CN115746092B - 具有抗氧化、抗衰老活性的钝顶螺旋藻藻蓝蛋白活性肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有抗氧化、抗衰老活性的钝顶螺旋藻藻蓝蛋白活性肽及应用，属于活性肽蛋白技术领域。所述活性肽选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3；所述SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的氨基酸序列分别为：Phe‑Pro‑Pro‑Trp‑Phe(FPPWF)、Phe‑Pro‑Pro‑Trp‑Val‑Leu(FPPWVL)和Gly‑Trp(GW)。本发明的钝顶螺旋藻藻蓝蛋白活性肽经体内、外实验验证具有抗氧化、抗衰老活性，且安全、无毒性和无副作用，可以作为功能成分用于食品、保健品、化妆品以及抗氧化、抗衰老药品中，具有良好的潜力和应用前景。

Description

具有抗氧化、抗衰老活性的钝顶螺旋藻藻蓝蛋白活性肽及其 应用

技术领域

本发明涉及具有抗氧化、抗衰老活性的钝顶螺旋藻藻蓝蛋白活性肽及其应用，属于活性肽蛋白技术领域。

背景技术

衰老及多种疾病（如关节炎、动脉硬化、冠心病、神经性疾病和癌症等）都与人体内的自由基（尤其是活性氧）过量产生有关。自由基可摧毁细胞膜，影响细胞吸收营养物质及排出代谢废物，丧失抵抗病原微生物的侵袭能力，导致免疫低下、疲劳和器官病变等。

补充抗氧化剂能调节生理功能、新陈代谢，延缓衰老，防治疾病。

食品中的脂质氧化或酸败，形成脂质过氧化物会引起食品变质。目前，在食品和药品中，添加丁基羟基茴香醚（BHA）、叔丁基对苯二酚（TBHQ）、丁基羟基甲苯（BHT）和没食子酸丙酯（PG）等化学合成的抗氧化剂，用于延缓食品和药品的氧化变质。

化学合成品存在潜在的健康隐患，必须严格控制其用量和使用范围。寻找安全、天然、高效的抗氧化剂替代人工合成抗氧化剂十分必要。

抗氧化肽是一类具有清除自由基、抑制脂质过氧化及螯合金属离子等作用的生物活性肽，具有抗氧化和抗衰老功效，可用作功能性药品、化妆品等。抗氧化肽的应用前景广阔，因此近年来受到国内外的关注。

抗氧化肽的活性评价方法分为体内评价和体外评价两种。体外评价方法包括自由基清除能力测定、金属离子螯合能力测定、还原能力测定等；体内评价方法主要是在细胞、动物模型甚至人体上进行抗氧化活性测定。体外抗氧化性能测定法应用广泛，但没有考虑制剂在体内的生物利用度和代谢，而基于动物模型或人体的体内测定法能够真实评价制剂的抗氧化功效，但体内测定法的成本高、耗时长、难度大。

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的生命周期短、个体小、易培养、遗传物质简单，而且与人类的生化和遗传途径高度相似，因此被广泛用作评价抗氧化和抗衰老活性的模型生物。用活性肽孵育的线虫体内的活性氧水平（ROS）、抗氧化酶活性（SOD和CAT）和丙二醛（MDA）含量的变化等能够反映活性肽的抗氧化活性。实验线虫的寿命及死亡率是制剂抗衰老活性的最直观指标。

