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CN115521956A - 一种生物酶催化合成l-肌肽的方法 - Google Patents

一种生物酶催化合成l-肌肽的方法 Download PDF

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CN115521956A CN202211294445.6A CN202211294445A CN115521956A CN 115521956 A CN115521956 A CN 115521956A CN 202211294445 A CN202211294445 A CN 202211294445A CN 115521956 A CN115521956 A CN 115521956A
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Abstract

本发明提供一种生物酶催化合成L‑肌肽的方法，所述方法包括以下步骤：在生物酶和微孔聚合物存在下，L‑组氨酸与β‑丙氨酸反应得到L‑肌肽，本发明通过利用生物酶和微孔聚合物的共同作用，使得L‑组氨酸与β‑丙氨酸可以经过一步反应得到L‑肌肽，并且具有高的产物收率以及高的产物纯度，L‑肌肽的收率高达85‑95％，纯度高达99％以上。

Description

一种生物酶催化合成L-肌肽的方法
技术领域
本发明属于药物制备领域，涉及一种生物酶催化合成L-肌肽的方法。
背景技术
L-肌肽(β-丙氨酰-L-组氨酸)是一种重要的天然二肽，可以保护脑血管内皮细胞免受丙二醛所诱导的氧化毒性，它是一种抗衰老药物，受到人们的广泛青睐。目前制备L-肌肽的方法主要依靠的还是化学合成，主要方法有：1.酰基叠氮法；2.酰基氨解法；3.酸酐氨解法；4.二氢-1,3-噻唑-2,4二酮法；5.N-羟基丁二酰亚胺法，化学法存在反应路线长，反应条件苛刻，选择性差，易生成副产物，产物纯度低，收率低，需用到昂贵的试剂，成本较高等不足；此外，大量有机溶剂的使用还会造成环境污染。
CN107217048A公开了采用氨肽酶催化β-丙氨酸甲酯与L-组氨酸合成L-肌肽，该方法在生成L-肌肽的同时也会形成一定量的三肽杂质，导致反应产物复杂，提取纯化困难，L-肌肽收率也比较的低。
CN109609536A公开了利用全细胞催化合成L-肌肽，该方法生成的反应液杂质比较的多，也有EDTA和大量的硼酸盐等，在后期分离的过程中比较复杂，需要对这些杂质逐一地进行分离，在一定的程度上会降低收率，提高生成成本。
CN106366158A和CN106366159A中公开了L-肌肽粗品纯化的方法，该方法在纯化时需要先得到L-肌肽粗品，再通过控制不同的纯化条件得到L-肌肽成品，此方法操作比较的繁琐，在一定的程度上生产成本较高，并且收率也相对比较的低。
因此，在本领域中期望能够开发一种可以高收率制备得到高纯度的L-肌肽产品的方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种生物酶催化合成L-肌肽的方法。本发明的方法工艺简单，生产周期短，生产成本低，有利于生产高纯度和高收率的L-肌肽。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种生物酶催化合成L-肌肽的方法，所述方法包括以下步骤：
在生物酶和微孔聚合物存在下，L-组氨酸与β-丙氨酸反应得到L-肌肽。
在本发明中利用生物酶和微孔聚合物的共同作用，使得L-组氨酸与β-丙氨酸可以经过一步反应得到L-肌肽，并且具有高的产物收率以及高的产物纯度。
优选地，所述生物酶为氨肽酶，所述氨肽酶为CN107217048A中公开的酶，即所述氨肽酶具有CN107217048A中公开的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。所述氨肽酶来源于体外重组构建的基因工程菌株。所述基因工程菌株为大肠杆菌、毕氏酵母、枯草芽孢杆菌。编码所述的氨肽酶的核苷酸序列如CN107217048A中公开的SEQ ID NO：1所示。
优选地，所述微孔聚合物包括共价有机骨架(COF)、超交联多孔离子聚合物(HCP)、共轭微孔聚合物(CMP)、固有微孔性聚合物(PIM)、三嗪骨架(CTF)或多孔芳族骨架(PAF)中的任意一种，优选超交联多孔离子聚合物HCP。
