CN115643797A

CN115643797A - 包含抗cd47抗体的药物组合物

Info

Publication number: CN115643797A
Application number: CN202180032167.4A
Authority: CN
Inventors: 曹巍; 叶春艳; 王正毅; 郭炳诗
Original assignee: Tianjing Biotechnology Shanghai Co ltd
Current assignee: Tianjing Biotechnology Shanghai Co ltd
Priority date: 2020-04-30
Filing date: 2021-04-29
Publication date: 2023-01-24
Also published as: WO2021219092A1; EP4143239A4; JP2023523977A; WO2021219092A9; EP4143239A1; US20230174649A1

Abstract

本发明提供一种药物组合物，其包含分离的抗CD47抗体或其免疫活性片段、治疗剂以及药学上可接受的载体。与单一物质相比，这些药物组合物通过增强癌细胞的吞噬作用产生协同效果。此外，本发明还提供一种通过给药所述药物组合物来治疗有需要的人受试者的疾病的方法。

Description

包含抗CD47抗体的药物组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年4月30日提交的国际申请PCT/CN2020/088226的优先权，其内容整体援引加入本文。

背景技术

CD47(分化簇47)在20世纪80年代首次确定为人卵巢癌的肿瘤抗原。此后，CD47据发现在多种人肿瘤类型上表达，包括急性髓系白血病(AML)、慢性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、膀胱癌以及其他实体肿瘤。高水平的CD47让癌细胞避免吞噬作用，尽管具有更高水平的钙网蛋白-主要的促吞噬信号。

CD47也称为整联蛋白相关蛋白(IAP)、卵巢癌抗原OA3、Rh-相关抗原和MER6，是一种属于免疫球蛋白(Ig)超家族的多跨的跨膜受体。通过其与信号调节蛋白α(SIRPα)(一种在巨噬细胞上表达的抑制蛋白)的相互作用，CD47引发SIRPα胞质免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)中的酪氨酸磷酸化并招募蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1/SHP-2，进一步介导抑制巨噬细胞吞噬作用的负信号事件。为此，CD47充当“自我(self)”标记和“不要吃我(do not eatme)”信号，防止巨噬细胞吞噬宿主细胞。CD47和SIRPα之间的相互作用在抑制巨噬细胞中起着关键作用。

因此，血细胞，如红细胞、血小板和淋巴细胞，在其表面表达CD47，以保护自身免受脾巨噬细胞的快速清除。然而，CD47在白血病干细胞(LSC)上的表达水平甚至高于相应的正常细胞。人LSC上CD47的高表达水平通过CD47与SIRPα的相互作用抑制其吞噬作用，从而导致发病。越来越多的证据表明，CD47在人实体肿瘤细胞上的表达是这些癌细胞保护自身免受吞噬作用的常见机制，从而使得肿瘤细胞增殖和转移(参见Frontiers in immunology,April 2017,Volume 8,Article 404)。

因此，抗CD47抗体阻断CD47-SIRPα通路可能具有增强癌细胞吞噬摄取的治疗效果。如国际申请号PCT/US2017/057535所公开的，我们提供了结合人CD47的新抗CD47抗体或其免疫活性片段，从而防止人CD47与SIRPα相互作用并促进表达CD47的细胞的巨噬细胞介导的吞噬作用。非常重要的是，这不会导致显著水平的血凝或红细胞耗竭。

与肿瘤细胞上的抗吞噬(不要吃我(don't-eat-me))信号CD47相反，积累的证据表明，细胞表面钙网蛋白据认为是一种“吃我(eat-me)”信号，有助于免疫系统吞噬摄取癌细胞。Clarke和Smyth证实，药物治疗(蒽环类药物)导致肿瘤细胞暴露出表面促吞噬细胞蛋白(prophagocytic protein)，钙网蛋白，其诱导免疫原性细胞死亡(参见NatureBiotechnology.2007；25(2):192–193)。因此钙网蛋白介导的免疫机制可能是开发新的抗癌治疗的重要策略。

治疗性单克隆抗体已证明在癌症治疗中具有重要的临床意义，但在操作和促进肿瘤细胞的吞噬作用方面仍有相当大的需求。本发明满足这些和其他需求。

发明内容

本发明提供用于治疗疾病的方法和药物组合物。在这种药物组合物中，一种重要组分是新的CD47抗体(公开于PCT/US2017/057535)，其阻断细胞表面上的CD47并防止CD47与SIRPα之间的相互作用。另一种重要组分是第二治疗剂，其可以是小分子治疗剂，用于增加钙网蛋白的表达水平和/或抑制CD47的表达水平，或者是具有协同效果的大分子(例如，第二抗体，如CD20抗体)。在一些实施方案中，所述药物组合物包含三种重要组分，即，新的CD47抗体、小分子治疗剂和具有协同效果的第二抗体(如CD20抗体)。与任何单一的物质相比，所述药物组合物具有协同效果以促进癌细胞的吞噬作用。所述物质的组合特别地用于治疗癌症、纤维化疾病、与吞噬作用抑制相关的疾病或与血小板凝集相关的疾病。

在一些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含新的CD47抗体或其免疫活性片段、治疗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂，其中分离的抗体或其免疫活性片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)具有与选自以下的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ IDNO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ IDNO:79和SEQ ID NO:81，所述轻链可变区(VL)具有与选自以下的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:82。

