残基，从而可以在相关的多聚化结构域之间形成二硫键。

在本文中，“异源多聚化结构域”特别涉及衍生自不同于如本文所述弹状病毒糖蛋白所来自的弹状病毒的实体的多聚化结构域。例如，异源多聚化结构域是由除弹状病毒之外的病毒基因组或优选由真核细胞或原核细胞特别是哺乳动物细胞的基因组编码的多聚化结构域。

优选地，多聚化结构域通过接头部分与所述胞外结构域连接。

如在本发明上下文中所述的接头部分优选是肽接头。

如本文所用，术语“肽接头”是指包含一个或多个氨基酸残基的肽。更具体地，如本文所用的术语“肽接头”是指能够连接两个可变结构域(例如，胞外结构域和多聚化结构域)的肽，其长度取决于要连接的可变结构域的种类。

在一个特别优选的方面，多聚化结构域通过接头部分与所述胞外结构域连接，其中

-多聚化结构域通过接头部分的N-端氨基酸残基和胞外结构域的C-端氨基酸残基之间的肽键连接到接头部分，并且

-接头部分通过多聚化结构域的N-端氨基酸残基和接头部分的C-端氨基酸残基之间的肽键连接至多聚化结构域。

此外，优选多聚化结构域通过多聚化结构域的N-端氨基酸残基和胞外结构域的C-端氨基酸残基之间的肽键连接至胞外结构域。

在另一个优选的方面，本发明提供了一种多肽，特别是如上所述的多肽，其中所述多肽是式x-y-z的融合蛋白，其中

x由弹状病毒糖蛋白的胞外结构域组成或包含弹状病毒糖蛋白的胞外结构域；

y是接头部分；并且

z是异源多聚化结构域。

式x-y-z尤其应理解为所述胞外结构域的C-端氨基酸残基与所述接头部分连接，优选通过肽键与所述接头部分的N-端氨基酸残基连接，并且所述多聚化结构域的N-端氨基酸残基与所述接头部分连接，优选通过肽键与所述接头部分的C-端氨基酸残基连接。

最优选地，本发明上下文中在此提及的胞外结构域不含弗林蛋白酶切割位点。“不含弗林蛋白酶切割位点”特别是指在胞外结构域的氨基酸序列中不存在弗林蛋白酶切割位点。

如本文所述，弗林蛋白酶切割位点特别是选自以下(a)、(b)和(c)的氨基酸序列：

(a)选自RXKR(SEQ ID NO:20)和RXRR(SEQ ID NO:21)的氨基酸序列，其中X可以是任何氨基酸残基；

(b)选自RX₁KRX₂(SEQ ID NO:22)和RX₁RRX₂(SEQ ID NO:23)的氨基酸序列，其中

X₁可以是任何氨基酸残基，并且

X₂可以是

-除赖氨酸残基外任何氨基酸残基，或

-除选自缬氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基和色氨酸残基的氨基酸残基外的任何氨基酸残基；

(c)选自RX₁KRX₂X₃(SEQ ID NO:24)和RX₁RRX₂X₃(SEQ ID NO:25)的氨基酸序列，其中

X₁可以是任何氨基酸残基，

X₂可以是

-除赖氨酸残基外任何氨基酸残基，或

X₃可以是除赖氨酸残基之外的任何氨基残基。

如本文所述，术语“任何氨基酸残基”特别理解为等同于“任何遗传编码的氨基酸残基”。

如本文所述，除赖氨酸残基外的氨基酸残基特别是天然存在的、优选遗传编码的氨基酸残基。

如本发明的上下文中所述，术语“遗传编码的氨基酸残基”特别是指选自丙氨酸残基(A)、天冬氨酸残基(D)、天冬酰胺残基(N)、半胱氨酸残基(C)、谷氨酰胺残基(Q)、谷氨酸残基(E)、苯丙氨酸残基(F)、甘氨酸残基(G)、组氨酸残基(H)、异亮氨酸残基(I)、赖氨酸残基(K)、亮氨酸残基(L)、蛋氨酸残基(M)、脯氨酸残基(P)、精氨酸残基(R)、丝氨酸残基(S)、苏氨酸残基(T)、缬氨酸残基(V)、色氨酸残基(W)和酪氨酸残基(Y)的氨基酸残基(括号内的是单字母代码)。

因此，例如，本文提到的措辞“可以是除赖氨酸残基之外的任何氨基酸残基”尤其理解为等同于“是选自丙氨酸残基、天冬氨酸残基、天冬酰胺残基、半胱氨酸残基、谷氨酰胺残基、谷氨酸残基、苯丙氨酸残基、甘氨酸残基、组氨酸残基、异亮氨酸残基、亮氨酸残基、蛋氨酸残基、脯氨酸残基、精氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、缬氨酸残基、色氨酸残基、和酪氨酸残基的氨基酸残基”。

最优选地，如在本发明的上下文中提到的，弹状病毒糖蛋白是草地贪夜蛾弹状病毒(S.frugiperda rhabdovirus，SF-rhabdovirus)糖蛋白。

在一个优选的方面，如本文所述的胞外结构域是SF-弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，其具有

(i)一种或多种选自以下的突变：

第306位氨基酸取代，第303位氨基酸取代，第305位氨基酸取代，第307位氨基酸取代，和第308位氨基酸取代，

和

(ii)一种或多种选自以下的突变：

第333位氨基酸取代，第330位氨基酸取代，第332位氨基酸取代，第334位氨基酸取代，和第335位氨基酸取代，

其中氨基酸位点的编号是根据野生型SF-弹状病毒糖蛋白的氨基酸序列。

本文中，术语“突变”涵盖氨基酸序列的任何变化(用遗传编码的氨基酸残基替换和插入以及缺失)。如本文所述，术语“氨基酸位点的取代”特别是指蛋白质氨基酸序列的特定位置的氨基酸残基发生变化。

优选地，本文提到的胞外结构域是具有一个或多个本文所述的突变或氨基酸残基的SF-弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，其中胞外结构域的N-端氨基酸残基优选对应于野生型SF-弹状病毒糖蛋白的第1-22位氨基酸中的任一个，最优选对应于第22、21或1位氨基酸。

根据进一步优选的方面，本文所述的胞外结构域包含长度为529-550个氨基酸残基的氨基酸序列或由其组成。

在一个特别优选的方面，所述胞外结构域是SF-弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，其在第306位氨基酸处具有取代和在第333位氨基酸处具有取代，其中氨基酸位点的编号根据野生型SF-弹状病毒糖蛋白的氨基酸序列。

优选地，本发明上下文中描述的胞外结构域是SF-弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，其具有

在第306位氨基酸处除精氨酸残基外的氨基酸残基，和

在第333位氨基酸处除精氨酸残基外的氨基酸残基，

其中氨基酸位点的编号是指野生型SF-弹状病毒糖蛋白的氨基酸序列。

在一个特别优选的方面，本文所述的胞外结构域是SF-弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，其包含与SEQ ID NO:4的序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％或特别地至少95％序列一致性的氨基酸序列或由其组成。

本文所述的胞外结构域是SF-弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，其包含与SEQ IDNO:4的序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％或特别地至少95％序列一致性的氨基酸序列或由其组成，并且具有

在第306位氨基酸处除精氨酸残基外的氨基酸残基，和

在第333位氨基酸处除精氨酸残基外的氨基酸残基，

其中氨基酸位点的编号根据野生型SF-弹状病毒糖蛋白的氨基酸序列。

术语“其中氨基酸位点的编号根据野生型SF-弹状病毒糖蛋白的氨基酸序列”指的是：氨基酸位点的编号根据全长野生型SF-弹状病毒糖蛋白的氨基酸序列。因此，本文所述的氨基酸位点编号特别是根据具有610个氨基酸残基的野生型SF-弹状病毒糖蛋白，包括(N-端)第1位氨基酸的甲硫氨酸残基。因此，如在本发明上下文中使用的该编号特别涉及野生型SF-弹状病毒糖蛋白的序列，如SEQ ID NO:16所示。换言之，在本文中，如果提及第306位氨基酸，则氨基酸残基是指对应于SEQ ID NO:16的第306位氨基酸，或者，如果提及第333位氨基酸，则表示氨基酸残基对应于SEQ ID NO:16的第333位氨基酸。然而，这并不意味着本文以这种方式描述的胞外结构域具有与SEQ ID NO:16的氨基酸序列相同的氨基酸序列。只是说相应的氨基酸位于序列内的某个位置，该位置对应于野生型SF-弹状病毒糖蛋白序列中明确提及的位置。例如，如果指的是SF-弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，其在第306位氨基酸处具有除精氨酸残基之外的氨基酸残基并且在第333位氨基酸处具有除精氨酸残基之外的氨基酸残基，其中氨基酸位点的编号是指野生型SF-弹状病毒糖蛋白的氨基酸序列，那么在一个实例中，这将涉及衍生自SEQ ID NO:16的野生型SF-弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，其在第306位和第333位氨基酸处含有取代(即，对应于SEQ ID NO:16的序列中第306位和第333位的精氨酸残基均已被除精氨酸残基之外的氨基酸残基取代)。