螺旋藻是一种单细胞蓝藻，营养均衡，具有极高的营养和防病保健价值。螺旋藻的化学组成具有高蛋白、低脂肪、低糖的特点，并含有多种维生素及微量元素。螺旋藻的蛋白质、糖、脂的比例约为60：20：5。其蛋白质含量高达60%-70%，是大豆的2倍，牛肉的3.5倍，鸡蛋的4倍，且所含人体必需氨基酸的种类齐全、组成合理；螺旋藻的脂肪含量一般为干重的5%-6%，其中70%-80%为不饱和脂肪酸，尤其是亚麻酸的含量高达人乳的500倍；螺旋藻纤维素含量为2%-4%，细胞壁主要是由胶原蛋白和半纤维素组成，人体对其的吸收率高达95%以上。螺旋藻的维生素和矿物质含量极其丰富，前者包括维生素B1、B2、B6、B12、E和K等，后者包括锌、铁、钾、钙、镁、磷、硒、碘等微量元素，螺旋藻的生物锌与铁的比例与人体生理需要一致，容易被人体吸收。除此之外，螺旋藻内的C-藻蓝蛋白（CPC）、藻多糖、γ-亚麻酸甲酯、β-胡萝卜素、叶绿素a等活性成分还具有调节生长代谢和免疫调节作用。螺旋藻以其高营养性、高安全性而被联合国粮农组织誉为“人类最理想、最优秀的食品”，被世界卫生组织认定为“21世纪人类最佳保健品”和“未来超级营养食品”，被联合国教科文组织推荐为“明天最理想、最完美的食品”。美国膳食补充剂专家委员会的安全性评价结果表明，螺旋藻安全性好、无毒副作用。螺旋藻已被美国和欧洲航天局推荐为长期执行太空任务人员的主要食品之一。每人每日食用15g干重的螺旋藻就能保证必要的营养素来源。

螺旋藻还具有多种药理作用，如降血脂、抗氧化、抗感染、抗癌、抗辐射、抗衰老、增强机体免疫力等。螺旋藻在世界范围内已被广泛用作保健品。藻胆蛋白是螺旋藻的主要活性物质，其含量占螺旋藻蛋白质总量的70%左右。螺旋藻的藻胆蛋白包括C-藻蓝蛋白（CPC）和别藻蓝蛋白两种，其中藻蓝蛋白（即CPC）的含量显著高于别藻蓝蛋白。研究证明，螺旋藻藻蓝蛋白具有抗氧化、抗衰老、抗感染、抗癌、抗辐射、抗衰老、增强机体免疫力等多种功效，因此螺旋藻藻蓝蛋白可以作为筛选新型抗氧化肽、抗衰老肽的原料。

螺旋藻是规模化生产的微藻之一。通常用于大规模生产的螺旋藻有钝顶螺旋藻（Spirulina platensis）、极大螺旋藻（Spirulinamaxima）和盐泽螺旋藻（Spirulinasubsalsa）。

目前已经有多种从藻类中筛选出具有抗氧化、抗衰老作用的多肽，如石莼、小球藻、紫菜等。从食源性蛋白中获得的抗氧化肽有：条斑紫菜RYVSYALLAGDPSVLEDRC，螺旋藻PNN，紫菜DYYKR，海鞘LWHTH，鹿茸WDVK，中国干腌火腿MWTD、APYMM、FWIIE，海考克氏菌SSQ、PE、DI、LE，黑鳗鱼DLVKVEA等。

发明内容

本发明提供了具有抗氧化、抗衰老活性的钝顶螺旋藻藻蓝蛋白活性肽及其应用，本发明获得的钝顶螺旋藻藻蓝蛋白活性肽具有安全、无毒副作用的优点，可作为功能成分用于抗氧化、抗衰老化妆品以及药品中。本发明的技术方案如下：

具有抗氧化、抗衰老活性的钝顶螺旋藻藻蓝蛋白活性肽，所述活性肽选自SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3；

所述SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的氨基酸序列分别为：Phe-Pro-Pro-Trp-Phe（FPPWF）、Phe-Pro-Pro-Trp-Val-Leu（FPPWVL）和Gly-Trp（GW）。

进一步的，本发明还包括一种组合物，所述组合物包括本发明所述钝顶螺旋藻藻蓝蛋白活性肽以及药学或化妆品上可接受的辅料。

进一步的，本发明还包括上述钝顶螺旋藻藻蓝蛋白活性肽或者组合物在制备抗氧化剂、抗衰老剂中的用途。

进一步的，本发明还包括上述钝顶螺旋藻藻蓝蛋白活性肽或者组合物在抗氧化、抗衰老的药物中的应用。

进一步的，本发明还包括上述钝顶螺旋藻藻蓝蛋白活性肽或者组合物在制备抗氧化、抗衰老化妆品中的应用。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