在另一些实施方案中，所述分离的抗体或其免疫活性片段包含VH/VL对，其中所述VH/VL对包含VH和VL链序列，其分别与选自以下的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2(即1A1)、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4(即1F8)、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6(即2A11)、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8(即2C2)、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10(即2D7)、SEQID NO:11和SEQ ID NO:12(即2G4)、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14(即2G11)、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16(即6F4)、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18(即5H1)、SEQ ID NO:19和SEQ IDNO:20(即5F6)、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22(即1F3)、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24(即2A4)、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26(即2B12)、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28(即13A11)、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30(即15E1)、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32(即13H3)、SEQ IDNO:33和SEQ ID NO:34(即14A8)、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36(即16H3)、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38(即1A1)、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40(即1A1-A)、SEQ ID NO:41和SEQ IDNO:42(即1A1-Q)、SEO ID NO:43和SEQ ID NO:44(即1A2)、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46(即1A8)、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48(即1B1)、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50(即1B2)、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52(即1H3)、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54(即1H3-Q)、SEQ IDNO:55和SEQ ID NO:56(即1H3-A)、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58(即2A2)、SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60(即2A3)、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62(即2A6)、SEQ ID NO:63和SEQ IDNO:64(即2A10)、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66(即2B1)、SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68(即2C6)、SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70(即2E7)、SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72(即2E9)、SEQID NO:73和SEQ ID NO:74(即2F1)、SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:76(即2F3)、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78(即34C5)、SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80(即A1A)以及SEQ ID NO:81和SEQID NO:82(即T4J)。

在一些其他的实施方案中，特异性结合人CD47的分离的抗体或其免疫活性片段包含可变重链(VH)序列和可变轻链(VL)序列，所述可变重链(VH)序列与选自以下的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO.79和SEQ ID NO:81，所述可变轻链(VL)序列与选自以下的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:80和SEQ ID NO:82。

在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含新的CD47抗体或其免疫活性片段、治疗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂，其中分离的抗体或其免疫活性片段包含VH链和VL链，所述VH链具有以下序列所示的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述VL具有以下序列所示的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3：

VH CDR1:NAWMN(SEQ ID NO:85)或RAWMN(SEQ ID NO:86)

VH CDR2:RIKRKTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:87)

VH CDR3:SNRAFDI(SEQ ID NO:88)

VL CDR1:KSSQSVLYSSNNRNYLA(SEQ ID NO:89)或KSSQSVLYAGNNRNYLA(SEQ ID NO:90)

VL CDR2:QASTRAS(SEQ ID NO:91)

VL CDR3:QQYYTPPLA(SEQ ID NO:92)

在一些其他的实施方案中，特异性结合人CD47的分离的抗体或其免疫活性片段包含VH/VL对，其中所述VH/VL对包含VH和VL链序列，其分别与选自以下的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4(即1F8)、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32(即13H3)、SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80(即A1A)以及SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:82(即T4J)。抗体13H3和A1A是抗体1F8的亲和力成熟克隆。三种抗体的氨基酸序列高度相似。

在其他实施方案中，特异性结合人CD47的分离的抗体或其免疫活性片段包含SEQID NO:81的重链和SEQ ID NO:82的轻链。

分离的抗体或其免疫活性片段可以是嵌合的或人源化的。并且分离的抗体可以是结合人CD47的单克隆抗体、双特异性抗体或融合抗体。它们可以防止或显著减少人CD47与SIRPα的相互作用，或者促进表达CD47的细胞的巨噬细胞介导的吞噬作用。本发明的CD47抗体不引起显著或明显水平的血凝或红细胞耗竭，并且在许多情况下，它们完全不引起血凝或红细胞耗竭。

在一方面，分离的双特异性抗体包含第一臂和第二臂。所述第一臂包含结合人CD47的抗体或其免疫活性片段，并且所述第二臂包含不结合人CD47的第二单克隆抗体。

在另一方面，分离的双特异性抗体的第二臂结合癌细胞。

在又一方面，融合抗体是与额外的蛋白、小分子物质或标记物缀合的分离的抗体或其免疫活性片段。

在又一方面，额外的蛋白是抗体或细胞因子。小分子物质是抗癌或抗炎剂。所述标记物是生物标记或荧光标记。

在一些实施方案中，所述药物组合物中的治疗剂是小分子化疗剂，其不引起对巨噬细胞的明显毒性。本文所用的术语“明显毒性”表示由于(a)毒性效果的严重性，和(b)其发生的事实或可能性而引起的相当关注的毒性。通过增加钙网蛋白的表达水平和/或降低CD47的表达水平，或者为抗CD47抗体提供加和效果，药物组合物中的这些治疗剂可以与抗CD47抗体协同作用以增加巨噬细胞吞噬作用效果。

在一方面，治疗剂增加钙网蛋白的表达水平。在另一方面，治疗剂抑制CD47的表达水平。

在一些实施方案中，所述药物组合物中的治疗剂是化疗剂。这样的化疗剂可以是小分子药物，并且可以是阿扎胞苷(Azacitidine)、维奈托克(Venetoclax)或库潘尼西(Copanilisib)。在一些实施方案中，治疗剂是阿扎胞苷或维奈托克。在一些其他的实施方案中，治疗剂是阿扎胞苷。

在又一实施方案中，所述药物组合物中的治疗剂是第二抗体或其免疫活性片段。在另一些实施方案中，该第二抗体选择性结合CD20(因而称为“CD20抗体”或“抗CD20抗体”)，并且可以促进癌细胞的吞噬消除。在另一实施方案中个，CD47抗体或其免疫活性片段与CD20抗体协同作用以促进癌细胞的吞噬消除。

在又一实施方案中，选择性结合CD20的额外的/第二抗体是利妥昔单抗(Rituximab)(具有SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:84)或其生物类似物(biosimilar)，并且第二抗体如利妥昔单抗(具有SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:84)可以与CD47抗体协同作用以促进肿瘤细胞的吞噬作用。

在又一实施方案中，所述药物组合物中的治疗剂包括小分子化疗剂和结合CD20的第二抗体。在另一些实施方案中，治疗剂包括阿扎胞苷和利妥昔单抗作为协同物质。在另一些实施方案中，治疗剂包括维奈托克和利妥昔单抗作为协同物质。

