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CN115557812A - 一种含聚谷氨酸的复合微生物菌肥、制备方法和应用 - Google Patents

一种含聚谷氨酸的复合微生物菌肥、制备方法和应用 Download PDF

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CN115557812A
CN115557812A CN202211323758.XA CN202211323758A CN115557812A CN 115557812 A CN115557812 A CN 115557812A CN 202211323758 A CN202211323758 A CN 202211323758A CN 115557812 A CN115557812 A CN 115557812A
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polyglutamic acid
wswfj40
yws
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华小兵
李思颖
王斌
罗启鹏
李建云
张志红
王林涛
朱永立
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Microbial Fermentation Engineering Research Center Co ltd Of Yunnan Province
Original Assignee
Microbial Fermentation Engineering Research Center Co ltd Of Yunnan Province
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Abstract

本发明公开了一种含聚谷氨酸的复合微生物菌肥、制备方法和应用，涉及微生物肥料领域，解决了现有技术中土壤养分贫瘠，引发了土壤酸化、盐渍化、土壤板结、病虫害发生严重、烟叶品质难以持续提升的问题。本发明含聚谷氨酸的复合微生物菌肥，包括如下质量百分比的组分：复合微生物菌液15‑30％，助剂70‑85％，且复合微生物菌液与助剂的质量百分数之和为100％，其中，助剂包括聚谷氨酸、膨润土、氧化淀粉粘合剂和烟末型腐熟有机肥。本发明含聚谷氨酸的复合微生物菌肥可以土壤调理剂的方式对土壤养分状况和理化性质的调控，从而促进烟株的生长、提高烟株抗病性、改善烤烟经济性状以及提高烟叶品质，有助于烟草企业持续稳定健康发展。

Description

一种含聚谷氨酸的复合微生物菌肥、制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物肥料技术领域，尤其涉及一种含聚谷氨酸的复合微生物菌肥、制备方法和应用。
背景技术
中国是世界烟草生产第一大国，其烟草种植面积、总产量、卷烟产量、卷烟销售均居世界首位。
近年来，由于对农药、化肥等的滥用，再加上长期连作，土壤养分贫瘠，引发了土壤酸化、盐渍化、土壤板结、病虫害发生严重、烟叶品质难以持续提升等一系列问题，对植烟土壤以及烟株的产量、质量都造成严重影响。因此，筛选出一种能够通过调节土壤微生态平衡，构建生物屏障，从而缓解土壤酸化、平衡酸碱、改善土壤理化性质，兼具肥料增效、提高保肥效果的微生物菌肥已成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提出一种含聚谷氨酸的复合微生物菌肥、制备方法和应用，解决了现有技术中土壤养分贫瘠，引发了土壤酸化、盐渍化、土壤板结、病虫害发生严重、烟叶品质难以持续提升的技术问题。本发明优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明含聚谷氨酸的复合微生物菌肥，包括如下质量百分比的组分：复合微生物菌液15-30％，助剂70-85％，且所述复合微生物菌液与所述助剂的质量百分数之和为100％，其中，所述助剂包括聚谷氨酸、膨润土、氧化淀粉粘合剂和烟末型腐熟有机肥。
根据一个优选实施方式，所述助剂中各组分的重量份为：聚谷氨酸5-10份，膨润土8-12份，氧化淀粉粘合剂2-4份，烟末型腐熟有机肥30-40份。
根据一个优选实施方式，所述复合微生物菌液包括由菌株WSWFJ40活化、发酵制得的地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌液，由菌株YWS-20-2071活化、发酵制得的枯草芽孢杆菌YWS-20-2071菌液，以及由菌株WSWFJ41活化、发酵制得的芽孢杆菌WSWFJ41菌液。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，其编号为WSWFJ40，保藏登记号为CGMCC No.20150，保藏日期：2020年06月28日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其编号为YWS-20-2071，保藏登记号为CGMCC No.20199，保藏日期：2020年07月06日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 3号。
