CN115671225B - 一种针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物及其应用，由以质量份的原料药组成：当归6～10份，生地黄5～8份，熟地黄5～8份，黄芪10～20份，黄连2～5份，黄芩6～10份，陈皮5～8份，炒白术8～15份，川芎5～8份，桂枝8～15份，法半夏5～8份，地龙5～8份，炙百部8～15份。经药理试验发现，本发明公开的针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物可通过调控MAPK信号通路，调节炎性细胞因子过度释放与氧化应激失衡，修复肺泡毛细血管通透屏障，改善慢性肺损伤病理改变，从而治疗儿童肺炎恢复期慢性肺损伤。

Description

一种针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物及其应用

技术领域

本发明属于中医药技术领域，具体涉及一种针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物及其应用。

背景技术

呼吸系统疾病发病率和病死率持续上升是全球性的公共问题之一，由于儿童呼吸与免疫系统尚未发育完善，呼吸系统疾病是困扰儿童健康成长的问题之一。2019年全球疾病负担研究中心调查数据显示，小于5岁的儿童是受肺炎影响最大的人群之一。临床中可见部分肺炎患儿(尤其重症肺炎)在经过规范对症治疗后，肺炎恢复期仍然存在咳嗽、咳痰等症状，且短期内极易反复肺炎或患其他呼吸道感染性疾病。病原微生物清除、上皮修复通常需要长期过程，气道、肺泡组织由急性炎症损伤易转变为慢性肺损伤，其哮喘、肺纤维化和闭塞性细支气管炎等疾病的风险增加，引起患儿反复下呼吸道感染，频繁住院，运动耐力降低，严重影响其生命健康，造成巨大的经济和社会负担。

目前儿童肺炎慢性肺损伤相关研究较少，其作用机制复杂且尚不明确。对于儿童慢性肺损伤的治疗，特效药物较少，临床以抗生素和激素等对症治疗为主，并且存在耐药率逐年增高的趋势，疾病的诊疗与防治存在诸多挑战。而儿童时期的生命健康是生命全周期健康保障的基石与起点，因此根据儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中医证候特点，进行中医药防治的研究，提供安全有效的治疗方案，实现中、西医的优势互补，并为儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的临床防治提供新复方药物是亟待解决的技术问题。

已报道的当归六黄汤在临床中可防治儿童反复上呼吸道感染，但是无法将其直接运用于下呼吸道炎症感染，因其药味组成中，针对咳嗽、咳痰、喘憋等症状的中药较少，特别是针对儿童肺炎(尤其重症肺炎)恢复期慢性肺损伤，疗效欠佳。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物及其应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物，由以质量份的原料药组成：当归6～10份，生地黄5～8份，熟地黄5～8份，黄芪10～20份，黄连2～5份，黄芩6～10份，陈皮5～8份，炒白术8～15份，川芎5～8份，桂枝8～15份，法半夏5～8份，地龙5～8份，炙百部8～15份。

优选地，由以质量份的原料药组成：当归8份，生地黄6份，熟地黄6份，黄芪15份，黄连3份，黄芩8份，陈皮6份，炒白术10份，川芎6份，桂枝10份，法半夏6份，地龙6份，炙百部10份。

优选地，由以质量份的原料药组成：当归6份，生地黄6份，熟地黄5份，黄芪12份，黄连2份，黄芩6份，陈皮8份，炒白术12份，川芎8份，桂枝12份，法半夏5份，地龙8份，炙百部12份。

优选地，由以质量份的原料药组成：当归10份，生地黄8份，熟地黄5份，黄芪10份，黄连5份，黄芩10份，陈皮6份，炒白术8份，川芎5份，桂枝8份，法半夏8份，地龙8份，炙百部15份。

优选地，以所述中药组合物为药用成分，添加辅料制成口服制剂。

进一步优选地，所述的口服制剂为片剂、散剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂水煎剂。

进一步优选地，所述的辅料包括稳定剂、增溶剂、润滑剂或崩解剂中的一种或几种。

本发明还公开了一种针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药水煎剂，水煎剂是将权利要求1～4中任意一项所述的中药组合物的原料药加入纯净水，液量保证浸泡全部中药材，煎煮2次，过滤药渣，合并滤液，制得中药水煎剂。

