CN115551358A - 含高水平ω-3脂肪酸的微生物油脂 - Google Patents

Abstract

本申请提供了微生物油脂以及制备和使用含高水平ω‑3脂肪酸的微生物油脂的方法。具体地，本申请提供了包含至少85％的总脂肪酸的微生物油脂，其中所述总脂肪酸包含至少50％的DHA。本申请还提供了制备生物质的方法，其包括在包含脂肪酸合成抑制剂的培养基中培养产油脂的微生物，其中所述生物质包含至少500mg/g的油脂。

Description

含高水平ω-3脂肪酸的微生物油脂

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年4月3日提交的美国临时申请第63/005,054号的优先权，该申请通过引用整体并入本文。

背景技术

来自微生物的油脂是由两条平行的脂肪酸合成途径产生的：经典的脂肪酸合成(FAS)途径和多不饱和脂肪酸(PUFA)合酶途径。中链脂肪酸如肉豆蔻酸(C14:0)和棕榈酸(C16:0)通常由FAS途径产生，长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)如二十二碳六烯酸(DHA，C22:6 n-3)和二十二碳五烯酸(DPA，C22:5 n-6)通常由PUFA合酶途径产生。然而，根据这些平行途径的相对活性，所得的脂肪酸谱在跨微生物中变化很大。

发明内容

本文提供了微生物油脂以及制备和使用含高水平ω-3脂肪酸的微生物油脂的方法。具体地，提供了包含至少85重量％的总脂肪酸的微生物油脂，其中总脂肪酸包含至少50重量％的DHA。还提供了制备生物质的方法，其包括在包含脂肪酸合成抑制剂的培养基中培养产油脂的微生物(例如，橙黄壶菌属(Aurantiochytrium))，其中所述生物质包含至少500mg/g的油脂。

附图说明

图1是显示在20℃下利用不同的初始脂肪酸合成抑制剂给药时间点的橙黄壶菌属种(G3)的脂肪酸谱的图。

图2是显示在20℃下在不同浓度的脂肪酸合成抑制剂中的橙黄壶菌属种(G3)的脂肪酸谱的图。

图3是显示在20℃下的各种脂肪酸合成抑制剂给药策略中的橙黄壶菌属种(G3)的脂肪酸谱的图。指示3次和6次的处理是在接种后24小时开始以等间隔的时间间隔多次添加脂肪酸合成抑制剂。对于3次添加实验，间隔是24小时。对于6次添加实验，间隔是12小时。

图4是显示在20℃下的各种脂肪酸合成抑制剂给药策略中的橙黄壶菌属种(G3)中最终产物(DHA、总脂肪酸(TFA)和饱和脂肪酸(SFA))浓度的图。指示3次和6次的处理是在接种后24小时开始以等间隔的时间间隔(每12小时)多次添加脂肪酸合成抑制剂。

图5是显示在20℃下的各种脂肪酸合成抑制剂给药策略中的橙黄壶菌属种(G3)中消耗的每单位葡萄糖的产物(SFA和DHA)产率的图。指示3次和6次的处理是在接种后24小时开始以等间隔的时间间隔(每12小时)多次添加脂肪酸合成抑制剂。

图6是显示以烧瓶规模的25℃和20℃培养条件的橙黄壶菌属种(G3)的脂肪酸谱的图。

图7是显示橙黄壶菌属种(G3)的脂肪酸谱的图。对照在没有化学抑制剂的情况下在25℃下在烧瓶中培养。全程发酵运行是在30L发酵桶中在所指示温度下分批补料发酵，并且脂肪酸合成抑制剂处理在20℃下培养，在烧瓶规模下脉冲添加12μM总浅蓝菌素。

具体实施方式

ω-3脂肪酸，包括来自长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)家族的二十二碳六烯酸(DHA，C22:6 n-3)和二十碳五烯酸(EPA，C20:5 n-3)，是人和非人哺乳动物的必需脂肪酸。微生物油脂中所需的ω-3脂肪酸的量根据应用而变化。例如，膳食补充剂和药物通常优选每单位油脂中更高浓度的ω-3脂肪酸。为了达到此类浓度，ω-3脂肪酸通常通过酯基转移作用和分子蒸馏来浓缩(Bonilla-Mendez和Hoyos-Concha，Corpoica Cienc TecnolAgropecuaria，Mosquera(Colombia)，19(3)：645-668(2018))。然而，最终的浓缩产物通常是乙酯(EE)化学形式，而不是甘油三酯(TG)形式，即微生物合成脂质时的天然化学结构。不仅EE形式需要可能损害其嗅觉特性的另外的加工，而且已经显示EE形式的ω-3对人体的生物利用度低于原始的TG形式。

增加ω-3含量的常见策略包括选择高ω-3微生物菌株、经典诱变和遗传修饰(Lian等人，Appl BiochemBiotechnol，162：935-941(2010))。可替代地，已经在不同的微生物中测试了在各种机制下具有影响脂肪酸合成代谢潜力的化学品。然而，缺乏应用此类原理来实现DHA含量商业上有意义的增加，同时避免或最小化其它脂肪酸组分(包括DPA和饱和脂肪酸)的任何不希望的变化的高效且有效的方法。

本文描述了含有高水平ω-3脂肪酸的油脂，其中DHA约占脂肪酸谱的50％-70％。还描述了使用脂肪酸合成抑制剂来抑制FAS途径中不太需要的产物，而有利于来自PUFA合酶途径的高价值PUFA产物的方法。所提供的油脂含有高浓度的DHA，而不牺牲微生物的生产力。此外，描述了使用抑制本文所述脂肪酸合酶多酶复合物的抑制剂的方法。实例示出了G3的脂肪酸谱，显示了DHA含量的显著增加(当与对照相比时，高达83.3％以上)，并且在脉冲添加脂肪酸合成抑制剂的情况下甚至更高。油脂中几乎70％的TG形式的DHA的结果超过了报道的DHA浓度。