优选地，所述L-组氨酸与生物酶的质量比为1:0.1-1:1.1，例如1:0.1、1:0.2、1:0.4、1:0.5、1:0.7、1:0.8、1:0.9或1:1。如果生物酶的用量太低则反应不完全，收率比较低，如果生物酶的用量太高，则杂质比较多，产品纯度降低。
优选地，所述L-组氨酸与微孔聚合物的质量比为1:0.02-1:0.13，例如1:0.02、1:0.03、1:0.05、1:0.07、1:0.09、1:0.1、1:0.12或1:0.13。如果微孔聚合物的用量太高则会使得产物L-肌肽造成一部分损失，收率降低，如果微孔聚合物的用量太低，则杂质去除率低，产品纯度降低。
优选地，L-组氨酸与β-丙氨酸的摩尔比为1:0.5-1:2，例如1:0.5、1:0.7、1:0.9、1:1、1:1.3、1:1.5、1:1.8或1:2。
优选地，所述反应在碱存在下进行，所述碱为有机碱或无机碱。
优选地，所述有机碱包括三乙胺、甲醇钠、乙醇钠或氢氧化季铵盐中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述无机碱包括氨水、氢氧化钠、碳酸钠或碳酸氢钠中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述碱的用量为L-组氨酸质量的0.95-1.65倍，例如0.95倍、0.98倍、1倍、1.2倍、1.4倍、1.5倍或1.65倍等。
优选地，所述反应中反应体系的pH为5-12，例如5、5.5、5.8、6、6.4、6.8、7、7.4、7.8、8、8.3、8.5、8.8、9、9.5、9.8、10、10.5、11、11.5或12。
优选地，所述反应的溶剂为水。
优选地，所述反应的温度为10-50℃，例如10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃；反应的时间为3-24h，例如3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h或24h等。
在本发明中，反应结束后，将生物酶进行失活，而后进行过滤，减压浓缩去除溶剂，而后进行析晶、打浆、洗涤、干燥，得到L-肌肽，其纯度高，收率高。
作为优选技术方案，本发明所述的生物酶催化合成L-肌肽的方法具体包括以下步骤：
在氨肽酶和微孔聚合物存在下，L-组氨酸与β-丙氨酸在碱存在下，10-50℃下反应3-24h，所述L-组氨酸与生物酶的质量比为1:0.1-1:1，所述L-组氨酸与微孔聚合物的质量比为1:0.02-1:0.13，L-组氨酸与β-丙氨酸的摩尔比为1:0.5-1:2，反应结束后，将生物酶进行失活，而后进行过滤，减压浓缩去除溶剂，而后进行析晶、打浆、洗涤、干燥，得到L-肌肽。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明通过利用生物酶和微孔聚合物的共同作用，使得L-组氨酸与β-丙氨酸可以经过一步反应得到L-肌肽，并且具有高的产物收率以及高的产物纯度，L-肌肽的收率高达85-95％，纯度高达99％以上，并且本发明中可以降低碱的用量、减少废水排放，更为绿色环保。
附图说明
图1为实施例1制备得到的产物的液相色谱图。
图2为对比例1制备得到的产物的液相色谱图。
图3为对比例2制备得到的产物的液相色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例中使用的生物酶为按照CN107217048A中实施例1和实施例2制备得到的生物酶冻干粉。
以下实施例中涉及的液相色谱条件为：色谱柱：Kromasil 100-5C18，长度：150mm，内径：4.6mm，流动性A：pH2.5戊烷磺酸钠水溶液，流动性B：甲醇。
实施例1
在本实施例中提供一种生物酶催化合成L-肌肽的方法，所述方法包括以下步骤：
向1L的反应瓶中加入300mL去离子水，L-组氨酸16g(0.103mol)搅拌均匀，加入16g(1.0倍)生物酶和2g共价有机骨架(本征型COF，型号：COF-102，厂家：西安齐岳生物科技有限公司)，之后加入18g液碱(0.182mol)调pH＝7-8，控制反应温度25℃，滴加76.7gβ-丙氨酸的水溶液(含量12％，0.103mol)滴加完后，控制保温反应时间4小时，反应完毕后，使用30％盐酸调pH＝1-2进行失活。失活完毕后进行过滤，浓缩除去水，得到粘稠的液体，趁热加入250mL甲醇进行析晶，30℃，析晶8小时以上，过滤，洗涤，干燥，得到白色粉末21.3g，摩尔收率91.3％，纯度99.2％。