发明人首次从钝顶螺旋藻藻蓝蛋白中筛选得到了3条新肽FPPWF、FPPWVL和GW，明确了新肽FPPWF、FPPWVL和GW的结构，生物信息学预测结果表明FPPWF、FPPWVL和GW安全、无毒副作用、生物活性高。体外抗氧化实验结果表明，FPPWF、FPPWVL、GW的DPPH自由基清除率IC₅₀值分别为4.71mM、4.43 mM、2.92 mM；FPPWF、FPPWVL、GW的ABTS自由基清除率IC₅₀值分别为0.75mM、1.54 mM、0.39mM。在秀丽隐杆线虫上进行抗氧化、抗衰老活性评价，在氧化胁迫秀丽隐杆线虫上，1 mg/mL的肽溶液GW、FPPWVL和FPPWF能将秀丽隐杆线虫的平均寿命分别提高36.6%、24.58%、13.07%。抗衰老实验结果表明，1 mg/mL的肽溶液GW、FPPWVL、FPPWF能将秀丽隐杆线虫的平均寿命分别延长49.12%、40.51%和28.77%，与对照组生物统计学分析差异显著。体内抗氧化实验证实，多肽GW、FPPWVL、FPPWF是通过提高体内SOD和CAT的活性以及降低ROS、MDA含量，从而发挥抗氧化、抗衰老功效。综上，体内、体外测定结果均证实新肽FPPWF、FPPWVL和GW具有抗氧化、抗衰老活性。因此，新型抗氧化、抗衰老肽FPPWF、FPPWVL和GW作为功能成分用于抗氧化、抗衰老化妆品以及药品中，具有良好的应用前景。

附图说明

图1 为FPPWF的质谱分析结果；

图2为FPPWVL的质谱分析结果；

图3 为GW的质谱分析结果；

图4为多肽孵育的氧化胁迫秀丽隐杆线虫的抗氧化应激存活曲线（A，FPPWF；B，FPPWVL；C，GW）；

图5为多肽孵育的秀丽隐杆线虫的抗衰老存活曲线（A，FPPWF；B，FPPWVL；C，GW）。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的提取

（1）将钝顶螺旋藻粉按1:10-20的比例（w/v）分散到蒸馏水中，浸泡6-12小时，-20℃冷冻12~24 h，然后用流水或37℃水浴融化，反复3次。6000 rpm离心15 min，取上清液，即为蛋白粗提液。

（2）在蛋白粗提液中加入研磨的硫酸铵粉末，使其饱和度为60%；边加边搅拌，至硫酸铵完全溶解后继续搅拌2小时。然后置冰箱冷藏室，静置6-12小时。10000 rpm离心15min，取沉淀。沉淀用适量的PBS（20 mM，pH6.5）重溶，将重悬液用透析袋透析，透析过程中更换PBS（20 mM，pH6.5）3次。透析液用6000 rpm离心15 min，取上清液。上清液即为钝顶螺旋藻藻蓝蛋白粗提液。

（3）吸取适量上述藻蓝蛋白粗提液，加到PBS（20 mM，pH6.5）平衡的DEAESepharose Fast Flow层析柱中，阴离子交换层析法纯化藻蓝蛋白。先用PBS（20 mM，pH6.5）冲洗层析柱，去除杂质和多余的样品，再用含0.3M NaCl的PBS溶液（20 mM，pH6.5）直接洗脱，收集蓝色洗脱液。用透析袋透析，透析过程中更换超纯水3次。透析液用6000 rpm离心15min，取上清液，即为纯化的钝顶螺旋藻藻蓝蛋白溶液。

实施例2钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的酶解及其超滤组分制备

（1）调节钝顶螺旋藻藻蓝蛋白溶液的pH为10.5，然后加入3000 U/g的碱性蛋白酶，混匀后置于摇床中振荡酶解，摇床转速为100-200rpm，酶解时间200-300 min，酶解温度40℃。