本发明还提供一种利用所述药物组合物治疗受试者的疾病的方法。疾病的实例包括但不限于癌症、纤维化疾病、与吞噬作用抑制相关的疾病或与血小板凝集相关的疾病。

癌症的实例包括但不限于卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、膀胱癌、结直肠癌、胰腺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、慢性髓细胞性白血病、毛细胞白血病(HCL)、T细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)、大颗粒淋巴细胞白血病、成人T细胞白血病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、胶质瘤、胶质母细胞瘤、骨髓瘤、单核细胞性白血病、B细胞衍生的白血病、T细胞衍生的白血病、B细胞衍生的淋巴瘤、T细胞衍生的淋巴瘤、子宫内膜癌、肾癌、黑色素瘤、前列腺癌、甲状腺癌、宫颈癌、胃癌、肝癌和实体瘤。纤维化疾病选自心肌梗死、心绞痛、骨关节炎、肺纤维化、哮喘、囊性纤维化、支气管炎和气喘。与吞噬作用抑制相关的疾病是心血管疾病。与血小板凝集相关的疾病是血小板无力症(Glanzmann Thrombasthenia)、出血时间延长、免疫性血小板减少症(ITP)、血管性血友病(vWD)。

心血管疾病的实例包括但不限于动脉粥样硬化、卒中、高血压心脏病、风湿性心脏病、心肌病、心律失常、先天性心脏病、瓣膜性心脏病、心脏炎、主动脉瘤、外周动脉疾病和静脉栓塞形成。

本发明还提供所述药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。

附图说明

图1示出用选定的小分子治疗剂处理16小时后，巨噬细胞的成活力。

图2示出CD47和钙网蛋白的表达水平。在该测定中，用选定的小分子治疗剂处理Toledo细胞12小时，然后通过FACS测定评估CD47(左)和钙网蛋白(右)的表达水平。

图3示出在分离的抗CD47抗体、利妥昔单抗和选定的小分子治疗剂的存在下，与肿瘤细胞共培养2-6小时后，巨噬细胞的吞噬能力。吞噬作用通过FACS测定分析。

图4示出4个不同的处理组中肿瘤随时间的生长。

图5示出4个不同的处理组中肿瘤体重的变化。

图6示出不同处理组中的肿瘤体重变化，其使用带有皮下HL-60异种移植物模型的雌性NOG小鼠。图6a示出肿瘤体重变化，图6b示出百分比(％)变化。

图7示出不同处理组中的肿瘤生长曲线，其使用带有皮下HL-60异种移植物模型的雌性NOG小鼠。

具体实施方式

在进一步描述本发明之前，应当理解，本发明并不局限于所描述的特定实施方案，当然，因为这些实施方案可能发生变化。还应当理解，本文所用术语仅用于描述特定实施方案，而不意图进行限制，因为本发明的范围仅受所附权利要求的限制。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

本文所用的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的生物活性。“抗体”(或“Ab”)和“免疫球蛋白”(或“Ig”)是具有相同结构特征的糖蛋白。虽然抗体对特定抗原表现出结合特异性，但免疫球蛋白包括抗体和缺乏抗原特异性的其他抗体样分子。

本文所用的术语“免疫活性片段”及其所有语法变体定义为包含完整抗体的抗原结合位点或可变区的完整抗体的一部分，其中该部分不含完整抗体的Fc区中的恒定重链结构域(即CH2、CH3和CH4，取决于抗体同种型)。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2和Fv片段；双体；任何抗体片段，其为具有由一个连续氨基酸残基的不间断序列组成的一级结构的多肽(在本文中称为“单链抗体片段”或“单链多肽”)，包括但不限于(1)单链抗体(scFv)分子，(2)仅包含一个轻链可变结构域的单链多肽或其含有轻链可变结构域的三个CDR的片段，没有相关的重链部分，和(3)仅含有一个重链可变区的单链多肽或其含有重链可变区的三个CDR的片段，没有相关的轻链部分；以及由抗体片段形成的多特异性或多价结构。在包含一个或多个重链的抗体片段中，所述重链可以含有在完整抗体的非Fc区中发现的任何恒定结构域序列(例如IgG同种型中的CH1)，和/或可以含有任何在完整抗体中发现的铰链区序列，和/或可以含有与重链的铰链区序列或重链恒定区序列融合的或位于其中的亮氨酸拉链序列。

本文所用的术语“单克隆抗体”(mAb)是指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即包含在群体中的个体抗体是相同的，除了可能天然存在的少量突变。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。每种mAb针对抗原上的单一决定簇。除了特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可以通过杂交瘤培养合成，不受其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以在永生化B细胞或其杂交瘤中制备，或者可以通过重组DNA方法制备。

本文所用的术语抗体的“免疫活性片段”是指表现出与整个抗体相似的免疫活性效果的抗体片段。其也称为抗体的“抗原结合片段”。

本文的单克隆抗体包括杂合抗体和重组抗体，其产生是通过将CD47抗体的可变(包括高变)结构域与恒定结构域(例如“人源化”抗体)拼接，或轻链与重链拼接，或来自一个物种的链与来自另一物种的链拼接，或与异源蛋白融合，而无论起源物种或免疫球蛋白类别或亚类名称以及抗体片段(例如Fab、F(ab')2和Fv)，只要它们表现出期望的生物学活性。

本文的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与衍生自另一物种的抗体或属于另一种抗体类别或亚类的抗体以及这些抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们表现出期望的生物学活性。

如本文所述，“分离的”抗体是已经从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。天然环境的污染组分是干扰抗体诊断或治疗用途的物质，并且可能包括酶、激素和其他蛋白或非蛋白溶质。在一些实施方案中，将抗体纯化至：(1)通过Lowry法确定，抗体含量为重量75％以上，并且最优选80％、90％或99％以上，或(2)在还原或非还原条件下，使用考马斯蓝，或优选银染色法，通过SDS-PAGE电泳法确定的同质性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体天然环境中的至少一种组分不存在。然而，通常，至少通过一个纯化步骤来制备分离的抗体。