芽孢杆菌(Bacillus sp.)，其编号为WSWFJ41，保藏登记号为CGMCC No.20151，保藏日期：2020年06月28日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
根据一个优选实施方式，地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌液、枯草芽孢杆菌 YWS-20-2071菌液和芽孢杆菌WSWFJ41菌液的质量比为1∶1∶1。
根据一个优选实施方式，所述复合微生物菌液中，有效活菌数＞ 10.0×1010cfu/g。所得含聚谷氨酸的复合微生物菌肥中的有效活菌数为 5.0×1010cfu/g-10.0×1010cfu/g。
本发明中任一项技术方案所述的含聚谷氨酸的复合微生物菌肥的制备方法，包括如下步骤：
按照质量百分比取各原料备用，其中，复合微生物菌液15-30％，助剂 70-85％，且所述复合微生物菌液与所述助剂的质量百分数之和为100％；
将所述复合微生物菌液与所述助剂充分混合均匀后连续搅拌10min以上，即得含聚谷氨酸的复合微生物菌肥。
根据一个优选实施方式，所述复合微生物菌液的制备方法包括如下步骤：
以地衣芽孢杆菌WSWFJ40为菌种，将菌种进行活化、发酵制得地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌液；
以枯草芽孢杆菌YWS-20-2071为菌种，将菌种进行活化、发酵制得枯草芽孢杆菌YWS-20-2071菌液；
以芽孢杆菌WSWFJ41为菌种，将菌种进行活化、发酵制得芽孢杆菌 WSWFJ41菌液；
将地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌液、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071菌液和芽孢杆菌WSWFJ41菌液混合，即得所述复合微生物菌液，其中，地衣芽孢杆菌 WSWFJ40菌液、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071菌液和芽孢杆菌WSWFJ41菌液的质量比为1∶1∶1。
根据一个优选实施方式，制备地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌液、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071菌液和芽孢杆菌WSWFJ41菌液包括如下步骤：
菌种活化，将-85℃下保存的地衣芽孢杆菌WSWFJ40、枯草芽孢杆菌 YWS-20-2071和芽孢杆菌WSWFJ41分别在LB固体培养基上进行活化，采用划线培养的方式，于30℃～35℃条件下培养24～48h，分别挑取单菌落在第一固体培养基上继续进行划线培养，在30℃～35℃条件下培养24～48h，分别得到活化的地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌株、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071菌株和芽孢杆菌WSWFJ41菌株；
种子液制备，用无菌接种环分别刮取已活化的地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌株、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071菌株和芽孢杆菌WSWFJ41菌株，并分别接种到50ml的LB液体培养基中，在温度30℃～35℃、转速150rpm/min条件下培养 24～48h，分别得到地衣芽孢杆菌WSWFJ40种子液、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071 种子液和芽孢杆菌WSWFJ41种子液；
发酵液制备，分别将地衣芽孢杆菌WSWFJ40种子液、枯草芽孢杆菌 YWS-20-2071种子液和芽孢杆菌WSWFJ41种子液按照1‰-5‰的比例接种到发酵罐的发酵培养液中，在温度为35℃-38℃，转速为100-150rpm/min条件下培养48h-60h，分别得到地衣芽孢杆菌WSWFJ40发酵液、枯草芽孢杆菌 YWS-20-2071发酵液和芽孢杆菌WSWFJ41发酵液，地衣芽孢杆菌WSWFJ40 发酵液、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071发酵液和芽孢杆菌WSWFJ41发酵液即分别为地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌液、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071菌液和芽孢杆菌WSWFJ41菌液。
根据一个优选实施方式，所述LB固体培养基包括如下配比的组分：蛋白胨10g，酵母粉5g，琼脂粉5g，水1L；
所述第一固体培养基包括如下配比的组分：米糠1-3份、玉米粉1-2份、麸皮1-2份、豆饼粉1-3份、花生饼粉0.5-1份，各原料重量之和60％-80％的水；
所述LB液体培养基包括如下配比的组分：蛋白胨10g，酵母粉5g，水1L；
所述发酵培养液包括如下配比的组分：牛肉膏1-3份，黄豆粉2-4份，蔗糖0.5-1份，玉米粉2-3份，碳酸钙0.8-1.5份，鱼粉1-2份，磷酸二氢钾0.05-0.1 份，磷酸氢二钾0.05-0.1份，氯化钠1-5份，消泡剂0.1-0.3份，水500-1000份，并且所述发酵培养液的pH采用盐酸和氢氧化钠调节至6.8-7.5。
