CN115624097B

CN115624097B - 一种促进幼龄反刍动物生长和瘤胃上皮发育的吲哚衍生物

Info

Publication number: CN115624097B
Application number: CN202211059449.6A
Authority: CN
Inventors: 刘军花; 边高瑞; 张凯; 毛胜勇; 孙大明; 刘宁
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2022-08-31
Filing date: 2022-08-31
Publication date: 2023-06-30
Anticipated expiration: 2042-08-31
Also published as: CN115624097A

Abstract

本发明公开了一种促进幼龄反刍动物生长和瘤胃上皮发育的吲哚衍生物，具体是指吲哚三甲醛在促进幼龄反刍动物瘤胃发育和生长性能中的应用，吲哚三甲醛可以作为饲料添加剂在幼龄反刍动物代乳料和精料开食料中应用，促进瘤胃上皮形态及功能的发育，提高幼龄反刍动物的体增重、平均日增重、料重比、缩短断奶时间及提高出栏速率。本发明发现吲哚三甲醛通过调节幼龄反刍动物细胞瘤胃上皮细胞增殖分化进而促进瘤胃乳头的发育，促进瘤胃上皮对营养物质的吸收利用，保障动物健康，提高动物的生长性能。所以，吲哚三甲醛可以用于制备促进幼龄反刍动物瘤胃上皮发育及生长性能的饲料添加剂或者药物。

Description

一种促进幼龄反刍动物生长和瘤胃上皮发育的吲哚衍生物

技术领域

本发明属于饲料添加剂领域，具体涉及吲哚三甲醛在促进幼龄反刍动物瘤胃发育和生长性能中的应用。

背景技术

中国是一个养羊大国，肉羊产业在畜牧业中长期占有重要的地位。数据显示，自2017至2021年，中国羊的存栏量由30231.7万只增至31969.0万只，2021年羊的出栏量、存栏量和羊肉生产总量创近5年来新高，同时，居民对羊肉的消费也十分旺盛，2021年羊肉消费量较上年增长5.0％，表观消费量达到554.9万吨。

为满足市场对羊肉的极大需求，近年来，中国肉羊产业迅猛发展，集约化、规模化养殖成主要趋势。而在集约化养殖过程中，如何保证羔羊健康而快速的生长发育是保障羊肉市场供给和养殖户经济效益的关键。羔羊从非反刍向反刍过渡阶段，其日粮供应模式从完全液态饲料向固体饲料逐渐转变，营养源和消化生理功能也发生剧烈改变。这一阶段，瘤胃迅速发育，主要表现为瘤胃体积的增大，以及瘤胃乳头长度和宽度的增加，瘤胃上皮乳头向瘤胃腔中生长，瘤胃上皮基底层细胞迁移至上层分化为角质细胞并执行特定功能等。这一阶段羔羊最容易发生各种健康疾病，据不完全统计，每年因为羔羊瘤胃健康问题所造成的经济损失达数百亿元。

幼龄反刍动物瘤胃正值快速发育阶段，具有较强的可塑性，其发育程度对羔羊断奶后乃至成年后的健康状况以及生产性能都有显著的影响，因此幼龄期是调控瘤胃发育的最佳窗口期。若在此关键过渡阶段，瘤胃发育调控不佳，瘤胃上皮发育不良，很容易导致瘤胃能量吸收不足、物理屏障受损破坏、发育滞后等各种瘤胃健康问题。目前，如何合理调节瘤胃的健康发育已成为反刍动物现代化规模养殖中亟需解决的问题之一。

吲哚三甲醛(3-吲哚甲醛，indole-3-aldehyde，IAld)，分子式为：C₉H₇NO，是一种瘤胃微生物色氨酸代谢最终产物，属于吲哚衍生物。吲哚三甲醛具有一定的抗菌，抗炎，抗肿瘤等作用。此外，在医学和医药方面，吲哚三甲醛还是一种重要的有机中间体，用来合成许多具有生理和药理活性的化合物。但是有关其在畜牧业饲料方面的应用未见报道。

