CN115667362A

CN115667362A - 用于从富含pha的细菌生物质中分离pha的方法

Info

Publication number: CN115667362A
Application number: CN202180036122.4A
Authority: CN
Inventors: A·费雷尔乌加尔德; P·艾莫马尔多纳多
Original assignee: Venturo Biotechnology
Current assignee: Venturo Biotechnology
Priority date: 2020-05-18
Filing date: 2021-05-18
Publication date: 2023-01-31
Also published as: ES2982064T3; US20230131006A1; US11834552B2; EP4153654B1; EP4153654A1; EP4153654C0; WO2021233935A1

Abstract

本发明涉及一种用于从富含PHA的细菌生物质中分离聚羟基链烷酸酯(PHA)的方法，涉及通过所述方法分离的PHA和涉及具有特定性质的PHA。所述方法包括用最小量的次氯酸钠处理富含PHA的细菌生物质的水性悬浮液，甲醇洗涤和用碳酸二甲酯(DMC)从生物质中提取PHA。

Description

用于从富含PHA的细菌生物质中分离PHA的方法

技术领域

本发明涉及一种用于从富含PHA的细菌生物质中分离聚羟基链烷酸酯(PHA)的方法，涉及通过所述方法分离的PHA和涉及具有特定性质的PHA。

技术现状

聚羟基链烷酸酯(PHA)是包括聚羟基丁酸酯(PHB)、聚羟基戊酸酯(PHV)和聚羟基己酸酯(PHH)以及诸如聚(羟基丁酸酯-共-羟基戊酸酯)(PHBV)的这些共聚物的生物聚酯。

从环境的观点来看，PHA具有益处，因为它们可由可再生的碳源获得，并且它们是有很多功能的聚合物，其可用作用于众多应用的石油基塑料的替代品。

PHA的另外价值是它们可以通过从例如工业来源(诸如食品工业的废物流)或城市来源(诸如固体城市废物或污水污泥)获得的有机废料的微生物发酵产生，有助于残余物减少。这样的PHA生产的实例已经在例如WO2016/081902A1和WO2019/119157A1中描述，其描述从有机废物中生产聚羟基链烷酸酯(PHA)的方法。

此外，PHA是生物可降解的和生物相容的。

因此，PHA由于它们的附加环境和生物医学益处是非常有吸引力的。

PHA生产的挑战之一是从产生它们的生物质中回收。从细菌生物质中提取PHA的方法已经在例如WO97/07229中描述，其描述用于从包含PHA的生物质中分离聚羟基链烷酸酯(PHA)的方法，所述方法包括：(a)用PHA溶剂和PHA的边缘非溶剂处理所述生物质；(b)除去任何不溶性生物质，从而留下PHA和PHA的边缘非溶剂的溶液；和(c)从溶液中除去PHA溶剂，从而产生沉淀的PHA在PHA的边缘非溶剂中的悬浮液。US10,188,773描述通过在溶剂提取之前洗涤P4HB生物质，并从溶液中沉淀P4HB制备的具有高纯度的聚-4-羟基丁酸酯(P4HB)的组合物。相同的溶剂优选用于洗涤P4HB生物质，并作为非溶剂从P4HB溶剂溶液中沉淀聚合物。EP3152246B1描述从通过产生聚羟基链烷酸酯的微生物发酵的生物质和/或从含有至少一种产生聚羟基链烷酸酯的作物-植物的生物质中分离聚羟基链烷酸酯(PHA)的方法，其中通过用基于氯代烃的提取剂从生物质中提取来分离聚羟基链烷酸酯，接着从由此获得的提取溶液中分离提取物，随后聚羟基链烷酸酯从提取物中沉淀。