例如，SEQ ID NO:1的胞外结构域的序列第285位和第312位(即SEQ ID NO:16所示糖蛋白的胞外结构域(无N-端信号肽)在第306位和第333位氨基酸的每一处具有取代(即谷氨酰胺残基而不是精氨酸残基))对应于野生型SF-弹状病毒糖蛋白的氨基酸序列的第306位和第333位，如SEQ ID NO:16所示。

还应理解，本文使用的术语“信号肽”等同于术语“信号结构域”。

根据进一步优选的方面，如本文所述的胞外结构域是SF-弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，其具有

-在第306位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，和/或

-在第303位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，和/或

-在第305位氨基酸处除碱性氨基酸之外的氨基酸残基，和/或

-在第307位氨基酸处的选自赖氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、缬氨酸残基和色氨酸残基的氨基酸残基，和/或

-在第308位氨基酸处的赖氨酸残基；

并且具有

-在第333位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，和/或

-在第330位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，和/或

-在第332位氨基酸处除碱性氨基酸之外的氨基酸残基，和/或

-在第334位氨基酸处的选自赖氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、缬氨酸残基和色氨酸残基的氨基酸残基，和/或

-在第335位氨基酸处的赖氨酸残基，

如本文所述，术语“碱性氨基酸残基”特别涉及选自精氨酸残基、赖氨酸残基和组氨酸残基的氨基酸残基。

如本文所述，“碱性氨基酸残基之外的氨基酸残基”因此特别涉及除以下氨基酸残基之外的氨基酸残基

-精氨酸残基，

-赖氨酸残基或

-组氨酸残基。

优选地，所述胞外结构域是SF-弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，其具有

-在第306位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，和

-在第333位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，

如本文所述，野生型SF-弹状病毒糖蛋白优选由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成或者是SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在这点上，尤其应理解“由氨基酸序列组成”的措辞等同于“是氨基酸序列”的措辞。

因此，如本文所述，野生型SF-弹状病毒糖蛋白的氨基酸序列优选为SEQ ID NO:16的野生型SF-弹状病毒糖蛋白的氨基酸序列。

此外，根据本发明特别优选的是，如果胞外结构域是SF-弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，其在第306位和第333位氨基酸中的每一处具有除精氨酸残基之外的氨基酸残基，其中氨基酸位点的编号根据野生型SF-弹状病毒糖蛋白的氨基酸序列，并且其中所述胞外结构域由与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的序列具有至少70％序列一致性的氨基酸序列组成。

如本文所述，除精氨酸残基之外的氨基酸残基特别是天然存在的、优选遗传编码的氨基酸残基。

根据另一个优选的方面，本文提到的胞外结构域是SF-弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，其具有

-在第306位氨基酸处，选自具有极性但不带电荷的侧链的氨基酸残基、具有疏水性侧链的氨基酸残基和甘氨酸残基的氨基酸残基

和/或在第303位氨基酸处，选自具有极性但不带电荷的侧链的氨基酸残基、具有疏水性侧链的氨基酸残基和甘氨酸残基的氨基酸残基；

和

-在第333位氨基酸处，选自具有极性但不带电荷的侧链的氨基酸残基、具有疏水性侧链的氨基酸残基和甘氨酸残基的氨基酸残基

和/或在第330位氨基酸处，选自具有极性但不带电荷的侧链的氨基酸残基、具有疏水性侧链的氨基酸残基和甘氨酸残基的氨基酸残基；

如在本发明的上下文中提到的，具有极性但不带电荷的侧链的氨基酸残基优选自丝氨酸残基、苏氨酸残基、酪氨酸残基、天冬酰胺残基和谷氨酰胺残基。

如本文所述，具有疏水性侧链的氨基酸残基优选自丙氨酸残基、缬氨酸残基、亮氨酸残基、甲硫氨酸残基、异亮氨酸残基、苯丙氨酸残基和色氨酸残基。

根据一个更特别优选的方面，本文提及的胞外结构域是SF-弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，其具有

-在第306位氨基酸处选自谷氨酰胺残基和天冬酰胺残基的氨基酸残基和/或在第303位氨基酸处选自谷氨酰胺残基和天冬酰胺残基的氨基酸残基；和

-在第333位氨基酸处选自谷氨酰胺残基和天冬酰胺残基的氨基酸残基和/或在第330位氨基酸处选自谷氨酰胺残基和天冬酰胺残基的氨基酸残基；

更具体地，在本发明的上下文中优选胞外结构域，其中所述胞外结构域是SF-弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，其具有

-在第306位氨基酸处选自谷氨酰胺残基和天冬酰胺残基的氨基酸残基；和

-在第333位氨基酸处选自谷氨酰胺残基和天冬酰胺残基的氨基酸残基；

在另一个优选的方面，胞外结构域包含与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQID NO:3的序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％、还更优选地至少95％或特别地100％序列一致性的氨基酸序列或由其组成。

在一个实施例中，如在本发明上下文中描述的胞外结构域因此是包含与SEQ IDNO:1的序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％、还更优选地至少95％序列一致性的氨基酸序列或由其组成，

并且其中所述胞外结构域具有

-在第285位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，和/或

-在第282位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，和/或

-在第286位氨基酸处选自赖氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、缬氨酸残基和色氨酸残基的氨基酸残基，和/或

-在第287位氨基酸处的赖氨酸残基，

并且具有

-在第312位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，和/或

-在第309位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，和/或

-在第313位氨基酸处选自赖氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、缬氨酸残基和色氨酸残基的氨基酸残基，和/或

-在第314位氨基酸处的赖氨酸残基，

其中氨基酸位点的编号根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

特别地，所述胞外结构域优选包含与SEQ ID NO:1的序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％或还更优选地至少95％序列一致性的氨基酸序列或由其组成，并且其中所述胞外结构域具有

-在第285位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，

和

-在第312位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，

并且其中氨基酸位点的编号是指SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

更具体地，所述胞外结构域包含与SEQ ID NO:1的序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％或还更优选地至少95％序列一致性的氨基酸序列或由其组成，并且其中所述胞外结构域具有

-在第285位氨基酸处选自具有极性但不带电荷的侧链的氨基酸残基、具有疏水性侧链的氨基酸残基和甘氨酸残基的氨基酸残基

和/或在第282位氨基酸处选自具有极性但不带电荷的侧链的氨基酸残基、具有疏水性侧链的氨基酸残基和甘氨酸残基的氨基酸残基；

和

-在第312位氨基酸处选自具有极性但不带电荷的侧链的氨基酸残基、具有疏水性侧链的氨基酸残基和甘氨酸残基的氨基酸残基

和/或在第309位氨基酸处选自具有极性但不带电荷的侧链的氨基酸残基、具有疏水性侧链的氨基酸残基和甘氨酸残基的氨基酸残基；

并且其中氨基酸位点的编号根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

更特别地，所述胞外结构域包含与SEQ ID NO:1的序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％或还更优选地至少95％序列一致性的氨基酸序列或由其组成，并且其中所述胞外结构域具有

-在第285位氨基酸处选自谷氨酰胺残基和天冬酰胺残基的氨基酸残基和/或在第282位氨基酸处，选自谷氨酰胺残基和天冬酰胺残基的氨基酸残基；和

-在第312位氨基酸处选自谷氨酰胺残基和天冬酰胺残基的氨基酸残基和/或在第309位氨基酸处选自谷氨酰胺残基和天冬酰胺残基的氨基酸残基；

并且其中氨基酸位点的编号根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

术语“其中氨基酸位点的编号根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列”指的是：氨基酸位点的编号根据SEQ ID NO:1的整个序列的氨基酸序列。因此，本文提到的这种氨基酸位点编号是指具有529个氨基酸残基的序列，包括(N-端)第1位氨基酸处的天冬酰胺残基。换言之，在本文中，如果提及第285位氨基酸，则氨基酸残基是指对应于SEQ ID NO:1的第285位氨基酸，或者，如果提及第312位氨基酸，则表示氨基酸残基对应于SEQ ID NO:1的第312位氨基酸。然而，这并不意味着本文以这种方式描述的胞外结构域具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相同的氨基酸序列。只是说相应的氨基酸位于序列内的某个位置，该位置对应于SEQ IDNO:1的序列中明确提及的位置。

