CN115728433B - IgG4型单克隆抗体电荷异质性的离子交换色谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药领域，本发明提供了一种IgG4型单克隆抗体电荷异质性的离子交换色谱检测方法，其中检测条件包括：采用磺酸基官能团的强阳离子色谱柱，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱。该方法可以有效地检测IgG4型单克隆抗体特别是Dupilumab单抗及其生物类似物中的酸性、中性和碱性电荷异构体，本发明方法具有分离度高、重复性好、准确度高、专属性好，操作简单快速等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及一种IgG4型单克隆抗体的电荷异质性的离子交换色谱检测方法。
背景技术
治疗性单克隆抗体药物作为一种靶向性生物治疗药物，自1986年获得FDA批准上市以来，已成为制药企业研发热点。Dupilumab单抗是首个被FDA批准用于治疗中重度特应性皮炎的完全人源化IgG4型单克隆抗体，通过与IL-4Rα亚基结合，抑制IL-4、IL-13的信号传导。单克隆抗体分子量约150kDa，采用真核细胞表达，抗体分子在细胞内的生物合成、发酵培养、纯化以及制剂等过程中，会发生各种翻译后修饰变化，包括氧化、脱酰胺、重链C末端赖氨酸残留、异构化和糖基化等，此外抗体分子的断裂体和聚集体等大小变异体的综合因素导致抗体分子所带电荷存在差异，最终呈现出“异质性”的特点，称为电荷异构体。抗体分子的电荷异质性与其稳定性和生物学活性密切相关，直接影响产品生产工艺的稳定性，因此其作为一个产品的关键质量属性(CQA)，在抗体药物开发以及生产过程中备受密切关注。
目前用于评价单克隆抗体电荷异质性的方法包括平板等电聚焦电泳(IEF)、毛细管等电聚焦电泳(CIEF)、离子交换色谱(IEX)等。等电聚焦电泳(IEF/CIEF)根据抗体分子的等电点差异分离电荷异构体，IEF的检测结果是凝胶条带，目前不能精确定量和分析每个电荷异构体，虽然CIEF可以实现精确定量，根据等电点差异分离，对造成等电点变化的修饰进行监控，如末端赖氨酸切除不完全，但是不能监控未造成等电点变化的修饰，如氧化修饰等，此外等电聚焦电泳的样品前处理复杂，涉及样品脱盐等步骤，耗时较长。离子交换色谱根据抗体表面电荷的差异分离电荷异构体，可以综合监控造成异质性的所有修饰变化，无需样品前处理，操作简单，灵敏度相较更高。
目前获批上市最多的单抗属于IgG1型，相关的研究分析技术较为成熟，现有技术主要是围绕对IgG1类型抗体的分析检测，总体来说对电荷异构体的分析通常利用盐离子梯度介导的弱阳离子色谱法，可达到较好分离效果，能够满足对工艺开发和产品质量评估的需求，但是对于IgG2和IgG4类型的离子交换色谱方法的研究报道较少，这两个类型抗体在离子交换色谱检测方法的开发上存在较大难度，且IgG4型单克隆抗体疏水性较高，目前没有用于分离效果和稳定性更好的IgG4型单克隆抗体及其生物类似物电荷异质性的检测方法。
戴振宇等人的文章(“pH梯度离子交换色谱高分辨率分离单抗唾液酸化异构体”)公开了在ProPac SCX-10柱上使用基于pH梯度的强阳离子交换色谱可用于高分辨率分离单克隆抗体唾液酸化异构体。但是，该方法用于IgG4型单克隆抗体的电荷异质性分析具有不能达到酸性、中性和碱性异构体的较好分离的缺陷，且其采用的是pH梯度分离原理。
专利申请CN109946410A公开了采用弱阳离子色谱柱、具体公开了一种以PropacWCX-10分析单克隆抗体电荷异质性的离子交换色谱检测方法。但该方法无法实现分离并检测IgG4型单克隆抗体的电荷异构体。
因此，有必要开发一种分离效果和稳定性更好的用于IgG4型单克隆抗体电荷异质性的检测方法。
发明内容
针对以上技术现状，本发明的目的在于提供一种IgG4型单克隆抗体，特别是Dupilumab单克隆抗体及其生物类似物的电荷异质性分析的阳离子交换色谱检测方法，该方法具有较好的分离度，较高的专属性、重复性和准确度。本发明检测方法包括如下：
本发明提供了一种单克隆抗体电荷异质性的离子交换色谱检测方法，所述单克隆抗体为IgG4型单克隆抗体，检测条件包括：采用磺酸基官能团的强阳离子色谱柱，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，
其中，所述流动相A为两性电解质及其盐缓冲溶液，优选MES(2-吗啉乙磺酸)及其盐缓冲溶液、磷酸及其盐缓冲溶液或乙酸及其盐缓冲溶液、或它们中的多种组合；
所述流动相B为两性电解质及其盐缓冲溶液，优选MES(2-吗啉乙磺酸)及其盐缓冲溶液、磷酸及其盐缓冲溶液或乙酸及其盐缓冲溶液，或它们中的多种组合；
所述盐为钠盐或钾盐。
