CN115551998A

CN115551998A - 低免疫原性细胞

Info

Publication number: CN115551998A
Application number: CN202180037981.5A
Authority: CN
Inventors: 田村康一; 木村博信; 细谷朋方; 恒吉法寻
Original assignee: Healios KK
Current assignee: Healios KK
Priority date: 2020-05-26
Filing date: 2021-05-26
Publication date: 2022-12-30
Also published as: KR20230029659A; EP4159846A1; JPWO2021241658A1; WO2021241658A1; EP4159846A4; US20230203445A1; CA3185067A1

Abstract

本发明提供高功能的低免疫原性细胞、即低免疫原性人细胞，其满足：(1)缺损编码人白细胞型抗原(HLA)类Ia的α链的内源基因、(2)缺损编码HLA类II或其表达调控因子的内源基因、(3)包含编码HLA类Ib的α链的外源基因、(4)包含编码人PD‑L1的外源基因、以及(5)包含编码人PD‑L2的外源基因。

Description

低免疫原性细胞

技术领域

本公开涉及免疫原性非常低的基因修饰人多能干细胞和该细胞的制造方法。

背景技术

主要组织相容性抗原(MHC)在人中作为人白细胞抗原(Human leukocyteantigen：HLA)而已知，在大多数的细胞或组织中表达。HLA主要有A、B、C、DR、DQ、DP这6座抗原，而且分别由数十种不同类型(等位基因)的复杂组合构成，存在约数万个其组合。HLA在人体内承担着重要的免疫机制，其主要作用是用于进行自身及异体识别的抗原呈递。如果是在他人中移植(异体移植)了自身以外的细胞或组织的情况，则该HLA被细胞毒性T细胞(CTL)等免疫担负细胞识别为最重要的抗原(异物)，排斥成立，移植片不能存活。

因此，目前上市的细胞药物的大多数是自体细胞制品，但在细胞药物的普及中，认为异体细胞的使用必不可少，因此需要解决免疫排斥的问题。

京都大学iPS细胞研究所通过储存多种由HLA同源供体建立的iPS细胞来尝试着解决该问题。2019年间已经在日本人中制成了多个类型的4种HLA型iPS细胞，通过该储存iPS细胞可覆盖约40%的日本人。然而，在该方法中，将覆盖万人的细胞整齐排列极为困难，也需要巨额的费用。而且，未必能够完全排除免疫排斥的可能性。

另一方面，自古以来就尝试着通过使HLA基因缺损来制造低免疫原性的细胞。例如Cell Genesys公司公开了缺失至少一个MHC抗原而得的基因修饰细胞(专利文献1)。另外，Morphogenesis公司公开了缺损HLA-B基因和HLA-C基因而得的人干细胞的制造方法(专利文献2)。

而且，随着近年来的基因组编辑技术等的快速普及发展，可容易且准确地进行细胞的基因修饰、或者加入再生医疗/细胞药物的企业增加等，因此制造低免疫原性的多能干细胞的尝试在快速进行。

Universal Cells公司(Astellas制药收购)和华盛顿大学正在开发通过缺损多能干细胞中的B2M基因和RFXANK基因而得到的通用供体细胞(专利文献3和4)。另外，加利福尼亚大学正在开发在缺损B2M基因和CIITA基因的同时使CD47过度表达而得的低免疫原性iPS细胞(非专利文献1)。

另一方面，哈佛大学公开了通过B2M基因或CIITA基因的缺失、或者PD-L1基因或HLA-G基因的敲入而得到的治疗用细胞(专利文献5)。另外，京都大学制造了在仅使HLA-A和HLA-B各基因个别地缺损的同时使CIITA基因缺损而得的人iPS细胞(非专利文献2)。

通过像这样使以HLA基因为首的各种各样的基因缺失并导入，制造了各种各样的低免疫原性细胞。然而，几乎没有详细分析缺失哪个HLA基因对参与免疫排斥的其他基因的表达有怎样的影响的例子。另外，也几乎没有分析敲入哪个基因可得到更高功能的低免疫原性细胞的例子。根据这样的现状，仍然在寻求高功能的低免疫原性细胞。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第1995/017911号公报；

专利文献2：国际公开第98/42838号公报；

专利文献3：国际公开第2016/183041号公报；

专利文献4：国际公开第2012/145384号公报；

专利文献5：国际公开第2013/158292号公报；

非专利文献

非专利文献1：Tobias Deuse等人, Nature Biotechnology, 第37卷, 第252-258页, 2019；

非专利文献2：Huaigeng Xu等人, Cell Stem Cell, 24, 1-13, 2019。

发明内容

发明所要解决的课题

寻求高功能的低免疫原性细胞。

用于解决课题的手段

发明人认为：通过制造代替储存iPS细胞的低免疫原性细胞，可有助于开发异体细胞药物，使用基因组编辑工具对参与各种各样的免疫排斥反应的蛋白的组合进行了研究。

首先，发明人为了逃避由CTL引起的免疫应答，使编码与CTL的T细胞受体(TCR)结合的HLA类Ia (HLA-A、HLA-B和HLA-C)的各α链的内源基因缺损。另外，为了使与辅助性T细胞的TCR结合的HLA类II缺失，使编码作为HLA类II基因的转录调控因子之一的RFXANK的内源基因缺损。认为缺损了这些各基因的细胞通常不会因免疫而被排斥。然而，出乎意料地明确了：在上述细胞中，甚至连HLA类Ib (HLA-E)的完整表达也丢失了。由于不表达HLA类Ib的细胞会受到NK细胞的攻击，所以对用作移植用细胞源不利。因此，存在着导入编码HLA类Ib的基因的必要性。

发明人从上述必要性的角度考虑，在导入编码HLA类Ib的基因的同时，导入了与CTL上的PD-1和PD-2结合、并对CTL2起抑制作用的编码PD-L1和PD-L2的各基因。最终明确了：通过还导入编码HLA类Ia和HLA类Ib的通用氢链β2微球蛋白(B2M)的基因，可提高HLA类I的表达量。

作为这些结果，发现了：在人多能干细胞中，通过使编码作为HLA类Ia分子的HLA-A、HLA-B和HLA-C的各α链的内源基因缺损、使编码RFXANK的内源基因缺损，并将编码PD-L1和PD-L2的各外源基因、编码作为HLA类Ib分子的HLA-E和/或HLA-G的各α链的各外源基因、编码β2微球蛋白的外源基因导入到基因组内，可制造具有高安全性、同时保持了分化诱导能力的人多能干细胞。发明人根据这些发现，进一步进行深入研究，从而完成了本发明。

即，本发明提供以下内容。

[1] 低免疫原性人细胞，其满足：

(1) 缺损编码人白细胞型抗原(HLA)类Ia的α链的内源基因；

(2) 缺损编码HLA类II或其表达调控因子的内源基因；

(3) 包含编码HLA类Ib的α链的外源基因；

(4) 包含编码人PD-L1的外源基因；以及

(5) 包含编码人PD-L2的外源基因。

[2] [1]所述的细胞，该细胞不在细胞表面表达内源性HLA类Ib。

[3] [1]或[2]所述的细胞，其中，编码HLA类Ia的α链的内源基因为编码HLA-A的α链的内源基因、编码HLA-B的α链的内源基因和编码HLA-C的α链的内源基因。

[4] [1]～[3]中任一项所述的细胞，其中，编码HLA类II或其表达调控因子的内源基因为以下的(a)或(b)：

(a) 编码HLA-DP的α链和/或β链的内源基因、编码HLA-DQ的α链和/或β链的内源基因、编码HLA-DR的α链和/或β链的内源基因、编码HLA-DM的α链和/或β链的内源基因、以及编码HLA-DO的α链和/或β链的内源基因；

(b) 编码人RFXANK的内源基因、编码人RFX5的内源基因、编码人RFXAP的内源基因或编码人CIITA的内源基因。

[5] [1]～[4]中任一项所述的细胞，其中，编码HLA类Ib的α链的外源基因为编码HLA-E的α链的外源基因和/或编码HLA-G的α链的外源基因。

[6] [1]～[5]中任一项所述的细胞，该细胞满足：(6) 包含编码人β2微球蛋白的外源基因。

[7] [1]～[6]中任一项所述的细胞，该细胞满足：(7) 包含自杀基因。

[8] [1]～[7]中任一项所述的细胞，其中，包含外源基因或自杀基因的位点是基因组的Safe Harbor区。

[9] [8]所述的细胞，其中，Safe Harbor区为AAVS1区、CCR5区或ROSA26区。

[10] [1]～[9]中任一项所述的细胞，其中，低免疫原性人细胞为多能干细胞或其分化细胞。

[11] 制造低免疫原性人细胞的方法，该方法包括以下工序：

工序(i)：使人亲本细胞的编码HLA类Ia的α链的内源基因缺损；

工序(ii)：从人亲本细胞中缺损编码HLA类II或其表达调控因子的内源基因；

工序(iii)：向人亲本细胞中导入编码HLA类Ib的α链的外源基因；

工序(iv)：向人亲本细胞中导入编码人PD-L1的外源基因；以及

工序(v)：向人亲本细胞中导入编码人PD-L2的外源基因。

[12] [11]所述的方法，其中，低免疫原性人细胞不在细胞表面表达内源性HLA类Ib。

[13] [11]或[12]所述的方法，其中，编码HLA类Ia的α链的内源基因为编码HLA-A的α链的内源基因、编码HLA-B的α链的内源基因和编码HLA-C的α链的内源基因。

[14] [11]～[13]中任一项所述的方法，其中，编码HLA类II或其表达调控因子的内源基因为以下的(a)或(b)：

[15] [11]～[14]中任一项所述的方法，其中，编码HLA类Ib的α链的外源基因为编码HLA-E的α链的外源基因和/或编码HLA-G的α链的外源基因。

[16] [11]～[15]中任一项所述的方法，该方法还包括以下工序：

工序(vi)：向人亲本细胞中导入编码人β2微球蛋白的外源基因。

[17] [11]～[16]中任一项所述的方法，该方法还包括以下工序：

工序(vii)：向人亲本细胞中导入自杀基因。

[18] [11]～[17]中任一项所述的方法，其中，导入外源基因或自杀基因的位点是基因组的Safe Harbor区。

[19] [18]所述的方法，其中，Safe Harbor区为AAVS1区、CCR5区或ROSA26区。

[20] [11]～[19]中任一项所述的方法，其中，人亲本细胞为多能干细胞或其分化细胞。

发明效果

在人多能干细胞中，使编码作为HLA类Ia的HLA-A、HLA-B和HLA-C的各α链的内源基因缺损，使编码作为HLA类II的转录因子的RFXANK的内源基因缺损，向基因组中导入编码作为免疫检查点蛋白的PD-L1和PD-L2的各外源基因，并向基因组中导入编码HLA-E和/或HLA-G的各α链的各外源基因以补全内源性HLA类Ib的表达不全，从而可获取低免疫原性细胞，该细胞是保持了分化诱导能力的人多能干细胞。而且，发明人首次发现了：通过敢于向基因组中进一步导入编码B2M的外源基因，可提高HLA类Ib的表达量，结果是可超预期地提高细胞的低免疫原性。然后，发明人根据这样的见解，成功地制造了本发明的低免疫原性细胞。此外，通过向基因组中导入自杀基因，可任意地将细胞诱导至凋亡。通过本发明得到的低免疫原性细胞仍然维持多能性，可分化诱导成任意的细胞。

通过本发明得到的低免疫原性细胞可用作异体细胞药物的原料。即使移植将该细胞分化诱导而得到的细胞，也不会从受体侧接受来自T细胞或NK细胞的排斥反应，免疫排斥的程度非常低。另外，上述低免疫原性细胞对B细胞、巨噬细胞、单核细胞或树状细胞这样的抗原呈递细胞群的活化起抑制作用。

因而，可安心地将这些细胞供于移植医疗或细胞治疗。

附图说明

[图1]是显示HLA类Ia缺损iPS细胞克隆2E1的基因编辑结果的图。

[图2]是显示利用流式细胞术法分析克隆2E1中的HLA类I的细胞表面表达量的结果的图。

[图3]是显示利用流式细胞术法分析克隆2E1中的HLA-E的细胞表面表达量的结果的图。

[图4]是显示利用流式细胞术法分析克隆2E1中的未分化标记物的细胞表面表达量的结果的图。

[图5]是显示分析克隆2E1和第2候选克隆(2H3)中的RNA表达模式的结果的图。

[图6]是显示HLA类Ia＆II缺损iPS细胞克隆6B7的基因编辑结果的图。

[图7]是显示利用流式细胞术法分析克隆6B7中的HLA类I的细胞表面表达量的结果的图。

[图8]是显示利用流式细胞术法分析克隆6B7中的HLA类II的细胞表面表达量的结果的图。

[图9]是显示利用流式细胞术法分析克隆6B7中的HLA-E的细胞表面表达量的结果的图。

[图10]是显示利用流式细胞术法分析克隆6B7中的未分化标记物的细胞表面表达量的结果的图。

[图11]是显示分析克隆6B7中的RNA表达模式的结果的图。

[图12] A是显示分析由克隆6B7分化的肝细胞的尿素合成量的结果的图，以及B是显示分析由克隆6B7分化的血管内皮细胞的脉管形成能力的结果的图。

[图13]是显示利用流式细胞术法分析HLA类Ia＆II缺损、且PD-L1、PD-L2、HLA-G、B2M和iCasp9基因导入iPS细胞克隆9G11中的PD-L1、PD-L2、HLA-G和B2M的细胞表面表达量的结果的图。

[图14]是显示利用流式细胞术法分析来自克隆9G11 iPS细胞的血细胞系细胞中的HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA类II的细胞表面表达量的结果的图。

[图15]是显示利用流式细胞术法分析来自克隆9G11 iPS细胞的血细胞系细胞中的PD-L1、PD-L2、HLA-G和B2M的细胞表面表达量的结果的图。

[图16]是显示利用流式细胞术法分析克隆9G11中的未分化标记物的细胞表面表达量的结果的图。

[图17]是显示克隆9G11中的核型分析的结果的图。

[图18] A是显示由克隆9G11分化的肝细胞的细胞形态的图和显示分析尿素合成量的结果的图，以及B是显示由6B7分化的血管内皮细胞的细胞形态的图和显示分析血管形成能力的结果的图。