关于在本发明的上下文中提到的术语“至少90％”，应当理解，所述术语优选地涉及“至少91％”，更优选地涉及“至少92％”，还更优选地涉及“至少93％”或特别是“至少94％”。

关于在本发明的上下文中提到的术语“至少95％”，应当理解，所述术语优选地涉及“至少96％”，更优选地涉及“至少97％”，还更优选地涉及“至少98％”或特别是“至少99％”。

如本文所用，术语“具有100％序列一致性”应理解为等同于术语“相同”。

序列一致性百分比具有本领域公认的含义，并且有许多方法可以测量两个多肽或多核苷酸序列之间的一致性。参见，例如：Lesk，Ed.，Computational Molecular Biology，Oxford University Press，New York，(1988)；Smith，Ed.，Biocomputing：InformaticsAnd Genome Projects，Academic Press，New York，(1993)；Griffin&Griffin，Eds.，Computer Analysis Of Sequence Data，Part I，Humana Press，New Jersey，(1994)；vonHeinje，Sequence Analysis In Molecular Biology，Academic Press，(1987)；和Gribskov&Devereux，Eds.，Sequence Analysis Primer，M Stockton Press，New York，(1991)。用于比对多核苷酸或多肽的方法编码在计算机程序中，包括GCG程序包(Devereux等人，Nuc.Acids Res.12:387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul等人，J.Molec.Biol.215:403(1990))和Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8for Unix，Genetics Computer Group，University Research Park，575ScienceDrive，Madison，Wis.53711)，该程序使用Smith的局部同源算法和Waterman(Adv.App.Math.，2:482-489(1981))。例如，可以使用采用FASTA算法的计算机程序ALIGN，具有-12的空位开放罚分和-2的空位扩展罚分的仿射空位搜索。出于本发明的目的，核苷酸序列使用DNASTAR Inc.的MegAlign软件11.1.0(59)，419版本中的Clustal W方法使用程序中设置的默认多重比对参数进行比对(空位罚分＝15.0，空位长度罚分＝6.66，延迟发散序列(％)＝30％，DNA转换权重＝0.50和DNA权重矩阵＝IUB)，并且，蛋白质/氨基酸序列使用DNASTAR Inc.的MegAlign软件11.1.0(59)，419版本中的Clustal W方法使用程序中设置的默认多重比对参数进行比对(Gonnet系列蛋白质权重矩阵，空位罚分＝10.0，空位长度罚分＝0.2，延迟发散序列(％)＝30％)。

如本文所用，应特别理解术语“与SEQ ID NO:X的序列的序列一致性”分别等同于术语“在SEQ ID NO:X的长度上与SEQ ID NO:X的序列的序列一致性”或术语“在SEQ ID NO:X的整个长度上与SEQ ID NO:X的序列的序列一致性”。在本文中，“X”是选自1至25的任何整数，因此“SEQ ID NO:X”代表本文提及的任何SEQ ID NO。

根据进一步优选的方面，本文所述的胞外结构域包含长度为529、530或550个氨基酸残基的氨基酸序列或由其组成。

更具体地，本文提及的胞外结构域包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3的氨基酸序列或由其组成。

本文所述的异源多聚化结构域优选自免疫球蛋白序列、卷曲螺旋序列、链霉抗生物素序列、纤维蛋白(fibritin)序列和抗生物素蛋白序列。

更优选地，异源多聚化结构域选自免疫球蛋白恒定区结构域、亮氨酸拉链结构域和埃希氏菌病毒T4纤维蛋白序列。

更优选地，异源多聚化结构域是二聚化结构域，优选选自IgG Fc结构域和亮氨酸拉链结构域。

特别地，如果异源多聚化结构域包含IgG Fc结构域或由其组成，则是优选的。

如果本发明的多肽用于确定从个体获得的生物样品中是否存在对弹状病毒具有特异性的抗体，则免疫球蛋白恒定区结构域或IgG Fc结构域的氨基酸序列分别如本文所述，优选源自个体生物学分类科之外的生物学分类科。例如，如果本发明的多肽用于确定从猪获得的生物样品中是否存在对弹状病毒具有特异性的抗体，那么免疫球蛋白恒定区结构域或IgG Fc结构域的氨基酸序列分别优选地来源于除猪科之外的生物学分类科。因此，例如如果所述生物样品是从猪获得的，那么免疫球蛋白恒定区结构域或IgG Fc结构域分别优选是牛、犬、山羊、绵羊、人或豚鼠来源的。

更具体地，异源多聚化结构域优选包含豚鼠IgG Fc结构域或由其组成。

在进一步优选的方面，异源多聚化结构域包含与选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％、还更优选地至少95％或特别地100％序列一致性的氨基酸序列或由其组成。

本文提及的接头部分或肽接头分别优选为长度为1至50个氨基酸残基，特别是长度为3至20个氨基酸残基的氨基酸序列。

根据一个优选的方面，接头部分包含与选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:11的序列具有至少66％、优选地至少80％、更优选地至少90％、还更优选地至少95％或特别地100％序列一致性的氨基酸序列或由其组成。

在一个特别优选的方面，本发明的多肽是一种蛋白质，其包含与选自SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％或还更优选地至少95％序列一致性的氨基酸序列或由其组成。

优选地，本发明的多肽是一种蛋白质，其包含选自SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的序列。

还应理解，如本文所用，术语“由序列组成的蛋白质”还特别涉及受表达多肽的细胞影响的任何共翻译和/或翻译后修饰或序列的修饰。因此，如本文所述，术语“由序列组成的蛋白质”还指具有由表达多肽的细胞影响的一种或多种修饰的序列，特别是在蛋白质生物合成和/或蛋白质加工中影响的氨基酸残基的修饰，优选自糖基化、磷酸化和乙酰化。

根据本发明的一个特别优选的方面，在杆状病毒表达系统中，与SEQ ID NO:15的多肽的产量相比，本发明多肽的产率更高，优选高至少2倍，更优选至少3倍，还更优选至少5倍，还更优选至少8倍。

因此，本发明的多肽优选是重组蛋白，特别是重组杆状病毒表达的蛋白。

如本文所用，术语“重组蛋白质”特别是指通过重组DNA技术产生的蛋白质，其中通常将编码表达蛋白质的DNA插入合适的表达载体中，该表达载体继而用于转化或在病毒载体的情况下感染宿主细胞以产生异源蛋白质。因此，如本文所用，术语“重组蛋白质”特别是指从重组DNA分子表达的蛋白质分子。如本文所用，“重组DNA分子”是指由通过分子生物学技术连接在一起的DNA片段组成的DNA分子。用于生产重组蛋白的合适系统包括但不限于昆虫细胞(例如，杆状病毒)、原核系统(例如，大肠杆菌)、酵母(例如，酿酒酵母、毕赤酵母)、哺乳动物细胞(例如，中国仓鼠卵巢、HEK293)、植物(例如红花)、鸟类细胞、两栖动物细胞、鱼细胞和无细胞系统(例如兔网织红细胞裂解物)。

如本文所述，术语“产率”特别理解为“摩尔产率”。

根据另一方面，本发明还提供了一种编码本发明多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸在下文中也称为“根据本发明的多核苷酸”。

优选地，根据本发明的多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQID NO:19的序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％、还更优选地至少95％或特别地100％序列一致性的核苷酸序列。

本文所述的多核苷酸的生产在本领域技术范围内，并且可以根据Sam brook等人，2001，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY；Amusable等人，2003，Current Protocols In MolecularBiology，Greene Publishing Associates&Wiley Interscience，NY；Innis等人(eds)，1995，PCR Strategies，Academic Press，Inc，San Diego和Erlich(ed)，1994，PCRTechnology，Oxford University Press，New York以及其他地方描述的重组技术进行，以上这些援引加入本文。

