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CN115598267B - 一种格列齐特中潜在遗传毒性杂质的分析方法 - Google Patents

一种格列齐特中潜在遗传毒性杂质的分析方法 Download PDF

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CN115598267B CN202211593048.9A CN202211593048A CN115598267B CN 115598267 B CN115598267 B CN 115598267B CN 202211593048 A CN202211593048 A CN 202211593048A CN 115598267 B CN115598267 B CN 115598267B
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Abstract

本发明涉及药物分析技术领域，涉及一种格列齐特中潜在遗传毒性杂质的分析方法，具体涉及一种潜在遗传毒性杂质的电喷雾高效液相色谱分析方法，用于格列齐特中潜在遗传毒性杂质N‑氨基‑3‑氮杂双环[3,3,0]辛烷的分析检测。首先采用无水甲醇为溶剂制备供试品溶液；再以季铵盐强阴离子交换基团键合高纯硅胶为填充剂，对潜在遗传毒性杂质N‑氨基‑3‑氮杂双环[3,3,0]辛烷进行分离；最后采用电雾式检测器分析检测，实现了对格列齐特中潜在遗传毒性杂质的控制。

Description

一种格列齐特中潜在遗传毒性杂质的分析方法
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种潜在遗传毒性杂质的电喷雾高效液相色谱分析方法，用于格列齐特中潜在遗传毒性杂质N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷的分析检测。
背景技术
格列齐特（Gliclazide），化学名为1-(3-氮杂双环[3,3,0]辛基)-3-对甲苯磺酰脲，分子式为C12H21N3O3S，其结构式为：
格列齐特是由法国施维雅公司研发的第二代磺酰脲类口服降糖药，兼具降血糖及改善凝血功能的双重作用，不仅能够改善糖尿病患者的代谢，而且能够改善或延缓糖尿病血管并发症的发生，是目前治疗2型糖尿病最常用的药物之一，也是我国一线口服降糖药。
关于格列齐特的合成，文献报道多数以环戊烷邻二甲酸酐为原料，在溶剂中与水合肼进行回流反应得到N-氨基-1,2-环戊烷二甲酰亚胺，再经KBH4/AlCl3还原得到N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷及其盐酸盐，最后与对甲苯磺酰脲缩合反应得到格列齐特。合成工艺路线如下：
通过合成路线可知，N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷是合成格列齐特的关键中间体，同时格列齐特分子结构中存在酰胺键，易发生降解而生成N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷，N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷既是格列齐特的工艺杂质，也是降解杂质。此外，N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷属于肼类化合物，为潜在遗传毒性杂质，按照药品注册法规及ICH M7指导原则的相关规定，需要在格列齐特中监测其含量是否超过限度。根据格列齐特的最大日剂量为120 mg/天，以遗传毒性杂质限度水平小于1.5 μg/天计算，将N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷的控制限度定为0.001%。
前期研究结果表明，N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷因分子结构中不含有双键、共轭键及其他有紫外吸收的官能团，无法采用液相色谱紫外检测器定量检测；示差折光检测器、蒸发光检测器等通用型检测器灵敏度较低，无法满足检测需求；质谱检测器，虽然具有较高的灵敏度，但是响应信号易受化合物的离子化程度影响，稳定性较差，且价格昂贵不易推广应用；采用气相色谱分析方法，因格列齐特在高温下降解产生N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷，导致检测结果重复性和准确性较差。
综上所述，为了兼顾格列齐特以及N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷的结构特性及理化性质，同时满足检测灵敏度的要求，本发明开发了一种电喷雾高效液相色谱分析方法，用于格列齐特中潜在遗传毒性杂质N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷的分离、检测。目前，关于格列齐特中遗传毒性杂质的液相色谱测定方法未见有公开的报道，因此，本发明对格列齐特原料药的质量控制及其制剂的用药安全保证具有极其重要的意义。
发明内容
针对现阶段检测格列齐特中遗传毒性杂质的方法存在的需要高端检测设备的问题，本发明提供了一种格列齐特中潜在遗传毒性杂质的分析方法，用于格列齐特中潜在遗传毒性杂质N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷的含量检测。首先采用无水甲醇为溶剂制备供试品溶液；再以季铵盐强阴离子交换基团键合高纯硅胶为填充剂，对潜在遗传毒性杂质N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷进行分离；最后采用电雾式检测器分析检测，实现了对格列齐特中潜在遗传毒性杂质的控制。