包括破囊壶菌在内的微生物产生含有多种脂质的油脂，包括各种形式和量的脂肪酸。如本文所用，术语脂质包括磷脂、游离脂肪酸、脂肪酸酯、三酰基甘油、甾醇和甾醇酯、类胡萝卜素、叶黄素(例如，含氧类胡萝卜素)、烃和本领域普通技术人员已知的其他脂质。脂肪酸是以羧基基团为末端的烃链，如果它们含有至少一个碳-碳双键，则称为不饱和的，当它们含有多个碳-碳双键时，则称为多不饱和的。例如，微生物可以产生(i)短链脂肪酸(SCFA)，其是具有少于六个碳的脂肪族尾的脂肪酸(例如，丁酸)；(ii)中链脂肪酸(MCFA)，其是具有6-12个碳的脂肪族尾的脂肪酸；(iii)长链脂肪酸(LCFA)，其是具有多于13个碳的脂肪族尾的脂肪酸。各种微生物产生不同类型和量的这些脂肪酸。本文提供了将这些脂肪酸的产生从由FAS途径产生的中链脂肪酸转移到由PUFA合酶途径产生的长链脂肪酸的微生物和方法。脂肪酸合成(FAS)被定义为通过称为脂肪酸合酶的酶的作用从乙酰辅酶A和NADPH产生脂肪酸。PUFA合酶途径能够通过大的多结构域、多亚基酶从丙二酰辅酶A从头合成多不饱和脂肪酸。FAS途径的主要终产物是棕榈酸，而PUFA合酶的主要终产物是PUFA，诸如DHA和DPA。

因此，本文提供了微生物油脂以及制备和使用微生物油脂的方法。油脂包括甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯形式的脂肪酸，以及游离脂肪酸和磷脂。任选地，微生物油脂包含至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的甘油三酯。任选地，微生物油脂包含至少95％的甘油三酯。

油脂还含有至少85重量％(例如，86重量％、87重量％、88重量％、89重量％、90重量％、91重量％、92重量％、93重量％、94重量％、95重量％、96重量％、97重量％、98重量％或99重量％)的总脂肪酸(TFA)。任选地，油脂含有85重量％至99重量％之间的总脂肪酸。任选地，微生物油脂包含85重量％至95重量％的总脂肪酸。任选地，微生物油脂包含至少90重量％的总脂肪酸。

关于油脂或总脂肪酸的百分比在全文中以重量百分比叙述。例如，当微生物油脂包含至少90％的总脂肪酸时，油脂含有占油脂重量的至少90％的总脂肪酸。此外，总脂肪酸含有特定脂肪酸，并且特定脂肪酸的百分比在全文中表示为总脂肪酸的重量％。例如，当油脂中的总脂肪酸含有DHA时，DHA的量表示为总脂肪酸的重量％。例如，总脂肪酸包含至少50重量％的DHA。

如上所述，所提供的油脂的总脂肪酸含有DHA。任选地，总脂肪酸包含至少35％、至少40％或至少45％的DHA。任选地，总脂肪酸包含至少50％的DHA。任选地，总脂肪酸包含至少60％的DHA。任选地，总脂肪酸包含50％至70％的DHA。任选地，总脂肪酸包含60％至70％的DHA。

任选地，油脂还含有6％至18％之间的DPA。任选地，油脂含有10％至18％之间的DPA。任选地，油脂含有6％至10％之间的DPA。任选地，总脂肪酸包含至少60％的DHA和10重量％至18重量％之间的DPA。任选地，DHA与DPA的比率小于或等于7∶1或6∶1。任选地，总脂肪酸包含至少50％的DHA，并且DHA与DPA的比率小于或等于7∶1。任选地，总脂肪酸包含至少50％的DHA，并且DHA与DPA的比率小于或等于6∶1。

任选地，油脂含有少于1％的硬脂酸。任选地，总脂肪酸包含0.01％至1％的硬脂酸或0.001重量％至1重量％的硬脂酸。

任选地，微生物油脂包含至少85％的总脂肪酸，其中总脂肪酸包含至少50％的DHA、6％至18％之间的DPA和少于1％的硬脂酸。任选地，微生物油脂包含至少85％的总脂肪酸，其中总脂肪酸包含至少60％的DHA。

任选地，总脂肪酸包含少于3％、2％或1％的二十碳五烯酸。任选地，总脂肪酸包含0.01％至1％的二十碳五烯酸或0.001％至1％的二十碳五烯酸。任选地，总脂肪酸包含0.01％至2％的二十碳五烯酸或0.001％至2％的二十碳五烯酸。任选地，总脂肪酸包含0.01％至3％的二十碳五烯酸或0.001％至3％的二十碳五烯酸。

任选地，总脂肪酸包含少于5％、少于4％或少于3％的十五烷酸。任选地，总脂肪酸包含0.01％至3％、0.01％至4％或0.01％至5％的十五烷酸。

任选地，总脂肪酸包含少于45％、40％、35％、30％或25％的饱和脂肪酸(SFA)。通过本文所述方法产生的油脂中的饱和脂肪酸包括但不限于C12:0(月桂酸)、C14:0(肉豆蔻酸)、C15:0(十五烷酸)、C16:0(棕榈酸)、C17:0(十七烷酸)和C18:0(硬脂酸)。任选地，总脂肪酸包含10％至45％之间的饱和脂肪酸(例如，10％至40％、10％至30％、10％至20％、15％至30％、15％至20％、20％至30％或20％至25％之间的饱和脂肪酸)。

任选地，总脂肪酸包含0.001％至2.0％(例如，0.01％至2.0％或0.05％至2.0％)的花生四烯酸(C20:4(n-6))。任选地，总脂肪酸包含0.001％至1％(例如，0.01％至1％)二十碳四烯酸(C20:4(n-3))。