在又一方面，本发明提供了包含编码本发明多肽的多核苷酸的载体。

就本发明而言，“载体”以及“包含编码本发明多肽的多核苷酸的载体”是指合适的表达载体，优选杆状病毒表达载体，其进而用于转染，或者在杆状病毒表达载体的情况下用于感染宿主细胞以产生由DNA编码的蛋白质或多肽。载体和制备和/或使用载体(或重组体)进行表达的方法可以通过或类似于以下公开的方法制备或进行：U.S.Pat.Nos.4,603,112,4,769,330,5,174,993,5,505,941,5,338,683,5,494,807,4,722,848,5,942,235,5,364,773,5,762,938,5,770,212,5,942,235,382,425,PCT publications WO 94/16716,WO 96/39491,WO 95/30018；Paoletti,"Applications of pox virus vectors to vaccination:An update,"PNAS USA 93:11349-11353,October 1996；Moss,"Genetically engineeredpoxviruses for recombinant gene expression,vaccination,and safety,"PNAS USA93:11341-11348,October 1996；Smith等人,U.S.Pat.No.4,745,051(recombinantbaculovirus)；Richardson,C.D.(Editor),Methods in Molecular Biology 39,"Baculovirus Expression Protocols"(1995Humana Press Inc.)；Smith等人,"Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with aBaculovirus Expression Vector",Molecular and Cellular Biology,December,1983,Vol.3,No.12,p.2156-2165；Pennock等人,"Strong and Regulated Expression ofEscherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector,"Molecular and Cellular Biology March 1984,Vol.4,No.3,p.406；EPA0 370 573；U.S.application No.920,197,filed Oct.16,1986；EP Patent publication No.265785；U.S.Pat.No.4,769,331(recombinant herpesvirus)；Roizman,"The function of herpessimplex virus genes:A primer for genetic engineering of novel vectors,"PNASUSA 93:11307-11312,October 1996；Andreansky等人,"The application ofgenetically engineered herpes simplex viruses to the treatment ofexperimental brain tumors,"PNAS USA 93:11313-11318,October 1996；Robertson等人,"Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes",PNAS USA93:11334-11340,October 1996；Frolov等人,"Alphavirus-based expression vectors:Strategies and applications,"PNAS USA 93:11371-11377,October 1996；Kitson等人,J.Virol.65,3068-3075,1991；U.S.Pat.Nos.5,591,439,5,552,143；WO 98/00166；allowedU.S.application Ser.Nos.08/675,556,and 08/675,566both filed Jul.3,1996(recombinant adenovirus)；Grunhaus等人,1992,"Adenovirus as cloning vectors,"Seminars in Virology(Vol.3)p.237-52,1993；Ballay等人,EMBO Journal,vol.4,p.3861-65,Graham,Tibtech 8,85-87,April,1990；Prevec等人,J.Gen Virol.70,42434；PCT WO 91/11525；Felgner等人,(1994),J.Biol.Chem.269,2550-2561,Science,259:1745-49,1993；and McClements等人,"Immunization with DNA vaccines encodingglycoprotein D or glycoprotein B,alone or in combination,induces protectiveimmunity in animal models of herpes simplex virus-2disease",PNAS USA 93:11414-11420,October 1996；and U.S.Pat.Nos.5,591,639,5,589,466,and 5,580,859,aswell as WO 90/11092,WO93/19183,WO94/21797,WO95/11307,WO95/20660；Tang等人,Nature,and Furth等人,Analytical Biochemistry,relating to DNA expressionvectors,inter alia.See also WO 98/33510；Ju等人,Diabetologia,41:736-739,1998(lentiviral expression system)；Sanford等人,U.S.Pat.No.4,945,050；Fischbach等人(Intracel)；WO 90/01543；Robinson等人,Seminars in Immunology vol.9,pp.271-283(1997),(DNA vector systems)；Szoka等人,U.S.patent No.4,394,448(method ofinserting DNA into living cells)；McCormick等人,U.S.Pat.No.5,677,178(use ofcytopathic viruses)；and U.S.Pat.No.5,928,913(vectors for gene delivery)；以及本文引用的其他文件。

优选的病毒载体包括杆状病毒，例如BaculoGold(BD Biosciences Pharmingen，圣地亚哥，加利福尼亚州)，特别是在生产细胞是昆虫细胞的情况下。尽管优选杆状病毒表达系统，但本领域的技术人员认为，包括上述表达系统在内的其他表达系统将用于本发明的目的，即重组蛋白的表达。

因此，本发明还提供了含有编码本发明多肽的多核苷酸的杆状病毒，其中所述杆状病毒在下文中也称为“根据本发明的杆状病毒”。

此外，本发明提供了一种质粒，其中所述质粒包含编码本发明多肽的多核苷酸。所述质粒在下文中也称为“根据本发明的质粒”，优选为表达载体。

本发明还提供了一种细胞，

其包含质粒，特别是表达载体，所述质粒特别是表达载体包含编码本发明多肽的多核苷酸，

或者

其被包含编码本发明多肽的多核苷酸的杆状病毒感染，

并且其中所述细胞在下文中也称为“根据本发明的细胞”。

在另一个具体方面，根据本发明的质粒、根据本发明的细胞或根据本发明的杆状病毒分别包含多核苷酸，所述多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ IDNO:19的序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％、还更优选地至少95％或特别地100％序列一致性的核苷酸序列。

在又一方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包含固定在固体支持物上的本发明的多肽。

如本文所用，术语“固定”特别是指本发明的多肽可以任何方式或任何方法附着于表面(例如，固体支持物)；包括例如可逆或不可逆结合、共价或非共价连接等。

如本文所述，术语“固体支持物”表示非流体物质，包括由聚合物、金属(顺磁性、铁磁性颗粒)、玻璃和陶瓷等材料制成的芯片、容器和颗粒(包括微颗粒和微珠)；凝胶物质，例如二氧化硅、氧化铝和聚合物凝胶；毛细管，可以由聚合物、金属、玻璃和/或陶瓷制成；沸石和其他多孔物质；电极；微量滴定板；实心条；和比色皿、试管或其他光谱仪样品容器。测定的固体支持物组分与测定可能与之接触的惰性固体表面的区别在于“固体支持物”在其表面上包含至少一个部分，其旨在与捕获试剂直接或间接相互作用。固体支持物可以是固定组分，例如管、条、比色皿或微量滴定板，或者可以是非固定组分，例如珠子和微粒。

微粒也可用作均质测定形式的固体支持物。可以使用允许蛋白质和其他物质非共价或共价连接的多种微粒。这样的颗粒包括聚合物颗粒，例如聚苯乙烯和聚(甲基丙烯酸甲酯)；金粒子，例如金纳米粒子和金胶体；以及陶瓷颗粒，例如二氧化硅、玻璃和金属氧化物颗粒。参见Martin,C.R.等人，Analytical Chemistry-News&Features 70(1998)322A-327A，援引加入本文。

“芯片”是一种固体、无孔材料，例如金属、玻璃或塑料。该材料可以选择性地全部涂覆或在某些区域涂覆。在材料的表面上存在斑点阵列，无论是可见的还是坐标中的。在每个点上，可以固定材料表面上带有或不带有接头或间隔物的确定的多肽。本文提及的所有文献，无论是在上文还是在下文中，均援引加入本文。

在本发明的又一方面，提供了产生本发明的多肽的方法，其中该方法包括

-用质粒优选表达载体转染细胞，所述质粒优选表达载体包含多核苷酸，该多核苷酸包含编码本发明多肽的序列，

或者

-用含有多核苷酸的杆状病毒感染细胞，优选昆虫细胞，所述多核苷酸包含编码本发明多肽的序列。

在产生本发明多肽的方法的一个具体方面，所述质粒是根据本发明的质粒，特别是如上所述的。

在产生本发明多肽的方法的另一个具体方面，所述杆状病毒是根据本发明的杆状病毒，特别是如上所述的。

本发明进一步提供了一种确定从个体获得的生物样品中是否存在弹状病毒特异性抗体的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a.将生物样品与固定在固体支持物上的捕获试剂接触，其中捕获试剂是本发明的多肽；并且

b.确定是否存在与所述捕获试剂结合的所述抗体。

优选地，所述确定从个体获得的生物样品中是否存在弹状病毒特异性抗体的方法进一步包括以下步骤：

c.将生物样品与固定化的捕获试剂分离；

d.将固定的捕获试剂-抗体复合物与可检测试剂接触，该试剂与试剂-抗体复合物中的抗体结合；并且

e.使用检测试剂的检测方法测量与捕获试剂结合的抗体水平，并且其中测量步骤(e)优选地进一步包括与标准曲线的比较以确定与捕获试剂结合的抗体水平。

所述与试剂-抗体复合物中的抗体结合的可检测试剂优选为可检测抗体，更优选为标记的二抗。

如本文所用，术语“生物样品”是指取自个体(例如从猪或鸟)的任何样品，包括但不限于含细胞的体液、外周血、血浆或血清、唾液、组织匀浆、肺和其他器官抽吸物、灌洗液和灌肠液，以及可从人或动物受试者获得的任何其他来源的样品。对于动物，“生物样品”的例子包括血液、细胞、粪便、腹泻、乳汁、粘液、痰、脓液、唾液、精液、汗液、泪液、尿液、泪液、眼液、阴道分泌物和呕吐物(如果动物体内存在)。