[图19]是显示T细胞(CD4阳性细胞和CD8阳性细胞)相对于由克隆9G11分化的CD45阳性细胞的増殖率的图。

[图20]是显示T细胞(CD8阳性细胞)相对于由克隆9G11分化的CD45阳性细胞的细胞毒活性的图。

[图21]是显示NK细胞相对于克隆9G11的细胞毒活性的图。

[图22]是显示通过添加雷帕霉素而引起的细胞存活率的变化的图，该图用于确认克隆9G11的自杀基因的功能。

[图23]是显示外来性B2M基因的强制表达使HLA类Ia＆II缺损iPS细胞的HLA-G基因的表达量上升的图。

具体实施方式

以下，详细地说明本发明的内容。

本发明提供低免疫原性人细胞(以下，称为本发明的低免疫原性人细胞)，其具有以下的(1)～(5)的特征：

(1) 缺损了编码HLA类Ia的α链的内源基因；

(2) 缺损了编码HLA类II或其表达调控因子的内源基因；

(3) 包含编码HLA类Ib的α链的外源基因；

(4) 包含编码人PD-L1的外源基因；

(5) 包含编码人PD-L2的外源基因。

本发明的低免疫原性人细胞是指，当导入到受体的体内时不会引发因被受体识别为非自身而通常发生的免疫排斥反应、不会受到受体侧的T细胞或NK细胞的攻击、对抗原呈递细胞群的活化起抑制作用、或者即使发生免疫排斥反应其反应性也显著低的细胞。换言之，本发明的低免疫原性人细胞是对受体的免疫机制具有免疫耐受的细胞。

本发明的低免疫原性人细胞通过上述(1)和(2)的使内源基因缺损、以及上述(3)、(4)和(5)的导入外源基因，可获得对受体的免疫机制的免疫耐受，因此本发明的低免疫原性人细胞可成为针对受体的细胞药物。

本发明的低免疫原性人细胞只要是上述(1)和(2)的可使内源基因缺损、以及上述(3)、(4)和(5)的可导入外源基因的细胞即可，没有特别限定。作为这样的细胞，可列举：多能干细胞。

作为多能干细胞，可列举：胚胎干细胞(embryonic stem cell：ES细胞)、人工多能干细胞(induced pluripotent stem cell：iPS细胞)、胚胎肿瘤细胞(EC细胞)、胚胎生殖干细胞(EG细胞)，优选为ES细胞或iPS细胞。

在多能干细胞为ES细胞的情况下，可通过自身已知的方法进行制作。作为ES细胞的制作方法，例如可列举：培养人胚泡期的内部细胞团的方法(例如参照Manipulating theMouse Embryo: A Laboratory Manual, 第二版, Cold Spring Harbor LaboratoryPress (1994))、培养通过体细胞核移植制作的初期胚的方法(Wilmut等人, Nature, 385,810 (1997)；Cibelli等人, Science, 280, 1256 (1998)；入谷明等人, 蛋白核酸酶, 44,892 (1999)；Baguisi等人, Nature Biotechnology, 17, 456 (1999)；Wakayama等人,Nature, 394, 369 (1998)；Wakayama等人, Nature Genetics, 22, 127 (1999)；Wakayama等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984 (1999)；RideoutIII等人,Nature Genetics, 24, 109 (2000))等，但并不限定于这些。另外，ES细胞可从规定的机构获取，也可购入市售品。例如，关于人ES细胞株，H1、H7、H9、H13和H14可从美国的WiCellResearch Institute获取，HES1～6可从澳大利亚的ES Cell International获取，SA002、SA181和SA611可从瑞典的Cellartis AB获取，HUES1～17可从美国的HUES Cell Facility获取，KhES-1～KhES-5可从京都大学再生医科学研究所获取，SEES1～SEES7可从国立成育医疗研究中心获取。在通过体细胞核移植制作ES细胞的情况下，体细胞的种类或采集体细胞的来源依据下述iPS细胞制作的情况。

在多能干细胞为iPS细胞的情况下，iPS细胞可通过向体细胞内导入核初始化物质来制作。可用作用于制作iPS细胞的起始材料的体细胞可以是人的生殖细胞以外的任何细胞。例如可列举：角质化的上皮细胞(例如，角质化表皮细胞)、粘膜上皮细胞(例如，舌表层的上皮细胞)、外分泌腺上皮细胞(例如，乳腺细胞)、激素分泌细胞(例如，肾上腺髓质细胞)、代谢/贮藏用的细胞(例如，肝细胞)、构成界面的内腔上皮细胞(例如，I型肺泡细胞)、闭膜管的内腔上皮细胞(例如，血管内皮细胞)、具有具输送能力的纤毛的细胞(例如，气管上皮细胞)、细胞外基质分泌用细胞(例如，成纤维细胞)、收缩性细胞(例如，平滑肌细胞)、血液和免疫系统的细胞(例如，T淋巴细胞)、与感觉有关的细胞(例如，视杆细胞)、自主神经系统神经元(例如，胆碱能神经元)、感觉器官和外周神经元的支持细胞(例如，伴随细胞)、中枢神经系统的神经细胞与神经胶质细胞(例如，星状神经胶质细胞)、色素细胞(例如，视网膜色素上皮细胞)、以及它们的前体细胞(组织前体细胞)等。对细胞分化的程度没有特别限定，可以是未分化的前体细胞(还包括体干细胞)，也可以是最终分化的成熟细胞，同样地可用作本发明中的体细胞的起源。这里，作为未分化的前体细胞，例如可列举：来自脂肪的间质(干)细胞、神经干细胞、造血干细胞、间充质系干细胞、牙髓干细胞等组织干细胞(体性干细胞)。

作为为了制作iPS细胞而导入至体细胞的核初始化物质，可列举：迄今为止报道的各种初始化基因的组合(例如参照WO2007/069666、Nature Biotechnology, 26, 101-106(2008)、Cell, 126, 663-676 (2006)、Cell, 131, 861-872 (2007)、Nat. Cell Biol.,11, 197-203 (2009)、Nature, 451, 141-146 (2008)、Science, 318, 1917-1920(2007)、Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)、Cell Research (2008) 600-603、Nature454: 646-650 (2008)、Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008)、WO2008/118820、Nat. CellBiol., 11, 197-203 (2009)、Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009)、Science, 324:797-801 (2009))。另外，也可将由上述初始化基因所编码的蛋白作为核初始化物质导入至体细胞(Cell Stem Cell, 4: 381-384 (2009)、Cell Stem Cell, doi:10.1016/j.stem.2009.05.005 (2009))。

iPS细胞集落的选择可通过以耐药性和报道基因活性为指标的方法(Cell, 126,663-676 (2006)、Nature, 448, 313-317 (2007))或基于目视进行形态观察的方法(Cell,131, 861-872 (2007))来进行。其为iPS细胞的确认可以以各种ES细胞特异性基因的表达或畸胎瘤形成为指标来进行。

目前，iPS细胞(iPSC)的制作方法多种多样，除了由山中等人向小鼠成纤维细胞中导入Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc这4个因子而建立的iPSC (Takahashi K, Yamanaka S.,Cell, (2006) 126: 663-676)的制作方法以外，还可采用：将同样的4个因子导入至人成纤维细胞而建立的来自人细胞的iPSC (Takahashi K, Yamanaka S.等人. Cell, (2007)131: 861-872.)、导入上述4个因子后以Nanog的表达为指标进行筛选而建立的Nanog-iPSC(Okita, K., Ichisaka, T.和Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.)、通过不含c-Myc的方法制作的iPSC (Nakagawa M, Yamanaka S.等人. Nature Biotechnology,(2008) 26, 101 - 106)、通过非病毒法导入6个因子而建立的iPSC (Okita K.等人. Nat.Methods 2011 May; 8(5): 409-12, Okita K等人. Stem Cells. 31(3): 458-66.)等的制作方法。另外，还可采用：导入由Thomson等人制作的OCT3/4、SOX2、NANOG、LIN28这4个因子而建立的iPSC (Yu J., Thomson JA.等人. Science (2007) 318: 1917-1920.)、由Daley等人制作的iPSC (Park IH, Daley GQ.等人, Nature (2007) 451: 141-146)、由樱田等人制作的iPSC (日本特开2008/307007号)等的制作方法。

作为人工多能干细胞株，NIH、理研、京都大学等建立的各种人iPSC株均可利用。例如可列举：理研的HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株等、京都大学的253G1株、253G4株、1201C1株、1205D1株、1210B2株、1383D2株、1383D6株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株、1231A31株、FfI-01s04株等。

本发明的低免疫原性人细胞还可以是由上述(1)和(2)的缺损内源基因、且上述(3)、(4)和(5)的导入了外源基因的上述多能干细胞分化而得的细胞。多能干细胞可按照已知方法分化成特定的细胞。例如，可使多能干细胞分化成T细胞(国际公开第2016/076415号或国际公开第2017/221975号)、角膜上皮细胞(国际公开第2016/114285号)、心肌细胞(国际公开第2007/126077号、国际公开第2016/049099号、国际公开第2016/175303号或国际公开第2017/108705号)、胰β细胞(国际公开第2019/208788号)、肝细胞(国际公开第2013/183571号或国际公开第2019/073951号)、骨骼肌细胞(国际公开第2010/008100号、国际公开第2014/533491号或国际公开第2017/188458号)、视网膜色素上皮细胞(国际公开第2015/053375号)等。

本发明的低免疫原性人细胞缺损了编码HLA类Ia的α链的内源基因。

HLA类Ia是所有的有核细胞所持有的跨膜蛋白，具有数千以上的多种多态性，因此通过个体在细胞表面表达的HLA类Ia非常富有多样性。而且，这样的多样性在识别自身与非自身方面发挥最重要的作用。呈递至细胞表面的HLA类Ia被CTL表面的T细胞受体(TCR)识别。呈递所识别的HLA类Ia的细胞被CTL识别为异物，通过免疫机制被排除。因此，HLA类Ia表达不全的细胞可逃避被CTL识别，因此适合作为移植细胞源。

HLA类Ia是由HLA类Ia的各基因所编码的α链和作为β2微球蛋白的β链构成的二聚体。这里，β2微球蛋白是通用成分(common component)，其不仅与HLA类Ia的α链缔合，还与HLA类Ib的α链缔合。为了使HLA类Ia表达不全而使编码β2微球蛋白的内源基因缺损是在其他的低免疫原性细胞中进行，但导致HLA类Ib也表达不全，是不合适的。因此，在本发明的低免疫原性人细胞中，为了仅使HLA类Ia表达不全，而缺损了编码HLA类Ia的α链的内源基因。

作为在本发明的低免疫原性人细胞中缺损的编码HLA类Ia的α链的内源基因，可列举：选自编码HLA-A的α链的内源基因、编码HLA-B的α链的内源基因和编码HLA-C的α链的内源基因的至少1个基因，优选编码HLA-A的α链的内源基因、编码HLA-B的α链的内源基因和编码HLA-C的α链的内源基因。

本说明书中，使内源基因缺损是指通过破坏内源基因或者将其去除而不能产生完全的mRNA。

作为使内源基因缺损的具体方法，优选采用以下的方法等：按照常规方法分离来自将要缺损内源基因的对象细胞的基因组DNA，例如通过(1) 通过在内源基因的外显子部分或启动子区插入其他的DNA片段(例如，耐药性基因或报道基因等)来破坏外显子或启动子的功能、(2) 使用Cre-loxP系统或Flp-frt系统切取全部或一部分的内源基因以使该基因缺失、(3) 向蛋白编码区内插入终止密码子使无法进行完全的蛋白翻訳、或者(4) 向转录区内部插入终结基因转录的DNA序列(例如，Poly A添加信号等)使无法进行完全的mRNA合成，其结果，将具有以使基因失活的方式构建的DNA序列的DNA链(以下，简记为基因缺损用靶向载体)通过同源重组插入至对象细胞的内源基因座。

该同源重组细胞例如可通过向对象细胞中导入上述靶向载体而获取。

例如，在基因缺损用靶向载体是通过在内源基因的外显子部分或启动子区插入其他DNA片段以破坏该外显子或启动子的功能而设计的情况下，该载体例如可成为如下所述的构成。

首先，为了通过同源重组在内源基因的外显子或启动子部分插入其他DNA片段，基因缺损用靶向载体需要在该其他DNA片段的5’上游和3’下游分别包含与靶位点相同的序列(5’臂和3’臂)。

对要插入的其他DNA片段没有特别限定，若使用耐药性基因或报道基因，则可将耐药性或报道基因活性作为指标选择将基因缺损用靶向载体整合到染色体内而得的对象细胞。这里，作为耐药性基因，例如可列举：新霉素磷酸转移酶II (nptII)基因、潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因等，作为报道基因，例如可分别列举：β-半乳糖苷酶(lacZ)基因、氯霉素乙酰转移酶(cat)基因等，但并不限于这些。

耐药性或报道基因优选处于可在对象细胞内起作用的任意的启动子的控制下。例如可列举：来自SV40的初期启动子、巨细胞病毒(CMV)长末端重复序列(LTR)、劳斯肉瘤病毒(RSV) LTR、小鼠白血病病毒(MoMuLV) LTR、来自腺病毒(AdV)的初期启动子等病毒启动子、以及β-肌动蛋白基因启动子、PGK基因启动子、运铁蛋白基因启动子等。然而，在耐药性或报道基因以处于HLA类I基因的内源性启动子的控制下的方式插入到内源基因内的情况下，无需在基因缺损用靶向载体中控制该基因的转录的启动子。

另外，基因缺损用靶向载体优选在耐药性或报道基因的下游具有终结来自该基因的mRNA的转录的序列(多腺苷酸化(poly A)信号、也称为终止子)，例如可使用来自病毒基因、或者来自各种哺乳动物或鸟类的基因的终止子序列。优选使用来自SV40的终止子等。

通常，细胞中的基因重组大部分都非同源，所导入的DNA被随机插入到染色体的任意位置。因此，通过检测耐药性或报道基因的表达等的选择(阳性选择)，无法高效地仅选择在靶位点发生了同源重组的克隆，对于所选择的所有克隆，需要通过DNA杂交法或PCR法进行整合位点的确认。因此，如果在与基因缺损用靶向载体的靶位点相同的序列的外侧连接例如赋予更昔洛韦敏感性的来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-tk)基因，则随机插入有该载体的细胞具有HSV-tk基因，因此在含有更昔洛韦的培养基中无法生长，但通过同源重组靶向内源基因座的细胞不具有HSV-tk基因，因此呈更昔洛韦耐性而被选择(阴性选择)。或者，例如连接白喉毒素基因以代替HSV-tk基因，则随机插入有该载体的细胞被自身产生的该毒素杀死，因此也可在药剂不存在下选择同源重组体。