然而，这样的方法具有一些缺点，例如从环境角度来看，不期望的卤化溶剂的使用，使用用于除去它们的可能需要大量能耗的其它溶剂，或者使用难以回收PHA的溶剂的组合。

发明描述

本发明的第一方面涉及一种用于从富含PHA的细菌生物质中分离聚羟基链烷酸酯(PHA)的方法，所述方法包括：

a)用足以溶解所述富含PHA的细菌生物质的最小量的次氯酸钠处理所述富含PHA的细菌生物质的水性悬浮液，以提供在水相中的富含PHA的生物质溶解产物，

b)从所述水相中分离富含PHA的生物质溶解产物，

c)用水洗涤所述富含PHA的生物质溶解产物，

d)从所述富含PHA的生物质溶解产物中除去水以提供具有小于70％重量/重量的含水量的富含PHA的生物质饼，

e)用甲醇洗涤所述富含PHA的生物质饼以提供具有小于5％重量/重量的含水量的富含PHA的生物质饼，

f)任选地干燥在步骤e)中洗涤的富含PHA的生物质饼以提供干燥的富含PHA的生物质，

g)将任选地干燥的富含PHA的生物质与碳酸二甲酯(DMC)混合，以提供富含PHA的生物质在DMC中的悬浮液，

h)在剧烈搅拌下、在70至90℃的温度下加热在步骤g)中获得的悬浮液1-3小时，以提供细胞碎片和富含PHA的DMC的悬浮液，

i)将所述富含PHA的DMC与所述细胞碎片分离，

j)浓缩所述富含PHA的DMC以提供PHA-DMC浓缩物，

k)将-20℃至0℃的温度下的冷的非溶剂添加至所述PHA-DMC浓缩物中并混合，以提供PHA沉淀物在DMC和非溶剂中的悬浮液，

l)从所述DMC和非溶剂中分离所述PHA沉淀物，

m)用冷的非溶剂洗涤在步骤l)中分离的所述PHA沉淀物，

n)干燥在步骤m)中洗涤的所述PHA沉淀物以提供从所述富含PHA的细菌生物质中分离的PHA。

本发明的另一方面涉及通过如本文所述的方法可获得的PHA。

本发明的另一方面涉及一种PHA，其包含聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)共聚物，并且具有高于95％的纯度、200-500kDa的重均分子量(Mw)、100-200kDa的数均分子量(Mn)和2-2.5的多分散指数(PI)。

附图简述

为了完成描述并且为了提供对本发明的更好理解，提供一组附图。所述附图形成说明书的必要部分并图示本发明的实施方案，其不应被解释为限制本发明的范围。附图包括以下图：

图1：显示如本文所述的方法的图。

图2：实施例1的分离的PHA的¹H-NMR。

图3：实施例1的分离的PHA的GPC分析和TGA：A)色谱图和B)分布图；C)TGA。

发明详述

在如本文所述的方法中，从富含PHA的细菌生物质中分离聚羟基链烷酸酯(PHA)。所述方法包括用最小量的次氯酸钠处理富含PHA的细菌生物质的水性悬浮液，甲醇洗涤和用碳酸二甲酯(DMC)从生物质中提取PHA。这样的处理通常在温和条件(如室温或低温)下进行，这有利地确保所提取的PHA的质量。

所述方法包括在室温下用足以溶解富含PHA的细菌生物质的最小量的次氯酸钠处理富含PHA的细菌生物质的水性悬浮液(步骤a)。

富含PHA的细菌生物质的水性悬浮液可以优选通过在用于内源性细菌生长以提供发酵的进料和用于由产生PHA的细菌从所述发酵的进料产生PHA的条件下发酵有机废物而获得，所述产生PHA的细菌可以优选也是内源性的。有机废物可以优选选自工业或城市的废物流，例如食品工业或农业，特别是肉类加工工业、乳业或污水污泥流的废物流。这样的条件通常可以包括有机废物预处理、有机废物发酵、有机废物均匀化(adequation)、(内源性)PHA产生细菌的生长和PHA在细菌中的积累。通常，这样的发酵可以优选包括所述有机废物的预处理(例如通过用物理或化学方法消化有机废物)。

在几个实施方案中，有机废物可以在VE-BOX中加工，VE-BOX是由VEnvirotechBiotechnology设计的用于废物发酵和PHA内源性细菌生产的便携式技术，用以获得发酵的进料并通过所述内源性细菌进一步产生PHA以提供富含PHA的细菌生物质的水性悬浮液。

在几个实施方案中，富含PHA的细菌生物质的水性悬浮液包含选自富含PHA的革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的细菌与未发酵的有机废物在水中的混合培养物。特别地，相对于革兰氏阳性细菌，混合培养物可以具有更高比例的革兰氏阴性细菌。存在于在如本文所述的富含PHA的细菌生物质中的混合培养物的PHA产生细菌的实例包括杆菌和球菌，主要是假单胞菌属菌种(Pseudomonas s.p.)、丛毛单胞菌属菌种(Comamonas s.p.)或副球菌属菌种(Paracoccus s.p.)。

存在于如本文定义的富含PHA的细菌生物质的水性悬浮液中的未发酵的有机废物是指例如在有机废物发酵之后可能存在，但是在发酵或PHA产生过程中没有被消耗的悬浮液中的任何元素。可以存在于富含PHA的细菌生物质的水性悬浮液中的其它元素包括例如最初存在于有机废物中并且例如在有机废物预处理或有机废物均匀化期间没有被消除的无机元素。