制备得到的产物的液相色谱图如图1所示，图1中可以看出，实施例1的方法能得到高纯度的L-肌肽，无其它的杂质生成。
实施例2
在本实施例中提供一种生物酶催化合成L-肌肽的方法，所述方法包括以下步骤：
向1L的反应瓶中加入300mL去离子水，L-组氨酸16g(0.103mol)搅拌均匀，加入9.6g(0.6倍)生物酶和0.5g共价有机骨架(负载型COF，型号：COF-08，厂家：西安瑞禧生物科技有限公司)，之后加入20.2g液碱(0.152mol)调pH＝8-9，控制反应温度40℃，滴加76.7gβ-丙氨酸的水溶液(含量12％，0.103mol)滴加完后，控制保温反应时间3小时，反应完毕后，使用30％盐酸调pH＝1-2进行失活。失活完毕后进行过滤，浓缩除去水，得到粘稠的液体，趁热加入250mL乙醇进行析晶，35℃析晶8小时以上，过滤，洗涤，干燥，得到白色粉末19.9g，摩尔收率85.3％，纯度99.7％。
实施例3
在本实施例中提供一种生物酶催化合成L-肌肽的方法，所述方法包括以下步骤：
向1L的反应瓶中加入300mL去离子水，L-组氨酸16g(0.103mol)搅拌均匀，加入9.6g(0.6倍)生物酶和1g超交联多孔离子聚合物(型号：KAPMHCP，厂家：西安瑞禧生物科技有限公司)，之后加入19.6g三乙胺(0.194mol)调pH＝8-9，控制反应温度40℃，滴加115gβ-丙氨酸的水溶液(含量12％,0.155mol)滴加完后，控制保温反应时间4小时，反应完毕后，使用30％盐酸调pH＝1-2进行失活。失活完毕后进行过滤，浓缩除去水，得到粘稠的液体，趁热加入250mL乙醇进行析晶，35℃析晶8小时以上，过滤，洗涤，干燥，得到白色粉末20.3g，摩尔收率87.0％，纯度99.3％。
实施例4
在本实施例中提供一种生物酶催化合成L-肌肽的方法，所述方法包括以下步骤：
向1L的反应瓶中加入300mL去离子水，L-组氨酸16g(0.103mol)搅拌均匀，加入9.6g(0.6倍)生物酶和0.38g超交联多孔离子聚合物(型号：KAPMHCP，厂家：西安瑞禧生物科技有限公司)，之后加入26.2g液碱(0.214mol)调pH＝10-11，控制反应温度25℃，滴加115gβ-丙氨酸的水溶液(含量12％，0.155mol)滴加完后，控制保温反应时间4小时，反应完毕后，使用30％盐酸调pH＝1-2进行失活。失活完毕后进行过滤，浓缩除去水，得到粘稠的液体，趁热加入250mL甲醇进行析晶，30℃析晶8小时以上，过滤，洗涤，干燥，得到白色粉末22.1g，摩尔收率94.7％，纯度99.8％。
实施例5
在本实施例中提供一种生物酶催化合成L-肌肽的方法，所述方法包括以下步骤：
向1L的反应瓶中加入300mL去离子水，L-组氨酸16g(0.103mol)搅拌均匀，加入17.6g(1.1倍)生物酶和0.38g共轭微孔聚合物(型号：SCMP-1，厂家：西安齐岳生物科技有限公司)，之后加入20.2g氨水(0.356mol)调pH＝8-9，控制反应温度40℃，滴加99.2gβ-丙氨酸的水溶液(含量12％，0.134mol)滴加完后，控制保温反应时间5小时，反应完毕后，使用30％盐酸调pH＝1-2进行失活。失活完毕后进行过滤，浓缩除去水，得到粘稠的液体，趁热加入250mL甲醇进行析晶，30℃析晶8小时以上，过滤，洗涤，干燥，得到白色粉末21.5g，摩尔收率92.2％，纯度99.6％。
实施例6
在本实施例中提供一种生物酶催化合成L-肌肽的方法，所述方法包括以下步骤：
向1L的反应瓶中加入300mL去离子水，L-组氨酸16g(0.103mol)搅拌均匀，加入17.6g(1.1倍)生物酶和0.38g固有微孔性聚合物(型号：PIM-1，厂家：西安瑞禧生物科技有限公司)，之后加入20.2g液碱(0.152mol)调pH＝8-9，控制反应温度45℃，滴加99.2gβ-丙氨酸的水溶液(含量12％，0.134mol)滴加完后，控制保温反应时间5小时，反应完毕后，使用30％盐酸调pH＝1-2进行失活。失活完毕后进行过滤，浓缩除去水，得到粘稠的液体，趁热加入250mL甲醇进行析晶，35℃析晶8小时以上，过滤，洗涤，干燥，得到白色粉末21.3g，摩尔收率91.3％，纯度99.1％。