本发明中任一项技术方案所述的含聚谷氨酸的复合微生物菌肥在烟草种植中的应用，所述含聚谷氨酸的复合微生物菌肥作为底肥、定根肥和/或追肥施用，并且所述含聚谷氨酸的复合微生物菌肥的用量为50～150kg/亩。
本发明提供的含聚谷氨酸的复合微生物菌肥、制备方法和应用至少具有如下有益技术效果：
本发明含聚谷氨酸的复合微生物菌肥，包括如下质量百分比的组分：复合微生物菌液15-30％，助剂70-85％，且所述复合微生物菌液与所述助剂的质量百分数之和为100％，其中，所述助剂包括聚谷氨酸、膨润土、氧化淀粉粘合剂和烟末型腐熟有机肥，一方面，助剂中的聚谷氨酸作为植物增产营养素，具有超强亲水性与保水能力，可作为肥料增效剂，并增加植物抗病能力，还能改善土壤理化性质，有利于植株健康生长；第二方面，本发明含聚谷氨酸的复合微生物菌肥，可综合各菌株和助剂的优良性能，具有如下功能：(1)富集养分，提高肥料利用率：既富集氮磷钾，也富集钙、镁等中微量养分，满足作物多种需求，提高土壤养分的供应能力，促进植株对养分的吸收，利于植株生长；(2) 改善土壤理化性质：含聚谷氨酸的复合微生物菌肥本身含有有机质，可平衡酸碱，其高吸附性还能提高土壤对有机物的回收，有利于有机质含量的提高和土壤容量下降，提高土壤的保水保肥能力，促进作物新陈代谢，防止土壤板结； (3)长效缓释，提质增产：通过对土壤理化性质的调节，减缓养分的淋失和挥发，提高产量和质量；(4)增强植物抗性：能够刺激植物根毛和新生根系的生长，在旱涝和低温等逆境环境下，可有效地保证水分和养分的正常吸收，缓冲旱、涝、寒等逆境对植物根系造成的损伤以及产生防控效应，减少病虫害的发生；此外，该菌肥是以生物技术为载体，完全符合国家倡导的有机农业、绿色农业、生态农业，也符合绿色生态发展的必然要求。
即本发明所涉及的含聚谷氨酸的复合微生物菌肥、制备方法和应用能够有效解决现有技术中所存在的植烟土壤酸化、盐渍化、土壤板结、病虫害发生严重、烟叶品质难以持续提升等一系列问题，以土壤调理剂的方式对土壤养分状况和理化性质的调控，从而促进烟株的生长、提高烟株抗病性、改善烤烟经济性状以及提高烟叶品质，有助于烟草企业持续稳定健康发展。
此外，本发明优选技术方案还具有如下有益技术效果：
本发明优选技术方案含聚谷氨酸的复合微生物菌肥，复合微生物菌液包括由菌株WSWFJ40活化、发酵制得的地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌液，由菌株 YWS-20-2071活化、发酵制得的枯草芽孢杆菌YWS-20-2071菌液，以及由菌株 WSWFJ41活化、发酵制得的芽孢杆菌WSWFJ41菌液，一方面，地衣芽孢杆菌 WSWFJ40具有减少植物土传病害、提高幼苗成活率、降解拟除虫菊酯类农残的功效；第二方面，枯草芽孢杆菌YWS-20-2071不仅具有活化土壤、缓解连作障碍的功效，还是制备聚谷氨酸的主要菌株；第三方面，芽孢杆菌WSWFJ41 也具有改良土壤的功效。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
下面结合实施例1和2对本发明含聚谷氨酸的复合微生物菌肥、制备方法和应用进行详细说明。
实施例1
本实施例含聚谷氨酸的复合微生物菌肥的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：按照质量百分比取各原料备用，其中，复合微生物菌液15-30％，助剂70-85％，且所述复合微生物菌液与所述助剂的质量百分数之和为100％；
步骤11：制备地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌液、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071 菌液和芽孢杆菌WSWFJ41菌液，具体包括如下步骤：
菌种活化，将-85℃下保存的地衣芽孢杆菌WSWFJ40、枯草芽孢杆菌 YWS-20-2071和芽孢杆菌WSWFJ41分别在LB固体培养基上进行活化，采用划线培养的方式，于30℃～35℃条件下培养24～48h，分别挑取单菌落在第一固体培养基上继续进行划线培养，在30℃～35℃条件下培养24～48h，分别得到活化的地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌株、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071菌株和芽孢杆菌WSWFJ41菌株。
种子液制备，用无菌接种环分别刮取已活化的地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌株、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071菌株和芽孢杆菌WSWFJ41菌株，并分别接种到50ml的LB液体培养基中，在温度30℃～35℃、转速150rpm/min条件下培养 24～48h，分别得到地衣芽孢杆菌WSWFJ40种子液、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071 种子液和芽孢杆菌WSWFJ41种子液。