如本文所述，生物样品优选从哺乳动物或鸟类，优选从猪或鸡(Gallus gallusdomesticus)分离，和/或特别选自全血、血浆、血清、尿液和口腔液。在此，术语“血清(serum)”意味着等同于“血清(blood serum)”。

如本文所用，术语“口腔液”特别是指单独或组合地存在于口腔中的一种或多种液体。这些包括但不限于唾液和粘膜渗出液。应特别理解，口腔液可包括来自多种来源(例如腮腺、下颌下、舌下、副腺、牙龈粘膜和颊粘膜)的液体的组合，并且术语“口腔液”包括来自这些来源中的每一个的单独或组合的液体。术语“唾液”是指口腔液的组合，例如通常在口腔中发现的，特别是在咀嚼之后。如本文所用，术语“粘膜渗出液”是指由血清成分从口腔粘膜间质被动扩散到口腔中产生的液体。粘膜渗出液通常形成唾液的一种成分。

优选地，本文所述的抗体是多克隆抗体。

术语“弹状病毒特异性抗体”特别等同于“弹状病毒抗原特异性抗体”，其中所述抗原优选为弹状病毒糖蛋白。

本发明上下文中的弹状病毒糖蛋白最优选是SEQ ID NO：16所示的SF-弹状病毒糖蛋白。

如本文所用，术语“抗原”特别是指能够引发免疫反应的任何分子、部分或实体。这包括细胞和/或体液免疫反应。

如本文所用，术语“特异于”特定抗原的抗体特别是指以大于或等于约10⁵M^-1、10⁶M^-1、10⁷M^-1、10⁸M^-1、10⁹M^-1、10¹⁰M^-1、10¹¹M^-1、10¹²M^-1或10¹³M^-1的亲和力或Ka(即特定结合作用的平衡关联常数，单位为1/M)结合抗原的抗体，优选多克隆抗体。或者，结合亲和力可以定义为以M为单位(例如，10^-5M至10^-13M)的特定结合相互作用的平衡解离常数(Kd)。可以使用本领域技术人员熟知的技术容易地确定抗体的结合亲和力(参见Scatchard等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660；U.S.Pat.Nos.5,283,173；5,468,614；

分析；或同等物)。

如本文所述，固定的捕获试剂优选包被在微量滴定板上，特别是包被在能够被ELISA读数器读出的微量滴定板上。

如本文所用，“昆虫细胞”是指源自昆虫物种的细胞或细胞培养物。就本发明而言，特别令人感兴趣的是源自草地贪夜蛾和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)物种的昆虫细胞。

草地贪夜蛾(Sf)细胞优选自Sf9细胞和Sf+细胞。分别地，如本文所述，昆虫细胞优选为草地贪夜蛾(Sf)细胞，并且优选自Sf9细胞和Sf+细胞。

本发明进一步涉及本发明的多肽在用于确定从个体获得的生物样品中是否存在弹状病毒特异性抗体的方法中的用途，其中所述方法优选为如上所述的相应方法。

此外，本发明涉及本发明的多肽在确定个体是否已接受免疫原性组合物的方法中的用途，所述免疫原性组合物包含由培养的昆虫细胞中的表达系统产生的重组蛋白，其中，所述方法优选地是如上所述的相应方法。

实施例

以下实施例仅是本发明的说明，不应以任何方式限制权利要求的范围。

实施例1

Sf弹状病毒糖蛋白(SFRVG)杆状病毒表达构建体

通过去除SFRVG的跨膜螺旋和细胞质结构域，初步生成了SFRVG胞外结构域。进一步的修改是将野生型和突变型SFRV融合到免疫球蛋白G可结晶片段(IgG Fc)蛋白上。

已克隆SfRV糖蛋白胞外结构域(SFRVGecto)，将其插入杆状病毒转移质粒，并生成重组杆状病毒以表达SFRVGecto。重组杆状病毒的连续迭代产生了重组杆状病毒，该重组杆状病毒可以表达全长SFRVGecto，随后可以以高摩尔量回收。

SFRVG中弗林蛋白酶切割位点的发现

二级结构预测程序Jpred(http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/)和PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)用于定位卷曲区域SFRVG(SEQ ID NO:16)而Globplot(http://globplot.embl.de/)用于发现预测的紊乱区域，因为预计这些区域对蛋白水解切割更敏感。这些程序预测了一个大致包含285-335位氨基酸的大卷曲区域(根据未成熟蛋白质编号)，该区域与大致包含285-305位氨基酸的无序区域重叠。通过对该区域的研究确定了一个高度带电的区域，其序列RERR从第303位到第306位氨基酸，这是一个弗林蛋白酶位点，在最终的精氨酸之后具有推测的切割位点。然后使用蛋白前体转化酶识别位点预测程序ProP(http://www.cbs.dtu.dk/services/ProP/；Duckert,2004)来确认弗林蛋白酶位点。不仅该位置被高度可信地预测为弗林蛋白酶位点，而且在第330至第333位氨基酸的大部分卷曲区域内具有序列RHKR的第二个位点也被预测为可被弗林蛋白酶切割。

去除SFRVG弗林蛋白酶位点

进行定点诱变以从SFRVG中去除弗林蛋白酶位点。然后对SFRVGecto进行了三种不同的突变：R306Q、R333Q和R306Q/R333Q，然后评估它们表达SFRVGecto的能力。用于此目的的SFRVGecto序列包含SFRVG的前550个氨基酸，包括天然信号肽，融合(C-端)到TEV蛋白酶位点，后跟6xHis标签。

点突变体的产生如下：构成SFRVG胞外结构域的前550个氨基酸被PCR扩增、凝胶纯化和TOPO克隆。在通过PCR和DNA测序通过菌落筛选验证插入片段之后，使用QuikChangeLightning Site Directed Mutagenesis试剂盒(Agilent，cat#000628596)分别进行R306Q和R333Q点突变。插入片段通过DNA测序验证，并使用TOPO-SFRVGecto-R306Q作为模板，制作R306Q/R333Q双突变体，随后通过DNA测序验证。三个TOPO-SFRVGecto突变体都经过EcoRI/PstI消化和凝胶纯化，而pVL1393则经过EcoRI/PstI消化、去磷酸化和凝胶纯化。使用T4DNA连接酶进行连接。pVL1393的插入片段通过PCR和DNA测序通过菌落筛选进行验证。通过与FlashBAC ULTRA(FBU)共转染到Sf9细胞中产生杆状病毒。使用抗杆状病毒包膜gp64纯化克隆AcV1(eBiosciences，cat#14-6991-83)或抗His(C-端；Invitrogen，cat#46-0693)一抗以1:100和FITC结合的山羊抗小鼠(JIR，cat#115-095-003)二抗，同样以1:100稀释，来进行IFA。用pVL1393-SFRVGecto-R306Q、-R333Q或-R306Q/R333Q质粒转染的Sf9细胞对6xHis和杆状病毒gp64蛋白均呈阳性。

FBU/pVL1393-SFRVGecto-R306Q、-R333Q和-R306Q/R333Q杆状病毒在Sf9细胞的T25瓶上扩增6天，P2杆状病毒滴定。P3扩增和蛋白质表达试验通过在500mL转瓶中以0.1MOI接种100mL Sf+细胞来进行。用过的培养基和细胞样品在3-5DPI(感染后天数)收获，剩余培养物在5DPI收获。细胞沉淀在含有1％Triton X-100的缓冲液中裂解，样品以20,000g离心20分钟。所得样品经SDS-PAGE电泳，转移到硝酸纤维素上，并用1:500稀释的抗His(C-端；Invitrogen，cat#46-0693)一抗和1:1000稀释的HRP-结合的山羊抗小鼠(JIR,cat#115-035-146)二抗进行蛋白质印迹检测。

SFRVG胞外结构域与猪免疫球蛋白G 2a可结晶片段(IgG Fc)的融合

为了帮助SFRVG的表达和提供蛋白质纯化的方法，将SFRVGecto-R306Q/R333Q融合到猪IgG 2a Fc结构域(所述IgG Fc结构域具有SEQ ID NO:6的序列)。同时，具有完整弗林蛋白酶位点的SFRVGecto(SFRVGecto-WT)也与IgG Fc融合以确定在融合蛋白的情况下是否需要去除两个弗林蛋白酶位点。两个蛋白质编码序列的组装和插入pVL1393杆状病毒转移质粒简述如下：收到用于扩增SFRVGecto和IgG Fc的引物，并通过PCR扩增SFRVGecto-WT、SFRVG-R306Q/R333Q和IgG Fc、凝胶纯化和OEPCR以生成融合蛋白插入片段。OEPCR产物经凝胶纯化和TOPO克隆，插入片段通过PCR和DNA测序进行菌落筛选验证。含有SFRVGecto-WT-IgG2a和SFRVGecto-R306Q/R333Q-IgG2a插入片段的TOPO克隆经过EcoRI/PstI消化和凝胶纯化，而pVL1393经过EcoRI/PstI消化、去磷酸化和凝胶纯化。使用T4 DNA连接酶进行连接，插入片段通过PCR和DNA测序进行菌落筛选验证。