发明目的

发明内容：针对现有技术存在的问题，本发明提供吲哚三甲醛在促进幼龄反刍动物瘤胃上皮发育及生长性能中的应用。本发明提出了一种吲哚三甲醛的新功能，可以在幼龄反刍动物代乳料及精料开食料基础上口腔灌服，有效促进幼龄反刍动物瘤胃上皮发育，通过促进瘤胃上皮形态及功能的发育，进而保障羔羊后续对开食料的采食量，提高羔羊的生长性能，从而提高出栏速率，加大对市场的羊肉供应量。

本发明还提供一种促进幼龄反刍动物瘤胃发育的饲料添加剂。

技术方案：为了实现上述目的，本发明所述吲哚三甲醛在促进幼龄反刍动物瘤胃发育中的应用。

本发明所述吲哚三甲醛在提高幼龄反刍动物体增重、平均日增重、料重比、缩短断奶时间、提高出栏速率中的应用。

本发明所述的吲哚三甲醛在制备促进幼龄反刍动物瘤胃发育及生长性能的饲料添加剂中的应用。

其中，所述幼龄反刍动物为羔羊或犊牛。

进一步地，所述吲哚三甲醛在动物饲料基础上作为饲料添加剂促进幼龄反刍动物瘤胃复层上皮发育及生长性能中的应用。

其中，所述动物饲料为代乳料或精料开食料。

进一步地，所述吲哚三甲醛在幼龄反刍动物代乳料或者精料开食料基础上口腔灌服。

其中，所述口腔灌服吲哚三甲醛为20-40mg/kg体重幼龄反刍动物。

进一步地，所述口腔灌服龙胆酸为30mg/kg体重幼龄反刍动物。

其中，所述的羔羊或犊牛为出生后到断奶后六周内。

本发明所述促进幼龄反刍动物瘤胃发育及生长性能的饲料添加剂，所述饲料添加剂包括吲哚三甲醛作为有效成分，以及饲料添加剂所需辅料。

为应对以上羔羊饲养产业面临的问题，本发明前期对饲喂羊奶组羔羊(M组)和饲喂羊奶+精料开食料组羔羊(MC组)瘤胃主要代谢物进行测定和代谢组研究(如图1所示)，发现在饲喂羊奶+精料开食料组羔羊瘤胃代谢物中，除了碳水化合物代谢发生显著变化外，氨基酸代谢尤其是色氨酸代谢也发生显著变化，其中具有较多的吲哚衍生物，如吲哚三甲醛和羟基吲哚乙酸，结合随机森林分析和相关性分析结果，将吲哚三甲醛作为补饲精料开食料羔羊瘤胃中的特征代谢物，开展后续研究。

设计原理：基于试验前期的实验发现，通过Edu检测不同吲哚三甲醛浓度对瘤胃上皮细胞的促生长作用，确定了吲哚三甲醛在30μM处对瘤胃上皮有较好的促增殖作用(如图2，图3所示)，同时为了进一步在体验证吲哚三甲醛对羔羊瘤胃发育的促进作用，对湖羊羔羊进行口腔灌服吲哚三甲醛，试验发现吲哚三甲醛可有效促进羔羊瘤胃上皮发育。

本发明首次提出了吲哚三甲醛在促进幼龄反刍动物瘤胃发育和生长性能中的应用，一般而言对于吃开食料的羔羊由于营养主要在瘤胃消化吸收，所以促进瘤胃发育，可以有效促进生长。而对于早期吃代乳料的羔羊，吲哚三甲醛主要促进其瘤胃乳头发育，但为动物采食开食料做好准备，有利于幼龄反刍动物早期断奶。