发酵液制备，分别将地衣芽孢杆菌WSWFJ40种子液、枯草芽孢杆菌 YWS-20-2071种子液和芽孢杆菌WSWFJ41种子液按照1‰-5‰的比例接种到发酵罐的发酵培养液中，在温度为35℃-38℃，转速为100-150rpm/min条件下培养48h-60h，分别得到地衣芽孢杆菌WSWFJ40发酵液、枯草芽孢杆菌 YWS-20-2071发酵液和芽孢杆菌WSWFJ41发酵液，地衣芽孢杆菌WSWFJ40 发酵液、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071发酵液和芽孢杆菌WSWFJ41发酵液即分别为地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌液、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071菌液和芽孢杆菌WSWFJ41菌液。
LB固体培养基包括如下配比的组分：蛋白胨10g，酵母粉5g，琼脂粉5g，水1L。
第一固体培养基包括如下配比的组分：米糠1份、玉米粉1份、麸皮1份、豆饼粉1份、花生饼粉0.5份，各原料重量之和60％的水。
LB液体培养基包括如下配比的组分：蛋白胨10g，酵母粉5g，水1L。
发酵培养液包括如下配比的组分：牛肉膏1份，黄豆粉2份，蔗糖0.5份，玉米粉2份，碳酸钙0.8份，鱼粉1份，磷酸二氢钾0.05份，磷酸氢二钾0.05 份，氯化钠2份，消泡剂0.2份，水500份，并且发酵培养液的pH采用盐酸和氢氧化钠调节至7.0。
步骤12：将地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌液、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071 菌液和芽孢杆菌WSWFJ41菌液混合，即得复合微生物菌液，其中，地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌液、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071菌液和芽孢杆菌WSWFJ41 菌液的质量比为1∶1∶1。复合微生物菌液中，有效活菌数＞10.0×1010cfu/g。
步骤2：将复合微生物菌液与所述助剂充分混合均匀后连续搅拌10min以上，即得含聚谷氨酸的复合微生物菌肥。其中，复合微生物菌液15-30％，助剂 70-85％，且所述复合微生物菌液与所述助剂的质量百分数之和为100％，含聚谷氨酸的复合微生物菌肥中的有效活菌数为5.0×109cfu/g-10.0×109cfu/g。助剂包括如下重量份的组分：聚谷氨酸5-10份，膨润土8-12份，氧化淀粉粘合剂2-4 份，烟末型腐熟有机肥30-40份。
本实施例含聚谷氨酸的复合微生物菌肥在烟草种植中应用，含聚谷氨酸的复合微生物菌肥作为底肥、定根肥和/或追肥施用，并且含聚谷氨酸的复合微生物菌肥的用量为100kg/亩。
对本实施例含聚谷氨酸的复合微生物菌肥的效果进行验证。
1、材料与方法
1.1试验时间、地点
试验于2021年3月至9月在云县湖南中烟基地单元内的和尚庄附近进行。试验地土壤pH 6.56，有机质21.04g/kg，碱解氮98.49mg/kg，速效磷80.98mg/kg，速效钾192.50mg/kg，基础肥力中等且分布均匀，排灌方便，远离污染源。
1.2供试材料
供试品种：红花大金元；
供试肥料：烟草专用复合肥(N-P2O5-K2O＝11-15-22)、硫酸钾(K2O>150％) 由当地烟草公司提供；含聚谷氨酸的复合微生物菌肥(由云南省微生物发酵工程研究中心有限公司提供)。
1.3试验设计
试验设2个处理：
对照：当地常规施肥；
示范：当地常规施肥+本实施例含聚谷氨酸的复合微生物菌肥(100kg/亩)，并采用穴施、撒施的方法作为底肥、定根肥、追肥进行施用。
试验除肥料施用不同外，其他生产管理措施等都按照当地优质烟叶生产标准执行。具体试验处理如下表1：
表1各处理肥料用量表
Figure BDA0003911575160000081
Figure BDA0003911575160000091
1.4调查项目及方法
1.4.1土壤养分变化情况调查
于施肥前和最终收获后进行土壤样品的采集，对所采集的土壤样品进行 pH、有机质、碱解氮、速效磷、速效钾的检测。
1.4.2农艺性状调查
旺长、团棵、现蕾、封顶各生育期每个示范区选取10株具有代表性的烟株按照YC/T142-2010烟草农艺性状调查测量方法调查，观察测定株高、茎围、节距、有效叶片数、最大叶长和最大叶宽。
1.4.3病害发生情况调查
按照GB/T 23222-2008烟草病虫害分级及调查方法，对各处理进行常见病害系统调查，并统计各病害的发病率。
1.4.4经济性状调查
各处理烟叶在正常成熟时分别采烤，按照同一标准进行分级、交售。统计各处理烤烟经济性状，包括亩产量、亩产值、均价、上等烟比例、中上等烟比例。
1.4.5烟叶品质分析
试验各处理分别选取有代表性的烟株定位挂牌标记留取中部叶，采烤后收集整理，按照部位各留2kg的中部烟叶，进行常规化学成分分析。
2、结果与分析
2.1土壤养分含量统计
由表2可知：烤烟移栽前，其土壤偏酸性，而经过不同施肥处理种植后，对照组的pH较种植前升高，但仍偏酸性，示范组pH较种植前升高，且将其调节至中性；较种植前，对照组有机质降低2g/kg，示范组有机质含量则升高了 5.99g/k；就碱解氮而言，对照组较种植前提高1.53％，示范组较种植前提高 44.70％；就速效磷而言，较种植前，对照组合示范组的含量均有所增加，且示范组含量更高，就速效钾而言，较种植前，对照组的含量较种植前，提高3.5％，示范组则较种植前提高达53.50％。整体而言，移栽前和移栽后土壤理化性质发生了改变，且施加了含聚谷氨酸的复合微生物菌肥的示范组对土壤理化性质具有较大影响，平衡了土壤的酸碱性，使土壤调节为中性，富集养分，提高土壤中的养分含量。