向对象细胞内导入基因缺损用靶向载体时，磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、脂质转染法、逆转录病毒感染法、凝集法、显微注入(微量注射)法、基因枪(粒子枪)法、DEAE-葡聚糖法等均可采用，但如上所述细胞中的基因重组大部分都非同源，得到同源重组体的频率低，因此从可简便地处理多个细胞等方面考虑，通常选择电穿孔法。电穿孔可直接采用用于向普通的动物细胞导入基因的条件，例如，可通过对处于对数増殖期的对象细胞进行胰蛋白酶处理使其分散成单一细胞后，悬浮于培养基使达到10⁶～10⁸个细胞/ml，再转移到比色皿中，添加10～100μg基因缺损用靶向载体，施加200～600V/cm的电脉冲来进行。

整合有基因缺损用靶向载体的对象细胞也可通过利用DNA杂交或PCR法筛选由培养单一细胞而得到的集落分离提取的染色体DNA来鉴定，但在使用耐药性基因或报道基因作为其他DNA片段的情况下，可将它们的表达作为指标，在细胞阶段选择转化体。例如，在使用包含nptII基因的载体作为阳性选择用标记物基因的情况下，在含有G418等新霉素系抗生素的培养基中培养基因导入处理后的对象细胞，选择所出现的耐性集落作为转化体的候选。另外，在使用含有HSV-tk基因的载体作为阴性选择用标记物基因的情况下，在含有更昔洛韦的培养基中进行培养，选择所出现的耐性集落作为同源重组细胞的候选。将所得到的集落分别转移到培养板，反复进行胰蛋白酶处理、培养基交换后，剩下一部分作为培养用，对剩余物进行PCR或DNA杂交，确认导入DNA的存在。

另外，在使用病毒作为基因缺损用靶向载体的情况下，可列举：用包含DNA的病毒感染对象细胞的方法，该DNA在5’和3’臂之间插入有阳性选择用标记物基因、且在该臂的外侧包含阴性选择用标记物基因。例如，在使用逆转录病毒或慢病毒的情况下，在培养皿等适当的培养器中接种细胞，在培养液中加入病毒载体(根据需要可使Polybrene共存)，培养1～2天后，如上所述添加选择药剂继续培养，选择整合有载体的细胞。

作为用于使内源基因缺损的另一优选实施方案，可列举：CRISPR-Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats CRISPR-Associatedproteins 9：成簇规律间隔短回文重复序列CRISPR关联蛋白9)系统。根据CRISPR-Cas9系统，使用作为基因组DNA切割酶的Cas9和识别基因组上的目标位点的RNA分子即sgRNA，切割基因组DNA上的任意区，从而可导入基因突变。由于在基因组DNA的切割所伴随的生物体内的修复过程中发生的碱基的插入/缺失，发生编码氨基酸的DNA的移码，使靶向的内源基因缺损。

Cas9识别DNA中的前间隔序列邻近基序(PAM)序列，作为在其上游进行切割的核酸内切酶起作用。Cas9包含2个具有核酸内切酶活性的功能结构域，因此可切割双链DNA使成为平滑末端。例如，具体而言，Cas9与包含特异性地与内源基因结合的核苷酸序列(CRISPR-RNA(crRNA))的单链核酸(sgRNA)形成复合物，在位于内源基因中的PAM的5’侧发生双链切割(DSB)。因此，本发明中Cas9是指与指导RNA (guide RNA)形成复合物、且具有双链DNA切割活性的蛋白。

作为Cas9，例如可列举：来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的SpCas9、来自嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的StCas9、来自脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的NmCas9等，但并不限于这些。

另外，Cas9可以是突变Cas9。突变Cas9只要是维持与指导RNA形成复合物的能力、并且具有Cas9中所含的2个具有核酸内切酶活性的功能结构域中的1个已失活的突变的蛋白即可，没有特别限定。作为这样的突变Cas9，例如可列举：具有选自Cas9的第10位的天冬氨酸被取代成丙氨酸的突变(D10A突变)、第840位的组氨酸被取代成丙氨酸的突变(H840A突变)和/或第863位的天冬酰胺被取代成丙氨酸的突变(N863A突变)中的1个突变的Cas9。

crRNA是与内源基因互补的核苷酸序列，只要是与内源基因中的PAM的5’侧相邻的核苷酸序列即可，没有特别限定。crRNA的核苷酸序列的长度只要可确保对内源基因的特异性即可，没有特别限定，通常可列举：10个碱基～30个碱基的长度、优选15个碱基～25个碱基的长度、更优选20个碱基的长度。

PAM根据Cas9的种类而不同，例如，在使用来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9 (SpCas9)的情况下，可列举：NGG (N为A、G、T或C。下同)，在使用来自嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的Cas9 (StCas9)的情况下，可列举：NNAGAAW，在使用来自脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的Cas9 (NmCas9)的情况下，可列举：NNNNGATT等。

包含特异性地与内源基因结合的核苷酸序列的单链核酸(sgRNA)可进一步包含Cas9的募集所需的核苷酸序列(反式激活RNA (tracrRNA))。tracrRNA的核苷酸序列可使用已知的核苷酸序列。tracrRNA可直接连接在crRNA的3’端，也可在中间夹持间隔序列。

或者，crRNA和tracrRNA可经由互补结合进行缔合(即，可成为双链核酸)。需要说明的是，即使在使用这种双链核酸进行基因编辑的情况下，以下记载的导入至对象细胞的方法也与导入单链核酸的情况相同。

向对象细胞中导入Cas9和sgRNA可按照已知的方法实施。例如，在将编码Cas9的核酸序列和转录sgRNA的核酸序列插入至适当的表达载体后，将表达载体导入到对象细胞中，从而可将Cas9和sgRNA导入到对象细胞中。

作为编码Cas9的核酸序列，可列举：基因组DNA、合成DNA等。如果是编码Cas9的基因组DNA，则可使用由上述微生物调制的基因组DNA组分作为模板，通过基于与cas9基因互补的引物对的聚合酶链反应(以下，简称为 “PCR法”)直接扩增。另外，转录sgRNA的核酸序列可通过DNA合成和PCR法来制作。

包含编码Cas9的核酸序列和转录sgRNA的核酸序列的表达载体例如可通过将编码Cas9的核酸序列片段和转录sgRNA的核酸序列片段连接在适当的表达载体中的启动子的下游来制造。

作为表达载体，使用动物细胞表达质粒(例如：pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)；逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒等动物病毒载体等。

作为启动子，只要是与用于基因表达的宿主对应的适当的启动子，则可以是任何启动子。

例如，使用SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV (巨细胞病毒)启动子、RSV(劳斯肉瘤病毒)启动子、MoMuLV (莫洛尼小鼠白血病病毒) LTR、HSV-TK (单纯疱疹病毒胸苷激酶)启动子等。其中，优选CMV启动子、SRα启动子等。

作为表达载体，除上述示例以外，根据需要还可使用含有增强子、Poly A添加信号、选择标记物、SV40复制起点(以下，有时简称为SV40 ori)等的表达载体。作为选择标记物，例如可列举：二氢叶酸还原酶基因(以下，有时简称为dhfr，甲氨蝶呤(MTX)耐性)、新霉素耐性基因(以下，有时简称为neor、G418耐性)等。

将上述的包含编码Cas9的核酸序列和转录sgRNA的核酸序列的表达载体导入至对象细胞进行培养，从而在对象细胞内Cas9和sgRNA形成复合物，切割成为sgRNA的靶的内源基因。被Cas9切割的内源基因在通过非同源末端结合(NHEJ)路径进行的DSB的修复期间向内源基因中导入小的插入和/或缺失(in/dels)而产生移码，产生内源基因的位点特异性突变或破坏。

另外，作为Cas9，可使用Cas9蛋白本身，而不使用如上述所示例的表达载体。通过使Cas9蛋白与sgRNA组合形成复合物，并将其导入至对象细胞，也可切割成为sgRNA的靶的内源基因。

如上所述，本发明的低免疫原性人细胞缺损编码HLA类Ia的α链的内源基因。

HLA类II是仅在巨噬细胞、树状细胞或B细胞这样的抗原呈递细胞中发现的跨膜蛋白。

HLA类II将来自胞外蛋白的肽抗原呈递到细胞表面上，该胞外蛋白包含因吞噬作用等而被免疫细胞摄入的胞外病原体的蛋白。由HLA类II呈递的肽抗原与CD4阳性辅助性T细胞的TCR相互作用，激活CD4阳性辅助性T细胞。被激活的T细胞识别同样地由HLA类II呈递肽抗原的B细胞进行激活，从而引起吞噬细胞的动员、局部炎症、体液性应答、CTL的激活等事件。因此，HLA类II表达不全的细胞可逃避发生上述事件，因此适合作为移植细胞源。

HLA类II是由2个同源的亚单位即α链和β链构成的二聚体。因此，在本发明的低免疫原性人细胞中，作为使HLA类II表达不全的一个实施方案，使编码HLA类II的α链和/或β链的内源基因缺损。作为在本发明的低免疫原性人细胞中缺损的编码HLA类II的内源基因，可列举：选自编码HLA-DP的α链和/或β链的内源基因、编码HLA-DQ的α链和/或β链的内源基因、编码HLA-DR的α链和/或β链的内源基因、编码HLA-DM的α链和/或β链的内源基因以及编码HLA-DO的α链和/或β链的内源基因的至少1个内源基因，优选编码HLA-DP的α链和/或β链的内源基因、编码HLA-DQ的α链和/或β链的内源基因、编码HLA-DR的α链和/或β链的内源基因、编码HLA-DM的α链和/或β链的内源基因以及编码HLA-DO的α链和/或β链的内源基因。

另外，HLA类II的各基因的表达由其表达调控因子控制。对表达调控机制没有特别限定，可通过直接与靶基因结合来控制其表达(例如，转录)，也可通过间接结合来控制其表达(例如，转录)。例如，RFXANK通过与DNA直接结合来控制作为靶基因的HLA类II各基因的转录。因此，在本发明的低免疫原性人细胞中，作为使HLA类II表达不全的另一个实施方案，缺损了编码HLA类II的表达调控因子的内源基因。作为编码HLA类II的表达调控因子的内源基因，例如可列举：编码RFXANK的内源基因、编码RFX5的内源基因、编码RFXAP的内源基因或编码CIITA的内源基因，优选编码RFXANK的内源基因。

作为使编码HLA类II或其表达调控因子的内源基因缺损的具体方法，可与上述的使编码HLA类Ia的内源基因缺损的方法相同。

本发明的低免疫原性人细胞包含编码HLA类Ib的α链的外源基因。

HLA类Ib具有多种多样的功能。作为这样的功能，例如可列举：特殊抗原的呈递、NK细胞的活性控制、作为Fc受体的作用。另外，还可列举：抑制B细胞、巨噬细胞、单核细胞或树状细胞这样的抗原呈递细胞群的激活的功能等。

如上所述，在本发明的低免疫原性人细胞中，缺损了编码HLA类Ia的α链的内源基因和编码HLA类II或其表达调控因子的内源基因，但不缺损编码β2微球蛋白的内源基因。即，认为内源性β2微球蛋白不是表达不全，当然内源性HLA类Ib也不是表达不全。然而，明确了：在上述细胞的制造过程中就连HLA类Ib (HLA-E)的完整表达也丢失了。未表达HLA类Ib(HLA-E)的细胞被NK细胞排斥，因此不利于用作移植用的细胞源。因此，为了补全内源性HLA类Ib的表达，本发明的低免疫原性人细胞包含编码HLA类Ib的α链的外源基因。

在本发明的低免疫原性人细胞中，作为要导入的编码HLA类Ib的α链的外源基因，可列举：选自编码HLA-E的α链的外源基因、编码HLA-F的α链的外源基因和编码HLA-G的α链的外源基因的至少1个基因，优选编码HLA-E的α链的外源基因和/或编码HLA-G的α链的外源基因。而且，HLA-G的α链的信号肽对HLA-E的膜表面的表达较为重要，所以在本发明的低免疫原性人细胞中，作为要导入的编码HLA类Ib的α链的外源基因，最优选编码HLA-E的α链的外源基因和编码HLA-G的α链的外源基因。需要说明的是，在使用本发明的低免疫原性人细胞作为移植用细胞源的情况下，要导入的编码HLA类Ib的α链的外源基因优选与编码受体的HLA类Ib的等位基因的α链的基因相同。

本说明书中，导入外源基因是指，通过向基因组的靶位点导入外源基因，使外源基因成为可在对象细胞中表达的状态。

作为导入外源基因的具体方法，可优选采用下述方法等：通过按照常规方法分离外源基因的DNA，例如在对象细胞的靶位点插入外源基因的DNA片段，结果是，将具有以外源基因在对象细胞内表达的方式构建的DNA序列的DNA链(以下，简记为基因导入用靶向载体)通过同源重组整合到对象细胞的靶位点。根据同源重组法，基因插入位置被固定，因此如果没有随机整合，则可期待克隆间的表达量之差和对其他基因的影响少。

该同源重组细胞例如可通过向对象细胞内导入上述靶向载体而获取。

例如，在基因导入用靶向载体是通过在靶位点插入外源基因的DNA片段使该外源基因在对象细胞内表达而设计的情况下，该载体例如可成为如下所述的构成。

首先，为了通过同源重组在靶位点插入外源基因的DNA片段，基因导入用靶向载体需要在该外源基因的DNA片段的5’上游和3’下游分别包含与靶位点相同的序列(5’臂和3’臂)。

为了选择在染色体中整合有基因导入用靶向载体的对象细胞，优选除了包含所插入的外源基因以外，在基因导入用靶向载体中还包含耐药性基因或报道基因。这里，作为耐药性基因和报道基因，可与基因缺损用靶向载体中使用的基因相同。

耐药性或报道基因优选处于可在对象细胞内起作用的任意的启动子的控制下。这里，作为启动子，可与基因缺损用靶向载体中使用的启动子相同。

另外，基因导入用靶向载体优选在耐药性或报道基因的下游具有polyA信号，可与基因缺损用靶向载体中使用的polyA信号相同。

另外，如果在与基因导入用靶向载体的靶位点相同的序列的外侧连接HSV-tk基因或白喉毒素基因，则可选择通过同源重组靶向于靶位点的细胞，因此优选。

向对象细胞内导入基因导入用靶向载体时，可采用与用于基因缺损用靶向载体的方法相同的方法。

整合有基因导入用靶向载体的同源重组细胞可按照与选择整合有基因缺损用靶向载体的同源重组细胞的方法相同的方法来选择。

另外，在使用病毒作为基因导入用靶向载体的情况下，可列举：通过包含DNA的病毒使对象细胞感染的方法，所述DNA在5’和3’臂之间插入有外源基因和阳性选择用标记物基因，在该臂的外侧包含阴姓选择用标记物基因。病毒、细胞的感染方法、整合有载体的细胞的选择方法等可与基因缺损用靶向载体中使用的病毒、方法相同。