（2）酶解结束，酶解液沸水浴10 min，灭活残留的酶。

（3）4℃条件下10000-12000 rpm离心15 min，收集上清液，弃沉淀。上清液即为钝顶螺旋藻藻蓝蛋白肽溶液。

（4）使用截留分子量为3 kDa的超滤离心管，6000 rpm离心30 min，吸取超滤管中截留的溶液，即为分子量＜3 kDa的超滤组分。

（5）收集分子量＜3 kDa的超滤组分，冷冻真空干燥制备钝顶螺旋藻藻蓝蛋白肽冻干粉。

实施例3钝顶螺旋藻藻蓝蛋白肽的结构鉴定

（1）分子量＜3 kDa的钝顶螺旋藻藻蓝蛋白肽冻干粉溶于超纯水中，用0.22 um水系针头滤器过滤去除颗粒，然后利用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-ESI-TOF-MS/MS）法进行钝顶螺旋藻藻蓝蛋白肽的质谱鉴定。UPLC的流动相A为水溶液（含0.1%甲酸），流动相B为乙腈溶液（含0.1%甲酸），洗脱时间为60 min，梯度洗脱条件见表1，进样量为5μL，流速设定为300μL/min。

表1 超高效液相色谱洗脱条件

时间（min）	流动相A	流动相B	流速（μL/min）
				0	95%	5%	300
5	95%	5%	300
				45	50%	50%	300
50	10%	90%	300
				55	10%	90%	300
60	95%	5%	300

串联质谱采用正离子模式，二级质谱分析，以分辨率120000进行100-2000 m/z的全MS扫描，具体质谱参数设定见表2。

表2 串联质谱分析条件

项目	MS	MS/MS
			毛细管电压	3500 V	3500 V
离子扫描范围	100-2000 m/z	60-1000 m/z
			采集速度	4张质谱图/秒	2张质谱图/秒
锥孔电压	20 V	20 V
			离子源温度	100℃	100℃
脱溶剂温度	400℃	400℃
			脱溶剂气流量	700 L/h	700 L/h
锥孔气流量	50 L/h	50 L/h
			碰撞电压	6/20 eV	10-25 eV

（2）质谱数据解析

使用MM File Conversion软件对UPLC-MS/MS分析得到的原始文件转换成MGF格式的质谱通用文件，使用Mascot质谱数据在线分析平台（http://www.matrixscience.com/）检索uniport数据库（http://www.uniprot.org/taxonomy/8139）中的蛋白数据，分析MGF文件中的质谱信息，具体检索参数：Fixed modifications（Carbamidomethyl, C）、VariableModifications（Oxidation, M）、Enzyme（none）、Maximum Missed Cleavages（1）、PeptideMass Tolerance（1.2 Da）、Fragment Mass Tolerance（0.6 Da）、Mass values（Monoisotopic）、Peptide charge（1+, 2+and 3+）、Significance threshold（0.05）。

（3）经UPLC-ESI-TOF-MS/MS鉴定，得到多个钝顶螺旋藻藻蓝蛋白肽。质谱分析结果见图1-图3。钝顶螺旋藻藻蓝蛋白肽的氨基酸序列及其分子量和疏水性（结果见表3）。对钝顶螺旋藻藻蓝蛋白肽进行生物信息学预测。根据预测结果，挑选无毒性、生物活性高的肽，然后化学合成，再进行体内、体外抗氧化、抗衰老活性测定。筛选的钝顶螺旋藻藻蓝蛋白肽的氨基酸序列分别为：Phe-Pro-Pro-Trp-Phe（FPPWF）、Phe-Pro-Pro-Trp-Val-Leu（FPPWVL）和Gly-Trp（GW），即SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。

实施例4钝顶螺旋藻藻蓝蛋白肽的生物信息学预测

（1）肽的潜在生物学活性预测

利用PeptideRanker在线平台（http://distilldeep.ucd）分析获得的多肽序列的潜在生物学活性。根据多肽的生物活性预测概率进行排名，PeptideRanker预测模型的预设阈值为0.5，阈值大于0.5的肽被认为具有生物活性，阈值越大则活性越高。本申请筛选的钝顶螺旋藻藻蓝蛋白肽FPPWF、FPPWVL和GW的预测分值分别为0.997604、0.977268和0.993164（详见表3）。生物信息学预测分析结果表明，FPPWF、FPPWVL和GW的潜在生物学活性高。