富含PHA的细菌生物质的水性悬浮液，特别是通过发酵如本文所述的有机废物获得的富含PHA的细菌生物质的水性悬浮液可以具有7.5-15g/L、特别是8-12g/L、更特别是9-11g/L、还更特别是约10g/L的基于每升水性悬浮液中富含PHA的细菌生物质的固体含量的浓度。

如上所显示的，用足以溶解富含PHA的细菌生物质的最小量的次氯酸钠处理富含PHA的细菌生物质的水性悬浮液。使用次氯酸钠以杀死细菌，因此它们不消耗产生的PHA，所述消耗将不利地降低PHA生产收率，但是为了避免损坏PHA，使用的量应该是最小的，未达到细菌的完全消化，因为已经发现大量的次氯酸钠可以降解并且降低所产生的PHA的分子量。通常，基于富含PHA的生物质固体含量的每克富含PHA的生物质，可以用0.01至0.5克的量的次氯酸钠处理富含PHA的生物质。在几个实施方案中，基于富含PHA的生物质固体含量的每克富含PHA的生物质可以使用0.03至0.04克。在其它实施方案中，基于富含PHA的生物质固体含量的每克富含PHA的生物质可以使用0.05-0.45克次氯酸钠，更特别地，基于富含PHA的生物质固体含量的每克富含PHA的生物质可以使用0.1-0.2克次氯酸钠。例如，基于每100mL水性溶液中的次氯酸钠的克数，次氯酸钠可以以10-20％重量/体积的水性溶液、特别是12-18％重量/体积的溶液和更特别是约15％重量/体积的溶液的形式使用。基于富含PHA的生物质固体含量的每克富含PHA的细菌生物质，次氯酸钠水性溶液可以以0.1-3mL的量添加到富含PHA的细菌生物质的水性悬浮液中。在几个实施方案中，基于富含PHA的生物质固体含量的每克富含PHA的细菌生物质使用0.1-0.4mL的所述次氯酸钠水性溶液，特别是使用0.13-0.3mL，特别是使用0.15-0.25mL，优选使用约0.2mL的约15％重量/体积的次氯酸钠溶液。在其它实施方案中，基于富含PHA的生物质固体含量的每克富含PHA的细菌生物质可以使用0.5-3mL的次氯酸钠水性溶液，特别是可以使用0.75-2mL，更特别是可以使用约1mL的例如约15％重量/体积的次氯酸钠溶液。

作为具有10g/L基于富含PHA的细菌生物质的固体含量的浓度的1L富含PHA的细菌生物质的水性悬浮液的实例模式，2mL至12mL，特别是5mL至10mL的15％重量/体积次氯酸钠水性溶液可以足以溶解富含PHA的细菌生物质。

富含PHA的细菌生物质的浓度可以通过本领域已知的方法估算。例如，包含在已知体积的液体中的生物质的干量可以通过在105℃的烘箱中在二十四小时期间干燥生物质并测量最终重量确定。干燥的生物质的重量和含有生物质的体积之间的关系提供细菌浓度的估计值。

细菌溶解可以通过本领域已知的方法验证，例如通过用氧饱和20mL处理过的水性悬浮液，并且然后向混合物中供给(例如0.1mL)作为进料的发酵的有机废物，并且在超过5分钟的时间段内测量氧水平。如果氧浓度保持恒定，可以证实细菌是死亡的(由于缺乏氧消耗)，并且已经实现细菌的溶解。

通常，在向富含PHA的细菌生物质的水性悬浮液中添加次氯酸钠后，在例如在室温(18-25℃)下搅拌所得悬浮液15-45分钟、特别是20-40分钟、更特别是约30分钟之后可以实现溶解。已经发现次氯酸钠在如本文所述的方法中特别有效，因为它可以针对生物质和所关注的PHA进行调节以实现对PHA的损坏最小的溶解。

其它细菌细胞溶解的方法，诸如机械处理，诸如珠磨，一般难以逐步升级或仅在使用高浓度的生物质(例如远高于15g/L)时，诸如使用高压匀浆器(HPH)时才很好地起作用。此外，在其它细胞溶解方法中热的使用可能导致损坏PHA产物。

在如本文所述的方法的步骤b)中，将富含PHA的生物质溶解产物从水相中分离。分离可以通过例如在室温下离心进行。离心可以在3000至4000rpm，特别是约3500rpm下进行5至15分钟，并弃去上清液。

在步骤c)中，用水洗涤富含PHA的生物质溶解产物。例如，可以优选以每体积富含PHA的生物质饼5-15体积的水，特别是8-12体积的水，更特别是约10体积的水来洗涤，离心(例如在相同条件下)并弃去上清液。可重复洗涤以确保除去水溶性杂质和NaClO。