基因导入用靶向载体的靶位点只要可使外源基因成为可在对象细胞中表达的状态即可，没有特别限定，作为这样的位点，可列举：基因组内的Safe Harbor区。这里，SafeHarbor区是指，即使整合外源基因，也不会发生表型变化的位点，被选择作为用于在用作药物的细胞中整合外源基因的靶位点。在低免疫原性人细胞中，作为外源基因这样的SafeHarbor区，可列举：AAVS1 (Adeno-associated virus integration site 1，腺相关病毒整合位点1)区、CCR5 (C-C chemokine receptor 5，C-C趋化因子受体5)区、ROSA26区等。在向Safe Harbor区以外的位点导入了外源基因的情况下，通过破坏所导入的位点的基因，存在导出不期待的表型、或所导入的外源基因的表达受到抑制的情况，因此不优选。在向SafeHarbor区导入外源基因的情况下，由于外源基因的整合位置被固定，所以可期待所获取的同源重组体间的外源基因的表达量之差和对其他基因的影响少。

作为用于导入外源基因的另一优选实施方案，可列举：PiggyBac法。在PiggyBac法中，使用整合有包含外源基因的DNA片段的转座子载体和表达转座酶的转座酶表达载体。转座子载体和转座酶表达载体中所含的基因等可分开存在于上述的各载体，也可包含在单一载体中。转座子载体和转座酶表达载体例如可成为如下所述的构成。

为了利用转座酶从转座子载体切取包含外源基因的DNA片段，转座子载体在包含该外源基因的DNA片段的5’上游和3’下游包含末端反向重复序列(Terminal InvertedRepeat)。转座酶识别转座子载体中所含的末端反向重复序列，从转座子载体切取被末端反向重复序列夹持的包含外源基因的DNA片段。

为了选择在靶位点整合有外源基因的对象细胞，优选在包含外源基因的DNA片段中耐药性基因或报道基因包含在转座子载体中。这里，作为耐药性基因和报道基因，可与基因导入用靶向载体中使用的基因相同。

耐药性和报道基因优选处于可在对象细胞内起作用的任意的启动子的控制下。这里，作为启动子，可与基因导入用靶向载体中使用的启动子相同。

另外，转座子载体优选在耐药性或报道基因的下游具有polyA信号，可与基因导入用靶向载体中使用的polyA信号相同。

另外，转座酶表达载体除了包含编码转座酶的基因以外，还可包含耐药性基因、报道基因、启动子、polyA信号等。耐药性基因、报道基因、启动子、polyA信号可与转座子载体中所含的相同。

向对象细胞中导入转座子载体和转座酶表达载体时，可采用与用于基因导入用靶向载体的方法相同的方法。

在靶位点整合有外源基因的细胞可通过与选择整合有基因导入用靶向载体的同源重组细胞的方法相同的方法来选择。

如上所述，通过整合有所导入的外源基因的DNA片段的转座子载体和转座酶表达载体，可在对象细胞的基因组的转座酶靶序列TTAA中整合该外源基因的DNA片段。不同于上述的使用了基因导入用靶向载体的同源重组法，在该方法中靶序列为TTAA，所以无法限定整合外源基因的位点，但事后通过使转座酶表达，也可去除整合至基因组的外源基因而不留痕迹。

本发明的低免疫原性人细胞还分别包含编码人PD-L1的外源基因和编码人PD-L2的外源基因。

PD-L1和PD-L2是属于免疫球蛋白超家族的跨膜蛋白，作为免疫耐受因子而已知。具体而言，PD-L1和PD-L2抑制性地控制外周的免疫活性，因此作为自身免疫的耐受或过度免疫、炎症应答中的检查点发挥重要作用。组成性表达PD-L1和PD-L2的细胞可抑制T细胞的增殖或损伤功能，逃避免疫反应。因此，本发明的低免疫原性人细胞分别包含编码人PD-L1的外源基因和编码人PD-L2的外源基因。

作为导入编码PD-L1的外源基因和编码PD-L2的外源基因的具体方法，可与导入上述的编码HLA类Ib的α链的外源基因的方法相同。

如上操作，可获取本发明的低免疫原性人细胞。如上所述，本发明的低免疫原性人细胞可逃避免疫应答。另外，本发明的低免疫原性人细胞维持着亲本细胞的特征。例如，在上述(1)和(2)的使内源基因缺损、且上述(3)、(4)和(5)的导入外源基因的细胞为人多能干细胞的情况下，所得到的本发明的低免疫原性人细胞与原始的人多能干细胞同样地，维持未分化标记物的表达，总基因表达模式也类似。而且，本发明的低免疫原性人细胞与原始的人多能干细胞同样地，仍维持着分化成各种各样的细胞的能力。

接下来，发明人对进一步导入了编码β2微球蛋白的外源基因的本发明的低免疫原性人细胞进行了分析。

在本发明的低免疫原性人细胞中，本来编码β2微球蛋白的内源基因不是表达不全，所以当初认为编码β2微球蛋白的外源基因的导入对HLA类Ib的本发明的低免疫原性人细胞在细胞表面的表达没有特殊影响。事实上，仅导入了编码HLA类Ib的α链的外源基因的细胞的例子、或在使编码β2微球蛋白的基因缺损而导致HLA类I的表达不全的细胞中连接HLA类Ib的α链和β链(β2微球蛋白)作为单分子来表达的例子已有报道，但还未想到在具有内源性β2微球蛋白的细胞中敢于进一步导入编码β2微球蛋白的外源基因，实际上这样的例子均完全未见报道。然而，出乎意料的是，判明了：在进一步导入了编码β2微球蛋白的外源基因的本发明的低免疫原性人细胞中，细胞表面的HLA类Ib的α链和β2微球蛋白的分子数增加。

因此，为了通过增加细胞表面的HLA类Ib的分子数来进一步提高本发明的低免疫原性人细胞的低免疫原性，本发明的低免疫原性人细胞可进一步包含编码人β2微球蛋白的外源基因。迄今为止，这样的进一步包含编码外源人β2微球蛋白的外源基因的低免疫原性人细胞完全未见报道，为了达到这样的构成，可以说要求本领域技术人员进行过度的反复试验。

由以上可知：本发明的低免疫原性人细胞可以说是根据以往的想法而无法实现的全新的低免疫原性细胞。因此，进一步导入了编码β2微球蛋白的外源基因的本发明的低免疫原性人细胞，通过使细胞表面的HLA类I的分子数增加，可期待高于导入前的低免疫原性。

需要说明的是，β2微球蛋白是与作为HLA类I的HLA类Ia和HLA类Ib的α链缔合的通用成分。作为导入编码β2微球蛋白的外源基因的具体方法，可与导入上述的编码HLA类Ib的α链的外源基因的方法相同。

本发明的低免疫原性人细胞还可包含自杀基因。特别是，在上述(1)和(2)的使内源基因缺损、且上述(3)、(4)和(5)的导入外源基因的细胞为人多能干细胞的情况下，为了逃避所得的本发明的低免疫原性人细胞所具有的致癌性等风险，希望导入自杀基因。由此，在本发明的低免疫原性人细胞在移植后发生癌化等不希望的副作用的情况下，可仅去除本发明的低免疫原性人细胞。

作为要导入至本发明的低免疫原性人细胞中的自杀基因，例如可列举：HSV-tk基因或其突变体(例如，HSV-TK、HSV-TK39等)或iCaspase9 (例如，AP1903结合型、Rapamycin结合型等)，但没有特别限定。作为导入自杀基因的具体方法，可与导入上述的编码HLA类Ib的α链的外源基因的方法相同。然而，导入至本发明的低免疫原性人细胞中的自杀基因可任意地操纵表达。因此，在用于导入自杀基因的自杀基因导入用靶向载体中，自杀基因与附条件的启动子连接。作为附条件的启动子，可列举：包含Tet操纵基因DNA序列(tetO)的启动子。包含Tet操纵基因DNA序列(tetO)的启动子由反向四环素控制的反式激活因子(rtTA)与多西环素(Dox)的复合物驱动。

本发明还提供制造低免疫原性人细胞的方法(以下，记作本发明的低免疫原性人细胞的制造方法)，该方法包括以下的工序(i)～(v)：

工序(i)：使人亲本细胞的编码HLA类Ia的α链的内源基因缺损；

工序(ii)：使从人亲本细胞中缺损编码HLA类II或其表达调控因子的内源基因；

工序(iv)：向人亲本细胞中导入编码人PD-L1的外源基因；以及

工序(v)：向人亲本细胞中导入编码人PD-L2的外源基因。

在本发明的低免疫原性人细胞的制造方法中，(i)～(v)的各工序中使用的人亲本细胞可与本发明的低免疫原性人细胞的制作中的(1)和(2)的使内源基因缺损、且(3)、(4)和(5)的可导入外源基因的细胞相同。

在本发明的低免疫原性人细胞的制造方法中，在(i)～(v)的各工序中缺损的内源基因和导入的外源基因可与本发明的低免疫原性人细胞中缺损的内源基因和导入的外源基因相同。另外，在本发明的低免疫原性人细胞的制造方法中，在(i)～(v)的各工序中使内源基因缺损的具体方法和导入外源基因的具体方法可与在本发明的低免疫原性人细胞中使内源基因缺损的具体方法和导入外源基因的具体方法相同。另外，在本发明的低免疫原性人细胞的制造方法中，在(iii)～(v)的各工序中导入外源基因的靶位点也可与在本发明的低免疫原性人细胞中导入外源基因的靶位点相同。需要说明的是，在本发明的低免疫原性人细胞的制造方法中，(i)～(v)的各工序只要可获取本发明的低免疫原性人细胞即可，可按任意的顺序进行。

如上操作而得到的低免疫原性人细胞与本发明的低免疫原性人细胞同样地逃避免疫应答，维持着人亲本细胞的特征。例如，在人亲本细胞为人多能干细胞的情况下，所得到的低免疫原性人细胞与亲本株的人多能干细胞同样地维持未分化标记物的表达量，总基因表达模式也非常类似，也维持着分化成各种各样的细胞的能力。

本发明的低免疫原性人细胞的制造方法可进一步包含工序(vi)：向人亲本细胞中导入编码人β2微球蛋白的外源基因。在本发明的低免疫原性人细胞的制造方法中，工序(vi)中使用的人亲本细胞、所导入的编码人β2微球蛋白的外源基因、导入外源基因的具体方法、导入外源基因的靶位点等可与本发明的低免疫原性人细胞的制作中的记载相同。

如上操作而得到的进一步导入了编码β2微球蛋白的外源基因的本发明的低免疫原性人细胞通过使细胞表面的HLA类I的分子数增加，可期待更高的低免疫原性。

另外，本发明的低免疫原性人细胞的制造方法可进一步包括工序(vii)：向人亲本细胞中导入自杀基因。在本发明的低免疫原性人细胞的制造方法中，工序(vii)中使用的人亲本细胞、所导入的自杀基因、导入自杀基因的具体方法、导入自杀基因的靶位点等可与本发明的低免疫原性人细胞的制作中的记载相同。

如上操作而得到的进一步导入了自杀基因的本发明的低免疫原性人细胞在移植后发生癌化等不希望的副作用的情况下，可仅去除本发明的低免疫原性人细胞。

本发明还提供：包含本发明的低免疫原性人细胞的药物(以下，记作本发明的药物)。由于本发明的低免疫原性人细胞可逃避免疫应答，因此可用作移植用的细胞源。因此，包含本发明的低免疫原性人细胞的药物可用作再生治疗用药物。

本发明的药物优选以胃肠外的方式给予至对象而使用。作为胃肠外给药方法，可列举：静脉内、动脉内、肌肉内、腹腔内和皮下给药等方法。给药量根据对象的状态、体重、年龄等适当选择，通常，以细胞数计，对于体重为60kg的对象，每次通常以1×10⁶～1×10¹⁰个的方式进行给药。另外，可1次给药，也可多次给药。本发明的药物可制成适合胃肠外给药的已知形态、例如注射或注入剂。另外，本发明的药物为了稳定地维持细胞，可包含生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、培养基等。另外，在该药物中可添加药学上可接受的载体(例：人血清白蛋白)、保存剂等以实现稳定化。

实施例

以下，通过实施例，进一步详细地说明本公开，但这些实施例为示例，本公开并不受这些实施例的限制。

[实施例1] HLA类Ia缺损iPS细胞的制造

为了逃避HLA错配所引起的T细胞的免疫排斥应答，使属于HLA类Ia的HLA-A、HLA-B、HLA-C各自的α链基因缺损。基因缺损采用了CRISPR-Cas9法。

作为针对HLA类Ia的各α链基因的指导RNA (gRNA)，使用了下述的crRNA序列。下划线为PAM序列。

#HLA-A: ACAGCGACGCCGCGAGCCAGAGG (SEQ ID NO: 1)；

#HLA-B: CCTCCTCCGCGGGTATGACCAGG (SEQ ID NO: 2)；

#HLA-C: AGCGACGCCGCGAGTCCAAGAGG (SEQ ID NO: 3)。

合成包含各crRNA序列的gRNA，与tracrRNA (Thermo Fisher Scientific)混合，制作了双链gRNA。将该双链gRNA与Cas9蛋白(Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3、Integrated DNA Technologies)混合，制作了Cas9-gRNA复合物。以下，分别记作“HLAA-gRNA-Cas9复合物”、“HLAB-gRNA-Cas9复合物”和“HLAC-gRNA-Cas9复合物”。各复合物在即将向iPS细胞中导入之前混合并使用。

作为iPS细胞的亲本株，使用了iPS细胞克隆06E (TC-1133HKK_06E_MCB)。以下，将该亲本株记作“未编辑iPS细胞”。首先，将iPS细胞悬浮液和HLAB-gRNA-Cas9复合物混合，利用电穿孔法(Neon转染系统、Thermo Fisher Scientific)向未编辑iPS细胞内导入HLAB-gRNA-Cas9复合物，培养5天。5天后，导入HLAC-gRNA-Cas9复合物，再培养5天。之后，导入HLAA-gRNA-Cas9复合物，再培养5天。由导入了gRNA-Cas9复合物的该iPS细胞进行单细胞克隆，分离了基因编辑过的细胞。