表3钝顶螺旋藻藻蓝蛋白肽的质谱分析和生物学活性预测分析结果

肽	分子量(Da)	PeptideRanker	疏水性	Charge	PI
						GW	261.3	0.993164	0.27	0	5.88
FPPWF	692.87	0.997604	0.29	0	5.88
						FPPWVL	758.01	0.977268	0.32	0	5.88

（2）钝顶螺旋藻藻蓝蛋白肽的潜在毒性预测

采用ToxinPrep（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/multi_submit.php）平台，基于SVM（Swiss-Port）算法，对结构解析的钝顶螺旋藻藻蓝蛋白肽进行潜在毒性预测。

经潜在毒性分析，FPPWF、FPPWVL和GW均为无毒性的肽。

实施例5钝顶螺旋藻藻蓝蛋白肽的化学合成及其体外抗氧化活性测定

（1）筛选的钝顶螺旋藻藻蓝蛋白肽FPPWF、FPPWVL、GW，利用Fmoc氨基酸固相合成技术进行人工化学合成。肽由南京肽谷生物技术股份有限公司合成。合成肽的纯度＞95％。

（2）采用DPPH自由基清除率试验和ABTS自由基清除率试验测定多肽的体外抗氧化活性

本实施例所用的药品及仪器无特殊说明均可从商业获得。

①DPPH自由基清除率试验

测定原理：DPPH（1, 1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）的中文名为1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼，常用于抗氧化剂的体外抗氧化性评价。DPPH是一种稳定的以氮为中心的自由基，含有单电子，在517nm处有最大光吸收，其醇溶液呈紫色。当存在自由基清除剂时，DPPH自由基接受一个电子而使其光吸收逐渐消失，溶液颜色由深紫色变为黄色，其褪色程度与其接受的电子数量（即自由基清除活性）成定量关系，因而可用分光光度计进行快速定量分析。即自由基清除剂的清除能力越强，DPPH的吸光度越小。

步骤：于96孔板中分别加入100 uL多肽（FPPWF、FPPWVL或GW）溶液与0.1 mM DPPH无水乙醇溶液，混合，室温下于暗处反应30 min。于517 nm处测定吸光值。每组设3个重复，取平均值。

DPPH自由基清除率计算公式如下：

清除率（%）=（1-(As-Ac)/Ab）×100%

式中：As为样品组（即样品+DPPH）的吸光值；Ac为对照组（即水+样品）的吸光值；Ab为空白组（即DPPH+无水乙醇）的吸光值。

DPPH法测定多肽FPPWF、FPPWVL、GW的DPPH自由基清除率详见表4。

表4不同浓度多肽的DPPH自由基清除率测定结果统计表

经计算，FPPWF、FPPWVL、GW的DPPH自由基清除率的IC₅₀值分别为4.71mM、4.43 mM、2.92 mM。

②ABTS自由基清除率试验

测定原理：ABTS的全称是2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid)，中文名为2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸。ABTS能被K₂S₂O₈氧化，生成蓝绿色的ABTS⁺自由基，在734nm处有最大光吸收，ABTS⁺相当稳定，但有抗氧化剂存在时，ABTS⁺与之反应，生成没有颜色的ABTS。

步骤：分别配制7.4mmol/L的ABTS储备液和2.6mmol/L的K₂S₂O₈储备液，分别量取0.2mL 7.4mmol/L的ABTS储备液和0.2mL 2.6mmol/L的K₂S₂O₈储备液，混合，室温避光反应12小时，制得ABTS⁺自由基母液。使用PBS（5.0 mM，pH7.4）稀释ABTS⁺母液至A734 值为1.000-1.099，制得ABTS⁺自由基工作液。将200 uL稀释的ABTS⁺自由基工作液加入到20 uL肽（FPPWF、FPPWVL或GW）溶液中，室温条件下，避光反应10 min，于734 nm处测定吸光值。每组设3个重复，取平均值。