表2土壤养分状况统计表
Figure BDA0003911575160000101
2.2经济性状调查
烟叶的亩产值、亩产量、均价和上等烟比例等，一方面，受烟株健康状况的影响，另一方面，通过影响烟草的经济性状直接决定了烟农的经济收入；由表3可知：施加了含聚谷氨酸的复合微生物菌肥的示范组烟株亩产量高达 256.6kg，较未施加含聚谷氨酸的复合微生物菌肥的对照组高出55.8kg/亩，亩产值达8262.52元；上等烟比例和中上等烟比例较对照组分别高出28.9％和16.7％。
表3烤烟产值产量统计表
Figure BDA0003911575160000102
Figure BDA0003911575160000111
2.3烤烟农艺性状调查
随机选取对照组和示范组各10株，进行农艺性状测定，由表4的结果表明：示范组：施加了含聚谷氨酸的复合微生物菌肥的烟株整体农艺性状指标在烟草生长的团棵期、旺长期和封顶后均优于未施加含聚谷氨酸的复合微生物菌肥的对照组。
表4烤烟农艺性状调查记录表
Figure BDA0003911575160000112
2.4烤烟病害发生情况统计
试验地主要病害发生情况如表5所示。从表5中可以看出，试验地发生的主要病害有立枯病、根腐病、赤星病、黑胫病；其中立枯病、根腐病发病情况较为严重。整体来看，各处理病害的发生情况以示范组的最轻，其中对赤星病和黑胫病的防治效果较好，均未发病；而对照组的发病率较高，其中立枯病和根腐病的发病率均超过6％，较示范组分别高出5.33％、8.34％；说明在常规施肥的基础上增施含聚谷氨酸的复合微生物菌肥能提高烟株的抗病性，对烟草病害防控具有一定意义。
表5主要病害发病率情况统计表
处理 立枯病(％) 根腐病(％) 赤星病(％) 黑胫病(％)
A 6.00 10.00 3.12 2.78
B 0.67 1.66 0.00 0.00
2.5烤烟内在成分分析
总糖、总氮、烟碱和还原糖是决定烟叶品质的主要成分；由表6可以看出，各处理中部叶和上部叶的总氮和烟碱含量偏低，化学成分协调性均较差，整体来看，施加了聚谷氨酸型微生物菌肥的处理B的总糖、总氮、烟碱含量较高，化学成分协调性略好于常规施肥的处理A。
表6化学成分分析表
Figure BDA0003911575160000121
3、结论与讨论
通过对土壤养分状况调查、烤烟农艺性状、经济性状、病害发生状况以及烟叶化学成分分析，可知使用含聚谷氨酸的复合微生物菌肥可以平衡酸碱，改善土壤理化性质，提高土壤养分含量，明显改善烟草的农艺性状、经济性状，提高烟叶品质，而上述的性状和烟叶品质又受土壤养分状况和理化性质的影响，因此，研制一种聚谷氨酸复合微生物菌肥作为土壤调理剂来调节土壤养分状况，改善土壤理化性质至关重要。
实施例2
本实施例含聚谷氨酸的复合微生物菌肥的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：按照质量百分比取各原料备用，其中，复合微生物菌液15-30％，助剂70-85％，且所述复合微生物菌液与所述助剂的质量百分数之和为100％；
步骤11：制备地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌液、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071 菌液和芽孢杆菌WSWFJ41菌液，具体包括如下步骤：
菌种活化，将-85℃下保存的地衣芽孢杆菌WSWFJ40、枯草芽孢杆菌 YWS-20-2071和芽孢杆菌WSWFJ41分别在LB固体培养基上进行活化，采用划线培养的方式，于30℃～35℃条件下培养24～48h，分别挑取单菌落在第一固体培养基上继续进行划线培养，在30℃～35℃条件下培养24～48h，分别得到活化的地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌株、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071菌株和芽孢杆菌WSWFJ41菌株。
种子液制备，用无菌接种环分别刮取已活化的地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌株、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071菌株和芽孢杆菌WSWFJ41菌株，并分别接种到50ml的LB液体培养基中，在温度30℃～35℃、转速150rpm/min条件下培养 24～48h，分别得到地衣芽孢杆菌WSWFJ40种子液、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071 种子液和芽孢杆菌WSWFJ41种子液。