任选地，总脂肪酸包含少于5重量％的肉豆蔻酸。任选地，总脂肪酸包含0.001重量％至5重量％(例如，0.01重量％至5重量％、0.1重量％至5重量％、0.01重量％至4重量％、0.1重量％至4重量％或1重量％至4重量％)的肉豆蔻酸。

任选地，总脂肪酸包含少于40重量％的棕榈酸。任选地，总脂肪酸包含5重量％至40重量％、5重量％至30重量％、10重量％至40重量％、10重量％至30重量％、20重量％至40重量％、20重量％至30重量％、20重量％至40重量％、20重量％至25重量％、或25重量％至40重量％之间的棕榈酸。

任选地，总脂肪酸包含0.1重量％至0.5重量％或0.001重量％至0.5重量％的十七烷酸。

任选地，生物质中的脂肪酸或从生物质中分离的脂肪酸包含少于3重量％的二十碳五烯酸、少于5重量％的十五烷酸和少于45重量％的饱和脂肪酸。

任选地，生物质中的脂肪酸或从生物质中分离的脂肪酸包含0.001％至2.0％、0.01％至2.0％或0.05％至2.0％的花生四烯酸、少于5重量％的肉豆蔻酸和少于40重量％的棕榈酸。

本文还提供了包含油脂的微生物生物质。微生物生物质包含总生物质重量的40％至75％之间的总脂肪酸。任选地，生物质中的油脂包含DHA，并且生物质包含生物质重量的20％至55％的DHA。任选地，生物质中的油脂包含生物质重量的2.5％至8％之间的DPA。任选地，油脂含有生物质重量的4％至8％之间的DPA。任选地，油脂含有生物质重量的2.5％至4％的DPA。

用于产生所提供的微生物油脂和生物质的真核微生物包括但不限于选自椭圆壶菌属、橙黄壶菌属、破囊壶菌属、裂殖壶菌属和吾肯氏壶菌属或其任意混合物的微生物。任选地，产油脂的真核微生物是具有与SEQ ID NO：1中所示的核酸序列具有至少97％、98％、99％或100％同一性的18S序列的微生物。任选地，产油脂的微生物是微生物菌株Aurantiochytrium limacinum。任选地，真核微生物与2016年7月22日保藏在加拿大国际保藏机构(IDAC)，加拿大公共卫生署国家微生物实验室，1015Arlington Street，Winnipeg，Manitoba Canada R3E3R2，具有IDAC指定的登记号220716-01的微生物相同。这种保藏将根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约进行维护。这种保藏是示例性的，并且仅仅是为了方便本领域技术人员而进行的，而不是承认保藏对于专利性是必需的。术语“G3”、“G3-1”或“G3-1菌株”或“菌株G3-1”在本文中可互换使用，指具有IDAC登记号220716-01的真核微生物。

如本文所用的核酸是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物和互补物。该术语包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。该术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或键的核酸，它们是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合特性，并且以与参考核苷酸相似的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸和肽核酸(PNA)。除非另有说明，核酸序列的保守修饰变体(例如简并密码子取代)和互补序列可以用来代替本文所述的特定核酸序列。具体地，简并密码子取代可通过产生其中一个或多个选择的(或所有)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。

在两种或多种核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或“同一性百分比”是指两种或多种序列或亚序列是相同的，或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，当在比较窗口或指定区域上进行最大对应性的比较和比对时，在特定区域内具有约60％的同一性，优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)，如使用BLAST或BLAST2.0序列比较算法和下述默认参数测量的，或通过手动比对和目视检查(参见，例如，NCBI网站等)。此类序列被认为是基本相同的。该定义也指或可应用于测试序列的补充。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。如下所述，优选算法可以考虑间隙等。优选地，同一性存在于长度为至少约25个氨基酸或核苷酸的区域上，或者更优选存在于长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域上。

对于序列比较，通常一个序列作为参照序列与测试序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，指定子序列坐标(如果需要)，并指定序列算法程序参数。优选地，可以使用默认程序参数，或者可以适当地指定替代性参数。然后，使用序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

如本文所用，比较窗口包括参考选自由20至600个，通常约50至约200个，更通常约100至约150个组成的组的连续位置的数量的任一者的片段，其中在两个序列最佳比对后，可将一个序列与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过例如Smith&Waterman，AdvAppl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法；通过Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法；通过Pearson&Lipman，Proc.Nat’1.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相似性方法检索；通过这些算法的计算机化实现(威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.，麦迪逊，威斯康星州)；或者通过手动比对和目视检查(参见，例如，Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel等人编辑，1995年增刊))进行。

适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的优选实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等人Nuc.Acids Res.25：3389-3402(1977)，和Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。BLAST和BLAST 2.0与本文描述的参数一起用于确定核酸或蛋白质的序列同一性百分比。用于进行BLAST分析的软件可通过如本领域已知的美国国家生物技术信息中心公开获得。该算法涉及首先通过鉴定查询序列中选定长度(W)的短字来鉴定高分值序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字比对时，所述短字匹配或满足某个正值阈值分值T。T被称为相邻字分值阈值(Altschul等人)。这些初始相邻字命中(hits)用作开始检索以查找含有它们的较长HSP的种子。字命中沿着每个序列在两个方向上延伸，直到累积比对分值可以增加。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励分值；始终＞0)和N(错配残基的惩罚分值；始终<0)计算累积分值。对于氨基酸序列，使用计分矩阵来计算累积分值。当：累积比对分值从其达到的最大值下降了数量X时；由于一个或多个负分值残基比对的累积，累积分值变为零或更低；或者到达任一序列的末端时，字命中在每个方向上的延伸停止。BLAST算法参数W、T和X确定了比对的灵敏度和速度。期望值(E)代表不同比对的数量，这些比对的分值等于或优于预期在数据库检索中偶然出现的分值。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，并比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长3、期望值(E)10和BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))、比对(B)50、预期(E)10、M＝5、N＝-4，以及两条链的比较。