通过将pVL1393-SFRVGecto-R306Q/R333Q-IgG2a或pVL1393-SFRVGecto-WT-IgG2a与FlashBAC ULTRA(FBU)共转染到Sf9细胞中来产生杆状病毒。使用抗杆状病毒包膜gp64纯化克隆AcV1(eBiosciences，cat#14-6991-83)一抗以1:100和FITC结合的山羊抗小鼠(JIR，cat#115-095-003)二抗，同样以1:100稀释，来进行IFA。用任一pVL1393质粒转染的Sf9细胞对杆状病毒gp64蛋白呈阳性。FBU/pVL1393-SFRVGecto-R306Q/R333Q-IgG2a和FBU/pVL1393-SFRVGecto-WT-IgG2a杆状病毒在Sf9细胞的T25瓶上扩增6天，P2杆状病毒滴定。

P3扩增和蛋白质表达试验通过在500mL转瓶中接种100mL Sf+细胞来进行，其中任一杆状病毒以0.1MOI接种。用过的培养基和细胞的样品在3和4DPI时收获，剩余的培养物在4DPI时收获。细胞沉淀在含有1％Triton X-100的缓冲液中裂解，样品以20,000g离心20分钟。所得样品经SDS-PAGE电泳，转移到硝酸纤维素上，并用1:1000稀释的HRP-结合的山羊抗猪(JIR,cat#115-035-003)抗体进行蛋白质印迹检测。

从包括上述SDS-PAGE和蛋白质印迹分析的实验可以看出(i)SFRVG胞外结构域与猪免疫球蛋白G 2a可结晶片段(IgG Fc)的融合，或(ii)与各自未修饰的SFRVG胞外结构域的表达相比，分别具有取代之一(R306Q或R333Q)的SFRVG胞外结构域在表达系统中导致显著更高的摩尔产率。

此外，发现与仅具有这些取代之一(R306Q或R333Q)的SFRVG胞外结构域的表达相比，SFRVG胞外结构域内R306Q和R333Q两种取代的组合导致显著更高的摩尔产率。

最后，令人意想不到的是，上述修饰的组合产生了协同效应，因为发现与IgG2a(pVL1393-SFRVGecto-R306Q/R333Q-IgG2a)融合的两个取代R306Q/R333Q的SFRV胞外结构域的表达与下述胞外结构域的表达相比显示出更高的产率(至少8倍)：

-与IgG2a融合的相应SFRVG野生型胞外结构域(pVL1393-SFRVGecto-WT-IgG2a)或

-具有R306Q和R333Q两种取代的SFRVG胞外结构域(pVL1393-SFRVGecto-R306Q/R333Q)。

对于包括豚鼠IgG Fc结构域的相应组合，即对于包含SEQ ID NO:1序列的融合蛋白，也观察到各自的协同效应，导致更高的产率。此外，所述SEQ ID NO:1的序列可以通过接头连接到豚鼠IgG Fc结构域，例如，连接到SEQ ID NO:5的序列。因此，特别地，对于具有SEQID NO:12的序列的融合蛋白观察到各自的协同效应，导致更高的产率，其包含SEQ ID NO:1的序列和通过肽接头与所述SEQ ID NO:1的序列连接的SEQ ID NO:5的序列。

实施例2

ELISA用于评估不同液体样品中抗弹状病毒抗体的存在。

为此，将上述式为x-y-z的融合蛋白作为抗原固定在ELISA板上(其中x是待检测的抗体特异性的弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，y是肽接头，z是IgG Fc结构域)，其中例如包含SEQ ID NO:12的序列的融合蛋白是固定的。

在此上下文中使用的ELISA方法在以下实验方法中进行了描述：

1.用5-500ng/孔的抗原涂布板或条(包括具有不同结合能力、材料(聚苯乙烯等)、格式(条/96孔板)等的板)。在2-8℃下孵育过夜以进行结合。

2.用含有2-10％脱脂牛奶的PBS和0.5-10％额外蛋白质(包括BSA/非相关血清)的封闭缓冲液清洗板和封闭孔。

3.封闭步骤后，在洗板机中清洗板子，并将板子放置在一叠纸巾上轻拍以除去剩余的洗涤液。

4.以1:100稀释测试血清，每孔加入100μL稀释的测试血清。以1:100稀释并添加100μL阴性对照血清(必要时添加阳性对照血清)至对照孔。

5.轻拍板的侧面以摇晃和混合。密封板/条并在37℃(98.6°F)下孵育1小时。

6.在洗板机中清洗板子，并将板子放置在一叠纸巾上轻拍以除去剩余的洗涤液。

7.向每个孔中加入100μL预稀释(稀释1:1000-1:100000)HRP结合物(例如抗猪IgG(全分子)，HRP结合的)。密封板并在37℃下孵育1小时。

8.在洗板机中清洗板子，并将板子放置在一叠纸巾上轻拍以除去剩余的洗涤液。

9.向每个孔中加入100μL的底物溶液。在室温下孵育10分钟。当第一个孔被填满时启动计时器。

10.向每个孔中加入50μL终止液以停止反应，并通过轻拍侧面轻轻混匀。

11.加入终止液后15分钟内测量450nm处的OD，以防止OD值波动。

ELISA的结果显示含有待检测抗弹状病毒抗体的样品(所述样品显示例如高于0.5的S/P比)和阴性对照(即不含此类抗体的相应样品，其显示例如，S/P比率约为0)。

总之，本发明的多肽用于检测抗弹状病毒抗体的用途允许容易地将包括抗弹状病毒抗体的样品与不包括这种抗体的样品区分开来。

在序列表中：

SEQ ID NO:1对应于SEQ ID NO:16所示糖蛋白的胞外结构域(没有N-端信号肽)的序列，在第306位氨基酸和第333位氨基酸的每一处具有取代(即，谷氨酰胺残基而不是精氨酸残基)，并且其中SEQ ID NO:16的所述氨基酸位点对应于SEQ ID NO:1的序列位置285和312，