优选地，浸泡完成后进行煎煮，煎煮温度为100℃，前后共煎两次：

第一煎：煮开水沸腾20分钟后倒出药汁，得到第一煎药汁；

第二煎：再加水，煮开水沸腾30分钟后倒出药汁，得到第二煎药汁；

将第一煎药汁和第二煎药汁混合，浓缩得到中药水煎剂。

本发明还公开了上述的针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物在制备治疗儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的药物中的应用，所述的药物为改善慢性肺损伤肺组织病理改变的药物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开的针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物，针对小儿肺炎恢复期慢性肺损伤的治疗，可以有效改善患儿预后，减少复发，缩短再次呼吸道感染的病程。组合物方中当归、生地黄，当归味甘而辛，《雷公炮制药性论》记载其入心、肝、肺三经，善养血活血，《神农本草经》曰：当归主咳逆上气；生地黄甘寒质润，《雷公炮制药性论》记载其入心、肝、脾、肺四经，既入营血分，清热凉血，又可养阴生津润燥，协助化痰。臣药黄芪，味甘，微温，归脾、肺经，补益肺脾之气，补气以行血，气行则血行，加强活血化瘀之功，叶天士在《本草经解》提到：“小儿稚阳也，稚阳为少阳，少阳生气条达，小儿何病之有？黄芪入少阳补生生之元气，所以概主小儿百病也”，同时，肺炎恢复期卫表不固，黄芪可补肺固表。黄芩、黄连为苦寒之品，黄芩入肺经，黄连入心经，可清热解毒，善清上、中二焦之热毒与湿热，合生地清瘀热；陈皮，辛，苦，入脾、肺经，苦辛降气，理气健脾，可用于肺失宜降、咳嗽痰多、气逆等证，合法半夏燥湿化痰以祛痰之源，黄芩黄连合法半夏，辛开苦降，化湿热，清痰热。熟地黄，甘微温，养血滋阴，佐生地，滋阴生津；白术，苦、甘，温，健脾益气，佐黄芪共奏补肺益气、固表护卫之功。川芎能行能散，为血中气药，《日华子本草》谓其治一切气，治一切血；《本草经解》记载其入肝、肺经，与当归相配，加强活血化瘀之功，治气络血络之病。桂枝，其体轻，味辛，甘温，有升无降,能入肺而开宣肺气，温化痰饮；合陈皮、白术，可佐制方中寒凉滋腻之品，防碍脾胃之弊，并可运脾和胃，地龙性善走窜，长于通行经络，清肺平喘，有通络之效，可为引经；炙百部，甘，苦，平，归肺经，可润肺止咳，用于新咳久咳。全方共奏凉血化瘀、益气养阴、化痰之功。本发明的中药组合物，经过实验验证，可以有效改善慢性肺损伤病理改变，改善氧化应激水平、调节IL-6的分泌，具有明显的治疗效果。

附图说明

图1为造模流程图；

图2为HE染色观察各组小鼠肺组织病理学改变(200×，Scale bars＝200μm)；

图3为Masson染色观察各组小鼠肺组织病理学改变(200×，Scale bars＝200μm)；

图4针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物的化学成分LC-MS/MS分析；其中，A为正离子模式的色谱图；B为负离子模式的色谱图。横坐标为代谢物检测的保留时间(Retentiontime，Rt)，纵坐标为离子检测的离子流强度(强度单位为cps，countpersecond)；

图5针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物对慢性肺损伤小鼠肺泡毛细血管屏障的保护作用；其中，A为肺泡灌洗液中蛋白浓度；B为occludin的平均荧光强度统计；C为ZO-1的平均荧光强度统计；D为免疫荧光染色观察occludin的表达；E为免疫荧光染色观察ZO-1的表达；

图6透射电镜观察各组小鼠肺组织微观结构(×11500，Scale bars＝1μm)；

图7免疫荧光双染观察肺泡I型与II型细胞的数量与分布。DAPI染色细胞核(蓝色)，T1a染色AT I细胞(红色)，SP-C染色AT II细胞(绿色)(×200,Scale bars＝200μm)；

图8各组小鼠IL-6、NO和SOD的分泌水平。A为肺泡灌洗液中IL-6、NO和SOD的分泌水平；B为血清中IL-6、NO和SOD的分泌水平(^#p<0.05，^##p<0.01，^###p<0.001与空白对照组相比；^*p<0.05，^**p<0.01与模型组相比)；

图9各组小鼠血液流变学改变(^#p<0.05，^##p<0.01，^###p<0.001与空白对照组相比；^*p<0.05，^**p<0.01与模型组相比)；其中，A为全血粘度低切图；B为全血粘度中切图；C为全血粘度高切图；D为血浆粘度图；