ABTS自由基清除率计算公式如下：

ABTS自由基清除率（%）=(Ac-As)/Ac×100%

式中：As为样品组吸光度，即为样品与ABTS自由基的吸光度；Ac为对照组吸光度，即为磷酸盐缓冲液与ABTS自由基的吸光度。

ABTS法测定多肽FPPWF、FPPWVL、GW的ABTS自由基清除率详见表5。

表5不同浓度多肽的ABTS自由基清除率测定结果统计表

经计算，FPPWF、FPPWVL、GW的ABTS自由基清除率IC₅₀值分别为0.75mM、1.54 mM、0.39mM。

实施例6钝顶螺旋藻藻蓝蛋白肽的体内抗氧化、抗衰老活性测定

（1）秀丽隐杆线虫抗氧化胁迫存活率测定：随机挑取L4期同步化秀丽隐杆线虫，接种于含OP50菌苔的NGM平皿上，每组30条。设实验组与对照组。实验组加预先经0.22 um滤膜除菌的1 mg/mL的多肽溶液20 uL和75 ug/mL 5-氟尿嘧啶20 uL，对照组用M9缓冲液代替多肽溶液。20℃培养24 h后，M9缓冲液冲洗平板上的秀丽隐杆线虫，收集线虫到2 mL离心管中，用M9缓冲液冲洗干净，加入500 uL 10 mM H₂O₂，作用1 h，置于显微镜下记录线虫的存活情况，直至线虫全部死亡，统计线虫的存活率。

1 mg/mL的肽溶液孵育处理秀丽线虫24 h后进行氧化胁迫的存活率K-M曲线分别见图4。氧化胁迫存活率测定结果表明，对照组的秀丽隐杆线虫的平均存活时间为15.3 h，最大存活时间为26.12 h；秀丽隐杆线虫经纯肽孵育处理后，其平均存活时间均明显延长，经GW、FPPWVL和FPPWF孵育的秀丽隐杆线虫的平均寿命分别延长至20.9 h、19.06 h和17.3h，平均寿命分别提高了36.6%、24.58%、13.07%。最大寿命分别延长至34.24 h、34.15 h和30.25 h。

（2）氧化胁迫秀丽隐杆线虫的体内抗氧化指标测定：随机挑取同步化后的L4期秀丽隐杆线虫成虫，接种于含OP50菌苔的NGM平皿中，每组30条。设实验组与对照组。实验组加入经0.22 um滤膜除菌的1 mg/mL的多肽溶液20 uL和5-氟尿嘧啶（75 ug/mL）20 uL。对照组中加入M9缓冲液20 uL和75 ug/mL 5-氟尿嘧啶20 uL。20℃培养24 h。收集线虫于离心管中，用M9缓冲液冲洗干净，并转移到新离心管，加入10 mM的H₂O₂，作用1 h后，用生理盐水清洗，破碎线虫细胞，制成终浓度10%的匀浆，离心，取上清。按照试剂盒说明书，测定过氧化氢酶（CAT）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量和蛋白含量，以蛋白含量标定抗氧化酶酶活及MDA含量。

通过测定在氧化胁迫下秀丽隐杆线虫体内的超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性以及丙二醛（MDA）的含量来评价多肽对秀丽隐杆线虫的氧化调节作用。结果见表6。与对照组相比，经肽孵育处理的氧化胁迫秀丽隐杆线虫体内的SOD和CAT活性均明显升高，而ROS、MDA的含量降低。实验结果表明，多肽是通过提高秀丽隐杆线虫体内SOD和CAT的活性以及降低ROS、MDA含量，从而发挥抗氧化调节作用的。

表6多肽处理的氧化胁迫秀丽隐杆线虫的体内抗氧化指标测定结果

（3）秀丽隐杆线虫抗衰老活性测定：随机挑取同步化的L4期秀丽隐杆线虫成虫，接种在含OP50菌苔的NGM平皿中，每组50条。设实验组与对照组。实验组加入经0.22 um滤膜除菌的1 mg/mL的多肽溶液20 uL和75 ug/mL 5-氟尿嘧啶20 uL，对照组用M9缓冲液替代多肽溶液。20℃培养。转移秀丽隐杆线虫的当天记作第0 d，每天同一时间将秀丽隐杆线虫转移至新的含OP50菌苔的NGM平皿中，每天观察并记录秀丽隐杆线虫的死亡数量，以秀丽隐杆线虫对外界刺激是否应答作为判断其死亡的依据，直至秀丽隐杆线虫全部死亡结束试验。计算线虫的平均寿命。