单细胞克隆按照下述方法进行。导入3种gRNA-Cas9复合物，5天后在96-孔板的各孔中接种了细胞使以计算值计包含1个细胞。从接种至96-孔板起12天后，将238个克隆的细胞在24-孔板和96-孔板的各孔中传代。该96-孔板的细胞用于筛选。另一方面，继续培养24-孔板的细胞，进行接种，1周后，根据筛选的结果，仅将候选克隆在9cm培养皿中传代。将在9cm培养皿上培养后的细胞冷冻保存。

筛选按照下述方法进行。在从96-孔板接种到另一个96-孔板的2天后，使用抗HLA-A/B/C抗体(克隆W6/32)对238个克隆进行免疫染色，选择了信号大幅减少的53个克隆。由该53个克隆的固定后且染色过的细胞提取基因组，通过体外Cas9 Cleavage Assay法分析了基因组上有无突变。具体而言，首先，将培养了细胞的96-孔板的各孔用PBS溶液洗涤。去除PBS后，加入了相对于100μL裂解缓冲液混合1μL的蛋白酶K而得的101μL溶液(TAKARA、PCR用裂解缓冲液、9170A)。将用含有蛋白酶K的裂解缓冲液裂解的细胞转移到0.2mL PCR管中，使用热循环仪在60℃下反应5分钟，将细胞完全裂解。然后，在98℃下反应2分钟，使蛋白酶K失活。将温度降至22℃以终结该反应，获取了基因组提取溶液。接下来，以该基因组为模板，通过PCR法扩增了针对HLA-A、HLA-B和HLA-C的gRNA靶序列附近的DNA片段。然后，将该PCR片段与针对各基因的gRNA-Cas9复合物混合，在37℃下反应60分钟。之后，进行琼脂糖凝胶电泳，分析了DNA片段的长度。基因组编辑后的PCR片段没有被gRNA-Cas9复合物切割，因此观察到1条DNA片段。另一方面，未经基因组编辑的PCR片段被gRNA-Cas9复合物切割，因此观察到2条DNA片段。由2条基因组均经基因编辑而发生了碱基插入或缺失(Insertion orDeletion、In/Del)的细胞观察到1条DNA片段。在一条基因组中发生In/Del、在另一条基因组中未编辑的情况下，观察到3条DNA片段。在2条基因组均未编辑的情况下，观察到2条DNA片段。关于HLA-B基因座和HLA-C基因座，也同样地进行分析。

利用体外Cas9 Cleavage Assay法对在免疫染色中HLA类I蛋白的表达减少的来自1个细胞的53个集落进行分析，其结果，在HLA-A、HLA-B、HLA-C这3个全部基因座中均未观察鉴定到根据2条基因链发生了基因突变的基因座(总计6处基因突变)。因此，分离发生了总计5处基因突变的6个克隆。

然后，通过PCR法由该6个候选克隆扩增包括gRNA的靶序列附近的DNA片段，通过Sanger测序分析了其核苷酸序列。在2条基因组为不同序列的情况下，从gRNA的靶序列附近起Sanger测序的波形重叠而变得不清楚。通过在线软件(TIDE) (https://tide.deskgen.com/)和目视分析该双重重叠的Sanger测序的波形，解读各基因链的序列，确认了实际的基因插入/缺失。确认了在这6个克隆中有2个克隆(18B12和17E10)在5处具有伴有移码的突变。

HLA-A(-/+):HLA-B(-/-):HLA-C(-/-)细胞克隆18B12的基因编辑结果如下所示。

#HLA-A: +1nt/没有突变；

#HLA-B: -10nt/-1+17nt；

#HLA-C: +1nt/-13nt。

为了通过PCR法扩增包含gRNA的靶序列附近的DNA片段，使用了下述引物。

#HLA-A、正向引物: AATCAGTGTCGTCGCGGTCG (SEQ ID NO: 4)；

#HLA-A、反向引物: AGTCTGTGAGTGGGCCTTCAC (SEQ ID NO: 5)；

#HLA-B、正向引物: GAGACACAGATCTCCAAGACCAACA (SEQ ID NO: 6)；

#HLA-B、反向引物: CCTGAGAGGAAAAGTCACGGTTC (SEQ ID NO: 7)；

#HLA-C、正向引物: AGGGAAACGGCCTCTGCGGA (SEQ ID NO: 8)；

#HLA-C、反向引物: TCTGTGCCTGGCGCTTGTAC (SEQ ID NO: 9)。

使用上述引物时的PCR产物的长度如下。

#HLA-A: 497bp；

#HLA-B: 889bp；

#HLA-C: 329bp。

为了向HLA-A(-/+):HLA-B(-/-):HLA-C(-/-) iPS细胞克隆18B12中未导入突变的HLA-A基因中导入突变，再次导入HLAA-gRNA-Cas9复合物，与上述同样地进行单细胞克隆和筛选，分离了HLA-A(-/-): HLA-B(-/-): HLA-C(-/-) iPS细胞。

在导入HLAA-gRNA-Cas9复合物的4天后，在96-孔板的各孔中接种了细胞使以计算值计包含1个细胞。从接种至96-孔板起12天后，将细胞在24-孔板和96-孔板的各孔中传代。

在传代的第二天回收该96-孔板的细胞，提取了基因组DNA。使用所提取的基因组DNA，利用体外Cas9 Cleavage Assay法分析了基因组上有无突变。对来自1个细胞的75个集落(克隆)进行分析，结果是在11个克隆的HLA-A基因中观察到了1条DNA片段，因此基因组DNA的双链均被作为基因编辑的候选克隆。然后，通过PCR法由该11个候选克隆扩增包含gRNA的靶序列附近的DNA片段，通过Sanger测序法分析了其核苷酸序列。确认了在所分离的所有HLA-A基因的双链中导入了伴有移码的突变。以下，将这里分离的HLA-A(-/-):HLA-B(-/-):HLA-C(-/-)细胞记作“HLA类Ia缺损iPS细胞(HGEC-0006细胞)”。

所得到的11个克隆中，HLA类Ia缺损iPS细胞克隆2E1的基因编辑结果如下所示(图1)。

#HLA-A: -13nt/+1nt；

#HLA-B: -10nt/-1+17nt；

#HLA-C: +1nt/-13nt。

利用流式细胞术法分析了HLA类Ia缺损iPS细胞克隆2E1中的HLA类Ia蛋白的细胞表面表达量。将200,000个iPS细胞悬浮液与识别HLA类I的抗体(克隆G46-2.6)混合，以20μL的溶液量在冰上反应30分钟。之后，加入1mL混合有2% BSA的PBS溶液，使未结合的抗体在溶液中扩散，离心操作后仅回收粒状沉淀(pellet)，从而仅回收了结合有抗体的细胞。通过使用荧光标记抗体作为抗体，利用流式细胞术(BD FACSVerse)分析了抗体所结合的蛋白的细胞表面表达量。其结果，确认到类I蛋白的细胞表面表达量大幅减少(图2)。

接下来，为了确认HLA-A、HLA-B、HLA-C蛋白的缺损对HLA类Ib的表达有怎样的影响，利用流式细胞术法分析了类Ia缺损iPS细胞克隆2E1中的HLA-E的细胞表面表达。作为抗HLA-E的抗体，使用了抗HLA-E抗体(克隆3D2)。其结果，虽然可确认到HLA-E的表达，但与未编辑iPS细胞相比减少至一半左右(图3)。

为了确认由于HLA-A、HLA-B、HLA-C蛋白的缺损而使iPS细胞的未分化性是否发生了变化，利用流式细胞术法分析了HLA类Ia缺损iPS细胞克隆2E1中的未分化标记物的表达。作为针对未分化标记物的抗体，使用了抗SSEA-4抗体(克隆MC813-70)和抗TRA-1-60抗体(克隆TRA-1-60)。其结果，确认到HLA类Ia缺损iPS细胞克隆2E1中的未分化标记物的表达量与作为亲本株的未编辑iPS细胞几乎同等(图4)。

为了确认由于HLA-A、HLA-B、HLA-C蛋白的缺损而使iPS细胞的总基因表达模式是否发生了变化，进行了转录组分析(TAKARA BIO公司、Agilent阵列表达登录分析)。该人SurePrint G3 Human Gene Expression 8×60K v3搭载覆盖26,083 Entrez gene RNA和30,606 lncRNAs的探针。在6cm培养皿中分别培养HLA类Ia缺损iPS细胞克隆2E1和HLA类Ia缺损iPS细胞克隆2H3 (第2候选克隆)、以及作为对照组的未编辑iPS细胞。在该培养容器中直接加入600μL的含有2-ME的Buffer RLT (QIAGEN)来裂解细胞，并转移到1.5mL管中。通过移液进一步裂解细胞，并在-80℃下冷冻。对该样品进行了Agilent微阵列表达登录分析，结果确认到：HLA类Ia缺损iPS细胞克隆2E1中的RNA表达模式与作为亲本株的未编辑iPS细胞克隆06E几乎同等(图5)。另外，第2候选克隆2H3的RNA表达模式也与未编辑iPS细胞克隆06E接近。

[实施例2] HLA类Ia＆II缺损iPS细胞的制造

为了抑制HLA错配所引起的T细胞的免疫排斥应答，在实施例1中得到的HLA类Ia缺损iPS细胞克隆2E1中进一步缺损RFXANK基因。由于RFXANK基因是控制HLA类II基因群的表达的转录因子，所以通过RFXANK基因的缺损可期待HLA类II基因群的表达量大幅减少。基因缺损采用了CRISPR-Cas9法。

使用了下述crRNA序列作为针对RFXANK基因的指导RNA (gRNA)。下划线为PAM序列。

#RFXANK: TGAGACCGTTCGCTTCCTGCTGG (SEQ ID NO: 10)。

合成包含针对RFXANK的crRNA序列的gRNA，与tracrRNA (Thermo FisherScientific)混合，制作了双链gRNA。将该双链gRNA与Cas9蛋白(Alt-R S.p. HiFi Cas9Nuclease V3、Integrated DNA Technologies)混合，制作了Cas9-gRNA复合物。以下，记作“RFXANK-gRNA-Cas9复合物”。将该复合物在即将向iPS细胞中导入之前混合并使用。

利用电穿孔法(Neon转染系统、Thermo Fisher Scientific)向HLA类Ia缺损iPS细胞克隆2E1中导入了RFXANK-gRNA-Cas9复合物。利用与实施例1同样的方法进行单细胞克隆和筛选，分离了HLA-A(-/-):HLA-B(-/-):HLA-C(-/-):RFXANK(-/-) iPS细胞。

在导入RFXANK-gRNA-Cas9复合物的4天后，在96-孔板的各孔中接种了细胞使以计算值计包含1个细胞。在从接种至96-孔板起12天后，将细胞在24-孔板和96-孔板的各孔中传代。在接种的第二天回收该96-孔板的细胞，提取了基因组。使用所提取的基因组，利用体外Cas9 Cleavage Assay法分析了基因组上有无突变。另一方面，继续培养24-孔板的细胞，进行接种，1周后根据筛选的结果仅将候选克隆在9cm培养皿中传代。将在9cm培养皿上培养后的细胞冷冻保存。

筛选按照下述方法进行。利用上述的体外Cas9 Cleavage Assay法分析了来自1个细胞的256个集落(克隆)，结果在4个克隆中观察到1条DNA片段，因此2条基因组均被作为基因编辑的候选克隆。然后，通过PCR由该4个候选克隆扩增包含gRNA的靶序列附近的DNA片段，对其核苷酸序列进行了Sanger测序分析。确认到：该4个候选克隆中，在2个克隆中在2个RFXANK基因座中具有伴随移码的基因缺损突变。以下，将这里分离的HLA-A(-/-):HLA-B(-/-):HLA-C(-/-):RFXANK(-/-)细胞记作“HLA类Ia＆II缺损iPS细胞(HGEC-0009细胞)”。

所得到的2个克隆中，HLA类Ia＆II缺损iPS细胞克隆6B7的基因编辑结果如下所示(图6)。

#HLA-A: -13nt/+1nt；

#HLA-B: -10nt/-17+1nt；

#HLA-C: +1nt/-13nt；

#RFXANK: -11nt/-10nt。

#RFXANK、正向引物: ATACCCACTCATGACGTGACCTG (SEQ ID NO: 11)；

#RFXANK、反向引物: CAGCCGCATCTCAAAGACAAG (SEQ ID NO: 12)。

使用上述引物时的PCR产物的长度如下。

#RFXANK: 410bp。

利用流式细胞术法，与实施例1同样地分析了HLA类Ia＆II缺损iPS细胞克隆6B7中的HLA类Ia蛋白的细胞表面表达量。其结果，在HLA类Ia＆II缺损iPS细胞克隆6B7中，与实施例1中得到的细胞同样地确认到HLA类I蛋白的细胞表面表达量的大幅减少(图7)。

在确认HLA类Ia＆II缺损iPS细胞克隆6B7中的HLA类II蛋白的细胞表面表达量时，需要将该iPS细胞分化诱导成HLA类II表达细胞。因此，作为这样的HLA类II表达细胞，利用了来自iPS细胞的包含树状细胞样细胞的血细胞系细胞。从iPS细胞向血细胞系前体细胞的分化依据文献(Biochem Biophys Res Commun. 2019 Jul 12; 515(1): 1-8.)。为了进行从血细胞系分化细胞向包含树状细胞样细胞的血细胞系细胞的分化诱导，在OP9饲养细胞上接种来自iPS细胞的血细胞系前体细胞，添加100ng/mL的FLT3L、20ng/mL的SCF、20ng/mL的GM-CSF，培养4-7天。为了检测树状细胞样细胞的出现，使用了识别树状细胞标记物的抗体、抗CD11c抗体(克隆REA618、MiltenyBiotec、130-114-110)和抗CD11b抗体(克隆ICRF44、BD Pharmingen、558123)。

为了确认因RFXANK缺损导致的HLA类II蛋白的表达量的减少，利用上述方法由iPS细胞分化成包含树状细胞的血细胞系细胞后，利用流式细胞术法分析了来自HLA类Ia＆II缺损iPS细胞克隆6B7的树状细胞样细胞中的HLA类II蛋白的细胞表面表达量。作为识别树状细胞标记物的抗体，使用了抗CD11c抗体(克隆REA618、MiltenyBiotec、130-114-110)和抗CD11b抗体(克隆ICRF44、BD Pharmingen、558123)。另外，作为识别HLA类II的抗体，使用了抗HLA-DR/DQ/DP (克隆Tu39、BD Pharmingen、557715) (图8)。