发酵液制备，分别将地衣芽孢杆菌WSWFJ40种子液、枯草芽孢杆菌 YWS-20-2071种子液和芽孢杆菌WSWFJ41种子液按照1‰-5‰的比例接种到发酵罐的发酵培养液中，在温度为35℃-38℃，转速为100-150rpm/min条件下培养48h-60h，分别得到地衣芽孢杆菌WSWFJ40发酵液、枯草芽孢杆菌 YWS-20-2071发酵液和芽孢杆菌WSWFJ41发酵液，地衣芽孢杆菌WSWFJ40 发酵液、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071发酵液和芽孢杆菌WSWFJ41发酵液即分别为地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌液、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071菌液和芽孢杆菌WSWFJ41菌液。
LB固体培养基包括如下配比的组分：蛋白胨10g，酵母粉5g，琼脂粉5g，水1L。
第一固体培养基包括如下配比的组分：米糠1份、玉米粉1份、麸皮1份、豆饼粉1份、花生饼粉0.5份，各原料重量之和60％的水。
LB液体培养基包括如下配比的组分：蛋白胨10g，酵母粉5g，水1L。
发酵培养液包括如下配比的组分：牛肉膏1份，黄豆粉2份，蔗糖0.5份，玉米粉2份，碳酸钙0.8份，鱼粉1份，磷酸二氢钾0.05份，磷酸氢二钾0.05 份，氯化钠2份，消泡剂0.2份，水500份，并且发酵培养液的pH采用盐酸和氢氧化钠调节至7.0。
步骤12：将地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌液、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071 菌液和芽孢杆菌WSWFJ41菌液混合，即得复合微生物菌液，其中，地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌液、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071菌液和芽孢杆菌WSWFJ41 菌液的质量比为1∶1∶1。复合微生物菌液中，有效活菌数＞10.0×1010cfu/g。
步骤2：将复合微生物菌液与所述助剂充分混合均匀后连续搅拌10min以上，即得含聚谷氨酸的复合微生物菌肥。其中，复合微生物菌液15-30％，助剂 70-85％，且所述复合微生物菌液与所述助剂的质量百分数之和为100％，含聚谷氨酸的复合微生物菌肥中的有效活菌数为5.0×109cfu/g-10.0×109cfu/g。助剂包括如下重量份的组分：聚谷氨酸5-10份，膨润土8-12份，氧化淀粉粘合剂2-4 份，烟末型腐熟有机肥30-40份。
本实施例含聚谷氨酸的复合微生物菌肥在烟草种植中应用，含聚谷氨酸的复合微生物菌肥作为底肥、定根肥和/或追肥施用，并且含聚谷氨酸的复合微生物菌肥的用量为150kg/亩。
对本实施例含聚谷氨酸的复合微生物菌肥的效果进行验证。
1、材料与方法
1.1试验时间、地点
试验于试验时间为2021年4月19日，在云南省昭通市昭阳区布嘎乡有代表性的烟区进行。试验地土壤pH 8.56，偏碱性，试验地地势平坦、土壤肥力中等、肥力分布均匀，光照及排灌条件良好。
1.2供试材料
供试品种：当地主栽品种云烟87
供试肥料：烟草专用复合肥(N∶P2O5∶K2O＝12∶10∶24)，硝酸钾，农家肥(由当地烟草公司提供)；含聚谷氨酸的复合微生物菌肥(由云南省微生物发酵工程研究中心有限公司提供)；传统土壤调理剂(白云石粉)通过当地市场购入。
1.3试验设计
采用小区试验的模式进行研究，试验设3个处理，每个处理3次重复，小区采用随机区组排列，每个小区烟株的行株距为120cm×50cm，小区面积为 144m2。试验地周围设2行保护行，田间管理按当地优质烤烟生产方式进行。
处理A(对照)：当地常规施肥；
处理B：当地常规施肥+传统土壤调理剂(白云石粉)；
处理C(示范)：当地常规施肥+本实施例含聚谷氨酸的复合微生物菌肥 (150kg/亩)作为底肥、定根肥、追肥进行施用。
试验除肥料施用不同外，其他生产管理措施等都按照当地优质烟叶生产标准执行。
1.4调查项目及方法
1.4.1土壤养分变化情况调查
于施肥前和施肥后进行土壤样品的采集，对所采集的土壤样品进行pH、有机质、水解性氮、有效磷、速效钾和氯离子含量的检测。
1.4.2农艺性状调查
旺长、团棵、现蕾、封顶各生育期每个示范区选取10株具有代表性的烟株按照YC/T142-2010烟草农艺性状调查测量方法调查，观察测定株高、茎围、节距、有效叶片数、最大叶长和最大叶宽。
1.4.3病害发生情况调查
按照GB/T 23222-2008烟草病虫害分级及调查方法，对各处理进行常见病害系统调查，并统计各病害的发病率。
1.4.4经济性状调查
各处理烟叶在正常成熟时分别采烤，按照同一标准进行分级、交售。统计各处理烤烟经济性状，包括亩产量、亩产值、均价、上等烟比例、中上等烟比例。
1.4.5烟叶品质分析
试验各处理分别选取有代表性的烟株定位挂牌标记留取中部叶，采烤后收集整理，按照部位各留2kg的中部烟叶，进行常规化学成分分析。
2、结果与分析
2.1土壤养分含量统计
由表7可知：施肥前，供试土壤偏碱性，而施肥后，土壤养分各项状况均有所改变，其中常规施肥的处理A以及施用市售土壤调理剂的处理B对pH影响不大，土壤仍然偏碱性，不利于烟株生长，而施用了本实施例含聚谷氨酸的复合微生物菌肥的处理C不仅改变土壤团粒结构，有效降低土壤容重，还能平衡酸碱性，使得植烟土壤调节至中性，此外，在有机质、速效钾、速效磷和水解性氮含量状况上看，施用了本实施例含聚谷氨酸的复合微生物菌肥的处理C 均远高于其余两个处理。尤其高于施肥前的处理，在有机质上，处理C较施肥前高出3.15，其速效磷和速效钾较施肥前分别提高了68.63％和47.39％；且能够有效降低土壤中的氯离子含量，其氯离子含量降低至15.6，而处理A和处理 C氯离子含量仍在19.0以上，说明施用本实施例含聚谷氨酸的复合微生物菌肥能有效调节土壤养分状况，对烟株健康生长具有重要意义。