如附图5所示，为了评估肽对秀丽隐杆线虫寿命的影响，用浓度为1 mg/mL的多肽处理秀丽隐杆线虫，对照组秀丽隐杆线虫的平均寿命为10.22 d，GW、FPPWVL、FPPWF处理的秀丽隐杆线虫平均寿命分别为15.24 d、14.36 d和13.16 d，分别比对照组延长了49.12%、40.51%和28.77%，生物统计学分析表明均存在显著性差异（p<0.05）。对照组秀丽隐杆线虫的最大寿命为18.15 d，GW、FPPWVL和FPPWF处理的秀丽隐杆线虫的最大寿命分别为24.11d、23.32 d和23.26 d，分别比对照组延长了32.84%、28.48%和28.15%，均存在显著性差异（p<0.05）。抗衰老试验结果表明，三条多肽均能显著延长秀丽隐杆线虫的寿命。

以上体内和体外分析结果表明，钝顶螺旋藻抗氧化肽FPPWF、FPPWVL、GW具有抗氧化及抗衰老活性，可用于开发抗氧化、抗衰老相关的化妆品和药品。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细的说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1. 具有抗氧化、抗衰老活性的钝顶螺旋藻藻蓝蛋白活性肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤如下：

S1：钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的提取

（1）将钝顶螺旋藻粉按1:10-20的比例（w/v）分散到蒸馏水中，浸泡6-12小时，-20℃冷冻12~24 h，然后用流水或37℃水浴融化，反复3次；6000 rpm离心15 min，取上清液，即为蛋白粗提液；

（2）在蛋白粗提液中加入研磨的硫酸铵粉末，使其饱和度为60%；边加边搅拌，至硫酸铵完全溶解后继续搅拌2小时；然后置冰箱冷藏室，静置6-12小时；10000 rpm离心15 min，取沉淀；沉淀用适量的PBS重溶，将重悬液用透析袋透析，透析过程中更换PBS3次；透析液用6000 rpm离心15 min，取上清液；上清液即为钝顶螺旋藻藻蓝蛋白粗提液；所述PBS的pH为6.5；

（3）吸取适量上述藻蓝蛋白粗提液，加到PBS平衡的DEAE Sepharose Fast Flow层析柱中，阴离子交换层析法纯化藻蓝蛋白；先用PBS冲洗层析柱，去除杂质和多余的样品，再用含0.3M NaCl的PBS溶液直接洗脱，收集蓝色洗脱液；用透析袋透析，透析过程中更换超纯水3次；透析液用6000 rpm离心15 min，取上清液，即为纯化的钝顶螺旋藻藻蓝蛋白溶液；所述PBS的pH为6.5；

S2钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的酶解及其超滤组分制备

（1）调节钝顶螺旋藻藻蓝蛋白溶液的pH为10.5，然后加入3000 U/g的碱性蛋白酶，混匀后置于摇床中振荡酶解，摇床转速为100-200rpm，酶解时间200-300 min，酶解温度40℃；

（2）酶解结束，酶解液沸水浴10 min，灭活残留的酶；

（3）4℃条件下10000-12000 rpm离心15 min，收集上清液，弃沉淀；上清液即为钝顶螺旋藻藻蓝蛋白肽溶液；

（4）使用截留分子量为3 kDa的超滤离心管，6000 rpm离心30 min，吸取超滤管中截留的溶液，即为分子量＜3 kDa的超滤组分；

（5）收集分子量＜3 kDa的超滤组分，冷冻真空干燥制备钝顶螺旋藻藻蓝蛋白肽冻干粉；

所述钝顶螺旋藻藻蓝蛋白活性肽由Phe-Pro-Pro-Trp-Phe、Phe-Pro-Pro-Trp-Val-Leu和Gly-Trp组成。

2.如权利要求1所述制备方法获得的钝顶螺旋藻藻蓝蛋白活性肽制备抗氧化、抗衰老化妆品和药品中的应用；

所述钝顶螺旋藻藻蓝蛋白活性肽由Phe-Pro-Pro-Trp-Phe、Phe-Pro-Pro-Trp-Val-Leu和Gly-Trp组成。