SEQ ID NO:2对应于SEQ ID NO:1的序列N-端延伸一个丝氨酸残基(对应于SEQ IDNO:16的第21位氨基酸处的丝氨酸残基)，

SEQ ID NO:3对应于SEQ ID NO:1的N-端由SEQ ID NO:16的N-端21个氨基酸残基(即，包括N-端信号肽)延伸的序列，

SEQ ID NO:4对应于SEQ ID NO:16所示糖蛋白的序列，在第306位和第333位氨基酸的每一处具有取代(即，谷氨酰胺残基而不是精氨酸残基)，

SEQ ID NO:5对应于豚鼠IgG Fc结构域的序列，

SEQ ID NO:6对应于猪IgG Fc结构域的序列，

SEQ ID NO:7对应于GCN4亮氨酸拉链结构域的序列，

SEQ ID NO:8对应于埃希氏菌病毒T4纤维蛋白序列，

SEQ ID NO:9对应于接头部分的序列，

SEQ ID NO:10对应于接头部分的序列，

SEQ ID NO:11对应于接头部分的序列，

SEQ ID NO:12对应于本发明多肽的序列，

SEQ ID NO:13对应于本发明多肽的序列，

SEQ ID NO:14对应于本发明多肽的序列，

SEQ ID NO:15对应于SEQ ID NO:16所示的野生型糖蛋白的胞外结构域序列，

SEQ ID NO:16对应于野生型Sf-弹状病毒糖蛋白的序列，

SEQ ID NO:17对应于编码本发明多肽的多核苷酸的序列，

SEQ ID NO:18对应于编码本发明多肽的多核苷酸的序列，

SEQ ID NO:19对应于编码本发明多肽的多核苷酸的序列，

SEQ ID NO:20对应于弗林蛋白酶切割位点的序列，

SEQ ID NO:21对应于弗林蛋白酶切割位点的序列，

SEQ ID NO:22对应于弗林蛋白酶切割位点的序列，

SEQ ID NO:23对应于弗林蛋白酶切割位点的序列，

SEQ ID NO:24对应于弗林蛋白酶切割位点的序列，

SEQ ID NO:25对应于弗林蛋白酶切割位点的序列。

本文还公开了以下条款：

1.一种多肽，包含

-弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，和

-与所述胞外结构域连接的异源多聚化结构域。

2.条款1所述的多肽，

其中所述异源多聚化结构域通过接头部分与所述胞外结构域连接，

或其中所述异源多聚化结构域通过其N端氨基酸残基和所述胞外结构域的C端氨基酸残基之间的肽键与所述胞外结构域连接。

3.一种多肽，特别地是条款1或2所述的多肽，其中所述多肽是式x-y-z的融合蛋白，其中

y是接头部分；

z是异源多聚化结构域。

4.条款1-3中任一项所述的多肽，其中所述胞外结构域不含弗林蛋白酶切割位点。

5.条款4所述的多肽，其中所述弗林蛋白酶切割位点为选自以下(a)、(b)和(c)的氨基酸序列：

(a)选自RXKR(SEQ ID NO:20)和RXRR(SEQ ID NO:21)的氨基酸序列；

X₁可以是任何氨基酸残基，并且

X₂可以是

-除赖氨酸残基外或

X₁可以是任何氨基酸残基，

X₂可以是

-除赖氨酸残基外或

X₃可以是除赖氨酸残基之外的任何氨基残基。

6.条款1-5中任一项所述的多肽，其中所述弹状病毒糖蛋白是草地贪夜蛾弹状病毒(SF-弹状病毒)糖蛋白。

7.条款1-6中任一项所述的多肽，其中所述胞外结构域是SF-弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，其具有

(i)选自第306位氨基酸的取代、第303位氨基酸的取代、第305位氨基酸的取代、第307位氨基酸的取代和第308位氨基酸的取代的一种或多种突变，

以及

(ii)选自第333位氨基酸的取代、第330位氨基酸的取代、第332位氨基酸的取代、第334位氨基酸的取代和第335位氨基酸的取代的一种或多种突变，

8.条款1-7中任一项所述的多肽，其中所述胞外结构域是SF-弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，其包含与SEQ ID NO:4的序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％或特别地至少95％序列一致性的氨基酸序列或由其组成。

9.条款1-8中任一项所述的多肽，其中所述胞外结构域是SF-弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，其具有

-在第306位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，和/或

-在第303位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，和/或

-在第305位氨基酸处除碱性氨酸残基之外的氨基酸残基，和/或

-在第307位氨基酸处选自赖氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、缬氨酸残基和色氨酸残基的氨基酸残基，和/或

-在第308位氨基酸处的赖氨酸残基，

并具有

-在第333位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，和/或

-在第330位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，和/或

-在第332位氨基酸处除碱性氨酸残基之外的氨基酸残基，和/或

-在第334位氨基酸处选自赖氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、缬氨酸残基和色氨酸残基的氨基酸残基，和/或

-在第335位氨基酸处的赖氨酸残基，

10.条款1-9中任一项所述的多肽，其中所述胞外结构域是SF-弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，其具有

-在第306位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，

和

-在第333位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，

11.条款1-10中任一项所述的多肽，其中所述胞外结构域是SF-弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，其包含与SEQ ID NO:4的序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％或特别地至少95％序列一致性的氨基酸序列或由其组成，并且具有

-在第306位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，和

-在第333位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，

12.条款9-11中任一项所述的多肽，其中所述除精氨酸残基之外的氨基酸残基是天然存在的、优选遗传编码的氨基酸残基。

13.条款6-12中任一项所述的多肽，其中所述胞外结构域的N-端氨基酸残基对应于野生型SF-弹状病毒糖蛋白的氨基酸序列的第1-22位氨基酸中的任一个。

14.条款6-13中任一项所述的多肽，其中所述胞外结构域的N-端氨基酸残基对应于野生型SF-弹状病毒糖蛋白的氨基酸序列的第22、21或1位氨基酸中的任一个。

15.条款1-14中任一项所述的多肽，其中所述胞外结构域是SF-弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，其具有

-在第306位氨基酸处选自具有极性但不带电荷的侧链的氨基酸残基、具有疏水性侧链的氨基酸残基和甘氨酸残基的氨基酸残基；

和/或在第303位氨基酸处选自具有极性但不带电荷的侧链的氨基酸残基、具有疏水性侧链的氨基酸残基和甘氨酸残基的氨基酸残基；

和

-在第333位氨基酸处选自具有极性但不带电荷的侧链的氨基酸残基、具有疏水性侧链的氨基酸残基和甘氨酸残基的氨基酸残基；

和/或在第330位氨基酸处选自具有极性但不带电荷的侧链的氨基酸残基、具有疏水性侧链的氨基酸残基和甘氨酸残基的氨基酸残基；

16.条款15中所述的多肽，其中所述具有极性但不带电荷的侧链的氨基酸残基选自丝氨酸残基、苏氨酸残基、酪氨酸残基、天冬酰胺残基和谷氨酰胺残基，和/或其中所述具有疏水性侧链的氨基酸残基选自丙氨酸残基、缬氨酸残基、亮氨酸残基、甲硫氨酸残基、异亮氨酸残基、苯丙氨酸残基和色氨酸残基。

17.条款1-16中任一项所述的多肽，其中所述胞外结构域是SF-弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，其具有

-在第306位氨基酸处选自谷氨酰胺残基和天冬酰胺残基的氨基酸残基和/或在第303位氨基酸处选自谷氨酰胺残基和天冬酰胺残基的氨基酸残基；

和

18.条款7-17中任一项所述的多肽，其中所述野生型SF-弹状病毒糖蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成或为SEQ ID NO:16的氨基酸序列。

19.条款1-18中任一项所述的多肽，其中所述胞外结构域包含与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％或还更优选地至少95％序列一致性的氨基酸序列或由其组成。

20.条款1-19中任一项所述的多肽，其中所述胞外结构域包含与SEQ ID NO:1的序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％或还更优选地至少95％序列一致性的氨基酸序列或由其组成，

并且其中所述胞外结构域具有

-在第285位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，和/或

-在第282位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，和/或

-在第287位氨基酸处的赖氨酸残基，

并且具有

-在第312位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，和/或

-在第309位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，和/或

-在第314位氨基酸处的赖氨酸残基，

其中氨基酸位点的编号根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

21.条款20中所述的多肽，其中所述胞外结构域具有

-在第285位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，

和

-在第312位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，

并且其中氨基酸位点的编号根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

22.条款9-21中任一项所述的多肽，其中所述除精氨酸残基之外的氨基酸残基是天然存在的、优选遗传编码的氨基酸残基，

和/或其中所述除碱性氨基酸残基之外的氨基酸残基是天然存在的、优选遗传编码的氨基酸残基。

23.条款20-22中任一项所述的多肽，其中所述胞外结构域具有

和

并且其中氨基酸位点的编号根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

24.条款23中所述的多肽，其中所述具有极性但不带电荷的侧链的氨基酸残基选自丝氨酸残基、苏氨酸残基、酪氨酸残基、天冬酰胺残基和谷氨酰胺残基，和/或其中所述具有疏水性侧链的氨基酸残基选自丙氨酸残基、缬氨酸残基、亮氨酸残基、甲硫氨酸残基、异亮氨酸残基、苯丙氨酸残基和色氨酸残基。

25.条款20-24中任一项所述的多肽，其中所述胞外结构域具有

-在第285位氨基酸处选自谷氨酰胺残基和天冬酰胺残基的氨基酸残基和/或在第282位氨基酸处选自谷氨酰胺残基和天冬酰胺残基的氨基酸残基；

和

并且其中氨基酸位点的编号根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

26.条款1-25中任一项所述的多肽，其中所述胞外结构域包含长度为529-550个氨基酸残基的氨基酸序列或由其组成。

27.条款1-26中任一项所述的多肽，其中所述胞外结构域包含长度为529、530或550个氨基酸残基的氨基酸序列或由其组成。

28.条款1-27中任一项所述的多肽，其中所述胞外结构域具有SEQ ID NO：1至SEQID NO：3中任一项的序列。

29.条款1-28中任一项所述的多肽，其中所述异源多聚化结构域选自由免疫球蛋白序列、卷曲螺旋序列、链霉抗生物素蛋白序列、纤维蛋白(fibritin)序列和抗生物素蛋白序列组成的组。

30.条款1-29中任一项所述的多肽，其中所述异源多聚化结构域选自由免疫球蛋白恒定区结构域、亮氨酸拉链结构域和埃希氏菌病毒T4纤维蛋白序列组成的组。

31.条款1-30中任一项所述的多肽，其中所述异源多聚化结构域是二聚化结构域，优选选自IgG Fc结构域和亮氨酸拉链结构域。

32.条款1-31中任一项所述的多肽，其中所述异源多聚化结构域包含IgG Fc结构域或由其组成。

33.条款1-32中任一项所述的多肽，其中所述异源多聚化结构域包含豚鼠IgG Fc结构域或由其组成。

34.条款1-33中任一项所述的多肽，其中所述异源多聚化结构域包含与选自SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％、还更优选地至少95％或特别地100％序列一致性的氨基酸序列或由其组成。