图10潜在分子靶点网络药理学分析；其中，A为慢性肺损伤、肺炎及本发明的中药组合物相关基因维恩分析；B为交集基因复合网络；C为GO富集分析；D为KEGG富集分析；

图11转录组学分析得到差异表达基因结果；其中，A为差异基因分布火山图；B为差异基因聚类分析热图；C为KEGG富集分析；D为GO富集分析；

图12本发明的中药组合物抑制MAPK信号通路相关蛋白磷酸化水平；其中，A为Western blot条带图，B为磷酸化蛋白相对表达统计柱状图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

实施例1一种针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物

药物组成：当归8g，生地黄6g，熟地黄6g，黄芪15g，黄连3g，黄芩8g，陈皮6g，炒白术10g，川芎6g，桂枝10g，法半夏6g，地龙6g，炙百部10g。

制备方法：将上述中药原料溶于纯净水(液量保证浸泡全部中药材)中，煎煮2次，过滤药渣后，获得针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药水煎剂。

具体地，煎煮温度为100℃，前后共煎两次：

第一煎：煮开水沸腾20分钟后倒出药汁，得到第一煎药汁；

第二煎：再加水，煮开水沸腾30分钟后倒出药汁，得到第二煎药汁；

将第一煎药汁和第二煎药汁混合，浓缩至200mL，得到中药水煎剂。

实施例2动物体内药理学实验

1.实验材料

1.1实验动物

90只雄性BALB/c小鼠[北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK(京)2021-0006]，体质量10±2g，3周龄，按照小鼠体质量随机分组，每组15只。

1.2实验仪器

高速冷冻离心机(Centrifuge 5415D)购自德国Eppendorf公司，脱水机(ASP6025)，包埋机(EG1150)，石蜡切片机(RM2255)，烤片机(HI1220)、LBY-N6C全自动血流变仪(北京普利生公司)，Sunrise-Basic酶标仪(瑞士TECAN公司)，c600超灵敏多功能成像仪(美国Azure Biosystems公司)，Tecnai Spirit透射电子显微镜(赛默飞，美国)。

1.3实验药物

LPS(大肠杆菌，血清型O55：B5，L2880-10MG，Sigma)，配制当归六黄汤、本发明的中药组合物的中药材购买自北京中医药大学第三附属医院。Masson三色染色试剂盒(Solarbio公司，货号：G1340)，小鼠IL-6ELISA试剂盒(联科生物公司，货号：EK206/3-96)，总一氧化氮(Nitric Oxide，NO)定量测定试剂盒(北京百智生物有限公司，货号：BCOS007T-96)，总超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)测定试剂盒(WST-1法)(南京建成生物工程研究所，货号：A001-3-2)，SP-C(1μg/ml,rabbit；Abcam,ab90716)，T1α(1:1000,rat；Abcam,ab256559)，IgG H&L(Alexa 488)(1:1000,Goat anti rabbit；Abcam,ab150077)，IgG H&L(Alexa />594)(1:1000,Goat anti rat；Abcam,ab150160)p38MAPK(D13E1)XP抗体(美国CST公司，8690T)，phospho-p38 MAPK(thr180/tyr182)(美国CST公司，4511T)，重组Anti-JNK1+JNK2+JNK3抗体(美国abcam公司，ab179461)，重组Anti-JNK1+JNK2+JNK3(phospho T183+T183+T221)抗体(美国abcam公司，ab124956)，p44/42MAPK(Erk1/2)(137F5)抗体(美国CST公司，4695T)，Phospho-p44/42MAPK(Erk1/2)(美国CST公司，4370T)，PVDF膜(0.45um)(美国Millipore公司，IPVH00010)，Tubulin-Alpha Antibody(中国proteintech公司，66031-1-Ig)，Skim Milk脱脂奶粉(AQ翱擎，AQ62321)，HRP-conjugated Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(羊抗小鼠HRP)，HRP-Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)羊抗兔IgG(HRP)。

2.实验方法

2.1动物造模

LPS是革兰氏阴性菌细胞壁中主要的促炎性糖脂成分，长期暴露于LPS与许多慢性肺部炎症疾病(哮喘，慢性支气管炎和慢性阻塞性肺病)的发生、发展有关。因此，本研究参考Vernooy等模型制备方法，通过长期气管内滴注LPS诱导，模拟机体肺部炎症引起的慢性肺损伤过程，具体步骤如下：