本发明的方法中，作为实施方案之一，所述的强阳离子色谱柱为YMC BioPro IEXSF或Thermo MAbPac SCX-10。
本发明的方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括：所述流动相A或流动相B含有体积百分比为0-10％的乙腈、异丙醇、乙醇或甲醇。
本发明的方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括：所述流动相A中或流动相B含有体积百分比为5％的乙腈、异丙醇、乙醇或甲醇。
本发明的方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括：所述流动相A中或流动相B含有体积百分比为5％的乙腈。
本发明的方法中，作为实施方案之一，所述流动相A为pH 5.7-6.2，优选pH 5.8-6.1，最佳为pH 6.0。
本发明的方法中，作为实施方案之一，所述流动相A为浓度为10-50mM的MES及其盐缓冲溶液添加5％体积的乙腈，优选为20-50mM、进一步优选为30mM的MES及其盐缓冲溶液添加5％体积的乙腈；作为实施方案之一，优选流动相A为30mM MES，pH6.0，5％体积的乙腈。
本发明的方法中，作为实施方案之一，所述流动相B以流动相A为基础溶液，并添加0.1M-1M钠盐或钾盐的溶液，优选添加0.5M的氯化钠或氯化钾溶液。
本发明的方法中，作为实施方案之一，所述的流动相B为：30mM MES，0.5M NaCl，pH6.0，5％乙腈。
本发明的方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括流动相流速为0.2-1.5mL/min，优选0.4-0.6mL/min，进一步优选0.4mL/min。
本发明的方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括洗脱梯度为：
| 时间/min | 流动相A | 流动相B |
| 0min | 93 | 7 |
| 2min | 93 | 7 |
| 57min | 82 | 18 |
| 59min | 40 | 60 |
。
本发明的方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括检测时色谱柱温为20-50℃，优选40℃。
本发明的方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括采用紫外检测器，检测波长为280nm，进样量5-100μg、优选25-75μg。
本发明的方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括供试品的处理：取IgG4型单克隆抗体及其生物类似物，加入超纯水，混匀，得到浓度为2.5mg/mL的待测样品。
本发明的方法中，作为实施方案之一，所述IgG4型单克隆抗体为Dupilumab及其生物类似物，或Nivolumab及其生物类似物。
本发明的方法中，作为实施方案之一，取Dupilumab5μL，加入295μL超纯水，混匀，得到浓度为2.5mg/mL的待测样品。
本发明的方法中，作为实施方案之一，取Nivolumab25μL，加入75μl超纯水中，混匀，配制得到2.5mg/mL的待测样品。
本发明的方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括：所述Dupilumab或Nivolumab单抗及其生物类似物电荷异质性的高效检测方法包括以下检测条件：
色谱柱：YMC BioPro IEX SF或Thermo MAbPac SCX-10
流动相：A-30mM MES，pH6.0，5％乙腈；
B-30mM MES，0.5M NaCl，pH6.0，5％乙腈
柱温：40℃
检测波长：280nm
进样量：25μg
流速：0.4mL/min
流动相梯度：
| 时间/min | 流动相A | 流动相B |
| 0min | 93 | 7 |
| 2min | 93 | 7 |
| 57min | 82 | 18 |
| 59min | 40 | 60 |
本发明的方法中，作为实施方案之一，所述方法包括：
待测样品的制备：取Dupilumab或Nivolumab，加入超纯水，混匀，得到浓度为2.5mg/mL的待测样品。
定义
本发明中，“生物类似物”，也称“生物类似药”，在“生物类似药研发预评价技术指导原则”中明确“生物类似药”是指在质量、安全性和有效性方面与已获准注册的参照药具有相似性的治疗用生物制品，生物类似药候选药物的氨基酸序列原则上应与参照药相同。本发明中，用Dupilumab或Nivolumab的序列来做仿制药的都可称为Dupilumab或Nivolumab的生物类似物。本发明所针对的待测样品是含有与Dupilumab或Nivolumab抗体相同序列或位点突变的成分的溶液，包括Dupilumab或Nivolumab及其生物类似物。