本发明的技术方案如下：
一种格列齐特中潜在遗传毒性杂质的分析方法，所述潜在遗传毒性杂质选自肼类化合物；首先采用无水甲醇为溶剂制备供试品溶液；再以季铵盐强阴离子交换基团键合高纯硅胶为填充剂，对潜在遗传毒性杂质进行分离；最后采用电雾式检测器分析检测；
所述潜在遗传毒性杂质为N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷，其结构式为。
优选地，分离采用的流动相A为0.1%七氟丁酸水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱；流速为0.5mL/min；柱温为30℃～40℃，进样体积为20μL。
优选地，梯度洗脱程序为：0-3min，A相：B相体积比为80:20；3-10min，A相：B相体积比为80:20～20:80；10-12min，A相：B相体积比为20:80；12-12.5min，A相：B相体积比为20:80～80:20；12.5-20min，A相：B相体积比为80:20。
优选地，所述电雾式检测器的采样频率为5Hz，过滤常数为3.6s，雾化温度为35℃～45℃。
优选地，采用外标法以峰面积计算供试品溶液中所述潜在遗传毒性杂质的含量；
含量（ppm）= Ai/Ci×Cs/As×106
式中：Ai为供试品溶液色谱图中遗传毒性杂质的峰面积；
     As为对照品溶液色谱图中遗传毒性杂质的峰面积；
     Ci为供试品的浓度，mg/mL；
     Cs为对照品的浓度，ng/mL。
本发明的另一个目的，保护一种格列齐特原料药的质量控制方法，采用上述分析方法进行测定。
本发明的另一个目的，保护一种N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷的定量测定方法，采用上述分析方法进行测定。
本发明提供了一种电喷雾高效液相色谱分析方法，用于格列齐特中潜在遗传毒性杂质N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷的分离与定量分析。实现了对格列齐特中潜在遗传毒性杂质的有效控制，减少了患者的用药副反应发生，一定程度保证了患者用药安全。
为准确检测格列齐特中潜在遗传毒性杂质N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷的含量，本发明首先根据格列齐特的溶解性以及结构特性，采用无水甲醇作为溶剂，实现了供试品溶液的稳定性；其次，选择季铵盐强阴离子交换基团键合高纯硅胶色谱柱，实现了N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷色谱峰的选择性以及与其他色谱峰的分离；此外，在流动相中加入七氟丁酸，实现了N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷色谱峰的柱保留及对称性，最后，根据N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷的结构特性以及检测灵敏度要求，采用电雾式检测器进行定量分析。同时，对流动相的组成、梯度洗脱程序以及雾化器的温度等色谱条件进行筛选，最终确定了最优的分析方法。
本发明的有益效果在于：
1. 本发明所用溶剂无水甲醇，经济易得、毒性低，且不干扰格列齐特中其他有紫外吸收杂质的检测以及含量测定，因此本发明分析方法的供试品溶液可用于格列齐特有关物质的检测及含量测定，很大程度上提高了工作效率、节约了工作成本。
2. 本发明所用溶剂无水甲醇，有效避免了格列齐特的降解，实现了供试品溶液的稳定性，24小时内供试品溶液中N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷峰面积的RSD为3.4%，同时对格列齐特及杂质N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷均有较高的溶解度。
3. 本发明所述分析方法采用季铵盐强阴离子交换基团键合高纯硅胶色谱柱，有效实现了N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷色谱峰的选择性以及与其他色谱峰的分离，N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷峰的理论塔板数为17789，与相邻峰的分离度为27.7。
4. 本发明所述分析方法在流动相中加入0.1%七氟丁酸，梯度洗脱，实现了N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷色谱峰的柱保留及对称性，保留时间为4.417分钟，拖尾因子为0.9。
5. 本发明所述分析方法采用电雾式检测器，灵敏度高，稳定性好。不仅可以有效检出杂质N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷，检测限浓度为2.5ng/mL，定量限浓度为8.25ng/mL，达到质谱检测器的灵敏度要求，同时有效避免了质谱检测器信号稳定性差的弊端，N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷对照品溶液24小时内峰面积的RSD为2.6%。