此外，瘤胃上皮属于复层鳞状上皮，不同于肠道属于单层柱状上皮，两者是完全不同的器官，本发明中首次发现吲哚三甲醛在促进幼龄反刍动物瘤胃复层上皮发育中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明所使用的吲哚三甲醛是一种经济有效的饲料添加剂，本发明提出了一种吲哚三甲醛的新功能，可以在幼龄反刍动物代乳料及精料基础上口腔灌服，促进幼龄反刍动物瘤胃上皮发育；在体试验中，吲哚三甲醛可以显著提高羔羊瘤胃乳头的长度、宽度、表面积，瘤胃上皮总厚度以及棘突层和基底层厚度，提高断奶羔羊的平均日增重，降低料重比。说明吲哚三甲醛可以在幼龄反刍动物代乳料及精料基础上作为饲料添加剂，促进羔羊等幼龄反刍动物瘤胃及生长性能，特别是上皮组织的发育，保障幼龄反刍动物瘤胃健康减少疾病的发生，提高动物的生产水平。所以，吲哚三甲醛可以用于制备促进幼龄反刍动物瘤胃发育及生长性能的饲料添加剂。

附图说明

图1为M和MC组氨基酸代谢组结果；

图2为体外添加30μM吲哚三甲醛影响瘤胃上皮细胞增殖的Edu标记细胞比例柱状图；

图3为体外添加30μM吲哚三甲醛影响瘤胃上皮细胞增殖的Edu免疫荧光图；

图4为对照组和吲哚三甲醛组羔羊屠宰后瘤胃组织对比图；

图5为对照组和吲哚组羔羊瘤胃组织和瘤胃上皮乳头HE切片对比图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

实施例中所使用的原料和仪器都是市售可得。

吲哚三甲醛购自Sigma Aldrich。

BeyoClick^TM Edu-594细胞增殖检测试剂盒盒购自碧云天。

实施例1

为判断吲哚三甲醛对原代瘤胃上皮细胞的增殖作用以及最佳浓度，试验选择3只42日龄性别一致，体重相近的湖羊公羔羊用于细胞试验。羔羊屠宰后立即分离瘤胃，用6倍的青链霉素的D-Hanks溶液多次冲洗，去除瘤胃内容物，然后再漂洗2-3次，能有效的去除残留的细菌和真菌。收集瘤胃腹囊部上皮组织块，加入含0.25％的胰蛋白酶液，在37℃水浴中消化30min，一般羊的瘤胃上皮组织的消化时间为2-3h。清洗后用含0.25％胰蛋白酶继续消化，直到看到有细碎细胞脱落(大部分是椭圆形细胞时开始收集)，间隔5min收集一次细胞消化液。收集的细胞消化液用70μm的滤膜进行过滤，离心，重悬，将细胞接种到培养瓶中，置于5％CO₂，37℃培养箱中培养。待细胞融合到70-80％，进行传代，96孔板中每个孔接种5000个细胞，完全培养液培养24h，之后进行饥饿处理24h。通过Edu检测不同浓度吲哚三甲醛对瘤胃上皮细胞的促生长作用，加入不同浓度吲哚三甲醛(IAld)和Edu(10μM)培养24h，染色之后使用共聚焦显微镜观察，以不加吲哚三甲醛作为对照。

弃去细胞培养基加入4％组织细胞固定液固定半小时。然后用PBS洗涤液清洗3次，加入0.3％曲拉通室温孵育15min。PBS清洗3次后加入5％PBS溶液，室温摇床孵育60min。弃去封闭液，加入一抗稀释液，4℃避光孵育过夜。PBS清洗3次，每次5min，加入二抗，37℃孵育1h。PBS清洗3次，用DAPI(索莱宝，中国)染细胞核10min。最后PBS清洗3次后，滴加抗荧光淬灭剂，用激光共聚焦显微镜进行扫描观察细胞蛋白荧光标记情况。