本文所用的术语“治疗”是指对疾病(例如癌症或纤维化疾病)的治疗性处理和预防性或防止性措施。需要治疗的个体包括已经患有该疾病的个体以及需要预防该疾病的个体。

癌症的实例包括但不限于卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、膀胱癌、结直肠癌、胰腺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、慢性髓细胞性白血病、毛细胞白血病(HCL)、T细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)、大颗粒淋巴细胞白血病、成人T细胞白血病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、胶质瘤、胶质母细胞瘤、骨髓瘤、单核细胞性白血病、B细胞衍生的白血病、T细胞衍生的白血病、B细胞衍生的淋巴瘤、T细胞衍生的淋巴瘤、子宫内膜癌、肾癌、黑色素瘤、前列腺癌、甲状腺癌、宫颈癌、胃癌、肝癌和实体瘤。纤维化疾病可以是心肌梗死、心绞痛、骨关节炎、肺纤维化、哮喘、囊性纤维化、支气管炎和气喘。与吞噬作用抑制相关的疾病可以是心血管疾病。与血小板凝集相关的疾病可以是血小板无力症、出血时间延长、免疫性血小板减少症(ITP)、血管性血友病(von Willebrand disease，vWD)。

本文所用的术语“药学上可接受的载体或赋形剂”是指可用于制备药物组合物或制剂的载体或赋形剂，其通常是安全、无毒的，并且既不是生物学上也非其它方面不期望的。所采用的载体或赋形剂通常是适合给药人受试者或其他哺乳动物的载体或赋形剂。在制备组合物时，通常将活性成分与载体或赋形剂混合，由载体或赋形剂稀释或封闭。当载体或赋形剂用作稀释剂时，其可以是固体、半固体或液体材料，充当抗体活性成分的媒介物、载体或介质。

本发明的CD47抗体可以结合多种不同的载体并用于检测表达CD47的细胞的存在。公知的载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。出于本发明的目的，载体的性质可以是可溶或不可溶的。本领域技术人员会知道用于结合单克隆抗体的其他合适的载体，或能够使用常规实验来确定这种载体。

术语“药学上可接受”、“生理上可耐受”及其语法变体，由于其指的是组合物、载体、稀释剂和试剂，可互换使用，并表示该材料能够向人给药或对人给药，而不会产生不期望的生理效应，达到禁止给药该组合物的程度。

除非特别的相反的说明，本文所用的术语“缀合”和“缀合的”定义为一个或多个抗体片段通过共价与一个或多个聚合物分子连接形成异质分子，其中所述异质分子为水溶性的，即可溶于生理流体如血液中，并且其中所述异质分子不含任何结构化聚集体。

术语“化疗剂”是一个涵盖具有不同作用机制的许多化疗剂的广泛概念。可以与抗CD47剂联合给药的化疗剂包括但不限于阿扎胞苷、艾德拉尼(idelalisib)、杜韦利西布(duvelisib)、维奈托克、库潘尼西(copanlisib)、依鲁替尼(Ibrutinib)、苯达莫司汀(bendamustine)和来那度胺(lenalidomide)。本发明的药物组合物中可以包含的额外的单克隆抗体是选择性结合CD20的抗体，其可以包括但不限于利妥昔单抗，其具有以下序列的重链和轻链：

重链：

QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:83)

轻链：

QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:84)。

实施例

下文的实施例用于向本领域普通技术人员提供完整的公开和说明如何制备和使用本发明，并不意图限制发明人所认为的发明范围，也不表示下文的实验是进行的全部或仅有的实验。通过努力获得关于所用数值(例如，量、温度等)的精确性，但是应当考虑某些实验误差和偏差。除非特别说明，份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。

尽管在本发明的实施或测试中可以使用与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料，但在实施例中描述了优选方法，并且下文描述了材料。

下文的实施例中使用的材料包括：

CellTrace^TMViolet：Thermo Fisher Scientific，货号：C34557

CellTrace^TMFar Red：Thermo Fisher Scientific，货号：34564

CellTiter-Glo^TMLuminescent Cell Viability Assay Kit：Promega，货号：G7573

抗钙网蛋白抗体：Abcam,货号：ab83220

647小鼠抗人CD47：BD biosciences，货号：561249

Ficoll-Paque Plus：Axis-Shield，货号：AS1114547

MACS系统：Miltenyi Biotech,货号：130-045-201。

肿瘤细胞系，Toledo，购自ATCC。

作为实例，适合用于本发明的组合物的CD47抗体包含(a)可变重链(VH)序列和(b)可变轻链(VL)序列，

所述可变重链(VH)序列选自：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ IDNO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ IDNO:79和SEQ ID NO:81；

所述可变轻链(VL)序列选自：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ IDNO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ IDNO:80和SEQ ID NO:82。

在一些情况下，特异性结合人CD47的分离的抗体或其免疫活性片段包含可变重链(VH)序列和可变轻链(VL)序列，所述可变重链(VH)序列与选自以下的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO.79和SEQ ID NO:81，所述可变轻链(VL)序列与选自以下的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:80和SEQID NO:82；其中分离的单克隆抗体或其免疫活性片段包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:31、SEQID NO.79或SEQ ID NO:81中所示的VH序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:80或SEQ ID NO:82中所示的VL序列的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3；其中VH CDR1具有NAWMN(SEQ ID NO:85)或RAWMN(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列，VHCDR2具有RIKRKTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:87)的氨基酸序列，并且VH CDR3具有SNRAFDI(SEQ ID NO:88)的氨基酸序列；并且其中VL CDR1具有KSSQSVLYSSNNRNYLA(SEQ ID NO:89)或KSSQSVLYAGNNRNYLA(SEQ ID NO:90)的氨基酸序列，VL CDR2具有QASTRAS(SEQ ID NO:91)的氨基酸序列，并且VL CDR3具有QQYYTPPLA(SEQ ID NO:92)的氨基酸序列。