实施例7
在本实施例中提供一种生物酶催化合成L-肌肽的方法，所述方法包括以下步骤：
向1L的反应瓶中加入300mL去离子水，L-组氨酸16g(0.103mol)搅拌均匀，加入16g(1.0倍)生物酶和0.38g三嗪骨架(型号：CTF-CX，厂家：西安瑞禧生物科技有限公司)，之后加入18.6g液碱(0.139mol)调pH＝10-11，控制反应温度20℃，滴加99.2gβ-丙氨酸的水溶液(含量12％，0.134mol)滴加完后，控制保温反应时间4小时，反应完毕后，使用30％盐酸调pH＝1-2进行失活。失活完毕后进行过滤，浓缩除去水，得到粘稠的液体，趁热加入250mL乙醇进行析晶，35℃析晶8小时以上，过滤，洗涤，干燥，得到白色粉末21.7g，摩尔收率93.1％，纯度99.2％。
实施例8
在本实施例中提供一种生物酶催化合成L-肌肽的方法，所述方法包括以下步骤：
向1L的反应瓶中加入300mL去离子水，L-组氨酸16g(0.103mol)搅拌均匀，加入12.8g(0.8倍)生物酶和0.5g多孔芳族骨架(型号：PAF-23，厂家：西安瑞禧生物科技有限公司)，之后加入18.6g液碱(0.139mol)调pH＝10-11，控制反应温度30℃，滴加59.5gβ-丙氨酸的水溶液(含量20％，0.134mol)滴加完后，控制保温反应时间4小时，反应完毕后，使用30％盐酸调pH＝1-2进行失活。失活完毕后进行过滤，浓缩除去水，得到粘稠的液体，趁热加入250mL甲醇进行析晶，30℃析晶8小时以上，过滤，洗涤，干燥，得到白色粉末21.5g，摩尔收率92.2％，纯度99.1％。
实施例9
在本实施例中提供一种生物酶催化合成L-肌肽的方法，所述方法包括以下步骤：
向1L的反应瓶中加入300mL去离子水，L-组氨酸16g(0.103mol)搅拌均匀，加入1.6g(0.1倍)生物酶和0.38g多孔芳族骨架(PAF-1，厂家：西安瑞禧生物科技有限公司)，之后加入18.4g液碱(0.137mol)调pH＝8-9，控制反应温度30℃，滴加99.2gβ-丙氨酸的水溶液(含量12％，0.134mol)滴加完后，控制保温反应时间3.5小时，反应完毕后，使用30％盐酸调pH＝1-2进行失活。失活完毕后进行过滤，浓缩除去水，得到粘稠的液体，趁热加入250mL甲醇进行析晶，30℃析晶8小时以上，过滤，洗涤，干燥，得到白色粉末19.9g，摩尔收率85.3％，纯度99.3％。
实施例10
与实施例4不同之处仅在于，将其中超交联多孔离子聚合物替换为用量相同的共价有机骨架(本征型COF，型号：COF-102，厂家：西安齐岳生物科技有限公司)，得到白色粉末21.3g，摩尔收率91.3％，纯度99.2％。
实施例11
与实施例4不同之处仅在于，将其中超交联多孔离子聚合物替换为用量相同的共轭微孔聚合物(型号：SCMP-1，厂家：西安齐岳生物科技有限公司)，得到白色粉末21.5g，摩尔收率92.2％，纯度99.6％。
实施例12
与实施例4不同之处仅在于，将其中超交联多孔离子聚合物替换为用量相同的固有微孔性聚合物(型号：PIM-1，厂家：西安瑞禧生物科技有限公司)，得到白色粉末21.3g，摩尔收率91.3％，纯度99.1％。
实施例13
与实施例4不同之处仅在于，将其中超交联多孔离子聚合物替换为用量相同的三嗪骨架(型号：CTF-CX，厂家：西安瑞禧生物科技有限公司)，得到白色粉末21.7g，摩尔收率93.1％，纯度99.2％。
实施例14
与实施例4不同之处仅在于，将其中超交联多孔离子聚合物替换为用量相同的多孔芳族骨架(型号：PAF-23，厂家：西安瑞禧生物科技有限公司)，得到白色粉末21.5g，摩尔收率92.2％，纯度99.1％。
实施例15
与实施例1不同之处仅在于加入生物酶的用量为20g(1.25倍)，则得到白色粉末21.1g，摩尔收率90.4％，纯度96.3％。
实施例16
与实施例1不同之处仅在于加入生物酶的用量0.8g(0.05倍)，则得到白色粉末19.9g，摩尔收率85.3％，纯度98.6％。
实施例17
与实施例1不同之处仅在于，加入共价有机骨架的用量为4g，则得到白色粉末20.0g，摩尔收率85.7％，纯度99.7％。
实施例18