如图2和图3所示，IAld组Edu标记的细胞显著(P<0.05)高于Con组，结果表明吲哚三甲醛(30μM)对瘤胃上皮有较好的促增殖作用。

实施例2

试验选择12头健康、生长状况良好的且体重相近的11日龄湖羊羔羊。试验羔羊与母羊分离后饲喂配置好的羊奶粉，经过三天预饲期后随机分配为两组。一组按30mg/kg体重口腔灌服吲哚三甲醛(处理组，IAld,n＝6)，吲哚三甲醛粉末(Sigma，美国)是溶解在含1.25％DMSO的生理盐水中，最终的浓度是18.9mg/mL，灌服体积根据每周称量的体重调整一次(保持30mg/kg)。另一组口腔灌服相同体积的含1.25％DMSO的生理盐水(对照组，Con,n＝6)，每天8：00进行灌服。在灌服期间，羔羊自由摄取羊奶，不进行固体饲料的饲喂。试验所用羊奶粉购自陕西样样祥乳液有限公司，饲喂前按照羊奶粉：水＝1：10的比例进行配置。配置水温为60℃，待自然冷却至37-40℃用带有奶嘴的奶桶饲喂羔羊。每日饲喂四次(07:00、12:00、17:00和22:00)，每次饲喂半小时，防止饲喂时间过长造成奶温过低造成腹泻，饲喂后用清水冲洗奶桶，并每3天用开水浸泡消毒。每天记录羔羊喝奶量，每周于晨饲前称量羔羊体重。试验开始前，两组羔羊的体重没有显著差异。

实施例3

试验期间每天称量实施例2的对照组和试验组的喝奶量，每周监测实施例2的对照组和试验组羔羊体重变化，吲哚三甲醛灌服对羔羊代乳料的平均日采食量和平均日增重的影响结果如表2。

表2.吲哚三甲醛灌服对羔羊代乳料的平均日采食量和平均日增重的影响

注：数据以平均值±标准误形式表示，n＝6

由表2可知，与对照组相比，灌服吲哚三甲醛对羔羊的平均日增重以及平均日采食量影响不大，表明灌服吲哚三甲醛对羔羊代乳料的采食无显著影响。

实施例4

取实施例2的羔羊，于42日龄时早晨饲喂2小时后进行屠宰。屠宰后立即分离瘤胃并称重(对应实施例5瘤胃器官指数)，如图4所示为对照组和吲哚三甲醛组羔羊屠宰后瘤胃组织对比图，可看出灌服吲哚三甲醛组羔羊瘤胃发育较好。采集瘤胃组织用于测定瘤胃器官指数，采集腹囊部的瘤胃上皮测定瘤胃形态结构(对应实施例5乳头形态和瘤胃各层细胞厚度)。

实施例5

检测吲哚三甲醛灌服对羔羊瘤胃器官指数和瘤胃上皮乳头形态结构的影响：

取实施例2的羔羊，在42日龄时屠宰采样，羔羊屠宰后立即分离瘤胃，去除瘤胃内容物后用于称重；取3块瘤胃腹囊部的1×1cm²的瘤胃上皮，使用放大倍率为2.5倍的放大镜(MG3B-1A，上海)测定乳头密度，每头羊每块瘤胃上皮取15个瘤胃乳头用于测定瘤胃上皮乳头长度和宽度，乳头的表面积/cm²计算为乳头长度×宽度×密度(乳头数/cm²)×2；每头羔羊选取瘤胃腹囊的瘤胃上皮进行组织形态学分析，将固定在4％多聚甲醛的瘤胃乳头样品，包埋在石蜡中，切成6μm厚，并用苏木精和曙红染色，使用Image Pro Plus(MediaCybernetics，美国)软件测量瘤胃乳头的角质层，颗粒层，棘突层和基底层的厚度。结果如表3和图5所示。

表3.吲哚三甲醛灌服对羔羊瘤胃重量和瘤胃上皮乳头形态学的影响

注：数据以平均值±标准误形式表示，n＝6

由表3可知，吲哚三甲醛灌服显著提高了瘤胃上皮乳头长度、宽度和瘤胃上皮吸收表面积，显著增加了瘤胃上皮棘突层和基底层以及瘤胃上皮总厚度，而对瘤胃干重，乳头密度以及角质层、颗粒层厚度无显著影响，图5结果也可看出吲哚三甲醛灌服能促进瘤胃上皮乳头长度、宽度以及表面积。吲哚三甲醛灌服显著提高了棘突层和基底层厚度以及总厚度。上述结果说明，吲哚三甲醛灌服可有效促进瘤胃上皮形态学发育。