在另一些情况下，适合用于本发明的组合物的CD47抗体包含组合的VH/VL链序列，其选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2(即1A1)、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4(即1F8)、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6(即2A11)、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8(即2C2)、SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:10(即2D7)、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12(即2G4)、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14(即2G11)、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16(即6F4)、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18(即5H1)、SEQID NO:19和SEQ ID NO:20(即5F6)、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22(即1F3)、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24(即2A4)、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26(即2B12)、SEQ ID NO:27和SEQ IDNO:28(即13A11)、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30(即15E1)、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32(即13H3)、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34(即14A8)、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36(即16H3)、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38(即1A1)、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40(即1A1-A)、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42(即1A1-Q)、SEO ID NO:43和SEQ ID NO:44(即1A2)、SEQ IDNO:45和SEQ ID NO:46(即1A8)、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48(即1B1)、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50(即1B2)、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52(即1H3)、SEQ ID NO:53和SEQ IDNO:54(即1H3-Q)、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56(即1H3-A)、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58(即2A2)、SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60(即2A3)、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62(即2A6)、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64(即2A10)、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66(即2B1)、SEQ IDNO:67和SEQ ID NO:68(即2C6)、SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70(即2E7)、SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72(即2E9)、SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74(即2F1)、SEQ ID NO:75和SEQ IDNO:76(即2F3)、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78(即34C5)、SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80(即A1A)以及SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:82(即T4J)。

在一些特别的实例中，适合用于本发明的组合物的CD47抗体包含组合的VH/VL链序列，其选自SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4(即1F8)、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32(即13H3)或者SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80(即A1A)。抗体13H3和A1A是抗体1F8的亲和力成熟克隆。三种抗体的氨基酸序列高度相似。

实施例1：人外周血单个核细胞的分离

通过Ficoll–Hypaque密度梯度离心分离人外周血单个核细胞(PBMC)。所有人体血液实验均根据机构审查委员会(IRB)批准的方案进行。

将新鲜血液样品用磷酸缓冲盐水(PBS)稀释，然后小心地在Ficoll-Paque Plus密度梯度离心介质上放置。然后将样品以2000rpm的速度离心20min，然后分离。密度梯度离心后，离心过程中细胞的差异迁移导致形成含有不同细胞类型的层。可以发现PBMC与其他低密度缓慢沉积颗粒(如血小板)一起存在于血浆与Ficoll-Paque层之间的界面。通过倒入顶层收获PBMC，将其转移到新管中，然后用PBS洗涤。通过1500rpm下离心10min，收集新鲜分离的PBMC，并将其重悬浮在PBS中，以进一步分离T细胞亚群。

实施例2:从人外周血CD14⁺单核细胞产生巨噬细胞

根据制造商的方案，利用磁激活细胞分选(MACS)系统，通过阳性选择方法分离人外周血CD14⁺单核细胞。

然后，将通过MACS分离的单核细胞随后在新鲜完整培养基中培养以活化分化的巨噬细胞，所述培养基补充有重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF(50ng/ml)和人重组IL-4(35ng/ml)。培养6天后(第7天)，收获细胞，汇集在一起并计数以备用。

实施例3：巨噬细胞成活力测定

将来自实施例2的细胞以0.05×10⁶细胞/孔的密度接种于96孔平底板中。孵育2小时后，将巨噬细胞小心地附着至板上。然后将所选的小分子治疗剂添加至孔中，并共培养16小时。在第8天，根据生产商的说明书，通过

Luminescent细胞成活力测定评估巨噬细胞成活力。

表1选择的小分子治疗剂(提供了供应商)

治疗剂	作用机理	供应商和货号
			来那度胺	免疫调节剂，po	MedChemExpress(HY-A0003)
苯达莫司汀	烷化剂，iv	MedChemExpress(HY-B0077)
			依鲁替尼	BTK抑制剂，po	MedChemExpress(HY-10997)
维奈托克	Bcl-2抑制剂，po	MedChemExpress(HY-15531)
			库潘尼西	PI3K抑制剂，po	MedChemExpress(HY-15346)
杜韦利西布	PI3K抑制剂，po	MedChemExpress(HY-17044)
			艾德拉尼	PI3K抑制剂，po	MedChemExpress(HY-13026)
阿扎胞苷	核苷抗代谢物，DNA甲基转移酶	MedChemExpress(HY-10586)

结果表明，治疗剂库潘尼西、杜韦利西布和艾德拉尼在0.1-50μM的剂量下对巨噬细胞表现出明显的毒性。当剂量为10μM以下时，阿扎胞苷(Azacytidine)、苯达莫司汀、依鲁替尼、来那度胺和维奈托克对巨噬细胞表现出很少的毒性，虽然当剂量高达50μM时，其对巨噬细胞表现出毒性(参见图1，表2)。

表2：巨噬细胞成活力测定结果

实施例4：肿瘤细胞表面上CD47和钙网蛋白表达水平的荧光激活细胞分选(FACS)分析

对于FACS分析，在分析当天(第1天)，将Toledo细胞以0.2×10⁶细胞/孔的密度接种到96孔板中并培养。然后用选定的小分子治疗剂处理细胞12小时。

第2天，收获细胞，洗涤两次，然后重悬浮在100uL FACS缓冲液中，进行FACS分析。对于检测钙网蛋白和CD47的表达，将细胞用抗钙网蛋白抗体和可商购的抗CD47抗体(BDBiosciences，货号：561249)在4℃下避光孵育30min。

然后，对细胞进行FACS分析。采集并分析数据。

在本测定中，我们研究了所选小分子治疗剂对钙网蛋白和CD47表达水平的效果，以观察治疗剂是否能够影响巨噬细胞的吞噬能力。

结果表明，阿扎胞苷和维奈托克(Venecoclax)可以明显地抑制CD47表达水平，在5μM的剂量下抑制几乎50％的CD47表达；而库潘尼西仅轻微地抑制CD47表达水平。结果还表明，阿扎胞苷和维奈托克可以明显增加钙网蛋白表达水平，在5μM的剂量下，分别增加至约20倍和120倍，而库潘尼西仅轻微增加钙网蛋白表达水平(参见图2、表3)。