在步骤d)中，从富含PHA的生物质溶解产物中除去水以提供具有小于70％重量/重量，特别是小于60％重量/重量和更特别是小于50％重量/重量的含水量的富含PHA的生物质饼。例如，富含PHA的生物质溶解产物可以通过压滤机过滤以提供富含PHA的生物质饼。

在步骤e)中，用甲醇洗涤富含PHA的生物质饼以提供具有小于5％重量/重量，特别是小于3％重量/重量和更特别是小于2％重量/重量的含水量的富含PHA的生物质饼。例如，用甲醇洗涤富含PHA的生物质饼可以通过以下步骤进行：I)基于富含PHA的生物质饼固体含量的每1g富含PHA的生物质，向富含PHA的生物质饼添加1-10mL甲醇，特别是3-7mL甲醇，以及更特别是约5mL甲醇，II)搅拌混合物1-15分钟，特别是3-12分钟，更特别是5-10分钟，III)离心混合物和IV)弃去上清液，并任选地重复步骤I)-IV)。甲醇洗涤可以优选在室温下进行。这样的甲醇洗涤确保大部分水以及诸如脂质的许多有机杂质被除去。

在几个实施方案中，可以通过本领域已知的方法，例如通过蒸馏和从上清液冷凝甲醇，从步骤e)的洗涤中回收甲醇。回收的甲醇可以优选在如本文所述的方法的随后步骤e)和/或随后步骤l)中再利用。

在任选的步骤f)中，将在步骤e)中洗涤的富含PHA的生物质饼干燥以提供干燥的富含PHA的生物质。干燥可以简单地通过例如使富含PHA的生物质饼对大气敞开以使大部分溶剂蒸发，例如持续0.5-3小时，特别是1-2小时来进行。已经发现，使用甲醇，特别是本文所述的少量甲醇，有利地有助于除去水和甲醇本身，而不必使用高耗能步骤来干燥富含PHA的生物质饼，所述使用高耗能步骤来干燥富含PHA的生物质饼从环境角度来看也是不希望的。

在几个实施方案中，在步骤f)中获得的干燥的富含PHA的生物质通常可以具有基于溶剂的总重量和干燥的富含PHA的生物质的总重量的5-15％重量/重量的总溶剂含量，特别是溶剂含量小于10％重量/重量和更优选小于7％重量/重量。总溶剂的量可以通过干燥富含PHA的生物质(如在炉子中)直到达到恒定重量并测定重量差来确定。通常，残余溶剂可以仅为甲醇。

在几个实施方案中，在步骤f)中获得的干燥的富含PHA的生物质可以具有基于甲醇的总重量和干燥的富含PHA的生物质的总重量的小于10％重量/重量的甲醇，特别是小于7％重量/重量的甲醇和更特别是小于5％重量/重量的甲醇。

已经发现，在干燥的富含PHA的生物质中这样少量的残余溶剂有利地有助于随后从生物质中提取PHA。已经发现使用如本文所述的甲醇在提供具有低溶剂含量的干燥的富含PHA的生物质方面特别成功。此外，已经发现任何残余量的甲醇与所选择的用于PHA提取的溶剂碳酸二甲酯(DMC)相容。

然而，步骤f)是完全任选的，并且富含PHA的生物质可以在不进行步骤f)的情况下使用。这样的富含PHA的生物质可以简单地被称为富含PHA的生物质或湿的富含PHA的生物质。湿的富含PHA的生物质可以具有基于溶剂的总重量和富含PHA的生物质的总重量的70-95％重量/重量、特别是75-90％重量/重量和更特别是80-85％重量/重量的总溶剂含量。相应地，湿的富含PHA的生物质可以具有基于固体含量的5-30％，特别是10-25％，更特别是15-20％的富含PHA的生物质。因此，如果不进行任选的干燥步骤f)，在步骤g)中与DMC混合的富含PHA的生物质可以具有基于溶剂和富含PHA的生物质的总重量的70-95％重量/重量，特别是75-90％重量/重量和更特别是80-85％重量/重量的溶剂含量。

在步骤g)中，将任选干燥的富含PHA的生物质与碳酸二甲酯(DMC)混合，以提供富含PHA的生物质在DMC中的悬浮液。通常，5-70mL的DMC可以用于基于富含PHA的生物质固体含量的1g富含PHA的生物质。在几个实施方案中，7.5-12.5mL，特别是约10mL的DMC可以用于基于富含PHA的生物质的干含量的1g富含PHA的生物质。在其它实施方案中，15-65mL可以用于基于富含PHA的生物质固体含量的1g富含PHA的生物质，特别是可以使用30-60mL，更特别是可以使用约50mL。