相对于现有技术，本发明具有如下的优点及效果：该发明提供了一种针对IgG4型单克隆抗体，特别是Dupilumab及其生物类似物的电荷异质性分析的离子交换色谱检测方法，与传统方法中通常利用弱阳离子色谱柱进行单克隆抗体电荷异质性分析不同，本方法采用以磺酸基为官能团的强阳离子色谱柱结合在流动相中添加一定比例的有机试剂，得到优于多种弱阳离子色谱柱的分离效果，该方法可以有效地将IgG4型单克隆抗体，特别是Dupilumab单抗及其生物类似物的酸性、中性和碱性电荷异构体进行分离，具有分离度高、重复性好、准确度高、专属性好，操作简单快速等优点，并且该方法通用性较强，对同为IgG4型的Nivolumab的分离效果也优于弱阳离子色谱柱的分离。
因此，采用本发明检测方法成功实现了IgG4型单克隆抗体、特别是Dupilumab单抗及其生物类似物电荷异构体的有效检测，从而能够检检测出IgG4型单克隆抗体、特别是Dupilumab单抗及其生物类似物产品的质量属性。
附图说明
图1是实施例1中检测条件得到的典型的Dupilumab抗体的酸性、中性和碱性电荷异构体分布图；
图2是实施例2中检测条件在Thermo propac Elite WCX上得到的Dupilumab抗体的酸性、中性和碱性电荷异构体分布图；
图3是实施例2中检测条件在Thermo propac WCX-10上得到的Dupilumab抗体的酸性、中性和碱性电荷异构体分布图；
图4是实施例3中检测条件在Thermo MAbPac SCX-10上得到的Dupilumab抗体的酸性、中性和碱性电荷异构体分布图；
图5是实施例4中流动相在pH5.8、6.0和6.1条件下测得Dupilumab抗体的酸性、中性和碱性电荷异构体分离效果图；
图6是实施例5中流动相MES在浓度为20mM和50mM下测得的Dupilumab抗体的酸性、中性和碱性电荷异构体分离效果图；
图7是实施例6中流速在0.4和0.6mL/min条件下测得Dupilumab抗体的酸性、中性和碱性电荷异构体分离效果图；
图8是实施例7中盐离子变化梯度为1.5、1.0、0.8和0.6mM/min条件下测得Dupilumab抗体的酸性、中性和碱性电荷异构体分离效果图；
图9是实施例8中色谱柱温在35、37、40、45℃条件下测得Dupilumab抗体的酸性、中性和碱性电荷异构体分离效果图；
图10是实施例9中流动相中添加0％、2％和5％体积乙腈后测得Dupilumab抗体的酸性、中性和碱性电荷异构体分离效果图；
图11是实施例11中Dupilumab抗体羧肽酶B未酶切和酶切后的酸性、中性和碱性电荷异构体分布图；
图12是实施例12中本发明检测方法的线性回归线图；
图13是实施例14中的检测条件检测Nivolumab单抗的酸性、中性和碱性电荷异构体分布图；
图14是实施例14中Thermofisher公司的弱阳离子色谱柱检测的Nivolumab单抗的酸性、中性和碱性电荷异构体分布图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
仪器与试剂
表1
实施例1
本实施例是利用YMC BioPro IEX SF色谱柱对Dupilumab抗体的电荷异构体的检测实验，实验过程如下
(1)待测样品1的制备(又称“供试品1的处理”)：取Dupilumab单抗5μL(批号9L003K)，加入295μL超纯水，混匀，得到浓度为2.5mg/mL的待测样品。
(2)确定色谱条件：检测色谱条件如表2所示。
表2
检测结果如图1所示，利用上述检测条件，可以将Dupilumab单抗的酸性电荷异构体、中性电荷异构体和碱性电荷异构体进行有效分离。
实施例2
本实施例对比实施例1，检测相同流动相条件下Dupilumab在弱阳离子色谱柱上的分离效果。
(1)供试品的处理：同实施例1。
(2)检测色谱条件如表3所示
表3
检测结果如图2所示，Dupilumab抗体在Thermo propac Elite WCX上只有酸峰少量分离，碱峰完全没有分离效果。
此外利用相同的流动相和盐离子变化梯度，在Thermo propac WCX-10弱阳离子色谱柱上对Dupilumab抗体进行分离，得到结果如图3所示，该款色谱柱在IgG1型抗体的电荷异质性评价方面使用较多，但是对于Dupilumab抗体的酸性、中性和碱性电荷异构体完全没有分离效果，通过以上对比实施例，充分说明强阳离子色谱柱在Dupilumab抗体的电荷异质性分析方面有着巨大优越性。
实施例3
本实施例研究了不同强阳离子色谱柱对Dupilumab电荷异构体的分离效果。
供试品处理同实施例1，色谱柱选择Thermo MAbPac SCX-10，除色谱柱不同，其他检测条件与实施例1相同。