35.条款2-34中任一项所述的多肽，其中所述接头部分是长度为1至50个氨基酸残基的氨基酸序列。

36.条款2-35中任一项所述的多肽，其中所述接头部分是长度为3至20个氨基酸残基的氨基酸序列。

37.条款2-36中任一项所述的多肽，其中所述接头部分包含与选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的序列具有至少66％、优选地至少80％、更优选地至少90％、还更优选地至少95％或特别地100％序列一致性的氨基酸序列或由其组成。

38.条款1-37中任一项所述的多肽，其中所述多肽是蛋白质，其包含与选自SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％或还更优选地至少95％序列一致性的氨基酸序列或由其组成。

39.条款1-38中任一项所述的多肽，其中所述多肽是蛋白质，其包含选自SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的序列。

40.条款1-39中任一项所述的多肽，其中在杆状病毒表达系统中，与SEQ ID NO:15的多肽的产率相比，所述多肽的产率更高，优选高至少2倍，更优选高至少3倍，还更优选高至少5倍，还更优选高至少8倍。

41.条款1-40中任一项所述的多肽，其中所述多肽是重组蛋白，优选是重组杆状病毒表达的蛋白。

42.编码条款1-41中任一项所述的多肽的多核苷酸。

43.条款42中所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:17、SEQID NO:18和SEQ ID NO:19的序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％、还更优选地至少95％或特别地100％序列一致性的核苷酸序列。

44.一种质粒，优选表达载体，其包含编码条款1-41中任一项所述的多肽的多核苷酸。

45.一种细胞，其包含质粒，优选表达载体，所述质粒，优选表达载体包含编码条款1-41中任一项所述的多肽的多核苷酸。

46.一种杆状病毒，其包含编码条款1-41中任一项所述的多肽的多核苷酸。

47.一种被杆状病毒感染的细胞，优选昆虫细胞，所述杆状病毒包含编码条款1-41中任一项所述的多肽的多核苷酸。

48.条款44所述的质粒、条款45所述的细胞、条款46所述的杆状病毒或条款47所述的细胞，其中所述多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19的序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％、还更优选地至少95％或特别地100％序列一致性的核苷酸序列。

49.一种试剂盒，该试剂盒包含固定在固体支持物上的条款1-41中任一项所述的多肽。

50.一种产生条款1-41中任一项所述的多肽的方法，其中该方法包括

-用质粒优选表达载体转染细胞，所述质粒优选表达载体包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码本发明多肽的序列，

或者

51.条款50所述的方法，其中所述质粒是条款44或48所述的质粒。

52.条款50所述的方法，其中所述杆状病毒是条款46或48所述的杆状病毒。

53.一种确定从个体获得的生物样品中是否存在弹状病毒特异性抗体的方法，包括以下步骤：

a.将生物样品与固定在固体支持物上的捕获试剂接触，其中捕获试剂是条款1-41中任一项所述的多肽；并且

b.确定是否存在与所述捕获试剂结合的所述抗体。

54.根据条款53所述的方法，进一步包括以下步骤：

c.将生物样品与固定化的捕获试剂分离；

55.条款1-41中任一项所述的多肽在用于确定从个体获得的生物样品中是否存在弹状病毒特异性抗体的方法中的用途，其中所述方法优选是条款53或54所述的方法。

Claims

1.一种多肽，包含

-弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，和

-与所述胞外结构域连接的异源多聚化结构域。

2.权利要求1所述的多肽，

3.一种多肽，特别地是权利要求1或2所述的多肽，其中所述多肽是式x-y-z的融合蛋白，其中

y是接头部分；

z是异源多聚化结构域。

4.权利要求1-3中任一项所述的多肽，其中所述胞外结构域不含弗林蛋白酶切割位点，并且其中

所述弗林蛋白酶切割位点优选为选自以下(a)、(b)和(c)的氨基酸序列：

(a)选自RXKR(SEQ ID NO:20)和RXRR(SEQ ID NO:21)的氨基酸序列；

X₁可以是任何氨基酸残基，并且

X₂可以是

-除赖氨酸残基外或

X₁可以是任何氨基酸残基，

X₂可以是

-除赖氨酸残基外或

X₃可以是除赖氨酸残基之外的任何氨基残基。

5.权利要求1-4中任一项所述的多肽，其中所述胞外结构域是SF-弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，其具有

以及

其中氨基酸位点的编号根据野生型SF-弹状病毒糖蛋白的氨基酸序列，

和/或其中所述胞外结构域是SF-弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，其具有

-在第306位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，和/或

-在第303位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，和/或

-在第308位氨基酸处的赖氨酸残基，

并具有

-在第333位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，和/或

-在第330位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，和/或

-在第335位氨基酸处的赖氨酸残基，

6.权利要求5所述的多肽，其中所述野生型SF-弹状病毒糖蛋白的氨基酸序列由SEQ IDNO:16的氨基酸序列组成或为SEQ ID NO:16的氨基酸序列。

7.权利要求1-6中任一项所述的多肽，其中所述胞外结构域包含与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％或还更优选地至少95％序列一致性的氨基酸序列或由其组成。

8.权利要求1-7中任一项所述的多肽，其中所述胞外结构域包含与SEQ ID NO:1的序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％或还更优选地至少95％序列一致性的氨基酸序列或由其组成，

并且其中所述胞外结构域具有

-在第285位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，和/或

-在第282位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，和/或

-在第287位氨基酸处的赖氨酸残基，

并且具有

-在第312位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，和/或

-在第309位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，和/或

-在第314位氨基酸处的赖氨酸残基，

其中氨基酸位点的编号根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

9.权利要求1-8中任一项所述的多肽，其中所述异源多聚化结构域选自由免疫球蛋白序列、卷曲螺旋序列、链霉抗生物素蛋白序列、纤维蛋白(fibritin)序列和抗生物素蛋白序列组成的组，并且

其中所述异源多聚化结构域优选包含IgG Fc结构域或由其组成。

10.权利要求1-9中任一项所述的多肽，其中所述异源多聚化结构域包含与选自SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％、还更优选地至少95％或特别地100％序列一致性的氨基酸序列或由其组成。

11.权利要求2-10中任一项所述的多肽，其中所述接头部分是长度为1-50个氨基酸残基的氨基酸序列，

和/或其中所述接头部分包含与选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的序列具有至少66％、优选地至少80％、更优选地至少90％、还更优选地至少95％或特别地100％序列一致性的氨基酸序列或由其组成。

12.权利要求1-11中任一项所述的多肽，其中所述多肽是包含选自SEQ ID NO:12、SEQID NO:13和SEQ ID NO:14的序列的蛋白质。

13.编码权利要求1-12中任一项所述的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸任选地包含与选自SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19的序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％、还更优选地至少95％或特别地100％序列一致性的核苷酸序列。

14.一种质粒，优选地表达载体，包含编码权利要求1-12中任一项的多肽的多核苷酸。

15.一种包含质粒，优选包含表达载体的细胞，所述质粒优选表达载体包含编码权利要求1-12中任一项的多肽的多核苷酸，

或者

一种被杆状病毒感染的细胞，优选被杆状病毒感染的昆虫细胞，所述杆状病毒包含编码权利要求1-12中任一项的多肽的多核苷酸。

16.一种杆状病毒，其包含编码权利要求1-12中任一项所述的多肽的多核苷酸。

17.一种试剂盒，其包含固定在固体支持物上的权利要求1-12中任一项的多肽。

18.一种产生权利要求1-12中任一项所述的多肽的方法，其中所述方法包括

-用质粒优选表达载体转染细胞，所述质粒优选表达载体包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码所述多肽的序列，并且其中所述质粒优选为权利要求14的质粒，

或者

-用含有多核苷酸的杆状病毒感染细胞，优选昆虫细胞，所述多核苷酸包含编码所述多肽的序列，并且其中所述杆状病毒优选为权利要求16的杆状病毒。

19.一种确定从个体获得的生物样品中是否存在弹状病毒特异性抗体的方法，包括以下步骤：

a.使生物样品与固定在固体支持物上的捕获试剂接触，其中所述捕获试剂是权利要求1-12中任一项的多肽；并且

b.确定是否存在与所述捕获试剂结合的所述抗体。

20.权利要求1-12中任一项所述的多肽在用于确定从个体获得的生物样品中是否存在弹状病毒特异性抗体的方法中的用途，其中所述方法优选为权利要求19所述的方法。