通过腹腔注射戊巴比妥钠(80mg/kg)麻醉小鼠，待小鼠麻醉后，小鼠仰卧位固定于倾斜角度为45°的工作台上，借助强光源小鼠胸腔透光，眼科镊轻柔牵引小鼠舌体与舌根部，暴露咽喉，将22G动静脉留置针的软管经口咽轻柔插入气管，插入约1-1.5cm，软管下端平气管中下段。随后，经软管滴注适量LPS溶液，使用浓度为0.2mg/mL，小鼠体质量每g滴注2μL。随后注入100μl空气，将小鼠保持直立姿势10min，竖直旋转小鼠10圈，以保证LPS充分散布到气管和整个肺组织中。每周造模三次，周一、周三、周五进行造模，持续4周。而正常组小鼠麻醉固定后，经软管滴注相应体积的0.9％氯化钠溶液，其他操作相同。造模流程图参见图3，适应性饲养一周，LPS造模两周后，LPS合并给药治疗两周。

2.2实验分组与给药方式

空白对照组：造模第2周后，每日灌胃相应体积0.9％氯化钠溶液，小鼠体重每10g灌胃0.1mL，持续2周。

模型组：造模第2周后，每日灌胃相应体积0.9％氯化钠溶液，小鼠体重每10g灌胃0.1mL，持续2周。

阿奇霉素组：造模第2周后，每日灌胃相应体积阿奇霉素混悬液，灌胃剂量为4mg/kg，小鼠体重每10g灌胃0.1mL，持续2周。

当归六黄汤组：造模第2周后，每日灌胃相应体积当归六黄汤的水煎剂治疗，小鼠体重每10g灌胃0.1mL，持续2周。

本发明的针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物高、中、低剂量组：造模第2周后，每日灌胃相应体积高剂量(49.32g/kg)、中剂量(24.66g/kg)、低剂量(12.33g/kg)的水煎剂治疗，小鼠体重每10g灌胃0.1mL，持续2周。

2.3样本制备

最后一次造模24h后采集样本。小鼠麻醉后眼球取血1mL，制备抗凝全血及血清备用。暴露小鼠气管，气管插管后，用1mL无菌注射器缓慢注入预冷PBS缓冲液，再缓慢回吸PBS缓冲液，反复3次，抽取支气管肺泡灌洗液(BALF)，4℃条件下1500rpm离心5min，取肺泡灌洗液上清液-20℃保存。取出肺组织，用无菌0.9％氯化钠溶液冲洗，置于4％多聚甲醛溶液中固定。

2.4小鼠肺组织形态学观察

通过HE染色和Masson染色观察肺组织形态学病理改变，手术方式取出小鼠肺组织，4％多聚甲醛固定48h后，肺组织脱水，石蜡包埋，制备5μm石蜡切片后，HE染色，观察小鼠肺组织形态学病理改变。

2.5中药化学成分的超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)分析

将草药浸泡在纯水中30分钟，然后煮沸30分钟，得到第一煎药液。第二煎，向药渣中加入纯水，煮沸后，收集第二次水煎剂，将收集的两次药液进行浓缩至200ml(临床用量)。取水煎剂样本500ul，置2ml EP管中。加入500μl 70％甲醇内标提取液，涡旋15min。4℃，12000rpm/min离心3min。取上清液用微孔滤膜(0.22um)过滤，进行LC-MS/MS试测。色谱质谱采集条件数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱(Ultra Performance LiquidChromatography,UPLC)(SHIMADZU Nexera X2https://wwwshimadzucomcn/)和串联质谱(Tandemmass spectrometrv，MS/MS)(Applied Biosystems6500 OTRAP，http://wwwappliedbiosystems.comcn/)。

液相条件主要包括：色谱柱:AgilentSB-C1818um，2.1mm*100mm；流动相:A相为超纯水(加入0.1％的甲酸)，B相为乙腈(加入0.1％的甲酸)；洗脱梯度:0.00min B相比例为5％，9.00min内B相比例线性增加到95％，并维持在95％1min，10.00-11.10min，B相比例降为5％，并以5％平衡至14min；流速0.35ml/min；柱温40℃；进样量2μl。