检测结果如图4所示，其他检测条件完全相同的情况下，Thermo MAbPac SCX-10强阳离子色谱柱对Dupilumab的酸性、中性和碱性电荷异构体的分离效果与实施例1的相当。
实施例4
本实施例研究了不同流动相pH值对Dupilumab电荷异构体分离效果。
供试品处理同实施例1，色谱检测条件如表4所示：
表4
检测结果如图5所示，流动相pH值为5.8，6.0和6.1条件下，该检测条件对Dupilumab抗体的酸性、中性和碱性异构体的分离效果接近，都可达到分离要求，从每个峰的形状来看，pH6.0为最佳pH值。
实施例5
本实施例研究了不同MES浓度对Dupilumab电荷异构体分离效果的影响。
供试品的处理同实施例1，色谱检测条件与实施例1唯一不同的是MES的浓度，考察了20和50mM MES的检测条件。
检测结果如图6所示，MES浓度从20mM升高至50mM，Dupilumab抗体的酸峰、主峰和碱峰的分离效果与MES浓度为30mM(如图1)的分离效果相当。
实施例6
本实施例研究了不同流速对Dupilumab电荷异构体分离效果的影响。
供试品的处理同实施例1，色谱检测条件与实施例1唯一不同的是流速，由于该款色谱柱流速推荐使用0.2-0.8mL/min，因此本发明考察了0.4和0.6mL/min的检测条件。
检测结果如图7所示，流速从0.4mL/min提高至0.6mL/min时，靠近主峰的酸碱峰分离效果稍有下降，但总体不变，亦可达到分离效果。
实施例7
本实施例研究了不同盐离子变化梯度对Dupilumab电荷异构体分离效果的影响。盐离子变化梯度指流动相B从7％升高至18％的盐浓度差与所用时间的比值，实施例1的盐离子变化梯度为1.0mM/min。
供试品的处理同实施例1。色谱条件与实施例1不同的是流动相B的盐离子变化梯度改变，考察0.6、0.8、1.0、1.5mM/min的变化梯度。
检测结果如图8所示，随着盐离子梯度从0.6提高至1.5mM/min的过程中，酸碱峰的分离度有所下降，但都可达到分离效果，为兼顾分析时间和峰分辨率，1.0mM/min的盐离子梯度为最佳。
实施例8
本实施例考察了不同色谱柱温对Dupilumab电荷异构体分离效果的影响。
供试品的处理同实施例1，色谱条件与实施例1不同的是色谱柱温，考察35℃，37℃，40℃和45℃。
检测结果如图9所示，随着柱温从35℃升高至40℃，碱峰的峰分离效果稍有增加，再升高至45℃时，分离效果和35℃时基本一致，都可达到分离效果，柱温对酸碱峰的分离效果改善有限，40℃柱温为最佳检测温度。
实施例9
本实施例是不同乙腈浓度对Dupilumab电荷异构体分离效果的检测实验。
与实施例1唯一不同的是流动相A和流动相B的乙腈添加比例，考察了0％，2％，5％乙腈浓度(体积百分比)对分离结果的影响，检测图谱如图10所示，分析结果如表5所示，在不添加乙腈的条件下亦可以满足实验要求和对工艺样品的检测，但是添加5％体积的乙腈后，可以显著提高检测结果的分离度。
表5
| 乙腈浓度(体积百分比) | 酸峰A1和主峰M分离度 | 酸峰A1峰谷比 |
| 0％ | 0.58 | 1.25 |
| 2％ | 0.62 | 1.29 |
| 5％ | 0.89 | 1.45 |
其中，酸峰A1的峰谷比＝A1峰的峰高/与主峰相邻的谷高。
实施例10
本实施例是对该检测方法的重复性进行验证。
供试品的处理同实施例1，色谱检测条件设置了30mM MES浓度和20mM MES浓度的流动相，其他检测条件不变。配制8份供试品，检测后对比主峰保留时间，以及酸性、中性和碱性电荷异构体的含量变化，结果如表6和表7所示，体现了30mM MES流动相和20mM MES流动相的检测方法的重复性，前者重复性更优。
表6. 20mM MES+5％乙腈作为流动相
| 样品 | 主峰保留时间/min | 酸峰含量％ | 主峰含量％ | 碱峰含量％ |
| 1 | 32.186 | 31.062 | 61.105 | 7.833 |
| 2 | 32.238 | 30.309 | 61.512 | 8.179 |
| 3 | 32.222 | 31.193 | 61.173 | 7.634 |
| 4 | 31.955 | 31.199 | 61.142 | 7.659 |
| 5 | 31.984 | 30.969 | 61.403 | 7.728 |
| 6 | 32.039 | 31.221 | 61.067 | 7.712 |
| 7 | 31.968 | 31.326 | 61.065 | 7.609 |
| 8 | 31.947 | 31.296 | 61.978 | 7.726 |
| RSD值 | 0.39％ | 1.08％ | 0.30％ | 2.21％ |
表7. 30mM MES+5％乙腈作为流动相
实施例11