本文提供了使用产油脂的微生物制备生物质的方法。具体地，本文提供了制备生物质的方法，其包括在包含脂肪酸合成抑制剂的培养基中培养产油脂的橙黄壶菌属微生物，其中所述生物质包含至少350、400、450或500mg/g的油脂。生物质可用于制备具有本文所述特征的油脂。方法进一步包括从生物质中分离油脂。

培养步骤可以在15℃至28℃的温度下进行(例如，15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃或28℃)。任选地，培养基的温度为18℃至22℃、22℃至28℃、22℃至25℃或25℃至28℃。

脂肪酸合成抑制剂可以在向培养基中添加微生物之前、之后或同时添加到培养基中。任选地，将脂肪酸合成抑制剂连续或间歇地补料至培养基中。任选地，方法进一步包括将微生物添加到培养基中，并且然后在将微生物添加到培养基中后至少6、12、24或48小时将脂肪酸合成抑制剂添加到培养基中。任选地，方法进一步包括将微生物添加到培养基中，并且然后在将微生物添加到培养基中后24至48小时之间将脂肪酸合成抑制剂添加到培养基中。任选地，方法进一步包括将微生物添加到培养基中，并且然后在将微生物添加到培养基中后6至24小时之间将脂肪酸合成抑制剂添加到培养基中。任选地，方法进一步包括将微生物添加到培养基中，并且然后在将微生物添加到培养基中后12至24小时之间将脂肪酸合成抑制剂添加到培养基中。

脂肪酸合成抑制剂可以以一个或多个剂量添加到培养基中。任选地，该方法进一步包括将微生物添加到培养基中，并且培养包括例如在将微生物添加到培养基中后6、12、24或48小时开始以1、2、3、4、5或6个剂量添加脂肪酸合成抑制剂。任选地，每6、12或24小时添加一个或多个剂量。举例来说，在将微生物添加至培养基后24小时开始，可以每12小时向培养基中添加3个剂量的脂肪酸抑制剂。

添加到培养基中的脂肪酸合成抑制剂的总量包括3μM至40μM之间。任选地，脂肪酸合成抑制剂以一个或多个剂量(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个剂量)施用，抑制剂的总量在3μM至40μM之间。例如，脂肪酸合成抑制剂可以以2μM的6个剂量添加，总计12μM。通过其它实例，脂肪酸合成抑制剂可以以1、2、3或8μM的剂量添加3次。任选地，脂肪酸合成抑制剂可以以0.5、1、2、3和4μM的剂量添加6次。任选地，在培养期间添加到培养基中的脂肪酸合成抑制剂的总浓度包括每克生物质30μg至700μg之间的抑制剂。任选地，脂肪酸合成抑制剂以1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个剂量施用，总计每克生物质30μg至700μg之间。举例来说，脂肪酸合成抑制剂可以以每克生物质40μg的6个剂量添加，总计240μg。通过其它实例，脂肪酸合成抑制剂可以以每克生物质约12、24、42和120μg的剂量添加3次。任选地，脂肪酸合成抑制剂可以以每克生物质5.5、11、25、40和62μg的剂量添加6次。

合适的脂肪酸合成抑制剂包括但不限于脂肪酸合酶抑制剂。任选地，脂肪酸合酶抑制剂选自由以下组成的组：槲皮素、α-倒捻子素、硫乳霉素、三氯生、异烟肼、癸酰基-N-乙酰半胱胺(NAC)和浅蓝菌素。

如上所述，可用于所提供方法的真核微生物包括但不限于选自椭圆壶菌属(Oblongichytrium)、橙黄壶菌属、破囊壶菌属、裂殖壶菌属和吾肯氏壶菌属或其任意混合物的微生物。任选地，产油脂的真核微生物是具有与SEQ ID NO：1中所示的序列具有至少97％、98％、99％或100％同一性的18S序列的微生物。任选地，真核微生物具有IDAC登记号220716-01。

如本文所述，生物质包含脂肪酸，例如，包含至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的如上所述的甘油三酯的脂肪酸。如上所述，生物质中的油脂还含有至少85重量％的总脂肪酸。

任选地，如上所述，从生物质中分离的脂肪酸包含至少50重量％的DHA。

如上所述，生物质中的脂肪酸任选地包含6重量％至18重量％之间的DPA。任选地，如上所述，生物质中的脂肪酸、油脂或从生物质中分离的脂肪酸、油脂中DHA与DPA的比率小于或等于7∶1或6∶1。

如上所述，生物质中的油脂或从生物质中分离的油脂任选地含有少于1重量％的硬脂酸。

任选地，如上所述，生物质中的脂肪酸或从生物质中分离的脂肪酸包含少于3重量％的二十碳五烯酸、少于5重量％的十五烷酸和少于45重量％的饱和脂肪酸。

任选地，生物质中的脂肪酸或从生物质中分离的脂肪酸包含0.001％至2.0％或0.01％至2.0％或0.05％至2.0％的花生四烯酸、少于5重量％的肉豆蔻酸和少于40重量％的棕榈酸。任选地，脂肪酸包含0.1重量％至0.5重量％或0.001重量％至0.5重量％的十七烷酸。

所述方法中使用的培养基为微生物提供各种营养成分，包括碳源和氮源。用于培养的培养基可以包括多种碳源中的任一种。碳源的实例包括脂肪酸、脂质、甘油、甘油三酯、碳水化合物、多元醇、氨基糖和任何种类的生物质或废物流。脂肪酸包括例如油酸。碳水化合物包括但不限于葡萄糖、纤维素、半纤维素、果糖、右旋糖、木糖、乳果糖、半乳糖、麦芽三糖、麦芽糖、乳糖、糖原、明胶、淀粉(玉米或小麦)、乙酸盐、间肌醇(例如，来自玉米浆)、半乳糖醛酸(例如，来自果胶)、L-岩藻糖(例如，来自半乳糖)、龙胆二糖、葡糖胺、α-D-葡萄糖-1-磷酸盐(例如，来自葡萄糖)、纤维二糖、糊精、α-环糊精(例如，来自淀粉)和蔗糖(例如，来自糖浆)。多元醇包括但不限于麦芽糖醇、赤藓糖醇和阿东糖醇(adonitol)。氨基糖包括但不限于N-乙酰基-D-半乳糖胺、N-乙酰基-D-葡萄糖胺和N-乙酰基-β-D-甘露糖胺。碳源可以以200g/L、175g/L、150g/L、100g/L、60g/L或更低的浓度，例如浓度为1至200g/L、5至200g/L、10至200g/L、50至200g/L或100至200g/L存在于异养培养基中。