质谱条件主要包括：电喷雾离子源(electrosprayionization，ESL温度500°℃:离子喷雾电压(IS)5500V(正离子模式)/-4500V(负离子模式)；离子源气体I(GSI)，气体II(GSII)和气帘气(CUR)分别设置为50、60和25psi，碰撞诱导电离参数设置为高。在QQQ和LIT模式下分别用10和100μmol/L聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准。QQQ扫描使用MRM模式，并将碰撞气体(氮气)设置为中等。通过进一步的去簇电压(declusteringpotential，DP)和碰撞能(collisionenergy，CE)优化，完成了各个MRM离子对的DP和CE。根据每个时期内洗脱的代谢物，在每个时期监测一组特定的MRM离子对。

代谢物定性与定量原理：基于自建数据库MWDB(metware database)，根据二级谱信息进行物质定性，分析时去除了同位素信号，含K+离子、Na+离子、NH4+离子的重复信号，以及本身是其他更大分子量物质的碎片离子的重复信号。代谢物定量是利用三重四级杆质谱的多反应监测模式(multiple reaction monitoring，MRM)分析完成。

2.6支气管肺泡灌洗液中蛋白浓度检测

充分暴露小鼠咽部气管后，行气管插管，用1ml无菌注射器抽取预冷PBS进行肺组织灌洗，获取BALF，4℃1500rpm条件下离心10min。上清冷冻于-20℃保存，通过蛋白质定量试剂盒BCA法检测BALF蛋白浓度来评价肺损伤程度。

2.7免疫荧光染色

5μm厚的肺组织切片分别用枸橼柠檬酸钠热修复，内源性过氧化物酶阻断，山羊血清孵育后。滴加相应的一抗孵育，4℃过夜。第2天，加入相应二抗孵育。DAPI核复染，激光共聚焦显微镜拍摄观察。

2.8小鼠血液流变学检测

小鼠血液置于抗凝取血管中，通过全自动血流变仪上机检测，分析高、中、低切全血粘度值，血浆粘度等指标。

2.9IL-6、NO和SOD的含量检测

检测BALF与血清中IL-6、NO和SOD的含量，操作过程按照试剂盒说明书进行。

2.10透射电子显微镜观察肺组织微观结构

分离小米粒大小的肺组织，保存于预冷的2.5％戊二醛中，使用0.1M磷酸盐缓冲液冲洗，用1％四氧化锇固定2小时，乙醇梯度脱水后，包埋切片，3％乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色，通过透射电子显微镜进行观察。

2.11网络药理学分析

通过UPLC-MS/MS鉴定本发明针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物的化学成分，在TCMSP数据库(http：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)中，设定筛选条件口服生物利用度(OB)≥0.25，药物相似度(DL)≥0.18，对其化学成分进行筛选，并通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获得SMILE结构化学式，导入SwissTargetPrediction数据库(STP，http://www.swisstargetprediction.ch/)，去除重复部分，建立化学成分的潜在靶点数据库。

在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)以“肺炎”与“慢性肺损伤”为关键词搜索，其中包含有关所有注释和预测的人类基因的详细信息。将本发明的针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物成分潜在靶点与“肺炎”和“慢性肺损伤”对比分析，通过生物信息学(http://www.bioinformatics.com.cn/)平台绘制潜在靶点与疾病共同基因目标数的维恩图。

使用DAVID V6.8数据库进行基因本体(GO)富集和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析。DAVID数据库整合了多种类型的数据库资源，可对特定基因集进行富集分析，针对潜在靶点基因，本发明使用GO分析通过三个模块来注释基因功能：生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞成分(CC)。并进行通路富集分析，以预测潜在生物学功能和分子途径。

2.12转录组学测序分析

提取小鼠肺组织总RNA。RNA沉淀用1mL 75％乙醇洗涤两次，然后将混合物以4℃，13600rpm离心3分钟，收集残余乙醇，然后将颗粒在生物安全柜中风干5-10分钟。最后加入25μL～100μL经焦碳酸二乙酯处理的水溶解RNA。随后，使用Nano Drop和安捷伦2100生物分析仪对总RNA进行定性和定量分析。构建基因文库的构建，消化总RNA中的双链和单链DNA，纯化磁珠以回收反应产物，核糖核酸酶H去除rRNA。从纯化的mRNA中产生cDNA并通过PCR扩增。PCR产物通过夹板寡核苷酸序列加热、变性和环化。将单链环状DNA格式化为最终文库，并用phi29进行扩增，制成DNA纳米球，并将其加载到图案化纳米阵列中。在深圳华大基因BGISEQ500平台上生成单端100碱基读数，并由Dr.Tom平台分析数据。物种名：Mus_musculus，来源：NCBI，参考基因组版本：GCF_000001635.27_GRCm39。