6. 本发明分析方法重复性好，准确度高。N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷的重复性RSD为2.1%；平均回收率为99.1%（n=9），RSD为2.9%。
7. 本发明分析方法检测潜在遗传毒性杂质N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷，操作简便快速，检测成本低廉，与质谱检测器相比，具有更强的推广性以及更高的应用价值。
8. 本发明方法经过方法学验证，结果均符合要求，证明本发明可用于格列齐特中潜在遗传毒性杂质N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷的分离和定量分析。对格列齐特原料药的质量控制及其制剂的用药安全具有重要意义，同时N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷常作为起始物料及中间体用于原料药的合成工艺，因此本发明也为其他药物中N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷的定量分析提供了参考。
附图说明
图1为空白溶剂色谱图；
图2为对照品溶液色谱图；
图3为供试品溶液色谱图；
图4为N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，而不是对本发明进行限制。实施例中所用实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可以从商业途径得到。因此熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1 溶剂的考察
1.供试品溶液制备
因格列齐特结构和理化性质的特殊性，我们必须兼顾其溶解性以及溶液的稳定性，因此我们对溶剂进行筛选。
取本品适量，精密称定，选择三种不同溶剂溶解并稀释制成每1mL中约含4mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液。
溶剂1：无水甲醇
溶剂2：乙腈
溶剂3：乙腈-0.1%甲酸溶液（1:1）
2.色谱条件
仪器：液相色谱仪。色谱柱：Thermo Hypersil GOLD SAX（4.6×150mm，3μm）；流动相A为0.1%七氟丁酸水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱，流速为0.5mL/min；柱温为30℃～40℃，进样体积为20μL；电雾式检测器，采样频率为5Hz，滤过常数为3.6s，雾化温度为40℃。
表1 梯度洗脱程序见下表
3.结果与结论
表2 溶剂筛选结果
结论：由表2可知，采用无水甲醇为溶剂，供试品溶液室温放置24小时，潜在遗传毒性杂质N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷峰面积的RSD小于5%，溶液稳定性良好，而采用乙腈、乙腈-0.1%甲酸溶液（1:1）为溶剂，溶液稳定性差。
实施例2 色谱柱的选择
1.供试品溶液制备
取本品适量，精密称定，用无水甲醇溶解并稀释制成每1mL中约含4mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液。
2.色谱条件
选择三种不同的色谱柱，按照实施例1中确定的色谱条件，分别进行测定。
色谱柱1：Thermo Hypersil GOLD SAX（4.6×150mm，3μm）；
色谱柱2：Thermo Hypersil GOLD C18（4.6×150mm，3μm）；
色谱柱3：Thermo Hypersil GOLD aQ（4.6×150mm，3μm）。
3.结果与结论
采用Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱，潜在遗传毒性杂质N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷的柱保留差，采用Thermo Hypersil GOLD aQ色谱柱，N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷峰与格列齐特峰无法达到基线分离，而使用Thermo Hypersil GOLD SAX色谱柱，N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷色谱峰的保留时间合适，峰型较好，与格列齐特峰分离度符合要求。故选择Thermo Hypersil GOLD SAX（4.6×150mm，3μm）作为色谱柱。
实施例3 检测器雾化温度的考察
1. 对照品溶液制备
取N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷对照品适量，精密称定，用无水甲醇定量溶解并稀释制成每1mL中约含0.04μg的溶液，摇匀，作为对照品溶液。
2. 色谱条件
按照实施例1中确定的色谱条件，其他条件不变，分别设置检测器雾化温度为30℃、35℃、40℃、45℃。
3. 结果与结论
表3 雾化器温度考察结果
结论：由表3可知，雾化温度升高，N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷峰面积增大，但在35℃至45℃时，N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷峰面积变化不明显，此外，考虑到温度高可能导致样品降解，温度低可能导致样品雾化不完全对检测器造成污染，最终兼顾检测结果的稳定性以及准确性，将雾化器温度设定为40℃。