接下来，为了确认在除了缺损HLA-A、HLA-B、HLA-C蛋白还缺损RFXANK的情况下的HLA类Ib的表达，与实施例1同样地，利用流式细胞术法分析了HLA类Ia＆II缺损iPS细胞克隆6B7中的HLA-E的细胞表面表达。使用抗HLA-E抗体(克隆3D2)作为检测HLA-E的抗体。其结果，在HLA类Ia＆II缺损iPS细胞克隆6B7中无法检测到HLA-E的表达(图9)。

为了确认由于除了缺损HLA-A、HLA-B、HLA-C蛋白还缺损RFXANK而使iPS细胞的未分化性是否发生了变化，利用与实施例1同样的流式细胞术法分析了HLA类Ia＆II缺损iPS细胞克隆6B7中的未分化标记物的细胞表面表达。其结果，确认到HLA类Ia＆II缺损iPS细胞克隆6B7中的未分化标记物的表达量与作为亲本株的未编辑iPS细胞克隆06E几乎同等(图10)。

利用与实施例1同样的方法分析了由于除了缺损HLA-A、HLA-B、HLA-C蛋白还缺损RFXANK而使iPS细胞的全基因表达模式是否发生了变化。其结果，确认到HLA类Ia＆II缺损iPS细胞克隆6B7中的RNA表达模式与作为亲本株的未编辑iPS细胞克隆06E同等(图11)。

确认了HLA类Ia＆II缺损iPS细胞克隆6B7保持着向多个系统分化的能力。具体而言，分别实施向血管内皮细胞的分化诱导、向血细胞系细胞的分化诱导、向肝脏细胞的分化诱导，确认到分化诱导正常。向各细胞的分化诱导法如下所示。

从iPS细胞向血细胞系前体细胞的分化诱导依据文献(Biochem Biophys ResCommun. 2019 Jul 12; 515(1): 1-8.)。作为向血细胞系前体细胞的分化能力评价之一，利用流式细胞术法测定了血细胞系前体细胞特异性蛋白的细胞表面表达。作为血细胞系前体细胞的标记物，使用了抗CD45抗体(克隆HI30、BD Pharmingen、563880)、抗CD43抗体(克隆1G10、BD Pharmingen、555475)、抗CD34抗体(克隆8G12、BD Pharmingen、340441)。

从iPS细胞向肝细胞的分化依据文献(PNAS. 2012 Jul 31; 109(31): 12538-43(直至前半的DE诱导)、以及Hepatology, 2010 Jan; 51(1): 297-305和Stembook, Cai J.等人, Protocol for directed differentiation of human pluripoteit stem cellstoward a hepatocyte fate (使用后半的HCM))。作为向肝细胞的分化能力评价，评价了作为肝特异性功能之一的尿素合成能力(图12A)。结果是，克隆6B7中的尿素合成能力与未编辑iPS细胞克隆06E几乎同等。

从iPS细胞向血管内皮细胞的分化依据文献(Nat Cell Biol. 2015 Aug; 17(8):994-1003)。作为血管内细胞的标记物，使用了抗CD31抗体(克隆WM59、BD PharmingenD、555445)和抗CD144抗体(克隆55-7H1、BD Pharmingen、560410)。作为向血管内细胞的分化能力评价之一，评价了血管形成能力(图12B)。结果是，克隆6B7中的脉管形成能力与未编辑iPS细胞克隆06E几乎同等。

由以上的结果确认到：HLA类Ia＆II缺损iPS细胞克隆6B7的分化能力与未编辑iPS细胞克隆06E为同等程度。

[实施例3] 通用供体iPS细胞的制造

≪强化免疫逃避功能的基因的强制表达≫

为了抑制由T细胞或NK细胞引起的免疫排斥反应，通过使下述因子在实施例2中得到的HLA类Ia＆II缺损iPS细胞克隆6B7中强制表达，制造了通用供体iPS细胞。作为基因导入法，采用了PiggyBac法。另外，在各因子的cDNA强制表达中，使用了时常活性型的EF1α启动子区。

作为基于PiggyBac法的基因导入中所使用的载体，准备了以下的载体。需要说明的是，PD-L1和PD-L2通过P2A序列连接，在一个载体中同时表达。

#PB_PD-L1_P2A_PD-L2_Puro_载体；

#PB_B2M_Puro_载体；

#PB_HLAG_Puro_载体；

#PB_iCasp9_Puro_载体。

另外，作为PiggyBac转移酶，准备了以下的载体。

#hPBase_Hygro_载体。

基于PiggyBac法的基因导入中所使用的各载体按照以下方法来构建。人工合成PiggyBac的3’ITR序列(SEQ ID NO: 13)-限制酶的MCS-PiggyBac的5’ITR序列(SEQ ID NO:14)，将其加入(插入)到pHSG298质粒的PstI和EcoRI限制酶位点。向MCS中加入EF1A启动子(通过PCR由pBApo-EF1a Pur DNA质粒扩增)、各靶基因(PD-L1-P2A-PD-L2：SEQ ID NO: 15、HLAG：SEQ ID NO: 16、B2M：SEQ ID NO: 17、iCasp9的CDS (人工合成)：SEQ ID NO: 19)和IRES-Puro-hGHpolyA (人工合成)：SEQ ID NO: 23，从而构建了表达各靶基因的PB_CDS_Puro_载体。

另外，hPBase_Hygro_载体按照以下方法来构建。通过在pHSG298质粒的SalI和KpnI限制酶位点加入EF1A启动子(通过PCR扩增)、人密码子优化的PBase (人工合成、SEQID NO: 18)和IRES-Hygro-hGHpolyA (人工合成)：SEQ ID NO: 24，构建了hPBase载体。

然后，利用电穿孔法(Neon转染系统、Thermo Fisher Scientific)向实施例2中得到的HLA类Ia＆II缺损iPS细胞克隆6B7中导入上述5种质粒DNA。这里，将基因导入后的细胞命名为“HGEC-0012细胞”。

在导入质粒DNA的第二天交换成添加有嘌呤霉素和潮霉素的液体培养基，开始了耐药性细胞的筛选。在电穿孔的2天后～5天后，每天交换成添加有嘌呤霉素的液体培养基，继续进行药剂选择。在电穿孔的6天后交换成不含药剂的液体培养基，继续进行细胞培养。在电穿孔的7天后，在96-孔板的每1个孔中接种细胞使以计算值计包含1个细胞，并继续培养。从接种至96-孔板起12天后将细胞在24-孔板和96-孔板的各孔中传代。在96-孔板中接种使以计算值计每1个孔包含1个细胞，12+1天后的96-孔板上的细胞在传代的第二天回收，利用定量RT-PCR法分析各导入因子的表达量，从而筛选了所有的导入因子均过度表达的克隆。

基于定量RT-PCR法的1次筛选按照下述方法进行。为了分析96-孔板上的细胞，进行了逆转录反应(qPCR用SuperPrep细胞裂解和RT试剂盒、TOYOBO、SCQ-401)。以该逆转录产物为模板，进行定量PCR (StepOne Plus实时PCR系统、ThermoFisher Scientific)，分析了导入基因的表达量。在PCR反应中，使用了THUNDERBIRD Probe qPCR Mix (TOYOBO、QPS-101)或TaqMan Fast Advanced Master Mix (ThermoFisher Scientific、4444557)的任意试剂。在各因子的检测中，使用了TaqMan Gene Expression Assay (FAM和/或VIC)(ThermoFisher Scientific)；GAPDH (Hs02758991_g1)、PD-L1 (Hs00204257_m1)、PD-L2(Hs00228839_m1)、HLAG (Hs00365950_g1)、B2M (Hs00187842_m1)。用于检测iCasp9的荧光探针和引物是人工合成的(序列参照如下)。

人工合成的荧光探针(FAM)和引物的序列如下所示。

#iCasp9-正向引物: GAACTGCTGAAGCTGGAATC (SEQ ID NO: 20)；

#iCasp9-反向引物: CATTTCCTCTCAGGCTTTCCAG (SEQ ID NO: 21)；

#iCasp9-探针(5’6-FAM, 3’BHQ1): ATCTGGCGTTGACGGCTTTGGA GATGTG (SEQ IDNO: 22)。

从20块96-孔板分离242个来自单细胞的克隆，将1个克隆接种在“24-孔板‐继续培养用”和“96-孔板‐筛选用”的2个孔中。在接种的1天后回收“96-孔板‐筛选用”的细胞，通过上述的逆转录定量PCR法进行分析，结果在18个克隆中均确认到PD-L1、HLA-G、B2M和iCasp9mRNA的过度表达。作为比较对象，使用了未进行基因导入的HLA类Ia＆II缺损iPS细胞克隆6B7。另一方面，接种于“24-孔板‐继续培养用”的细胞，在接种1周后仅针对上述18个克隆在2块9cm培养皿中传代。接种6天后，使用1块9cm培养皿的细胞，通过流式细胞术法定量蛋白的表面表达，从而进行了2次筛选。剩下的1块9cm培养皿的细胞在培养后冷冻保存。

基于流式细胞术法的2次筛选按照下述方法进行。从培养皿剥离细胞后，将细胞悬浮液与荧光标记抗体混合，使用FACSVerse流式细胞仪(BD)定量分析了在细胞表面表达的蛋白的表达量。下述记载所使用的抗体：抗PD-L1抗体-APC标记(克隆MIH1、Invitrogen、12-5888-42)、抗B2M抗体-PECy7标记(克隆2M2、BioLegend、316318)、抗HLAG抗体-PE标记(克隆MEM-G/9、Abcam、ab24384)。其结果，在所有的18个克隆中均确认到PD-L1、HLA-G和B2M在细胞表面的高度表达。按照上述方法分离了通用供体iPS细胞克隆。

≪所得到的细胞的评价≫

利用与上述同样的方法确认了通用供体iPS细胞克隆9G11中的HLA-G、B2M、PD-L1和PD-L2在细胞表面的过度表达水平。以下记载所使用的抗体：抗PD-L1抗体-APC标记(克隆MIH1、Invitrogen、12-5888-42)、抗PD-L2抗体-PE标记(克隆MIH18，Invitrogen、17-5983-42)、抗HLAG抗体-PE标记(克隆MEM-G/9、Abcam、ab24384)。其结果，确认到HLA-G、B2M、PD-L1和PD-L2在细胞表面的高度表达(图13)。

将通用供体iPS细胞克隆9G11分化成包含造血前体细胞的血细胞系细胞集团(CD45阳性细胞)后，与实施例1同样地利用流式细胞术法分析HLA类Ia蛋白的细胞表面表达，确认了表达水平。需要说明的是，从通用供体iPS细胞向血细胞系前体细胞的分化与实施例2同样地进行实施。其结果，确认到HLA-A、HLA-B和HLA-C蛋白的细胞表面表达量大幅减少(图14)。另外，与实施例2同样地，利用流式细胞术法分析了HLA类II蛋白的细胞表面表达水平。其结果，确认到HLA类II蛋白(HLA-DR、DP、DQ)的细胞表面表达量的大幅减少(图14)。再按照与上述同样的方法确认了HLA-G、PD-L1和PD-L2在细胞表面的过度表达水平。以下记载所使用的抗体：抗PD-L1抗体-APC标记(克隆MIH1、Invitrogen、12-5888-42)、抗PD-L2抗体-PE标记(克隆MIH18，Invitrogen、17-5983-42)、抗B2M抗体-PECy7标记(克隆2M2、BioLegend、316318)、抗HLAG抗体-PE标记(克隆MEM-G/9、Abcam、ab24384)。其结果，确认了HLA-G在细胞表面的高度表达。关于PD-L1和PD-L2，虽然也观察到了内源性表达，但确认了有少许的表达上升(图15)。

为了确认由于除了缺损HLA-A、HLA-B、HLA-C、RFXANK蛋白还强制表达HLA-G、B2M、PD-L1、PD-L2、iCasp9而使iPS细胞的未分化性是否发生了变化，与实施例1同样地利用流式细胞术法分析了通用供体iPS细胞克隆9G11中的iPS细胞未分化标记物的表达。作为针对细胞表面的未分化标记物的抗体，使用了抗TRA-1-81抗体(克隆TRA-1-81)、抗SSEA-4抗体(克隆MC813-70)和抗TRA-1-60抗体(克隆TRA-1-60)。另外，利用流式细胞术法分析了细胞内Oct3/4蛋白的表达。为了将细胞内的蛋白染色，用透化缓冲液(Permeabilization Buffer)(BD)处理细胞悬浮液后，用抗Oct3/4抗体(克隆C30A3)进行染色。其结果，确认到通用供体iPS细胞克隆9G11充分地表达了各未分化标记物(图16)。未分化标记物的表达确认在免疫染色法中也同样地被确认。通过碱性磷酸酶染色法，进一步确认到对未分化性没有影响。

为了确认在基因编辑前后基因表达模式没有大幅变化，使用通用供体iPS细胞克隆9G11和未编辑iPS细胞实施了RNA-seq比较分析。其结果，确认到在基因编辑前后基因表达模式没有大幅变化。

另外，在用于基因编辑和克隆的培养过程中，为了研究有可能增大癌化风险的已知的基因突变的有无，在通用供体iPS细胞克隆9G11中使用QIAseq Targeted DNA Panel(Comprehensive Cancer Panel)实施了高灵敏度的基因组突变分析。其结果，确认到在用于基因编辑和克隆的培养过程中，没有发生已知癌变风险增加的已知突变。

在用于基因编辑和克隆的培养过程中，为了研究有无核型异常，进行了核型分析。其结果，在通用供体iPS细胞克隆9G11中，没有检测到核型异常(图17)。

为了确认由于除了缺损HLA-A、HLA-B、HLA-C、RFXANK蛋白还强制表达HLA-G、B2M、PD-L1、PD-L2、iCasp9而使iPS细胞在向多个系统的分化能力保持上是否发生了变化，尝试了通用供体iPS细胞克隆9G11向多个系统的分化诱导。按照与实施例2同样的方法确认了保持多分化能力(图18)。

实施例4：通用供体iPS细胞的免疫逃避机制和安全装置的评价

≪T细胞的应答≫

关于通用供体iPS细胞克隆，其基因编辑的结果，被期待容易逃避T细胞的免疫应答。对于通用供体iPS细胞克隆9G11，为了确认HLA错配所引起的T细胞的应答减弱，以T细胞的增殖为指标，通过流式细胞术法实施了分析。作为靶细胞，使用了包含来自通用供体iPS细胞(克隆9G11)的造血前体细胞的细胞集团(CD45阳性细胞)。从通用供体iPS细胞向血细胞系前体细胞的分化，与实施例2同样地进行实施。将T细胞和靶细胞共培养5天或7天，使用EdU试剂评价了T细胞的增殖。算出了T细胞的CD4阳性细胞和CD8阳性细胞各自的EdU阳性率作为各细胞的增殖率。另外，作为试验系统的阳性对照，在靶细胞中使用THP-1细胞，评价了T细胞的增殖。