如果甲醇存在于任选干燥的富含PHA的生物质中，甲醇与DMC(MeOH：DMC)的体积比可以是例如10:0.01至10:0.05，或10:0.02至10:0.05，例如约10:0.05。已经发现，在该范围内的比例在提取收率和经济成本之间提供良好的平衡。

在步骤h)中，将在步骤g)中获得的悬浮液在剧烈搅拌下在70至90℃的温度下加热1-3h，以提供细胞碎片和富含PHA的DMC的悬浮液。加热有利于将PHA提取到DMC，将生物质转化为细胞碎片，并且通过本领域已知的方法进行。

在步骤i)中，将细胞碎片与富含PHA的DMC分离。分离优选通过过滤进行。特别地，过滤优选通过当在步骤h)中获得的悬浮液仍然是热的，特别是在50-90℃的温度下时过滤所述悬浮液进行。已经发现在这些温度下过滤(热过滤)有利于细胞碎片与富含PHA的DMC的分离，并且特别是通过防止其沉淀来避免PHA的损失。较高的温度将有利于DMC的蒸发，并且可能促使PHA破坏。过滤相对于其它类型的分离是有利的，因为它是快速的并且实现悬浮液在仍然是热的时被分离，这不同于例如离心的情况，离心需要许多时间并且悬浮液将冷却，由此PHA可能开始沉淀并且与细胞碎片一起损失。

在几个实施方案中，将在步骤i)中分离的细胞碎片干燥(如在烘箱中)并储存以供以后使用或直接用作微生物发酵中的进料。干燥可以例如在烘箱中进行以除去所有溶剂。例如，干燥的细胞碎片可以用于发酵以提供如上所述的富含PHA的细菌生物质的水性悬浮液。

在步骤j)中，浓缩富含PHA的DMC以提供PHA-DMC浓缩物。浓缩可以通过本领域已知的方法，通过例如蒸发DMC进行。蒸发的DMC可以被回收并在例如如本文所述的方法的随后步骤g)中再利用。

在步骤k)中，将在-20℃至0℃的温度下的冷的非溶剂添加至PHA-DMC浓缩物中并混合以提供PHA沉淀物在DMC和非溶剂中的悬浮液。如本文所用的术语非溶剂是指在其中PHA是不溶的，例如在室温或在低温(如-20℃至0℃)下是不溶的溶剂。

冷的非溶剂的添加诱导PHA沉淀。

非溶剂可以是醇、水性醇或水。非溶剂可以优选地选自水、甲醇或乙醇，特别是可以选自甲醇和/或乙醇或选自水和/或甲醇，并且最优选是甲醇。使用甲醇作为非溶剂有利地促进随后从PHA中除去非溶剂，这都因为甲醇与DMC是可混溶的，并且同时具有低沸点。使用水作为非溶剂可以有利地减少在所述方法中使用的试剂的数量。

冷的非溶剂以每1mL PHA-DMC浓缩物7-3mL，特别是6-4mL，更特别是约5mL的量添加。

在步骤k)中，混合也可在低温下、特别是在-5至5℃的温度下进行。这进一步促进PHA沉淀。

在步骤l)中，从DMC和非溶剂中分离PHA沉淀。例如，可以过滤PHA沉淀物在DMC和非溶剂中的悬浮液。

在步骤m)中，用冷的非溶剂洗涤步骤l)中分离的PHA沉淀。在洗涤中使用的非溶剂优选与在步骤k)中使用的非溶剂相同。可以优选用冷的非溶剂洗涤过滤的沉淀物，每克PHA用1-2mL冷的非溶剂。

在步骤j)、l)和/或m)中，DMC和/或非溶剂可以被回收，并且优选地，当非溶剂是甲醇时，回收的DMC和/或非溶剂在随后的步骤e)、随后的步骤g)、随后的步骤k)和/或随后的步骤m)中再利用。在DMC的情况下，在如本文所述的方法中，可以再利用的DMC的量为DMC的约90％。

优选地，非溶剂是甲醇，并且其中非溶剂是甲醇，并且在步骤e)中、在步骤j)中、在步骤l)和/或在步骤m)中，回收甲醇和/或DMC，并且优选地，回收的甲醇和/或DMC在随后的步骤e)中、随后的步骤g)中、随后的步骤k)中和/或随后的步骤m)中再利用。

在步骤n)中，将在步骤m)中洗涤的PHA沉淀物干燥以提供从富含PHA的细菌生物质中分离的PHA。例如，PHA可以在烘箱中在50-70℃的温度下，特别是在约60℃下干燥。干燥可以进行6-48小时、特别是12-36小时，更特别是约24小时。