表7土壤养分状况统计表
Figure BDA0003911575160000171
2.2烤烟农艺性状调查
由表8可知，处理B、C在株高、茎围、有效叶片数、最大叶长和最大叶宽上均优于对照处理A，其中，处理C>处理B>处理A；且处理C在株高、茎围、最大叶长上均显著优于处理A；在节距上，处理B>A>C，而三者间的差异性不显著；综上所述，施加了本实施例含聚谷氨酸的复合微生物菌肥的处理C 在烤烟农艺性状上表现最佳。
表8不同处理田间农艺性状对比分析表
Figure BDA0003911575160000172
2.3病害发生情况调查
病虫害的发生会严重影响烟草的生长，导致烟草产量、质量降低，减少烟草的经济价值；试验地主要病害发生情况如表9所示。从表9中可以看出，试验地发生的主要病害有花叶病、番茄斑萎病、赤星病、气候斑点病、炭疽病和白粉病，且各处理中处理A的发病率均高于处理B和处理C，而施加了市售土壤调理剂的处理B和施加本实施例含聚谷氨酸的复合微生物菌肥的处理C相比，其发病率仍较为严重；尤其在番茄斑萎病发病率上，处理B较处理C高出 5.67％，处理A较处理C高出8.34％；说明在常规施肥的基础上施加土壤调理剂可以提高烟株抗病性，而增施本实施例含聚谷氨酸的复合微生物菌肥作为土壤调理剂更能有效提高烟株的抗病性，降低病害发生率，对病虫害防控具有一定意义。
表9主要病害发病率调查结果表
Figure BDA0003911575160000181
2.4经济性状调查
经济性状统计结果见表10。从表10中可以看出，处理C的亩产量、亩产值、均价和中上等烟比例均是最高值，其中亩产量高达151.35kg，较处理A和处理B分别高出21.79kg、15.14kg，亩产值也处于最高值，分别高出处理A和处理C15.3％和4.0％；其中上等烟的比例达到95％以上，分别高出处理A和处理C14.53％和3.82％，说明施用本实施例含聚谷氨酸的复合微生物菌肥能够改善烤烟的经济性状。
表10各处理亩产量和亩产值统计表
Figure BDA0003911575160000182
Figure BDA0003911575160000191
2.5中部烟叶化学成分分析
研究表明，烟叶的还原糖适宜范围一般为16％～22％，总糖适宜范围为 18％～24％，钾含量最适范围为2.0％～3.5％，总氮适宜范围为1.5％～3.5％，氯含量为0.3％～0.8％，蛋白质为7％～10％，淀粉范围为3.5％～6.0％，糖碱比为8～12，氮碱比为0.8～1.1，若各项指标在此范围内一般被视为优质水平。
由表11可以看出，所有处理中部叶总糖含量偏高，各处理含量均在30％以上；处理C的还原糖含量在适宜范围，其余处理含量偏高，所有处理总氮、烟碱含量、氧化钾含量都较为适宜，其中处理C的烟碱含量最近于最佳值；糖碱比除处理A偏高外，其余处理均在适合范围内；两糖差以处理C最高，对照组最低。整体来看，通过中部烟叶化学成分分析，施加了本实施例含聚谷氨酸的复合微生物菌肥的处理C烟叶化学成分协调性最好，其烟叶品质较高。
表11各处理中部叶化学成分分析
Figure BDA0003911575160000192
3、结论与讨论
施用本实施例含聚谷氨酸的复合微生物菌肥的示范研究表明：施用含聚谷氨酸的复合微生物菌肥可有效降低土壤容重、调节土壤理化性质、促进肥料利用与保肥效果，减少烟草病害的发生，提高烟叶内在品质，提升烟叶产量和产值。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种含聚谷氨酸的复合微生物菌肥，其特征在于，包括如下质量百分比的组分：复合微生物菌液15-30％，助剂70-85％，且所述复合微生物菌液与所述助剂的质量百分数之和为100％，其中，所述助剂包括聚谷氨酸、膨润土、氧化淀粉粘合剂和烟末型腐熟有机肥。
2.根据权利要求1所述的含聚谷氨酸的复合微生物菌肥，其特征在于，所述助剂中各组分的重量份为：聚谷氨酸5-10份，膨润土8-12份，氧化淀粉粘合剂2-4份，烟末型腐熟有机肥30-40份。
3.根据权利要求1或2所述的含聚谷氨酸的复合微生物菌肥，其特征在于，所述复合微生物菌液包括由菌株WSWFJ40活化、发酵制得的地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌液，由菌株YWS-20-2071活化、发酵制得的枯草芽孢杆菌YWS-20-2071菌液，以及由菌株WSWFJ41活化、发酵制得的芽孢杆菌WSWFJ41菌液。
4.根据权利要求3所述的含聚谷氨酸的复合微生物菌肥，其特征在于，地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌液、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071菌液和芽孢杆菌WSWFJ41菌液的质量比为1∶1∶1。
5.根据权利要求4所述的含聚谷氨酸的复合微生物菌肥，其特征在于，所述复合微生物菌液中，有效活菌数＞10.0×1010cfu/g。
6.一种根据权利要求1至5中任一项所述的含聚谷氨酸的复合微生物菌肥的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