微生物可以在氯化物浓度为约0.5g/L至约50.0g/L(例如，氯化物浓度为约0.5g/L至约35g/L，约18g/L至约35g/L，或约2g/L至约35g/L)的培养基中培养。本文所述的微生物可在低氯化物条件下生长，例如约0.5g/L至约20g/L或约0.5g/L至约15g/L。

培养基任选地包括NaCl。培养基可以包括不含氯化物的钠盐作为钠源。适用于本方法的非氯化钠盐的实例包括但不限于苏打灰(碳酸钠和氧化钠的混合物)、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸钠及其混合物。参见例如美国专利号5,340,742和6,607,900，其中每一个的全部内容通过引用并入本文。任选地，当使用20g/L碳、20g/L大豆蛋白胨和5g/L酵母提取物时，培养基包含9g/L氯化物。当培养基含有10g/L碳、5g/L大豆蛋白胨、5g/L酵母提取物和10g/L琼脂时，培养基可以包含35g/L氯化物。当培养基含有20-40g/L碳、1g/L酵母提取物、1-20g/L谷氨酸单钠(MSG)、0.3-2.0g/L磷酸盐、4g/L硫酸镁、5-10g/L硫酸铵、1.5mL/L微量元素溶液、1mL/L维生素B溶液和0.1g/L CaCl₂时，培养基可以包含2g/L氯化物。

用于微生物培养的培养基可以包括多种氮源中的任一种。示例性的氮源包括铵溶液(例如，含NH₄的H₂O)、铵或胺盐(例如(NH₄)₂SO₄，(NH₄)₃PO₄，NH₄NO₃，NH₄OOCH₂CH₃(NH₄Ac))、蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物、麦芽提取物、鱼粉、谷氨酸钠、大豆提取物、酪蛋白氨基酸和酒糟。合适培养基中氮源的浓度通常在约1g/L至约25g/L之间，包括1g/L和25g/L(例如，约5至20g/L、约10至15g/L或约20g/L)。任选地，当酵母提取物是培养基中复合氮源时，氮的浓度为约10至15g/L。任选地，当培养基中含有大豆蛋白胨以及L-谷氨酸单钠盐水合物(MSG)或硫酸铵时，氮的浓度约为1至5g/L。

培养基任选地包含磷酸盐，诸如磷酸钾或磷酸钠(例如磷酸二氢钾)。

培养基中的无机盐和微量营养物可以包括硫酸铵、碳酸氢钠、原钒酸钠、铬酸钾、钼酸钠、亚硒酸、硫酸镍、硫酸铜、硫酸锌、氯化钴、氯化铁、氯化锰、氯化钙和EDTA。任选地，培养基包括至少1.5ml/L的微量元素溶液。任选地，微量元素溶液包含2mg/mL硫酸铜(II)五水合物、2mg/mL硫酸锌七水合物、1mg/mL氯化钴(II)六水合物、1mg/mL氯化锰(II)四水合物、1mg/mL钼酸钠二水合物和1mg/mL硫酸镍(II)。

培养基可以包含硫酸镁，任选地，以及微量元素溶液和/或磷酸二氢钾。

培养基中可以包含维生素，诸如盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、泛酸钙、对氨基苯甲酸、核黄素、烟酸、生物素、叶酸和维生素B12。

可以使用酸或碱和/或使用氮源(适当时)，将培养基的pH调节至3.0和10.0之间，包括3.0和10.0。任选地，培养基是无菌的。

通常，用于培养微生物的培养基是液体培养基。然而，用于培养微生物的培养基可以是固体培养基。除了本文讨论的碳源和氮源之外，固体培养基可以含有一种或多种组分(例如琼脂和/或琼脂糖)，其提供结构支持和/或允许培养基为固体形式。

微生物的培养可以使用已知的条件进行，例如，在国际公开号WO 2007/069078和WO 2008/129358中描述的那些条件。例如，培养可以进行1至30天(例如，1至21天、1至15天、1至12天、1至9天或3至5天)。培养可以在4℃至30℃之间的温度下进行。任选地，通过通气-振动培养、振动培养、静止培养、分批培养、补料分批培养、连续培养、滚动分批培养、波动培养等进行培养。任选地，培养使用溶解氧含量在1％和20％之间、1％和10％之间或1％和5％之间的培养基进行。

本文所述的生物质可被掺入最终产物(例如，食品或饲料添加剂、生物燃料等)中。因此，本文提供了一种使用富含蛋白质的生物质的方法。该方法任选地包括将富含蛋白质的生物质掺入食物(例如，宠物食品、牲畜饲料或水产饲料)中。

油脂或脂质可以从所述微生物培养物中分离，并用于各种食品和饲料补充剂中。可以掺入油脂的合适的食品或饲料补充剂包括饮料，诸如牛奶、水、运动饮料、能量饮料、茶和果汁；零食，诸如糖果、果冻和饼干；含脂肪的食品和饮料，诸如乳制品；经加工的食品，诸如软米(或粥)；婴儿配方奶粉；早餐谷物等。任选地，可以将一种或多种产生的脂质掺入膳食补充剂中，诸如例如维生素或多种维生素。任选地，根据本文所述方法产生的油脂可以包括在膳食补充剂中，并且任选地可以直接掺入食品或饲料(例如，食品补充剂)的组分中。