结果见图19。在单独的T细胞中，几乎没有观察到细胞增殖(未摄入EdU)。若与作为阳性对照的THP-1或来自未编辑iPS细胞的CD45阳性细胞(06E)共培养，则T细胞作出应答，显示出细胞增殖(摄入EdU)。相对于此，通用供体iPS细胞克隆9G11在共培养时T细胞的应答显著减少(EdU的摄入减少)。由该结果确认到：通过基因编辑操作，来自通用供体iPS细胞克隆的分化细胞容易逃避T细胞的免疫应答。

≪由T细胞产生的细胞毒活性的逃避≫

为了确认T细胞对通用供体iPS细胞克隆9G11的损伤活性减弱，利用流式细胞术法实施了细胞损伤测定。作为效应细胞，使用了CD8阳性细胞，作为靶细胞，使用了包含来自iPS细胞(克隆9G11和未编辑细胞)的造血前体细胞的细胞集团(CD45阳性细胞)。将CD45阳性细胞在50ng/mL IFNγ存在下培养2天，使用终浓度为5μM的Cell Tracer Violet(Thermo Fisher Scientific)对活细胞进行染色。将已引发的CD8阳性细胞改变细胞数比率进行混合，共培养3小时后，为了标记受到损伤的靶细胞，添加了250μL以作为死细胞标记物的SYTOX计为0.1μM的SYTOX溶液。之后，使用流式细胞仪(Miltenyi Biotec MACSQuant)测定了Cell Tracer Violet和SYTOX的荧光。

计测总靶细胞中(Cell Tracer Violet阳性)的死细胞(SYTOX阳性)的比例，作为细胞毒活性的指标。以未引发的T细胞作为阴性对照反应实施试验，作为背景值而减去。

其结果，未编辑细胞由于引发的CD8阳性细胞而受到损伤，与此相比，可确认到通用供体iPS细胞克隆9G11如预料的那样不易受到损伤(图20)。

≪由NK细胞产生的细胞毒活性的逃避≫

接下来，按照以下的方法评价了NK细胞对iPS细胞的细胞毒活性。关于通用供体iPS细胞克隆，其基因编辑的结果，被期待容易逃避由NK细胞产生的免疫应答。对于通用供体iPS细胞克隆9G11，为了确认NK细胞的应答减弱，以NK细胞的增殖为指标，利用流式细胞术法实施了分析。作为靶细胞，分别使用了未编辑iPS细胞克隆06E、HLA类Ia＆II缺损iPS细胞克隆6B7、通用供体iPS细胞克隆9G11。

首先，为了用活细胞标记物即钙黄绿素标记靶细胞，在靶细胞的悬浮液(100,000个细胞/100μL)中加入0.03mM的钙黄绿素-AM溶液，使在K562中终浓度为500nM、在iPS细胞中终浓度为1500nM。在37℃/5%CO₂培养箱中静置30分钟。添加5mL的PBS，以200×g离心4分钟后去除上清。将250,000个或500,000个效应细胞(NK细胞)和50,000个靶细胞混合，在37℃/5%CO₂培养箱中静置2小时。添加0.25% BSA-PBS溶液，以300×g离心5分钟后去除上清。然后，为了标记受到损伤的靶细胞，添加250μL作为死细胞标记物的0.1nM SYTOX溶液。之后，使用流式细胞仪(Miltenyi Biotec MACSQuant)测定了钙黄绿素和SYTOX的荧光。计测总靶细胞中(钙黄绿素阳性)的死细胞(SYTOX阳性)的比例，作为细胞毒活性的指标。在数值的计算中，实施适当的阴性对照反应，作为背景值而减去。

测定NK细胞的细胞毒活性的结果，与在细胞表面表达HLA类I蛋白的未编辑iPS细胞相比，如上所述，HLA类Ia＆II缺损iPS细胞克隆6B7在细胞表面几乎没有表达HLA类I蛋白，如预料的那样，与未编辑iPS细胞相比，有更多的细胞受到NK细胞的损伤。在通用供体iPS细胞克隆9G11中，通过使HLA-G和B2M强制表达，如上所述，HLA类I蛋白在多个细胞表面表达，如期待的那样，仅有与未编辑iPS细胞为同等程度或其以下的细胞受到NK细胞的损伤(图21)。因而，可知本发明的细胞对由NK细胞产生的细胞毒活性的逃避能力高。

≪自杀基因的功能评价≫

接下来，进行实验以确认所导入的自杀基因是否起作用。为了确认作为安全装置的导入到通用供体iPS细胞中的自杀基因iCaspase9的功能，在体外确认了因添加雷帕霉素而导致的细胞死亡诱导。在评价细胞死亡诱导效率时，根据作为细胞存活性的指标的ATP量，使用了对细胞存活率进行发光测定的CellTiter Glo测定试剂盒(Promega)。测定了将上述iCaspase9导入细胞(克隆B)和不含iCaspase9的未编辑细胞(Parental)在各雷帕霉素浓度(0nM/0.003nM/0.01nM/0.03nM/0.1nM/0.3nM/1nM)条件下培养24小时后的活细胞率，结果可知：在雷帕霉素浓度为0.1nM以上时，iCaspase9导入细胞的细胞存活率与未编辑细胞相比显著降低(图22)。由该结果可确认到：在0.1nM以上的雷帕霉素浓度条件下，诱导了基于iCaspase9的细胞死亡。

[实施例5] 基于B2M的有无的HLA类Ib的表达

为了研究在本发明的细胞的制造中是否需要实施例3中的导入至本发明的细胞中的外源B2M，对在去除了外源B2M的情况下是否维持HLA类Ib的表达进行了比较试验。

“组合1”

#PB_B2M_Puro_载体；

#PB_HLAG_Puro_载体；

“组合2”

#PB_HLAG_Puro_载体。

利用电穿孔法向实施例2中得到的HLA类Ia＆II缺损iPS细胞中导入了上述“组合1”或“组合2”的PiggyBac基因表达载体。药剂选择按照实施例3中记载的方法进行。在电穿孔的6天后，交换成无药剂的液体培养基，并继续细胞培养。以下，将该状态的细胞称为“池细胞(pool cells)”。

强制表达因子的细胞表面表达通过流式细胞术法进行分析。从培养皿剥离细胞后，与荧光标记抗体混合，使用流式细胞仪(BD FACSVerse)定量分析了在细胞表面表达的蛋白的表达量。以下记载所使用的抗体：抗B2M抗体-PECy7标记(克隆2M2、BioLegend、316318)、抗HLA-G抗体-PE标记(克隆MEM-G/9、Abcam、ab24384)。

在池细胞中，比较上述2种的组合，其结果，通过导入B2M (组合1)，在细胞表面可确认到更高度表达的HLA-G和B2M (图23)。具有B2M时，总HLA类I量(根据B2M的细胞表面表达推测)增多，因此期待通过导入B2M而使本发明的细胞发挥更高的功能。

产业实用性

本公开所涉及的细胞例如可用于再生医疗领域。本申请以在日本申请的特愿2020-091787 (申请日：2020年5月26日)为基础，其内容均包含在本说明书中。

<110> 希里欧斯株式会社

<120> 低免疫原性细胞

<130> 093145

<150> JP 2020-091787

<151> 2020-05-26

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> crRNA

<400> 1

acagcgacgc cgcgagccag agg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> crRNA

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cctcctccgc gggtatgacc agg 23

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<212> DNA

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agcgacgccg cgagtccaag agg 23

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<212> DNA

<213> 人工序列

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aatcagtgtc gtcgcggtcg 20

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<212> DNA

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agtctgtgag tgggccttca c 21

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<213> 人工序列

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gagacacaga tctccaagac caaca 25

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

cctgagagga aaagtcacgg ttc 23

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物

<400> 8

agggaaacgg cctctgcgga 20

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物

<400> 9

tctgtgcctg gcgcttgtac 20

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tgagaccgtt cgcttcctgc tgg 23

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atacccactc atgacgtgac ctg 23

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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cagccgcatc tcaaagacaa g 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3'ITR

<400> 13

ccctagaaag ataatcatat tgtgacgtac gttaaagata atcatgcgta aaattgacgc 60

atgtgtttta tcggtctgta tatcgaggtt tatttattaa tttgaataga tattaagttt 120

tattatattt acacttacat actaataata aattcaacaa acaatttatt tatgtttatt 180

tatttattaa aaaaaaacaa aaactcaaaa tttcttctat aaagtaacaa aacttttaaa 240

cattctctct 250

<210> 14

<211> 307

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5'ITR

<400> 14

tatctataac aagaaaatat atatataata agttatcacg taagtagaac atgaaataac 60

aatataatta tcgtatgagt taaatcttaa aagtcacgta aaagataatc atgcgtcatt 120

ttgactcacg cggtcgttat agttcaaaat cagtgacact taccgcattg acaagcacgc 180

ctcacgggag ctccaagcgg cgactgagat gtcctaaatg cacagcgacg gattcgcgct 240

atttagaaag agagagcaat atttcaagaa tgcatgcgtc aattttacgc agactatctt 300

tctaggg 307

<210> 15

<211> 1758

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 15

atgaggatat ttgctgtctt tatattcatg acctactggc atttgctgaa cgcatttact 60

gtcacggttc ccaaggacct atatgtggta gagtatggta gcaatatgac aattgaatgc 120

aaattcccag tagaaaaaca attagacctg gctgcactaa ttgtctattg ggaaatggag 180

gataagaaca ttattcaatt tgtgcatgga gaggaagacc tgaaggttca gcatagtagc 240

tacagacaga gggcccggct gttgaaggac cagctctccc tgggaaatgc tgcacttcag 300

atcacagatg tgaaattgca ggatgcaggg gtgtaccgct gcatgatcag ctatggtggt 360

gccgactaca agcgaattac tgtgaaagtc aatgccccat acaacaaaat caaccaaaga 420

attttggttg tggatccagt cacctctgaa catgaactga catgtcaggc tgagggctac 480

cccaaggccg aagtcatctg gacaagcagt gaccatcaag tcctgagtgg taagaccacc 540

accaccaatt ccaagagaga ggagaagctt ttcaatgtga ccagcacact gagaatcaac 600

acaacaacta atgagatttt ctactgcact tttaggagat tagatcctga ggaaaaccat 660

acagctgaat tggtcatccc agaactacct ctggcacatc ctccaaatga aaggactcac 720

ttggtaattc tgggagccat cttattatgc cttggtgtag cactgacatt catcttccgt 780

ttaagaaaag ggagaatgat ggatgtgaaa aaatgtggca tccaagatac aaactcaaag 840

aagcaaagtg atacacattt ggaggagacg ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg 900

aagcaggcag gagacgtgga ggagaaccct gggcccatga tcttcctcct gctaatgttg 960

agcctggaat tgcagcttca ccagatagca gctttattca cagtgacagt ccctaaggaa 1020

ctgtacataa tagagcatgg cagcaatgtg accctggaat gcaactttga cactggaagt 1080

catgtgaacc ttggagcaat aacagccagt ttgcaaaagg tggaaaatga tacatcccca 1140

caccgtgaaa gagccacttt gctggaggag cagctgcccc tagggaaggc ctcgttccac 1200

atacctcaag tccaagtgag ggacgaagga cagtaccaat gcataatcat ctatggggtc 1260

gcctgggact acaagtacct gactctgaaa gtcaaagctt cctacaggaa aataaacact 1320

cacatcctaa aggttccaga aacagatgag gtagagctca cctgccaggc tacaggttat 1380

cctctggcag aagtatcctg gccaaacgtc agcgttcctg ccaacaccag ccactccagg 1440

acccctgaag gcctctacca ggtcaccagt gttctgcgcc taaagccacc ccctggcaga 1500

aacttcagct gtgtgttctg gaatactcac gtgagggaac ttactttggc cagcattgac 1560

cttcaaagtc agatggaacc caggacccat ccaacttggc tgcttcacat tttcatcccc 1620

ttctgcatca ttgctttcat tttcatagcc acagtgatag ccctaagaaa acaactctgt 1680

caaaagctgt attcttcaaa agacacaaca aaaagacctg tcaccacaac aaagagggaa 1740

gtgaacagtg ctatctga 1758

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<212> DNA

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atggtggtca tggcgccccg aaccctcttc ctgctactct cgggggccct gaccctgacc 60

gagacctggg cgggctccca ctccatgagg tatttcagcg ccgccgtgtc ccggcccagc 120

cgcggggagc cccgcttcat cgccatgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180

gacagcgact cggcgtgtcc gaggatggag ccgcgggcgc cgtgggtgga gcgggagggg 240

ccagagtatt gggaagagga gacacggaac accaaggccc acgcacagac tgacagaatg 300

aacctgcaga ccctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg ccagttctca taccctccag 360

tggatgattg gctgcgacct ggggtccgac ggacgcctcc tccgcgggta tgaacagtat 420

gcctacgatg gcaaggatta cctcgccctg aacgaggacc tgcgctcctg gaccgcagcg 480

gacactgcgg ctcagatctc caagcgcaag tgtgaggcgg ccaatgtggc tgaacaaagg 540

agagcctacc tggagggcac gtgcgtggag tggctccaca gatacctgga gaacgggaag 600

gagatgctgc agcgcgcgga cccccccaag acacacgtga cccaccaccc tgtctttgac 660

tatgaggcca ccctgaggtg ctgggccctg ggcttctacc ctgcggagat catactgacc 720

tggcagcggg atggggagga ccagacccag gacgtggagc tcgtggagac caagcctgca 780

ggggatggaa ccttccagaa gtgggcagct gtggtggtgc cttctggaga ggagcagaga 840

tacacgtgcc atgtgcagca tgaggggctg ccggagcccc tcatgctgag atggaagcag 900

tcttccctgc ccaccatccc catcatgggt atcgttgctg gtctggttgt ccttgcagct 960

gtagtcactg gagctgcggt cgctgctgtg ctgtggagga agaagagctc agattga 1017

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atgtctcgct ccgtggcctt agctgtgctc gcgctactct ctctttctgg cctggaggct 60