实施例6

试验选择16头体况良好，胎次一致且断奶两周内的公羔羊，经过三天预饲后随机分为两组。试验开始时两组羔羊的体重没有显著性差异(19.70±0.70vs.19.88±1.16,P＝0.90)，一组按照30mg/kg体重口腔灌服吲哚三甲醛(处理组，IAld,n＝8)，吲哚三甲醛粉末(Sigma，美国)是溶解在含1.25％DMSO的生理盐水中，最终的浓度是18.9mg/mL。另一组口腔灌服相同体积的含1.25％DMSO的生理盐水(对照组，Con,n＝8)，每天8：00进行灌服，每次灌服保证在20分钟内完成，共灌服21天，灌服体积根据每周称量的体重调整一次(保持30mg/kg·BW/d)。试验期间羔羊单栏饲养，没有机会接触其他羔羊的饲料。羔羊每天饲喂精料200g，自由采食粗饲料(花生秸秆)，自由饮水，每天记录羔羊采食量，每周监测羔羊体重变化。精料配方按照绵羊营养需求根据NRC(2007)设计，其组成和营养水平如表4所示。

表4.精料的组成和营养水平

Table 4.Ingredient and nutrient composition of the starter diet

¹预混料为每千克饲粮提供：MnSO4 153mg，ZnSO4 186mg，FeSO4 125mg，CoCl28.25mg，KIO3 25mg，CuSO4 33mg，NaSeO3 4mg，VA 15.28mg，VE 0.47mg。

¹Per kg premix contains:MnSO4 153mg,ZnSO4 186mg,FeSO4 125mg,CoCl28.25mg,KIO3 25mg,CuSO433mg,NaSeO3 4mg,VA 15.28mg,VE 0.47mg.

实施例7

试验期间每天称量实施例6的对照组和试验组的采食量，每周监测实施例6羔羊的体重变化，吲哚三甲醛对羔羊精料开食料的平均日采食量、平均日增重以及料重比的影响结果如表5。

表5.吲哚三甲醛对断奶羔羊平均日采食量、平均日增重及料重比的影响

注：数据以平均值±标准误形式表示，n＝8

由表5可知，灌服吲哚三甲醛对断奶羔羊平均日采食量无显著影响。与对照组相比，吲哚三甲醛处理可显著提高羔羊的平均日增重，显著降低羔羊料重比，证明吲哚三甲醛灌服可提高羔羊的生产水平。

综上，吲哚三甲醛可以在幼龄反刍动物代乳料基础上口腔灌服，可有效促进幼龄反刍动物瘤胃上皮发育，通过促进瘤胃上皮形态及功能的发育，保障羔羊等幼龄反刍动物瘤胃健康；在断奶羔羊精料开食料基础上口腔灌服，可有效提高羔羊的平均日增重，降低料重比，有效提高生产水平，加大对市场的羊肉供应量。吲哚三甲醛可以用于制备促进幼龄反刍动物生长及瘤胃上皮发育的饲料添加剂。

Claims

1.吲哚三甲醛在促进幼龄反刍动物瘤胃发育中的应用。

2.吲哚三甲醛在制备促进幼龄反刍动物瘤胃发育及生长性能的饲料添加剂中的应用。

3.根据权利要求1-2任一所述的应用，其特征在于，所述幼龄反刍动物为羔羊或犊牛。

4.根据权利要求1-2任一所述的应用，其特征在于，所述吲哚三甲醛在动物饲料基础上作为饲料添加剂促进幼龄反刍动物瘤胃复层上皮发育及生长性能中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述动物饲料为代乳料或精料开食料。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述吲哚三甲醛在幼龄反刍动物代乳料或精料开食料基础上口腔灌服。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述口腔灌服吲哚三甲醛为20-40mg/kg体重幼龄反刍动物。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的羔羊或犊牛为出生后到断奶后六周内。