表达差异显著性Qvalue<0.05为标准，筛选出差异表达基因，从GeneCards数据库获取肺炎与慢性肺损伤基因，通过维恩图分析比较转录组学差异表达基因与肺炎、慢性肺损伤的交集基因，将所有交集基因进行GO和KEGG富集分析，同时使用R软件中的phyper函数进行富集分析，计算Pvalue，然后对Pvalue进行FDR校正得到Qvalue，Qvalue≤0.05的功能视为显著富集，并绘制相关GO和KEGG条目柱状图。

2.13Western blot

取肺组织称重，用含10％蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂的裂解液匀浆，提取总蛋白。BCA试剂盒检测蛋白浓度。蛋白样品进行热变性、电泳并转移到硝酸纤维素滤膜上。然后，将5％的脱脂奶粉阻断后，进行一抗孵育4℃过夜。第2天洗膜，与HRP标记的二抗孵育1h。采用super ECL Plus超敏化学发光溶液滴膜显影，超敏多功能成像仪检测蛋白条带。

2.14统计学处理

计量数据以均数±标准差表示。正态性检验用Shapiro-Wilk法，方差齐性分析采用Levene检验。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，在进行多重比较时采用Bonferroni法，当数据总体分布非正态时，采用Mann-Whitney U检验。用GraphPad Prism 9.0，SPSS26.0进行统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。

3.结果

3.1本发明的针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物能够改善慢性肺损伤小鼠模型肺组织形态病理学改变

参见图1，通过HE染色观察各组小鼠肺组织病理学改变，发现与空白对照组相比，模型组小鼠气管管壁及周围间质充血，肺泡、肺泡囊、肺泡隔等结构破坏，肺泡间隔增厚，周围炎性细胞浸润明显，肺泡及细支气管内皮细胞完整性破坏，胶原纤维沉积增多，呈弥漫性分布，符合肺炎造成的肺损伤病理表现。与模型组相比，当归六黄汤组小鼠肺组织损伤改善不明显；而本发明的中药组合物组小鼠肺泡结构相对完整，炎性细胞浸润减少，表明本发明的针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物能够有效改善慢性肺损伤病理改变。

3.2针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物改善慢性肺损伤小鼠模型肺组织纤维化病理改变

参见图2，通过Masson染色观察各组小鼠肺纤维化的病理改变，与空白对照组相比，模型组小鼠蓝色胶原纤维沉积增多，肺泡及细支气管内皮细胞完整性破坏，胶原纤维沉积呈弥漫性分布；与模型组相比，当归六黄汤组肺纤维化改善不明显，仍存在较多胶原纤维沉积；而本发明的针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物组小鼠肺泡炎性浸润、胶原纤维沉积减轻，可明显改善肺组织纤维化程度。

以上结果表明，本发明的针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物可改善慢性肺损伤小鼠模型的病理改变。因此，采用本发明的针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物深入进行高、中、低剂量分子机制研究。

3.3针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物的化学成分分析

参见图4，通过超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)技术分析其化学成分，利用软件Analyst 1.6.3处理质谱数据，混样质控QC样本的总离子流图(Total ions current，TIC)即每个时间点质谱图中所有离子的强度加和对时间所作的图，鉴定出397种化合物；通过TCMSP数据库，筛选、优化成分，按照OB≥25％、DL≥0.18的标准对化学成分进行筛选，去除重复部分后，筛选出29种化学成分，见表1。

表1 29种化学成分

3.4针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物调节慢性肺损伤小鼠模型肺泡毛细血管通透屏障

参见图5，肺泡毛细血管通透屏障主要由微血管内皮细胞、肺泡上皮细胞和紧密连接(Tight junctions，TJs)组成，是肺组织气体交换的主要部位，而肺损伤极易破坏该屏障。通过BCA法检测各组小鼠BALF中蛋白含量变化，可评价慢性肺损伤小鼠肺泡毛细血管通透屏障的损伤情况。与空白对照组相比，模型组小鼠BALF中蛋白的浓度均显著增高(P<0.05)，表明其肺泡毛细血管通透屏障破坏，肺内蛋白外渗。与模型组相比，本发明的针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物组BALF中蛋白的浓度显著降低，可保护肺泡毛细血管通透屏障损伤。