可以掺入通过本文所述方法产生的油脂或脂质的饲料的实例包括宠物食品，诸如猫粮；狗粮；观赏鱼、养殖鱼或甲壳类动物等的饲料；或农场饲养动物(包括家畜和水产养殖的鱼类或甲壳类动物)的饲料。可以掺入根据本文所述方法产生的油脂或脂质的食品或饲料材料优选对作为预期接受者的生物是可口的。这种食品或饲料材料可以具有食物材料目前已知的任何物理性质(例如，固体、液体、柔性)。

任选地，可以将一种或多种产生的化合物(例如，PUFA)掺入保健品或药品中。此类保健品或药物形式的实例包括各种类型的片剂、胶囊、可饮用剂等。任选地，保健品或药物适用于局部应用(例如，洗剂形式)。剂型可以包括例如胶囊、油剂、片剂等。

根据本文所述方法产生的油脂或脂质可以与多种其他剂中的任一种组合掺入产品中。例如，此类化合物可以与一种或多种粘合剂或填料、螯合剂、颜料、盐、表面活性剂、保湿剂、粘度调节剂、增稠剂、软化剂、芳香剂、防腐剂等或其任意组合组合。

公开了可用于、可用于结合、可用于制备所公开的方法和组合物的产物的材料、组合物和组分或公开了所公开的方法和组合物的产物。本文公开了这些和其他材料，并且应当理解，当这些材料的组合、子集、相互作用、组被公开时，虽然这些化合物的各种个体和集体组合和排列的特指可能没有被明确公开，但本文中对每一种都进行了具体的考虑和描述。例如，如果公开和讨论了一种方法，并且讨论了可以对包括该方法在内的多种分子进行的多种修饰，则该方法的每种组合和排列以及可能的修饰都是具体预期的，除非有相反的具体说明。同样，这些的任何子集或组合也是具体考虑和公开的。这一概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果有多种可以进行的另外的步骤，应当理解，这些另外的步骤中的每一个都可以用所公开的方法的任何特定方法步骤或方法步骤的组合来进行，并且每个这样的组合或此类组合的子集都是具体考虑的，并且应当被认为是公开的。

本文引用的出版物和引用它们的材料通过引用以其全部在此并入。

以下实施例旨在进一步说明本文所述方法和组合物的某些方面，而非旨在限制权利要求的范围。

实施例

实施例1.脂肪酸合成抑制剂给药时间策略。

为了确定添加脂肪酸合酶抑制剂浅蓝菌素而不会产生过度的危害(诸如阻止细胞生长)的理想时间，通过在接种后的不同时间添加设定量的浅蓝菌素来进行实验。在所有实验中，对照实验都是在相同的培养基和生长条件下进行的，没有添加FAS抑制剂。结果表明，在任何添加时间细胞生长都没有受到抑制，但是它对脂肪酸谱确实有显著影响(图1)。表2显示，在接种后24小时添加浅蓝菌素导致更高的DHA和DPA含量(占TFA的百分比)，其中脂肪酸合成途径产物C14:0和C16:0分别减少21.1％和27.9％。

表1.在20℃(除48小时)时橙黄壶菌属种(G3)中主要脂肪酸的脂肪酸含量(以mg/g计)。添加时间代表接种后添加25μM浅蓝菌素的时间。

*来自25℃的数据

表2.在20℃(除48小时)时橙黄壶菌属种(G3)中主要脂肪酸的脂肪酸含量(相对于总脂肪酸)。添加时间代表接种后添加25μμM浅蓝菌素的时间

*来自25℃的数据

实施例2.脂肪酸合成抑制剂浓度。

为了确定提供最佳结果的浅蓝菌素的最佳浓度，测试了1μM至40μM的一系列浓度。为了一致性，所有浅蓝菌素的添加都在接种后24小时进行。图2显示了在20℃下不同浓度的浅蓝菌素中橙黄壶菌属种(G3)的脂肪酸谱。表5显示增加浅蓝菌素浓度对细胞中积累的C16:0和DPA的量有明显的影响。就总脂肪酸的百分比而言，当使用25μM浅蓝菌素时，特定脂肪酸的这些变化对应于DHA含量(占TFA的％)从44.71％增加到高达50.92％(表4)。

表3.在接种后24小时添加浅蓝菌素，在20℃时橙黄壶菌属种(G3)中主要脂肪酸的脂肪酸含量(mg/g)。

表4.在接种后24小时添加浅蓝菌素，在20℃时橙黄壶菌属种(G3)中主要脂肪酸的脂肪酸含量(相对于总脂肪酸)。

实施例3.脂肪酸合成抑制剂给药方案。

为了研究长时间重复暴露于浅蓝菌素的影响，在实验期间将剂量平均分布在3或6次。在每种情况下，添加的总量相当于在24小时时完全添加的相应处理。所有添加在接种后24小时开始。在图3和图4中，随着浅蓝菌素浓度的增加和浅蓝菌素的多次等量脉冲给药，可以看到增加的DHA和DPA的明显趋势。此外，表5显示，当采用重复剂量添加时，对总脂肪酸没有负面影响，而DHA的实际量(以mg/g计)随着浅蓝菌素的增加而增加。观察到的最高DHA是使用6等量剂量的浅蓝菌素，总计12μM，导致DHA增加51.6％。C14:0和C16:0也有85.1％和83.9％的最大降低，表明在这些条件下浅蓝菌素非常有效地抑制了FAS途径。

表5.在各种浅蓝菌素给药策略中在20℃下橙黄壶菌属种(G3)的脂肪酸含量(以mg/g计)。指示3次和6次的处理是在接种后24小时开始以等间隔的时间间隔多次添加浅蓝菌素。对于3次添加实验，间隔是24小时；而对于6次添加实验，间隔是12小时。

表6.在各种浅蓝菌素给药策略中在20℃下橙黄壶菌属种(G3)的脂肪酸含量(相对于总脂肪酸)。指示3次和6次的处理是在接种后24小时开始以等间隔的时间间隔多次添加浅蓝菌素。对于3次添加实验，间隔是24小时；而对于6次添加实验，间隔是12小时。