分离的PHA具有高回收收率。特别地，基于每个富含PHA的细菌生物质的总固体含量的PHA总重量，PHA回收收率可以是40-80％重量/重量，特别是50-70％重量/重量，更特别是约60％重量/重量。

PHA的化学性质可以通过本领域已知的方法验证，特别是使用质子核磁共振(¹H-NMR)和/或凝胶渗透色谱法(GPC)验证。

在如本文所述的方法中分离的PHA可包含聚羟基丁酸酯(PHB)、聚羟基戊酸酯(PHV)、聚(3-羟甲基戊酸酯)(PHMV)和聚羟基己酸酯(PHH)以及诸如聚(羟基丁酸酯-共-羟基戊酸酯)(PHBV)的这些共聚物。特别地，PHA可通常包含聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)。

特别是当与其它已知的PHA分离方法(例如使用机械和化学消化方法的那些)相比时，在如本文所述的方法中分离的PHA一般可以具有高纯度。特别地，PHA的纯度可以大于90摩尔％，具有小于10摩尔％的脂质残留物含量。特别地，一般实现大于95摩尔％的纯度。

纯度可以通过已知方法，特别是质子核磁共振(¹H-NMR)和/或热重分析(TGA)测定。

¹H-NMR一般可通过将聚合物样品溶解在氘代氯仿(CDCl₃)中在例如250MHz Bruker光谱仪中进行。

TGA可以通过例如Kwang Hahn和Keun Chang在Biotechnology Techniques,Volume 9No.12(Dec.1995)p.873-878中的“AThermogravimetric Analysis for Poly(3-Hydroxybutyrate)Quantification”中所述进行。

在如本文所述的方法中分离的PHA一般可以具有200-500kDa的重均分子量(Mw)、100-200kDa的数均分子量(Mn)和2-2.5的多分散指数(PI)。

Mw和Mn可以通过使用例如配备有一个Agilent PLgel 5μm Guard 50×7.5mm保护柱和两个Agilent PLgel 5μm Mixed-C 300×7.5mm柱的Agilent 1260Infinity II色谱仪的凝胶渗透色谱法(GPC)测定。通过将50mg共聚物溶解在10mL氯仿中，制备具有5mg mL^-1的浓度的PHBV透明溶液。使用100μL的样品注射体积，并且在30℃下进行分析，并且氯仿(作为洗脱剂)的流速设定为1.0mL min^-1。聚合物的平均分子量是基于使用聚苯乙烯标准物来计算的。

PI通过用测定的Mw除以测定的Mn计算(PI＝Mw/Mn)。

在如本文所述的方法中分离的PHA一般可以具有例如通过差示扫描量热法(DSC)测定的150至180℃、特别是155至170℃以及更特别是160-165℃的熔融温度和通过热重分析(TGA)测定的250至280℃、特别是255至270℃、更特别是260至265℃的降解温度。

在本文中，术语“包含(comprises)”及其派生词(诸如“包含(comprising)”等)不应以排除的含义理解，即这些术语不应被解释为排除所描述和定义的内容可以包括另外的要素、步骤等的可能性。

另一方面，本发明显然不限于本文所述的(多个)具体实施方案，而且包括在如权利要求书所定义的本发明的总体范围内可由本领域任何技术人员考虑的任何变型(例如，关于材料、尺寸、组分、构造等的选择)。

本发明通过以下实施例进行举例说明，但并不限于此或由此受限。

实施例1：

在该实施例中，加工10升具有10g/L的估算浓度的生物质(这将意味着100克干燥的生物质的总重量，即固体含量)。为了确保细菌死亡，添加20mL的15％重量/重量的次氯酸钠(NaClO)水性溶液，即2mL NaClO/l生物质。将悬浮液在室温下搅拌30分钟，然后通过用氧饱和处理过的水性悬浮液，然后向混合物中供给(2-3mL)作为进料的发酵的有机废物，并在5分钟的时段内测量氧含量来验证细菌溶解。氧浓度保持恒定，因此证实细菌是死亡的并且已经实现细菌的溶解。

随后将生物质悬浮液在室温下以3500rpm离心10分钟，并弃去上清液。然后，用1L水洗涤生物质并离心两次，始终弃去上清液。以该方式，确保除去大部分NaClO和水溶性杂质。通过压滤机过滤生物质以除去最大量的水，将生物质饼中的含水量降低至小于70％。

之后，通过用最小量的甲醇500mL搅拌生物质10分钟洗涤生物质，并且之后离心，再次弃去上清液。将该操作再重复一次以确保大部分水以及许多有机杂质已被除去。处理结束时的含水量为如通过¹H-NMR测定的低于5％。最后，将生物质于通风橱内对大气敞开放置两小时以使大部分溶剂蒸发。