TJs是维持肺泡-毛细血管通透屏障的重要组成部分，Occludin和zonulaoccludens protein-1(ZO-1)是紧密连接的关键成分，肺组织中occludin和ZO-1的表达减少可能导致上皮屏障高通透性和肺水肿。通过免疫荧光染色标记肺组织中ZO-1和occludin蛋白观察发现，与空白组相比，模型组小鼠肺组织中occludin和ZO-1蛋白的荧光信号表达显著降低；与模型组相比，针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物组occludin和ZO-1蛋白的表达显著上调，表明本发明的中药组合物可保护慢性肺损伤小鼠肺组织紧密连接，从而维持肺泡-毛细血管通透屏障。

3.5针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物调节慢性肺损伤小鼠模型肺组织超微结构

参见图6，通过投射电镜观察各组小鼠肺组织超微结构。空白组小鼠肺组织形态较规则，边缘清晰，细胞胞核较大，呈圆形，内质网未见扩大，线粒体嵴清晰，可见轻微扩张。与空白组相比，模型组细胞核和线粒体结构破坏，线粒体肿胀，嵴减少，板层小体形态受损，数量减少，可见多个空泡结构，上皮细胞间TJs增宽。针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物组中，肺组织超微结构可见上皮细胞形态、排列规律，呈扁平状，线粒体肿胀减轻，空泡减少。

3.6针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物调节慢性肺损伤小鼠模型肺组织肺泡上皮细胞

参见图7，肺泡上皮细胞对肺泡-毛细血管通透屏障具有重要保护作用，肺泡上皮细胞可分为AT I与AT II型细胞。AT II细胞分化为AT I细胞对于在肺损伤后修复过程中恢复正常的肺泡结构、屏障完整性和气体交换至关重要。通过免疫荧光双染标记AT I与AT II细胞，结果发现空白组小鼠肺泡结构正常。AT I细胞和AT II细胞均匀分布在肺泡周围。而模型组AT I细胞异常增殖，肺泡结构破坏，肺泡隔明显增厚，AT II.细胞数量显著减少，慢性肺损伤小鼠肺泡上皮细胞存在异常修复。与模型组相比，本发明的针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物组小鼠肺组织中AT I细胞异常增殖减少，肺泡结构较完整，肺泡隔增厚减少。

3.7针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物调节慢性肺损伤小鼠模型氧化应激紊乱与炎症

参见图8，模型组小鼠BALF中NO和IL-6的含量较空白对照组显著增高(P<0.001)，SOD的含量显著降低(P<0.01)。与模型组相比，针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物组BALF中SOD和IL-6的含量显著降低(P<0.05)，其中以低剂量组疗效最优，血清中以上指标的趋势与BALF中一致，以上结果表明，针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物可调节慢性肺损伤小鼠氧化应激失衡与过度炎症反应，

3.8针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物调节慢性肺损伤小鼠模型氧化应激紊乱与炎症

参见图9，肺泡毛细血管通透屏障损伤，部分炎症因子可能进入气血循环，引起血液流变学异常改变。因此，进一步观察了慢性肺损伤小鼠血液流变学变化。研究发现与空白对照组相比，模型组小鼠全血粘度(低、中、高切)和血浆粘度均显著增高(P<0.05)，表明其血液粘滞性增高，符合中医证候“瘀”的特质。而与模型组相比，当本发明的针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物不同剂量组小鼠上述指标有显著改善，低剂量组改善最显著(P<0.05)。

3.9网络药理学分析针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物的潜在分子机制

参见图10，本研究通过UPLC-MS/MS鉴定针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物水煎剂中的化学成分，基于TCMSP数据库OB≥25％和DL≥0.18的条件筛选得到可能被机体吸收利用的29化学成分，进一步通过SwissTargetPrediction数据库预测这些化学成分的潜在生物学靶点共466个，并与“肺炎”和“慢性肺损伤”疾病相关基因进行维恩(Venn)分析，得到三者全部交集基因389个，使用Cytoscape软件(v3.7.2)构建复合靶网络，将本发明针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物的潜在作用机制可视化，包括420个节点和1312个边。

通过David平台进行GO和KEGG通路富集分析，GO富集分析表明，可能影响Lipidmetabolism、Biological rhythms和Host-virus interaction等生物过程(BP)，Cellmembrane、Membrane、Cytoplasm和Cell junction等细胞成分(CC)，Kinase、Serine/threonine-protein kinase和Tyrosine-protein kinase等分子功能(MF)。KEGG分析表明，相关通路涉及Pathways in cancer、Neuroactive ligand-receptor interaction、PI3K-Akt signaling pathway和MAPK signaling pathway等。