atccagcgta ctccaaagat tcaggtttac tcacgtcatc cagcagagaa tggaaagtca 120

aatttcctga attgctatgt gtctgggttt catccatccg acattgaagt tgacttactg 180

aagaatggag agagaattga aaaagtggag cattcagact tgtctttcag caaggactgg 240

tctttctatc tcttgtacta cactgaattc acccccactg aaaaagatga gtatgcctgc 300

cgtgtgaacc atgtgacttt gtcacagccc aagatagtta agtgggatcg agacatgtaa 360

<210> 18

<211> 1785

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PBase

<400> 18

atgggaagct ccctggacga tgaacatatc ctctccgctc tgctccaaag cgatgacgaa 60

ctggtgggcg aggattccga ctctgagatt tctgaccatg tcagcgagga cgatgtgcag 120

tccgatactg aagaggcatt tatcgacgag gtgcatgaag tccagcccac ttcctctgga 180

agcgaaatcc tggacgagca gaatgtcatc gaacagcctg gctcctctct cgcttccaac 240

agaatcctga ccctccctca gaggacaatc agaggcaaga acaagcattg ctggtctaca 300

agcaaatcca ccaggagaag ccgggtgtct gccctcaata tcgtcagaag ccaaagggga 360

cccacccgga tgtgtaggaa catttacgat cctctgctct gcttcaagct gtttttcact 420

gacgagatca tttctgaaat tgtgaagtgg acaaacgccg aaatctctct caagagaagg 480

gaaagcatga caggggctac attcagggac acaaatgagg atgaaattta cgccttcttt 540

ggcattctgg tgatgacagc agtcagaaaa gataatcaca tgagcacaga tgatctcttc 600

gacagatccc tgagcatggt gtatgtctct gtgatgtcca gagatcggtt cgattttctc 660

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ttcacccctg tgcggaagat ttgggatctg ttcatccacc agtgcattca aaattacacc 780

cccggcgctc atctcacaat cgacgaacaa ctcctgggat ttcggggcag atgtcccttc 840

agaatgtata ttcctaataa gccaagcaag tacgggatca aaattctgat gatgtgtgac 900

tctggaacca agtatatgat taacggaatg ccttatctcg gcagagggac ccaaactaac 960

ggcgtgccac tcggcgaata ctatgtcaaa gagctgtcca aacctgtcca cggaagctgt 1020

agaaatatca cctgcgataa ctggtttaca tccattcccc tcgccaagaa cctgctccaa 1080

gaaccttaca agctgaccat tgtcggcact gtcaggtcca acaagaggga gattccagaa 1140

gtgctcaaga actccagaag caggccagtc ggcacatcca tgttctgttt cgacggacca 1200

ctgactctcg tgtcttacaa gcccaaacct gctaagatgg tctatctgct cagctcctgt 1260

gatgaggacg cctctattaa cgagagcacc ggcaagccac aaatggtgat gtactataac 1320

cagaccaagg ggggagtcga tactctcgac cagatgtgtt ccgtgatgac atgctccaga 1380

aagactaatc ggtggcctat ggctctcctg tatggcatga ttaacattgc ctgtatcaac 1440

agcttcatca tttatagcca caacgtgtcc tctaagggag aaaaggtcca aagcagaaag 1500

aaattcatgc ggaacctgta tatgagcctc acctcctctt ttatgcggaa gaggctggag 1560

gcacctactc tcaaaagata cctgagggat aacatcagca acattctccc taatgaggtc 1620

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atttgtagag aacataacat tgatatgtgt cagagctgct tctaa 1785

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 19

atggccagca gaatcctgtg gcacgagatg tggcatgaag gcctggaaga ggccagcagg 60

ctgtacttcg gcgagagaaa cgtgaagggc atgttcgagg tgctggaacc cctgcacgcc 120

atgatggaaa gaggccctca gacactgaaa gagacaagct tcaaccaggc ctacggccgg 180

gatctgatgg aagcccaaga gtggtgccgg aagtacatga agtccggcaa tgtgaaggac 240

ctgctgcagg cctgggacct gtactaccac gtgttcagac ggatcagcaa gctcgagtac 300

agcggcggag gatctctgga aggcgtccag gtggaaacaa tctctcctgg cgacggccgg 360

acattcccta aaaggggcca gacatgcgtg gtgcactaca ccggcatgct ggaagatggc 420

aagaagttcg acagcagccg ggacagaaac aagcccttca agttcatgct gggcaagcaa 480

gaagtgatca gaggctggga agagggcgtc gcccagatgt ctgttggaca gagagccaag 540

ctgacaatca gccccgatta cgcctatggc gccacaggac accctggcat cattcctcca 600

catgccacac tggtgttcga cgtggaactg ctgaagctgg aatctggcgg aggtggaagc 660

ggaggcggag gttctggtgg tggtggatct ggcgttgacg gctttggaga tgtgggcgcc 720

ctggaaagcc tgagaggaaa tgccgatctg gcctacatcc tgagcatgga accttgcggc 780

cactgcctga ttatcaacaa cgtgaacttc tgcagagaga gcggcctgag aaccagaacc 840

ggcagcaaca tcgactgcga gaagctgcgg agaagattca gcagcctgca cttcatggtg 900

gaagtgaagg gcgacctgac cgccaagaaa atggtgctgg ctctgctgga actggcccag 960

caagatcatg gcgctctgga ttgctgcgtg gtcgtgatcc tgtctcatgg ctgtcaggcc 1020

agccatctgc aattccctgg cgccgtgtat ggcaccgatg gctgtcctgt gtccgtggaa 1080

aagatcgtga acatcttcaa cggcaccagc tgtcctagcc tcggcggaaa gcccaagctg 1140

ttcttcatcc aagcctgtgg cggcgagcag aaggatcacg gatttgaggt ggccagcaca 1200

agccccgagg atgagtctcc tggaagcaac cctgagcctg acgccacacc tttccaagag 1260

ggactgagaa ccttcgacca gctggacgct atcagctccc tgcctacacc tagcgacatc 1320

ttcgtgtcct acagcacatt ccccggcttt gtgtcttggc gggatcccaa gtctggctct 1380

tggtacgtgg aaaccctgga cgatatcttc gagcagtggg cccatagcga ggacctgcaa 1440

tctctgctgc tgagagtggc caatgccgtg tccgtgaagg gaatctacaa gcagatgcct 1500

ggctgcttca acttcctgcg gaagaagctg tttttcaaga ccagcgccag ctga 1554

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

gaactgctga agctggaatc 20

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

catttcctct caggctttcc ag 22

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> probe

<400> 22

atctggcgtt gacggctttg gagatgtg 28

<210> 23

<211> 1706

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IRES-Puro-hGHpolyA

<400> 23

cgcccctctc cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg 60

tgtgcgtttg tctatatgtg attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc 120

cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa 180

ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga 240

caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc 300

ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc 360

cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac 420

aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg 480

tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac 540

ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga tgataatatg gccacaacca tgaccgaata 600

taaacctacg gttagattgg cgacaaggga cgacgtgcct agagctgtac gcacactggc 660

agccgcattt gcggactacc cggcaacacg acacaccgtg gaccctgatc gccacataga 720

gcgggtcact gaactccagg aattgtttct cacccgagta ggccttgaca ttggcaaggt 780

atgggtcgcg gacgacggtg ccgccgttgc tgtctggact accccggaaa gcgtagaagc 840

tggagctgta ttcgcagaga tcggtccaag gatggcagag ctttctggct ccagacttgc 900

cgcccaacaa cagatggaag gacttctggc gccccatagg ccgaaagagc ctgcgtggtt 960

tttggctaca gttggcgttt ccccagatca tcaaggtaaa gggctcggat ctgccgtggt 1020

gcttcctggg gttgaggcag ctgagagggc cggtgttcct gcgttccttg agacatccgc 1080

tcctcgcaac ttgcctttct atgaaaggct gggttttact gttacggccg atgtagaagt 1140

gccagaagga ccacgcacct ggtgcatgac tagaaagcct ggggcatgaa taacttcgta 1200

tagcatacat tatacgaagt tatctgcccg ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc 1260

ctctcctggc cctggaagtt gccactccag tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa 1320

gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct tctataatat tatggggtgg aggggggtgg 1380

tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac 1440

caagctggag tgcagtggca caatcttggc tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag 1500

cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt tgggattcca ggcatgcatg accaggctca 1560

gctaattttt gtttttttgg tagagacggg gtttcaccat attggccagg ctggtctcca 1620

actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt 1680

gaaccactgc tcccttccct gtcctt 1706

<210> 24

<211> 2144

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IRES-Hygro-hGHpolyA

<400> 24

cgcccctctc cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg 60

tgtgcgtttg tctatatgtg attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc 120

cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa 180

ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga 240

caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc 300

ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc 360

cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac 420

aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg 480

tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac 540

ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga tgataatatg gccacaacca tgaaaaagcc 600

tgaactcacc gcgacgtctg tcgagaagtt tctgatcgaa aagttcgaca gcgtctccga 660

cctgatgcag ctctcggagg gcgaagaatc tcgtgctttc agcttcgatg taggagggcg 720

tggatatgtc ctgcgggtaa atagctgcgc cgatggtttc tacaaagatc gttatgttta 780

tcggcacttt gcatcggccg cgctcccgat tccggaagtg cttgacattg gggaattcag 840

cgagagcctg acctattgca tctcccgccg tgcacagggt gtcacgttgc aagacctgcc 900

tgaaaccgaa ctgcccgctg ttctgcagcc ggtcgcggag gccatggatg cgatcgctgc 960

ggccgatctt agccagacga gcgggttcgg cccattcgga ccgcaaggaa tcggtcaata 1020

cactacatgg cgtgatttca tatgcgcgat tgctgatccc catgtgtatc actggcaaac 1080

tgtgatggac gacaccgtca gtgcgtccgt cgcgcaggct ctcgatgagc tgatgctttg 1140

ggccgaggac tgccccgaag tccggcacct cgtgcacgcg gatttcggct ccaacaatgt 1200

cctgacggac aatggccgca taacagcggt cattgactgg agcgaggcga tgttcgggga 1260

ttcccaatac gaggtcgcca acatcttctt ctggaggccg tggttggctt gtatggagca 1320

gcagacgcgc tacttcgagc ggaggcatcc ggagcttgca ggatcgccgc ggctccgggc 1380

gtatatgctc cgcattggtc ttgaccaact ctatcagagc ttggttgacg gcaatttcga 1440

tgatgcagct tgggcgcagg gtcgatgcga cgcaatcgtc cgatccggag ccgggactgt 1500

cgggcgtaca caaatcgccc gcagaagcgc ggccgtctgg accgatggct gtgtagaagt 1560

actcgccgat agtggaaacc gacgccccag cactcgtggg gatcgggaga tgggggaggc 1620

taactgaata acttcgtata ggatacctta tacgaagtta tctgcccggg tggcatccct 1680

gtgacccctc cccagtgcct ctcctggccc tggaagttgc cactccagtg cccaccagcc 1740

ttgtcctaat aaaattaagt tgcatcattt tgtctgacta ggtgtccttc tataatatta 1800

tggggtggag gggggtggta tggagcaagg ggcaagttgg gaagacaacc tgtagggcct 1860

gcggggtcta ttgggaacca agctggagtg cagtggcaca atcttggctc actgcaatct 1920

ccgcctcctg ggttcaagcg attctcctgc ctcagcctcc cgagttgttg ggattccagg 1980

catgcatgac caggctcagc taatttttgt ttttttggta gagacggggt ttcaccatat 2040

tggccaggct ggtctccaac tcctaatctc aggtgatcta cccaccttgg cctcccaaat 2100

tgctgggatt acaggcgtga accactgctc ccttccctgt cctt 2144

Claims

1.低免疫原性人细胞，其满足：

(1) 缺损编码人白细胞型抗原(HLA)类Ia的α链的内源基因；

(2) 缺损编码HLA类II或其表达调控因子的内源基因；

(3) 包含编码HLA类Ib的α链的外源基因；

(4) 包含编码人PD-L1的外源基因；以及

(5) 包含编码人PD-L2的外源基因。

2.权利要求1所述的细胞，该细胞不在细胞表面表达内源性HLA类Ib。

3.权利要求1或2所述的细胞，其中，编码HLA类Ia的α链的内源基因为编码HLA-A的α链的内源基因、编码HLA-B的α链的内源基因和编码HLA-C的α链的内源基因。

4.权利要求1～3中任一项所述的细胞，其中，编码HLA类II或其表达调控因子的内源基因为以下的(a)或(b)：

5.权利要求1～4中任一项所述的细胞，其中，编码HLA类Ib的α链的外源基因为编码HLA-E的α链的外源基因和/或编码HLA-G的α链的外源基因。

6.权利要求1～5中任一项所述的细胞，该细胞满足：(6) 包含编码人β2微球蛋白的外源基因。

7.权利要求1～6中任一项所述的细胞，该细胞满足：(7) 包含自杀基因。

8.权利要求1～7中任一项所述的细胞，其中，包含外源基因或自杀基因的位点是基因组的Safe Harbor区。

9.权利要求8所述的细胞，其中，Safe Harbor区为AAVS1区、CCR5区或ROSA26区。

10.权利要求1～9中任一项所述的细胞，其中，低免疫原性人细胞为多能干细胞或其分化细胞。

11.制造低免疫原性人细胞的方法，该方法包括以下工序：

工序(i)：使人亲本细胞的编码HLA类Ia的α链的内源基因缺损；

工序(iv)：向人亲本细胞中导入编码人PD-L1的外源基因；以及

工序(v)：向人亲本细胞中导入编码人PD-L2的外源基因。

12.权利要求11所述的方法，其中，低免疫原性人细胞不在细胞表面表达内源性HLA类Ib。

13.权利要求11或12所述的方法，其中，编码HLA类Ia的α链的内源基因为编码HLA-A的α链的内源基因、编码HLA-B的α链的内源基因和编码HLA-C的α链的内源基因。

14.权利要求11～13中任一项所述的方法，其中，编码HLA类II或其表达调控因子的内源基因为以下的(a)或(b)：

15.权利要求11～14中任一项所述的方法，其中，编码HLA类Ib的α链的外源基因为编码HLA-E的α链的外源基因和/或编码HLA-G的α链的外源基因。

16.权利要求11～15中任一项所述的方法，该方法还包括以下工序：

17.权利要求11～16中任一项所述的方法，该方法还包括以下工序：

工序(vii)：向人亲本细胞中导入自杀基因。

18.权利要求11～17中任一项所述的方法，其中，导入外源基因或自杀基因的位点是基因组的Safe Harbor区。

19.权利要求18所述的方法，其中，Safe Harbor区为AAVS1区、CCR5区或ROSA26区。

20.权利要求11～19中任一项所述的方法，其中，人亲本细胞为多能干细胞或其分化细胞。