与实施例1不同之处仅在于，加入共价有机骨架的用量为0.1g，则得到白色粉末20.3g，摩尔收率87.0％，纯度97.1％。
对比例1
与实施例1不同之处仅在于将其中的氨肽酶替换为氨基酸酯酰基转移酶，则得到白色粉末12.2g，摩尔收率52.3％，纯度84.6％。产品的液相色谱图如图2所示。
对比例2
与实施例1不同之处仅在于不加入共价有机骨架(本征型COF)，则得到白色粉末13.5g，摩尔收率57％，纯度96.8％，产品的液相色谱图如图3所示。
对比例3
向1L的反应瓶中加入300mL去离子水，L-组氨酸16g(0.103mol)搅拌均匀，加入9.6g(0.6倍)生物酶，之后加入49.3g液碱(0.314mol)调pH＝8-9，控制反应温度40℃，滴加76.7gβ-丙氨酸的水溶液(含量12％，0.103mol)滴加完后，控制保温反应时间3小时，反应完毕后，使用30％盐酸调pH＝1-2进行失活。失活完毕后进行过滤，浓缩除去水，得到粘稠的液体，趁热加入250mL乙醇进行析晶，35℃析晶8小时以上，过滤，洗涤，干燥，得到白色粉末13.5g，摩尔收率57％，纯度96.8％。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种生物酶催化合成L-肌肽的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
在生物酶和微孔聚合物存在下，L-组氨酸与β-丙氨酸反应得到L-肌肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物酶为氨肽酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述微孔聚合物包括共价有机骨架COF、超交联多孔离子聚合物HCP、共轭微孔聚合物CMP、固有微孔性聚合物PIM、三嗪骨架CTF或多孔芳族骨架PAF中的任意一种，优选超交联多孔离子聚合物HCP。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述L-组氨酸与生物酶的质量比为1:0.1-1:1.1。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述L-组氨酸与微孔聚合物的质量比为1:0.02-1:0.13；
优选地，L-组氨酸与β-丙氨酸的摩尔比为1:0.5-1:2。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应在碱存在下进行，所述碱为有机碱或无机碱。
优选地，所述有机碱包括三乙胺、甲醇钠、乙醇钠或氢氧化季铵盐中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述无机碱包括氨水、氢氧化钠、碳酸钠或碳酸氢钠中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述碱的用量为L-组氨酸质量的0.95-1.65倍。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应中反应体系的pH为5-12。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应的溶剂为水；
优选地，所述反应的温度为10-50℃，反应的时间为3-24h。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，反应结束后，将生物酶进行失活，而后进行过滤，减压浓缩去除溶剂，而后进行析晶、打浆、洗涤、干燥，得到L-肌肽。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
在氨肽酶和微孔聚合物存在下，L-组氨酸与β-丙氨酸在碱存在下，10-50℃下反应3-24h，所述L-组氨酸与生物酶的质量比为1:0.1-1:1，所述L-组氨酸与微孔聚合物的质量比为1:0.02-1:0.13，L-组氨酸与β-丙氨酸的摩尔比为1:0.5-1:2，反应结束后，将生物酶进行失活，而后进行过滤，减压浓缩去除溶剂，而后进行析晶、打浆、洗涤、干燥，得到L-肌肽。
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