表3：通过FACS分析肿瘤细胞上CD47和钙网蛋白的表达水平

实施例5：通过FACS分析巨噬细胞的吞噬能力

进行基于FACS的吞噬作用测定以评估巨噬细胞的吞噬能力。

将Toledo细胞(肿瘤细胞系，作为靶标)用CellTrace^TMFar Red标记并以0.15×10⁶细胞/孔的密度接种在96孔板中，保持12小时。然后如上讨论制备巨噬细胞，然后用CellTrace Violet标记。随后，将巨噬细胞作为效应物加入板中，比率为效应物：靶标(Toledo)＝1:3，以获得最终密度为0.05×10⁶细胞/孔的巨噬细胞。在指定的处理(小分子治疗剂、CD47抗体、CD20抗体或组合)的存在下，将巨噬细胞和肿瘤细胞在37℃下共培养2-6h。孵育时间取决于吞噬速率，预期吞噬5-20％的细胞。

然后，采集细胞并分析数据。

结果证实，分离的抗CD47抗体(即T4J)或利妥昔单抗自身可以促进巨噬细胞吞噬作用。而且，分离的抗CD47抗体(即T4J)与利妥昔单抗的组合甚至更高地增强巨噬细胞的吞噬能力(参见表4)。

此外，阿扎胞苷(Axacytidine)或维奈托克自身也可以增强巨噬细胞的吞噬能力。而且，三重组合(分离的抗CD47抗体(即T4J)、利妥昔单抗以及阿扎胞苷或维奈托克)增强巨噬细胞的吞噬能力要高得多。在另一方面，苯达莫司汀或来那度胺没有表现出协同效应(参见图3、表4)。

表4：三重组合疗法对巨噬细胞吞噬作用的治疗效果

实施例6：抗CD47抗体联合抗CD20抗体在肿瘤异种移植物模型中抗肿瘤效力的体内测试

所有动物实验程序均由机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准。在本研究中使用抗CD47抗体(即T4J)和抗CD20抗体(即利妥昔单抗)。

为了建立异种移植物模型，将人弥漫性大B细胞淋巴瘤(WSU-DLCL2cells)皮下(s.c.)注射到6-7周龄NOD/SCID小鼠(Shanghai Lingchang Biotechnology Co.,Ltd,Shanghai,China)，用于肿瘤发育。当肿瘤体积达到约94mm³的平均值时，将32只小鼠平均分为4组，每组8只，静脉内(i.v.)注射PBS(对照组)、抗CD47抗体(即T4J)、利妥昔单抗或者抗CD47抗体T4J+利妥昔单抗，剂量分别为5mg/kg(参见表5)。

抗肿瘤效力研究采用每周两次的剂量给药方案(5mg/kg)，持续4周。

表5：处理组和对照组的描述

抗体给药的第一天指定为第0天。然后监测小鼠肿瘤发育和进展，观察持续到第43天。每周用卡尺测量两次肿瘤体积的两个维度(长度和宽度)，并使用以下公式计算体积：体积(V)＝(L x W x W)/2，其中L是肿瘤长度(最长肿瘤尺寸)，并且W是肿瘤宽度(垂直于L的最长肿瘤尺寸)。

肿瘤生长抑制百分比(TGI)计算如下：100％×(1-[(V_处理的(^最后一天)-V_处理的(^第一天))/(V_对照(^最后一天)-V_对照(^第一天))])，其中V为肿瘤体积。随机化后每周测量两次肿瘤体重，并在第43天进行测量。然后在研究43天后停止抗体处理，并将小鼠安乐死和尸检，以获得肿瘤证据。

采用单路方差分析(ANOVA)进行组间比较。使用IBM SPSS软件版本18.0(IBM,Armonk,NY,U.S.)进行数据分析。肿瘤体积和肿瘤体重的值表示为平均值±平均值标准误差(SEM)。小于0.05(P<0.05)的P值认为具有统计学显著。

在给药四周后，与对照组相比，用T4J处理的组没有表现出抗肿瘤效力(1％ TGI,p＝1.000)。与对照组相比，用T4J(5mg/kg)和利妥昔单抗(5mg/kg)组合处理的组表现出显著的抗肿瘤效力(63％ TGI,p＝0.004)；与用T4J处理的组相比，证实显著改善的抗肿瘤效力(p＝0.002)；并且与用利妥昔单抗处理的组相比，表现出改善但不显著的抗肿瘤效力(p＝0.086)(表6)。在研究期间，所有组均未发生死亡或不良反应。因此，结果表明利妥昔单抗可以提高T4J在肿瘤异种移植物模型中的治疗效果。

表6：抗体的抗肿瘤效力

肿瘤生长分析显示，T4J联合利妥昔单抗，在第43天表现出显著的肿瘤消退(参见图4-5、表7)。总之，与使用任何单一药物(T4J或利妥昔单抗自身)处理的组相比，用T4J和利妥昔单抗的组合处理的组表现出改善的治疗效力(参见图4-5、表7)。

表7：肿瘤体重的分析

实施例7:抗CD47抗体联合阿扎胞苷(AZA)在肿瘤异种移植物模型中抗肿瘤效力的体内测试

所有动物实验程序均由机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准。在本研究中，在HL-60异种移植物模型中评价抗CD47抗体(即T4J)和AZA单独或联合的治疗效力。

细胞培养

在37℃、含5％ CO₂的环境下，将HL-60细胞(人早幼粒细胞白血病细胞系，

货号CCL-240)保持在完整细胞生长培养基中悬浮培养。使细胞每周分裂两次，以保持指数生长。培养后，收获细胞并计数，以进行肿瘤接种。

肿瘤接种和动物分组

为了建立异种移植物模型，将HL-60细胞(10x10⁶)悬浮在0.2mL PBS中，加入相同体积的基底胶(Matrigel)，并皮下注射到每只小鼠的右侧。当肿瘤体积达到约72mm³的平均值时，即接种后第6天，将小鼠分为几个组，并分别用PBS(对照组)、抗CD47抗体(即T4J)、AZA或者T4J与AZA的组合处理。