实施例4.脂肪酸合成抑制剂对产物产率的影响。

为了评估本文所述方法对PUFA增强策略的影响，研究了G3细胞相对于吸收的碳量的产物(即TFA、DHA或DPA)的产率。在图5中，描绘了合成产物的总量(分类为总脂肪酸(TFA)、饱和脂肪酸(SFA)或DHA)。在脂肪酸合成抑制剂的存在下，以一定的频率和浓度给药，TFA和DHA浓度均增加，而SFA浓度降低。例如，在以12小时的间隔每次给药1μM浅蓝菌素共给药6次的条件下，与对照实验的结果相比TFA和DHA分别增加了15％和71％(图5)。当结果计算为脂肪酸产率(克产物/克消耗的碳)时，在任何浅蓝菌素给药条件下，DHA产率通常显著增加，而SFA产率减少。例如，当与对照实验的结果相比时，在6x1 μM的最佳条件之一下，DHA产率增加了53％，SFA产率减少了64％，从而表明细胞不仅经历了对FAS途径的抑制，而且它们正上调PUFA合酶途径以更有效地利用可利用的碳。

实施例5.温度对来自橙黄壶菌属种(G3)的DHA％的影响。

进行烧瓶规模的实验以研究降低培养温度(从25℃至20℃)对橙黄壶菌属种(G3)的脂肪酸谱和生产力的影响。图6中的数据说明了随着培养温度降低到20℃，DHA和DPA的比例增加。表7和表8显示的汇总数据表明，DHA增加了14.7％，而C14:0和C16:0分别降低了27.5％和10.6％。

表7.不同温度对橙黄壶菌属种(G3)中存在的主要脂肪酸(以mg/g计)及其相互关系的影响。

表8.不同温度对橙黄壶菌属种(G3)中存在的主要脂肪酸(相对于总脂肪酸)的影响。

实施例6.全程发酵对来自橙黄壶菌属种(G3)的DHA％的影响。

橙黄壶菌属种G3的全程发酵使用30L不锈钢发酵桶在不同温度(25℃至20℃)下进行。这些发酵通常持续150小时至200小时，其中生物质和TFA分别达到130g/L和55％以上。从图7中可以看出，相对于使用烧瓶的典型对照培养，在25℃的典型温度下的全程发酵能够提高最终DHA含量；而在较低温度下的全程发酵能够达到甚至更高的DHA％。在图7包括的实施例中，25℃的发酵达到45％的DHA，比烧瓶对照的37％高出约8％。在22℃和20℃下的发酵分别实现了59.7％和60.0％的DHA％进一步增加。然而，来自使用多次和间歇给药浅蓝菌素的烧瓶实验的DHA含量仍然是达到的最高DHA％，为68.7％。

实施例7.升高的温度对橙黄壶菌属种(G3)的影响。

在22℃、25℃和28℃下，在30-L发酵桶中培养G3菌株以提高生物质和脂肪酸产量。在含有500mL基础培养基(50g/L葡萄糖、6.25g/L酵母提取物、4g/L MgSO₄.7H₂O、4g/L、2.5g/LNaCl、2mg/L硫酸铜、2mg/L硫酸锌、1mg/L钼酸钠、1mg/L氯化钴(II)、1mg/L氯化锰和1mg/L硫酸镍)的四个锥形瓶中预培养G3。将烧瓶在25℃和200rpm的搅拌下温育2天。在温育期后，使用三个烧瓶(1.5L)将20L培养基接种到30L生物反应器中，该生物反应器含有175g/L葡萄糖、9.66g/L酵母提取物、2.57g/L MgSO₄.7H₂0、0.45g/L氯化钠、6.44g/L硫酸铵、1.6g/L磷酸二氢钾、1.74g/L磷酸氢二钾、12.87g/L谷氨酸单钠、0.1g/L氯化钙二水合物、1mg/L硫酸铜、1mg/L硫酸锌、0.5mg/L钼酸钠、0.5mg/L氯化钴(II)、0.5mg/L氯化镁、0.5mg/L硫酸镍、0.03mg/L维生素B12、0.03mg/L生物素和6mg/L硫胺盐酸盐，并在22℃、25℃和28℃的条件下在30-L发酵桶中培养。搅拌以325rpm开始，并增加到365rpm，用大气保持0.3vvm的通气，并且pH为6.0。通过添加碱(27％NH₄OH)来保持pH。用750g/L的葡萄糖溶液向容器中补料，以保持葡萄糖消耗速率为约3g/L/h。以不同的时间间隔收集细胞，并测量生物质、TFA和脂质谱。表9显示了在25℃和28℃下的最终G3谱的特征。表10、11和12显示了脂质谱。

表9.在22℃、25℃和28℃时的G3最终结果。

Claims (45)

1.一种微生物油脂，其包含至少85重量％的总脂肪酸，其中所述总脂肪酸包含至少50重量％的二十二碳六烯酸、6重量％至18重量％之间的二十二碳五烯酸n-6和少于1重量％的硬脂酸。