本实施例是对该检测方法的专属性进行验证。单克隆抗体在表达过程中，其重链C末端的赖氨酸大部分会被细胞内的羧肽酶切除，但是存在少量的赖氨酸残留，进而增加抗体的碱性电荷异构体，也就是说，抗体的重链C末端赖氨酸残留是碱性电荷异构体的原因之一。因此专属性通过利用羧肽酶B处理Dupilumab单抗后的样品检测来验证。
供试品2的处理：取Dupilumab单抗5μL(批号9L003K)，加入295μLpH7.0，浓度为25mM的Tris溶液，混匀，得到浓度为2.5mg/mL的Dupilumab样品。
Dupilumab单抗羧肽酶B酶切的样品处理：取上述供试品溶液150μL，加入4μL羧肽酶B溶液，混匀。
将Dupilumab供试品2和酶切样品同时放入37℃温度下孵育60min，空白溶液为pH7.0，浓度为25mM的Tris溶液。
检测色谱条件同表1，检测结果如图11所示，经羧肽酶B酶切和未酶切结果相比，供试品2酶切后，对应的碱性峰变低，如箭头所示峰，符合理论预期，说明该检测方法可以有效分离少量的重链C末端赖氨酸残留导致的碱性电荷异构体，并且对比空白溶液的色谱图，在供试品出峰位置无干扰峰，说明该方法可以专属用于检测Dupilumab抗体。
实施例12
本实施例对该检测方法的线性进行验证。
供试品的处理和检测条件同实施例1。考察供试品在25-75μg范围内的线性，分别制备3份供试品溶液，每份供试品按进样体积10μL，15μL，20μL，25μL，30μL各测定一次，计算不同进样量的酸性、中性和碱性异构体的平均峰面积，单位为mAU·s，以供试品的进样量为横坐标，平均峰面积为纵坐标，分别对酸性电荷变异体、中性电荷变异体和碱性电荷异构体进行线性回归，根据回归曲线得出线性相关系数R2，具体峰面积和相关系数统计结果如表8所示，回归曲线如图12所示，说明利用该检测方法，进样量在25-75μg范围内，各电荷变异体的线性回归系数R2均在>0.99的可接受范围内。
表8
| 进样量 | 酸性峰面积 | 中性峰面积 | 碱性峰面积 |
| 25μg | 1419.014 | 2838.076 | 344.150 |
| 37.5μg | 2132.289 | 4266.835 | 496.096 |
| 50μg | 2816.487 | 5690.367 | 648.115 |
| 62.5μg | 3464.802 | 7130.874 | 803.470 |
| 75μg | 4140.146 | 8520.819 | 939.448 |
| R2 | 0.9997 | 1 | 0.9995 |
实施例13
本实施例对该检测方法的准确度进行验证。
供试品的处理和检测条件同实施例1。分别制备3份供试品溶液，每份供试品溶液按进样体积12μL和18μL各测定一次，对应进样量分别为30μg和45μg，将峰面积带入线性验证所得的回归方程，分别计算酸性、中性和碱性电荷异构体峰面积，所对应的进样量，以实测进样量除以理论进样量计算得出回收率(％)，统计结果如表9所示，所有组分在各进样量条件下的回收率均在90％-110％的可接受范围内。
表9
实施例14
本实施例利用相同的检测条件对Nivolumab的电荷异质性进行分析，检测该方法的通用性。
供试品3的处理：取Nivolumab单抗(批号ABR1014)25μL，加入75μl超纯水中，混匀，配制得到2.5mg/mL的供试品3溶液。
按照实施例1的检测条件进行分离，得到结果如图13所示，从图上可见，利用相同的检测条件，可以将IgG4型Nivolumab的酸性、中性和碱性电荷异构体进行有效分离，并且对比Thermofisher公司的弱阳离子色谱柱(Propac Elite WCX)的应用资料里提到的Nivolumab单抗的检测结果，如图14所示，本发明所述的方法对Nivolumab抗体的分离效果更优，说明本发明所述的方法在IgG4型抗体的电荷异质性分析方面具有通用性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (24)
1.一种IgG4型单克隆抗体电荷异质性的离子交换色谱检测方法，其特征在于，检测条件包括：采用磺酸基官能团的强阳离子色谱柱，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱；
所述流动相A为：
MES及其盐缓冲溶液，所述流动相A含有体积百分比为0-10％的乙腈；
所述流动相B为：
MES及其盐缓冲溶液；所述流动相B含有体积百分比为0-10％的乙腈；所述流动相B含有NaCl；
所述盐为钠盐；
洗脱梯度为：
或