将预处理的生物质和1000mL碳酸二甲酯装入装有磁力搅拌器的2升圆底烧瓶中，形成悬浮液。将冷凝器连接到烧瓶的颈部以防止溶剂损失，然后使用配备有用于圆底烧瓶的Heat-On块适配器的热板加热混合物。

在剧烈搅拌下用DMC提取的温度为80℃，持续2小时。然后，通过滤纸过滤热混合物，获得含有聚合物的DMC滤液，而保留在过滤器上的沉淀物主要对应于细胞碎片，将其干燥并作为用于发酵细菌的进料储存。然后，将滤液在旋转蒸发器中浓缩至100mL的体积，并回收蒸发的DMC(700-800mL)并保留用于随后的提取循环。

将500mL冷的非溶剂(甲醇或乙醇)添加到DMC浓缩物上以诱导聚合物沉淀，并将所得悬浮液在真空下通过烧结的过滤玻璃过滤。然后将聚合物用冷的非溶剂洗涤两次并置于室温下干燥一小时，同时将母液在旋转蒸发器中浓缩以回收最大量的非溶剂(通常约400mL)，用于连续提取。

最后，将聚合物置于烘箱中在60℃下干燥24小时。回收收率为50％重量/重量。

通过在250MHz Bruker光谱仪中，使用溶解在CDCl₃中的20mg分离的PHA的样品，使用质子核磁共振(¹H-NMR)RMN证实聚合物的结构为P(3HB-共-3HV)的共聚物。分离的PHA的¹H-NMR显示于图2。

分离的PHA具有大于95％的纯度(如通过TGA验证的)，如通过GPC测定的391KDa的Mw，164KDa的Mn和2.38的PI。GPC的色谱图和分布图分别作为A)和B)呈现于图3中，以及TGA呈现于图3C)中。

实施例2：

在该实施例中，加工10升具有10g/L的估算浓度的生物质(这将意味着100克干燥的生物质的总重量，固体含量)。为了确保细菌死亡，添加100mL的15％重量/重量的次氯酸钠(NaClO)水性溶液，即10mL NaClO/l生物质。在室温下搅拌悬浮液30分钟，然后通过用氧饱和处理过的水性悬浮液，然后向混合物中供给(2-3mL)作为进料的发酵的有机废物，并在5分钟的时段内测量氧含量来验证细菌溶解。氧浓度保持恒定，因此证实细菌是死亡的并且已经实现细菌的溶解。

之后，通过用最小量的甲醇500mL搅拌生物质10分钟洗涤生物质，并之后离心，再次弃去上清液。将该操作再重复一次以确保大部分水以及许多有机杂质已被除去。处理结束时的含水量如通过¹H-NMR测定的低于5％。生物质的总溶剂含量为85-80％重量/重量。

在剧烈搅拌下用DMC提取的温度为90℃，持续1小时。然后，通过滤纸过滤热混合物，获得含有聚合物的DMC滤液，而保留在过滤器上的沉淀物主要对应于细胞碎片，将其干燥并作为用于发酵细菌的进料储存。然后，将滤液在旋转蒸发器中浓缩至100mL的体积，并回收蒸发的DMC(700-800mL)并保留用于随后的提取循环。

将500mL冷的非溶剂(甲醇)添加到DMC浓缩物上以诱导聚合物沉淀，并将所得悬浮液在真空下通过烧结的过滤玻璃过滤。然后将聚合物用冷的非溶剂洗涤两次，并置于室温下干燥一小时，同时将母液在旋转蒸发器中浓缩以回收最大量的非溶剂(通常约400mL)，用于连续提取。

最后，将聚合物置于烘箱中在60℃下干燥24小时。回收产率为50％重量/重量。

通过在250MHz Bruker光谱仪中，使用溶解在CDCl₃中的20mg分离的PHA的样品，使用质子核磁共振(¹H-NMR)RMN证实聚合物的结构为P(3HB-共-3HV)的共聚物。分离的PHA的¹H-NMR未显示。