观察

在常规监测时，每天检查动物的肿瘤生长和处理对正常行为的任何影响，如活动性、食物和水的消耗(仅通过观察)、体重增加/减轻(体重每周测量两次)、眼睛/毛发垫以及任何其他异常影响。记录死亡和观察到的临床指征。

肿瘤测量

每周用卡尺测量两次肿瘤大小，并使用以下公式计算体积：体积(V)＝(L x W xW)/2，其中L是肿瘤长度(最长肿瘤尺寸)，并且W是肿瘤宽度(垂直于L的最长肿瘤尺寸)。然后用肿瘤体积计算T/C值。T/C值(百分比)是抗肿瘤效果的指标，其中T和C分别是处理组和对照组的平均体积。每组的肿瘤生长抑制百分比(TGI)计算如下：100％×(1-[(V_处理的(^最后一天)-V_处理的(^第一天))/(V_对照(^最后一天)-V_对照(^第一天))])，其中V为肿瘤体积。

研究结束时测量肿瘤体重。T/C重量值(百分比)使用以下公式计算：T/C重量％＝T重量/C重量x100％，其中T重量和C重量分别是处理组和对照组(媒介物组)的平均重量体重。

处理效力用Jin's公式评价：

Q＝TGI(A+B))/(TGI(A)+TGI(B)-TGI(A)×TGI(B))

根据Jin's公式，Q<0.85表示拮抗效果，0.85≤.85815表示加和效果，Q≥1.15表示协同效果。

统计分析

进行T检验以比较各组之间的肿瘤体重。进行单路ANOVA以比较各组之间的肿瘤体积，并且当获得显著的F统计量(处理方差与误差方差的比率)时，采用Games-Howell检验进行组间比较。所有数据均使用IBM SPSS软件进行分析。小于0.05(p<0.05)的p值认为是统计学显著的。

结果

定期监测肿瘤体重，作为毒性的间接度量。在研究期间，所有组均未发生死亡或不良反应。不同处理组的肿瘤体重变化示于图6a和图6b。

肿瘤体积随时间的变化显示于表8。肿瘤生长曲线示于图7。

表8：肿瘤体积随时间变化

^a.平均值±SEM；^b.第一次剂量给药后的天数

结论

如表9所总结的，与对照组(2964±248mm³)相比，用1mg/kg AZA处理的组没有表现出明显的抗肿瘤活性，平均体积为2081±177mm³。与对照组(2964±248mm³)相比，用3mg/kgTJC4和1mg/kg AZA处理12天的组表现出肿瘤体积显著减小(431±254mm³)，表明显著的抗肿瘤效果。

用2mg/ml AZA处理的组表现出一定的抗肿瘤活性，平均体积为1452±253mm³。与对照组(2964±248mm³)相比，用3mg/kg TJC4和2mg/kg AZA处理12天的组表现出肿瘤体积显著减小(850±258mm³)，表明显著的抗肿瘤效果。

基于JIN's公式进行两个组合处理组的统计学评价。结果表明，1mg/kg AZA和3mg/kg TJC4的组合处理获得1.22的Q值，证实AZA和CD47抗体之间的协同作用；并且2mg/kg AZA和3mg/kg TJC4处理获得0.90的Q值，证实AZA和CD47抗体之间的加和效果。

表9：第12天抗体T4J联合AZA的抗肿瘤效力

a.平均值±SEM。

b.基于肿瘤大小计算p值。

Claims

1.一种药物组合物，其包含

特异性结合人CD47的分离的抗体或其免疫活性片段、治疗剂以及药学上可接受的载体；其中

所述特异性结合人CD47的分离的抗体或其免疫活性片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，

所述重链可变区(VH)具有与选自以下的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列：SEQID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ IDNO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:81；

所述轻链可变区(VL)具有与选自以下的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列：SEQID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ IDNO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:82。

2.权利要求1的药物组合物，其中所述特异性结合人CD47的分离的抗体或其免疫活性片段包含VH/VL对，其中所述VH/VL对包含选自以下的VH和VL链序列：SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31和SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36、SEQID NO:37和SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42、SEO ID NO:43和SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47和SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:71和SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:76、SEQID NO:79和SEQ ID NO:80以及SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:82(即T4J)。

3.权利要求1的药物组合物，其中所述特异性结合人CD47的分离的抗体或其免疫活性片段包含可变重链(VH)序列和可变轻链(VL)序列，

所述可变重链(VH)序列与选自以下的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO.79和SEQ ID NO:81；

所述可变轻链(VL)序列与选自以下的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:82。

4.权利要求1-3中任一项的药物组合物，其中所述特异性结合人CD47的分离的抗体或其免疫活性片段包含VH/VL对，其中所述VH/VL对包含VH和VL链序列，其分别与选自以下的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80以及SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:82。

5.权利要求1-4中任一项的药物组合物，其中所述特异性结合人CD47的分离的抗体或其免疫活性片段包含SEQ ID NO:81的重链和SEQ ID NO:82的轻链。

6.一种药物组合物，其包含特异性结合人CD47的分离的抗体或其免疫活性片段、治疗剂以及药学上可接受的载体；其中

所述重链可变区(VH)具有：

CDR1，其具有NAWMN(SEQ ID NO:85)或RAWMN(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列，

CDR2，其具有RIKRKTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:87)的氨基酸序列，和

CDR3，其具有SNRAFDI(SEQ ID NO:88)的氨基酸序列；

所述轻链可变区(VL)具有：

CDR1，其具有KSSQSVLYSSNNRNYLA(SEQ ID NO:89)或KSSQSVLYAGNNRNYLA (SEQ ID NO:90)的氨基酸序列，

CDR2，其具有QASTRAS(SEQ ID NO:91)的氨基酸序列，和

CDR3，其具有QQYYTPPLA (SEQ ID NO:92)的氨基酸序列。

7.权利要求6的药物组合物，其中所述特异性结合人CD47的分离的抗体或其免疫活性片段包含VH/VL对，其中所述VH/VL对包含VH和VL链序列，其分别与选自以下的氨基酸序列至少95％相同：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80以及SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:82。