2.一种微生物油脂，其包含至少85重量％的总脂肪酸，其中所述总脂肪酸包含至少60重量％的二十二碳六烯酸。

3.如权利要求1或2所述的微生物油脂，其中所述总脂肪酸包含0.01重量％至1重量％的硬脂酸。

4.如权利要求1至3中任一项所述的微生物油脂，其中所述总脂肪酸包含10重量％至18重量％之间的二十二碳五烯酸n-6。

5.如权利要求1至4中任一项所述的微生物油脂，其中所述微生物油脂包含85重量％至95重量％的总脂肪酸。

6.如权利要求1至4中任一项所述的微生物油脂，其中所述微生物油脂包含至少90重量％的总脂肪酸。

7.如权利要求1至6中任一项所述的微生物油脂，其中所述总脂肪酸包含少于1重量％的二十碳五烯酸。

8.如权利要求1至7中任一项所述的微生物油脂，其中所述总脂肪酸包含少于3重量％的十五烷酸。

9.如权利要求1至8中任一项所述的微生物油脂，其中所述总脂肪酸包含少于40％的饱和脂肪酸。

10.如权利要求9所述的微生物油脂，其中所述总脂肪酸包含10％至40％之间的饱和脂肪酸。

11.如权利要求9所述的微生物油脂，其中所述总脂肪酸包含10％至30％之间的饱和脂肪酸。

12.如权利要求1至11中任一项所述的微生物油脂，其中所述总脂肪酸包含60重量％至70重量％的二十二碳六烯酸。

13.如权利要求1至12中任一项所述的微生物油脂，其中所述总脂肪酸包含0.01重量％至2.0重量％的花生四烯酸。

14.如权利要求1至13中任一项所述的微生物油脂，其中所述总脂肪酸包含0.01重量％至1重量％的二十碳四烯酸。

15.如权利要求1至14中任一项所述的微生物油脂，其中所述微生物油脂包含至少90％的甘油三酯。

16.如权利要求15所述的微生物油脂，其中所述微生物油脂包含至少95％的甘油三酯。

17.如权利要求1至16中任一项所述的微生物油脂，其中所述二十二碳六烯酸与二十二碳五烯酸n-6的比率小于或等于7:1。

18.如权利要求1至17中任一项所述的微生物油脂，其中所述总脂肪酸包含少于4重量％的肉豆蔻酸。

19.如权利要求1至18中任一项所述的微生物油脂，其中所述总脂肪酸包含少于30重量％的棕榈酸。

20.如权利要求1至19中任一项所述的微生物油脂，其中所述总脂肪酸包含至少60重量％的二十二碳六烯酸和10重量％至18重量％之间的二十二碳五烯酸n-6。

21.如权利要求1至20中任一项所述的微生物油脂，其中所述总脂肪酸包含0.1重量％至0.5重量％的十七烷酸。

22.如权利要求1至21中任一项所述的微生物油脂，其中所述油脂是通过在22℃至28℃的温度下在培养基中培养橙黄壶菌属微生物而产生的。

23.如权利要求1至21中任一项所述的微生物油脂，其中所述油脂是通过在25℃至28℃的温度下在培养基中培养橙黄壶菌属微生物而产生的。

24.一种制备生物质的方法，其包括在包含脂肪酸合成抑制剂的培养基中培养产油脂的橙黄壶菌属微生物，其中所述生物质包含至少500mg/g的油脂。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述培养基的温度为18℃至22℃。

26.如权利要求24所述的方法，其中所述培养基的温度为22℃至28℃。

27.如权利要求24所述的方法，其中所述培养基的温度为25℃至28℃。

28.如权利要求24至27中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述微生物添加到所述培养基中，并且其中在将所述微生物添加到所述培养基中后24至48小时之间将所述脂肪酸合成抑制剂添加到所述培养基中。

29.如权利要求24至27中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述微生物添加到所述培养基中，并且其中在将所述微生物添加到所述培养基中后至少6、12、24或48小时将所述脂肪酸合成抑制剂添加到所述培养基中。

30.如权利要求24至29中任一项所述的方法，其中所述培养包括将一个或多个剂量的所述脂肪酸合成抑制剂添加到所述培养基中。

31.如权利要求24至27中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述微生物添加到所述培养基中，并且其中所述培养包括在将所述微生物添加到所述培养基中后12小时开始以2、3、4、5或6个剂量添加所述脂肪酸合成抑制剂。

32.如权利要求31所述的方法，其中每6、12或24小时添加所述剂量。

33.如权利要求24至32中任一项所述的方法，其中在所述培养期间添加到所述培养基中的所述脂肪酸合成抑制剂的总浓度包括3至40μM之间。

34.如权利要求24至33中任一项所述的方法，其中在所述培养期间添加到所述培养基中的所述脂肪酸合成抑制剂的总浓度包括每克生物质30μg至700μg之间的抑制剂。

35.如权利要求24至33中任一项所述的方法，其中将所述脂肪酸合成抑制剂进料到所述培养基中。

36.如权利要求24至35中任一项所述的方法，其中所述微生物具有IDAC登记号220716-01。

37.如权利要求24至36中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括从所述生物质中分离油脂。

38.如权利要求24至37中任一项所述的方法，其中所述油脂包含脂肪酸，并且所述脂肪酸包含至少50重量％的二十二碳六烯酸、6重量％至18重量％之间的二十二碳五烯酸n-6和少于1重量％的硬脂酸。

39.如权利要求24至38中任一项所述的方法，其中所述油脂包含脂肪酸，并且所述脂肪酸包含10重量％至18重量％之间的二十二碳五烯酸n-6。

40.如权利要求24至39中任一项所述的方法，其中所述油脂包含脂肪酸，并且所述脂肪酸包含少于1重量％的二十碳五烯酸。

41.如权利要求24至40中任一项所述的方法，其中所述油脂包含脂肪酸，并且所述脂肪酸包含10％至40％之间的饱和脂肪酸。

42.如权利要求24至41中任一项所述的方法，其中所述油脂包含脂肪酸，并且所述脂肪酸包含50重量％至70重量％的二十二碳六烯酸。

43.如权利要求24至42中任一项所述的方法，其中所述油脂包含脂肪酸，并且所述脂肪酸包含至少95重量％的甘油三酯。

44.如权利要求24至43中任一项所述的方法，其中所述油脂包含脂肪酸，并且所述脂肪酸包含至少60重量％的二十二碳六烯酸和10重量％至18重量％之间的二十二碳五烯酸n-6。

45.如权利要求24至44中任一项所述的方法，其中所述油脂包含脂肪酸，并且所述脂肪酸包含0.1重量％至0.5重量％的十七烷酸。

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