。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的强阳离子色谱柱为YMC BioPro IEXSF或Thermo MAbPac SCX-10。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：所述流动相A或流动相B含有体积百分比为5％的乙腈。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相A为pH5.7-6.2。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述流动相A为pH5.8-6.1。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述流动相A为pH6.0。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相A为浓度为10-50mM的MES及其盐缓冲溶液添加5％体积的乙腈。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述流动相A为浓度为20-50mM的MES及其盐缓冲溶液添加5％体积的乙腈。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述流动相A为浓度为30mM的MES及其盐缓冲溶液添加5％体积的乙腈。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述流动相A为浓度为30mM的MES及其盐缓冲溶液添加5％体积的乙腈，pH6.0。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相B以流动相A为基础溶液，并添加0.1M-1M钠盐的溶液。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述流动相B以流动相A为基础溶液，并添加0.5M的氯化钠溶液。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的流动相B为：30mM MES，0.5MNaCl，pH6.0，5％体积的乙腈。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括流动相流速为0.2-1.5mL/min。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括流动相流速为0.4-0.6mL/min。
16.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括流动相流速为0.4mL/min。
17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括检测时色谱柱温为20-50℃。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括检测时色谱柱温为40℃。
19.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括采用紫外检测器，检测波长为280nm；进样量5-100μg。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括采用紫外检测器，检测波长为280nm；进样量25-75μg。
21.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括供试品的处理：取IgG4型单克隆抗体及其生物类似物，加入超纯水，混匀，得到浓度为2.5mg/mL的待测样品。
22.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述IgG4型单克隆抗体为Dupilumab及其生物类似物，或Nivolumab及其生物类似物。
23.根据权利要求1～22任一项所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括，所述Dupilumab及其生物类似物或Nivolumab及其生物类似物电荷异质性的高效检测条件如下：
色谱柱：YMC BioPro IEX SF或Thermo MAbPac SCX-10
流动相：A：30mM MES，pH6.0，5％乙腈；
B：30mM MES，0.5M NaCl，pH6.0，5％乙腈
柱温：40℃
检测波长：280nm
进样量：25μg
流速：0.4mL/min
流动相梯度：
。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
待测样品的制备：取Dupilumab或Nivolumab，加入超纯水，混匀，得到浓度为2.5mg/mL的待测样品。
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