实施例4 流动相的选择
1. 对照品溶液的制备
取N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷对照品适量，精密称定，用无水甲醇定量溶解并稀释制成每1mL中约含0.04μg的溶液，摇匀，作为对照品溶液。
2. 色谱条件
我们选择三种不同极性的有机溶剂作为洗脱相，按照设定色谱条件，分别进行测定。
洗脱相1：乙腈；洗脱相2：甲醇；洗脱相3：乙酸乙酯。
3. 结果与结论
采用乙腈作为洗脱相，对照品溶液色谱图中取N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷基本无保留，与溶剂几乎共洗脱；采用乙酸乙酯作为洗脱相，色谱峰保留时间过长且严重拖尾；而使用甲醇作为洗脱相，色谱峰保留时间合适，在水相中加入0.1%七氟丁酸后，保留时间的重复性得到极大改善，且峰形较好。故选择甲醇作为洗脱相，同时在水相中加入0.1%七氟丁酸。
实施例5 方法学考察
专属性考察：空白溶剂不干扰杂质N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷的检测；空白溶剂色谱图如图1所示。
检出限/定量限考察：精密量取杂质N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷对照品适量，用无水甲醇溶解并逐级进行稀释，选择信噪比约为3的溶液作为检出限溶液，信噪比约为10的溶液作为定量限溶液。
仪器精密度考察：取对照品溶液，按照确定的色谱条件，连续进样6次，计算各杂质峰面积的RSD；对照品溶液色谱图如图2所示。
线性考察：取杂质N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷对照品适量，精密称定，用无水甲醇定量溶解并稀释制成每1mL中约含0.009µg～0.213µg的7个不同浓度溶液，以浓度对峰面积作线性回归方程；结果见图4。
重复性考察：按照确定的方法制备供试品溶液6份，按照确定的色谱条件进行分析检测，计算供试品溶液中杂质N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷含量的RSD；供试品溶液色谱图如图3所示。
方法准确度考察：按照确定的方法制备对照品溶液。另取本品约40mg，精密称定，置10mL量瓶中，精密加入每1mL中约含杂质N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷2μg的溶液0.1mL（50%限度浓度）、0.2mL（100%限度浓度）、0.3mL（150%限度浓度），用无水甲醇溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液，每种浓度制备3份。按照确定的色谱条件分析检测，计算杂质N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷的回收率。
溶液稳定性考察：取“方法准确度考察”项下100%限度浓度供试品溶液与对照品溶液，室温条件下（25℃）分别于0、4、8、12、16、20、24小时，按照确定的色谱条件进行分析检测，计算杂质N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷峰面积的RSD。
方法耐用性考察：取“重复性考察”项下供试品溶液，分别改变柱温（±5℃）、雾化器提温度（±5℃）进行分析检测，其他色谱条件不变。结果表明，柱温、及雾化温度微调后，杂质N-氨基-3-氮杂双环[3,3,0]辛烷含量无显著变化。
表4 方法学考察结果
以上实施例仅用以详细说明本发明的技术方案而非限制，本领域的专业技术人员可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (3)

1.一种格列齐特中潜在遗传毒性杂质的分析方法，其特征在于，所述潜在遗传毒性杂质选自肼类化合物；首先采用无水甲醇为溶剂制备供试品溶液；再以季铵盐强阴离子交换基团键合高纯硅胶为填充剂，对潜在遗传毒性杂质进行分离；最后采用电雾式检测器分析检测；
所述潜在遗传毒性杂质为N -氨基-3 -氮杂双环[ 3 ,3 ,0 ] 辛烷，其结构式为；
分离采用的流动相A为0.1%七氟丁酸水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱；流速为0.5mL/min；柱温为30℃～40℃，进样体积为20μL；
梯度洗脱程序为：0-3min，A相：B相体积比为80:20；3-10min，A相：B相体积比为80:20～20:80；10-12min，A相：B相体积比为20:80；12-12.5min，A相：B相体积比为20:80～80:20；12.5-20min，A相：B相体积比为80:20；
所述电雾式检测器的采样频率为5Hz，过滤常数为3.6s，雾化温度为40℃。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，采用外标法以峰面积计算供试品溶液中所述潜在遗传毒性杂质的含量；
含量（ppm）= Ai/Ci×Cs/As×106
式中：Ai为供试品溶液色谱图中遗传毒性杂质的峰面积；
As为对照品溶液色谱图中遗传毒性杂质的峰面积；
Ci为供试品的浓度，mg/mL；
Cs为对照品的浓度，ng/mL。
3.一种格列齐特原料药的质量控制方法，其特征在于，采用权利要求1或2所述的分析方法进行测定。
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