分离的PHA具有大于95％的纯度(如通过TGA验证的)，如通过GPC测定的391KDa的Mw，164KDa的Mn和2.38的PI。

Claims

1.一种用于从富含PHA的细菌生物质中分离聚羟基链烷酸酯(PHA)的方法，所述方法包括：

a)在室温下用足以溶解所述富含PHA的细菌生物质的最小量的次氯酸钠处理所述富含PHA的细菌生物质的水性悬浮液，以提供在水相中的富含PHA的生物质溶解产物，

b)从所述水相中分离富含PHA的生物质溶解产物，

c)用水洗涤所述富含PHA的生物质溶解产物，

i)将所述细胞碎片与所述富含PHA的DMC分离，

j)浓缩所述富含PHA的DMC以提供PHA-DMC浓缩物，

k)将在-20℃至0℃的温度下的冷的非溶剂添加至所述PHA-DMC浓缩物中并混合，以提供PHA沉淀物在DMC和非溶剂中的悬浮液，

l)从所述DMC和非溶剂中分离所述PHA沉淀物，

m)用冷的非溶剂洗涤在步骤l)中分离的所述PHA沉淀物，

2.权利要求1所述的方法，其中所述富含PHA的细菌生物质的水性悬浮液通过处理选自食品工业或农业，特别是肉类加工工业、乳业或污水污泥的废物流的有机废物，通过使所述有机废物经受用于内源性细菌生长以提供发酵的进料和用于通过内源性产生PHA的细菌从所述发酵的进料产生PHA以提供富含PHA的细菌生物质的水性悬浮液的条件而获得，所述富含PHA的细菌生物质的水性悬浮液优选具有7.5-15g/L，特别是8-12g/L，更特别是9-11g/L，还更特别是约10g/L的基于每升水性悬浮液中富含PHA的细菌生物质的固体含量的富含PHA的细菌生物质浓度。

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述富含PHA的细菌生物质的水性悬浮液包含选自富含PHA的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的细菌与未发酵的有机废物在水中的混合培养物。

4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在步骤a)中，用基于富含PHA的生物质固体含量的每克富含PHA的生物质0.03至0.04克的量的次氯酸钠处理所述富含PHA的生物质。

5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在步骤a)中，以每100mL水性溶液基于次氯酸钠的克数10-20％重量/体积的水性溶液、特别是12-18％重量/体积的溶液和更特别是约15％重量/体积的溶液的形式使用次氯酸钠。

6.权利要求5所述的方法，其中在步骤a)中，基于富含PHA的细菌生物质固体含量的每克富含PHA的细菌生物质使用0.1-3mL次氯酸钠溶液。

7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中在步骤e)中，用甲醇洗涤富含PHA的生物质饼通过以下步骤进行：I)基于富含PHA的生物质固体含量的每1g富含PHA的生物质，向富含PHA的生物质饼添加1-10mL甲醇，特别是3-7mL甲醇和更特别是约5mL甲醇，II)搅拌混合物1-15分钟，特别是3-12分钟，更特别是5-10分钟，III)离心混合物和IV)弃去上清液，和任选地重复步骤I)-IV)。

8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中进行步骤f)，并且在步骤f)中获得的干燥的富含PHA的生物质具有基于溶剂的总重量和干燥的富含PHA的生物质的总重量的5-15％重量/重量的总溶剂含量，特别地，所述溶剂含量小于10％重量/重量并且更优选小于7％重量/重量。

9.权利要求8所述的方法，其中在步骤f)中获得的干燥的富含PHA的生物质具有基于甲醇的总重量和干燥的富含PHA的生物质的总重量的小于10％重量/重量的甲醇，特别是小于7％重量/重量的甲醇，并且更特别是小于5％重量/重量的甲醇。

10.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中不进行步骤f)，并且在步骤g)中与DMC混合的富含PHA的生物质具有基于溶剂和富含PHA的生物质的总重量的70-95％重量/重量，特别是75-90％重量/重量和更特别是80-85％重量/重量的溶剂含量。

11.权利要求1-10中任一项所述的方法，其中在步骤i)中，通过当在步骤h)中获得的悬浮液仍然是热的，特别是在50-90℃的温度下时过滤所述悬浮液，将细胞碎片与富含PHA的DMC分离。

12.权利要求1-11中任一项所述的方法，其中在步骤k)中，混合在低温下，特别是在-5至5℃的温度下进行。

13.权利要求1-12中任一项所述的方法，其中在步骤k)中，所述非溶剂选自水、甲醇和乙醇，特别是选自甲醇和/或乙醇，或选自水和/或甲醇，并且更特别是甲醇。

14.权利要求1-13中任一项所述的方法，其中在步骤i)中，将分离的细胞碎片干燥并储存以供以后使用或直接用作微生物发酵中的进料，特别是用于获得根据权利要求3所述的富含PHA的细菌生物质的水性悬浮液的发酵中的进料。

15.权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述非溶剂是甲醇，并且其中在步骤e)中、在步骤j)中、在步骤l)和/或在步骤m)中回收甲醇和/或DMC，并且优选地，将回收的甲醇和/或DMC在随后的步骤e)中、随后的步骤g)中、随后的步骤k)中和/或随后的步骤m)中再利用。