8.权利要求6或7的药物组合物，其中所述特异性结合人CD47的分离的抗体或其免疫活性片段包含SEQ ID NO:81的重链和SEQ ID NO:82的轻链。

9.权利要求1-8中任一项的药物组合物，其中所述特异性结合人CD47的分离的抗体或其免疫活性片段是嵌合的或人源化的。

10.权利要求1-9中任一项的药物组合物，其中所述特异性结合人CD47的分离的抗体或其免疫活性片段是单克隆抗体、双特异性抗体或融合抗体。

11.权利要求10的药物组合物，其中所述分离的双特异性抗体包含第一臂和第二臂，其中所述第一臂包含权利要求1-4中任一项的特异性结合人CD47的抗体或其免疫活性片段，并且所述第二臂包含不结合人CD47的第二单克隆抗体。

12.权利要求11的药物组合物，其中所述分离的双特异性抗体的第二臂结合癌细胞。

13.权利要求10的药物组合物，其中所述融合抗体是与额外的蛋白、小分子物质或标记物缀合的权利要求1的分离的抗体或其免疫活性片段。

14.权利要求13的药物组合物，其中所述额外的蛋白是抗体或细胞因子，其中所述融合蛋白中的小分子物质是抗癌或抗炎剂，其中所述标记物是生物标记或荧光标记。

15.权利要求1-14中任一项的药物组合物，其中所述分离的抗体或其免疫活性片段防止人CD47与信号调节蛋白α(SIRPα)相互作用。

16.权利要求1-12中任一项的药物组合物，其中所述分离的抗体或其免疫活性片段促进表达CD47的细胞的巨噬细胞介导的吞噬作用。

17.权利要求1-16中任一项的药物组合物，其中所述分离的抗体或其免疫活性片段不引起显著水平的血凝或红细胞耗竭。

18.权利要求1-17中任一项的药物组合物，其中所述治疗剂与所述特异性结合人CD47的分离的抗体或其免疫活性片段产生协同效果以促进吞噬作用。

19.权利要求1-18中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物为协同组合，并且所述治疗剂增强所述分离的抗体或其免疫活性片段对癌细胞吞噬消除的治疗效果。

20.权利要求1-19中任一项的药物组合物，其中所述治疗剂增加钙网蛋白的表达水平。

21.权利要求1-20中任一项的药物组合物，其中所述治疗剂抑制CD47的表达水平。

22.权利要求1-21中任一项的药物组合物，其中所述治疗剂不引起对巨噬细胞的明显毒性。

23.权利要求1-22中任一项的药物组合物，其中所述治疗剂是化疗剂。

24.权利要求23的药物组合物，其中所述化疗剂包括阿扎胞苷、维奈托克或库潘尼西。

25.权利要求23或24的药物组合物，其中所述化疗剂包括阿扎胞苷或维奈托克。

26.权利要求23-25中任一项的药物组合物，其中所述化疗剂包括阿扎胞苷。

27.权利要求1-22中任一项的药物组合物，其中所述化疗剂是抗体或其免疫活性片段，其选择性结合CD20并促进癌细胞的吞噬消除。

28.权利要求27的药物组合物，其中所述选择性结合CD20的抗体或其免疫活性片段是利妥昔单抗或其生物类似物。

29.权利要求1-22中任一项的药物组合物，其中所述治疗剂包括化疗剂以及选择性结合CD20的抗体或其免疫活性片段。

30.权利要求27-29中任一项的药物组合物，其中所述结合CD47的分离的抗体或其免疫活性片段与所述选择性结合CD20的分离的抗体协同作用并促进癌细胞的吞噬消除。

31.权利要求30的药物组合物，其中所述治疗剂包括阿扎胞苷和利妥昔单抗或者维奈托克和利妥昔单抗。

32.一种治疗有需要的人受试者的疾病的方法，其包括向所述受试者给药治疗有效量的权利要求1-31中任一项的药物组合物，其中所述疾病是癌症、纤维化疾病、与吞噬作用抑制相关的疾病或与血小板凝集相关的疾病。

33.权利要求32的方法，其中

所述癌症选自卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、膀胱癌、结直肠癌、胰腺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、慢性髓细胞性白血病、毛细胞白血病(HCL)、T细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)、大颗粒淋巴细胞白血病、成人T细胞白血病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、胶质瘤、胶质母细胞瘤、骨髓瘤、单核细胞性白血病、B细胞衍生的白血病、T细胞衍生的白血病、B细胞衍生的淋巴瘤、T细胞衍生的淋巴瘤、子宫内膜癌、肾癌、黑色素瘤、前列腺癌、甲状腺癌、宫颈癌、胃癌、肝癌和实体瘤；

所述纤维化疾病选自心肌梗死、心绞痛、骨关节炎、肺纤维化、哮喘、囊性纤维化、支气管炎和气喘；

所述与吞噬作用抑制相关的疾病是心血管疾病；

所述与血小板凝集相关的疾病是血小板无力症、出血时间延长、免疫性血小板减少症(ITP)、血管性血友病(vWD)。

34.权利要求32或33的方法，其中所述心血管疾病选自动脉粥样硬化、卒中、高血压心脏病、风湿性心脏病、心肌病、心律失常、先天性心脏病、瓣膜性心脏病、心脏炎、主动脉瘤、外周动脉疾病和静脉栓塞形成。

35.权利要求1-31中任一项的药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途，其中所述疾病是癌症、纤维化疾病、与吞噬作用抑制相关的疾病或与血小板凝集相关的疾病。