按照质量百分比取各原料备用，其中，复合微生物菌液15-30％，助剂70-85％，且所述复合微生物菌液与所述助剂的质量百分数之和为100％；
将所述复合微生物菌液与所述助剂充分混合均匀后连续搅拌10min以上，即得含聚谷氨酸的复合微生物菌肥。
7.根据权利要求6所述的含聚谷氨酸的复合微生物菌肥的制备方法，其特征在于，所述复合微生物菌液的制备方法包括如下步骤：
以地衣芽孢杆菌WSWFJ40为菌种，将菌种进行活化、发酵制得地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌液；
以枯草芽孢杆菌YWS-20-2071为菌种，将菌种进行活化、发酵制得枯草芽孢杆菌YWS-20-2071菌液；
以芽孢杆菌WSWFJ41为菌种，将菌种进行活化、发酵制得芽孢杆菌WSWFJ41菌液；
将地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌液、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071菌液和芽孢杆菌WSWFJ41菌液混合，即得所述复合微生物菌液，其中，地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌液、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071菌液和芽孢杆菌WSWFJ41菌液的质量比为1∶1∶1。
8.根据权利要求7所述的含聚谷氨酸的复合微生物菌肥的制备方法，其特征在于，制备地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌液、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071菌液和芽孢杆菌WSWFJ41菌液包括如下步骤：
菌种活化，将-85℃下保存的地衣芽孢杆菌WSWFJ40、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071和芽孢杆菌WSWFJ41分别在LB固体培养基上进行活化，采用划线培养的方式，于30℃～35℃条件下培养24～48h，分别挑取单菌落在第一固体培养基上继续进行划线培养，在30℃～35℃条件下培养24～48h，分别得到活化的地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌株、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071菌株和芽孢杆菌WSWFJ41菌株；
种子液制备，用无菌接种环分别刮取已活化的地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌株、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071菌株和芽孢杆菌WSWFJ41菌株，并分别接种到50ml的LB液体培养基中，在温度30℃～35℃、转速150rpm/min条件下培养24～48h，分别得到地衣芽孢杆菌WSWFJ40种子液、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071种子液和芽孢杆菌WSWFJ41种子液；
发酵液制备，分别将地衣芽孢杆菌WSWFJ40种子液、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071种子液和芽孢杆菌WSWFJ41种子液按照1‰-5‰的比例接种到发酵罐的发酵培养液中，在温度为35℃-38℃，转速为100-150rpm/min条件下培养48h-60h，分别得到地衣芽孢杆菌WSWFJ40发酵液、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071发酵液和芽孢杆菌WSWFJ41发酵液，地衣芽孢杆菌WSWFJ40发酵液、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071发酵液和芽孢杆菌WSWFJ41发酵液即分别为地衣芽孢杆菌WSWFJ40菌液、枯草芽孢杆菌YWS-20-2071菌液和芽孢杆菌WSWFJ41菌液。
9.根据权利要求8所述的含聚谷氨酸的复合微生物菌肥的制备方法，其特征在于，所述LB固体培养基包括如下配比的组分：蛋白胨10g，酵母粉5g，琼脂粉5g，水1L；
所述第一固体培养基包括如下配比的组分：米糠1份、玉米粉1份、麸皮1份、豆饼粉1份、花生饼粉0.5份，各原料重量之和60％的水；
所述LB液体培养基包括如下配比的组分：蛋白胨10g，酵母粉5g，水1L；
所述发酵培养液包括如下配比的组分：牛肉膏1份，黄豆粉2份，蔗糖0.5份，玉米粉2份，碳酸钙0.8份，鱼粉1份，磷酸二氢钾0.05份，磷酸氢二钾0.05份，氯化钠2份，消泡剂0.2份，水500份，并且发酵培养液的pH采用盐酸和氢氧化钠调节至7.0。
10.一种根据权利要求1至5中任一项所述的含聚谷氨酸的复合微生物菌肥在烟草种植中的应用，其特征在于，所述含聚谷氨酸的复合微生物菌肥作为底肥、定根肥和/或追肥施用，并且所述含聚谷氨酸的复合微生物菌肥的用量为50～150kg/亩。
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