3.10转录组学分析针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物干预慢性肺损伤小鼠的差异基因

参见图11，根据药理学结果，选取模型组和针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物的低剂量组肺组织进行转录组学测序。筛选出64个差异基因，其中上调基因26个，下调基因38个。构建差异基因的聚类分析热图和火山图，并对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析。GO结果显示，在BP方面，差异表达基因主要富集protein peptidyl-prolylisomerization,response to bacterium,cellular component organization,andnegative regulation of toll-like receptor 4signaling pathway等；CC方面富集在extracellular space,external side of plasma membrane,and MHC class I proteincomplex等；MF方面富集在MHC class Iprotein binding identical protein bindingTAP2 binding等。KEGG富集结果显示，针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物影响Rap1 pathway,MAPK pathway,and Lipid and atherosclerosis等信号通路。有趣的是，网络药理学KEGG分析也预测MAPK通路是潜在分子靶点。

3.11针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物通过抑制MAPK信号通路改善慢性肺损伤

参见图12，对比分析网络药理学预测靶点与转录组测序的结果发现，MAPK信号通路是针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物可能发挥治疗作用的重要信号通路。通过Western blot实验进行通路蛋白验证，与空白对照组相比，模型组中p38、ERK和JNK的磷酸化水平均显著增加(P<0.05)；与模型组相比，针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物低剂量组p38和JNK磷酸化水平显著降低(P<0.05)，这与RNA-seq和网络药理学预测的结果一致，提示针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物通过抑制p38 MAPK和JNK信号抑制炎症反应、凋亡与过度增殖，从而改善慢性肺损伤。

综上所述，本发明经药理试验发现，本发明公开的针对儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物通过调控MAPK信号通路，调节炎性细胞因子过度释放与氧化应激失衡，修复肺泡毛细血管通透屏障，从而改善慢性肺损伤病理改变。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种治疗儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物，其特征在于，原料药按质量份组成如下：当归6~10份，生地黄5~8份，熟地黄5~8份，黄芪10~20份，黄连2~5份，黄芩6~10份，陈皮5~8份，炒白术8~15份，川芎5~8份，桂枝8~15份，法半夏5~8份，地龙5~8份，炙百部8~15份。

2.根据权利要求1所述的治疗儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物，其特征在于，原料药按质量份组成如下：当归8份，生地黄6份，熟地黄6份，黄芪15份，黄连3份，黄芩8份，陈皮6份，炒白术10份，川芎6份，桂枝10份，法半夏6份，地龙6份，炙百部10份。

3.根据权利要求1所述的治疗儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物，其特征在于，原料药按质量份组成如下：当归6份，生地黄6份，熟地黄5份，黄芪12份，黄连2份，黄芩6份，陈皮8份，炒白术12份，川芎8份，桂枝12份，法半夏5份，地龙8份，炙百部12份。

4.根据权利要求1所述的治疗儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物，其特征在于，原料药按质量份组成如下：当归10份，生地黄8份，熟地黄5份，黄芪10份，黄连5份，黄芩10份，陈皮6份，炒白术8份，川芎5份，桂枝8份，法半夏8份，地龙8份，炙百部15份。

5.根据权利要求1~4中任意一项所述的治疗儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物，其特征在于，添加辅料制成口服制剂。

6.根据权利要求5所述的治疗儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物，其特征在于，所述的口服制剂为片剂、散剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或水煎剂。

7.根据权利要求5所述的治疗儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药组合物，其特征在于，所述的辅料包括稳定剂、增溶剂、润滑剂或崩解剂中的一种或几种。

8.一种治疗儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药水煎剂，其特征在于，水煎剂是将权利要求1~4中任意一项所述的中药组合物的原料药加入纯净水，液量保证浸泡全部中药材，煎煮2次，过滤药渣，合并滤液，制得中药水煎剂。

9.根据权利要求8所述的治疗儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的中药水煎剂，其特征在于，浸泡完成后进行煎煮，煎煮温度为100℃，前后共煎两次：

第一煎：煮开水沸腾20分钟后倒出药汁，得到第一煎药汁；

第二煎：再加水，煮开水沸腾30分钟后倒出药汁，得到第二煎药汁；

将第一煎药汁和第二煎药汁混合，浓缩得到中药水煎剂。

10.权利要求1~4中任意一项所述的中药组合物在制备治疗儿童肺炎恢复期慢性肺损伤的药物中的应用，其特征在于，所述的药物为改善慢性肺损伤肺组织病理改变的药物。