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CN115505605B - 一种熊果酸的生产方法 - Google Patents

一种熊果酸的生产方法 Download PDF

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CN115505605B CN202211366063.XA CN202211366063A CN115505605B CN 115505605 B CN115505605 B CN 115505605B CN 202211366063 A CN202211366063 A CN 202211366063A CN 115505605 B CN115505605 B CN 115505605B
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Abstract

本发明涉及发酵工程技术领域，具体提供了一种熊果酸的生产方法，包括两阶段发酵培养酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），通过本申请的生产方法获得了熊果酸产量在2331.44±180.87mg/L及以上，为加快推进生物法合成熊果酸的生产工艺早日实现工业化应用提供示范作用。

Description

一种熊果酸的生产方法
技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域，具体涉及一种熊果酸的生产方法，尤其涉及一种利用酿酒酵母高密度发酵生产熊果酸的发酵的方法及应用。
背景技术
熊果酸是一种天然存在于植物中的乌苏烷型五环三萜化合物，许多研究表明其具有抗炎症、抗氧化及抗肿瘤等生理活性。目前熊果酸的获取方式主要是从植物中获取，然而植物生长周期漫长，过度砍伐会造成严重的生态问题。化学合成法存在工艺繁琐和提取效率低等技术难题。微生物发酵法因其具有条件温和、不占用耕地以及过程绿色可控等优势备受人们的关注。但目前熊果酸在酿酒酵母中的产量距离达到工业化生产的最低标准还有一定的距离。为了进一步释放工程酿酒酵母生产熊果酸的能力，对工程菌株进行发酵工艺的放大培养是十分必要的。因此，通过进行系统的发酵条件优化，并开发放大规模的发酵工艺，从而确定菌株发酵的最佳条件，对推动微生物发酵法合成熊果酸早日实现工业化生产具有重要意义。
发明内容
为解决现有技术的缺陷，本申请提供了一种酿酒酵母高密度发酵生产熊果酸的方法，结果显示，通过发酵生产的工艺放大和优化，采用本申请所述的方法发酵8天大幅提高熊果酸的产量，至少20倍，具体熊果酸产量达到2331.44±180.87mg/L及以上。具体的：
本发明的第一方面，提供了一种熊果酸的生产方法，所述的生产方法包括两阶段发酵培养酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），所述的两阶段发酵包括：
第一阶段：以葡萄糖为碳源，以不含氨基酸的酵母氮源为氮源。
优选的，第一阶段碳源初始浓度为50-70g/L。进一步优选为55-65g/L。例如50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70g/L。
优选的，第一阶段氮源的初始浓度为15-25g/L。进一步优选为18-22g/L。例如15、16、17、18、19、20、20.1、21、22、23、24、25g/L。
第二阶段：以乙醇为碳源，以不含氨基酸的酵母氮源为氮源。
优选的，第二阶段氮源的初始浓度为15-25g/L。进一步优选为18-22g/L。例如15、16、17、18、19、20、20.1、21、22、23、24、25g/L。
优选的，第二阶段中流加乙醇的时间为细胞生长的对数生长期，进一步优选为对数生长期前期。
优选的，第二阶段中流加乙醇的时间为发酵的第40-50h（例如40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50h）开始流加乙醇。
优选的，所述的第二阶段中乙醇的流加速率为28-36mL/h。例如28、28.5、28.8、29、30、31、32、33、34、35、36mL/h。
优选的，加入乙醇后，控制乙醇的浓度维持5g以下。
优选的，所述发酵的第10-12h（例如10h、10.5h、11h、11.5h、12h）开始流加葡萄糖补料培养基，且在35-38h（例如35、36、37、38h）停止流加。
葡萄糖补料培养基每升包括：400-600g葡萄糖，10-15g不含氨基酸的酵母氮源，1-2g脱落氨基酸混合物，8-10g KH2PO4，2-3g MgSO4，3-4g K2SO4，0.2-0.35g Na2SO4，8-12mL微量金属溶液，10-15mL维生素溶液。
进一步优选的，所述的葡萄糖补料培养基的流加速率可以根据实际情况调节，例如在保证酿酒酵母产生乙醇的浓度在不超过10g/L的前提下加入葡萄糖，优选葡萄糖补料培养基的流加速率为30mL/h-80mL/h，例如30、40、50、60、70、80mL/h。
优选的，待葡萄糖耗尽后开始加入半乳糖。例如停止流加葡萄糖补料培养基后的1-3h（例如1、2、3h）推定葡萄糖耗尽，开始加入半乳糖。
进一步优选的，所述发酵的第35-45h（例如35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45h）开始加入半乳糖作为诱导剂，加入后，半乳糖的终浓度为55-65g/L（例如55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65g/L）。
所述的加入可以为流加或者间歇补加。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的加入半乳糖的方式为间歇补加。
优选的，所述的发酵过程中添加维生素溶液和/或微量金属溶液。
在本发明的一个具体实施方式中，在所述发酵第40-50h（例如40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50h）后每隔10-12h（例如10h、10.5h、11h、11.5h、12h）加入半乳糖补料培养基、维生素溶液以及微量金属溶液。具体加入的量为，如果在5L的发酵罐中，2-3升的发酵体系，加入维生素溶液大概5-10mL（例如5、6、7、8、9、10mL），以及加入微量金属溶液大概5-10mL（例如5、6、7、8、9、10mL），以及加入半乳糖补料培养基40-60mL（例如40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60mL）。若为其他发酵体系，参照2-3升的发酵体系加入量，按照比例加入。
在本发明的一个具体实施方式中，半乳糖补料培养基每升包括：400-600g半乳糖，10-15g不含氨基酸的酵母氮源，1-2g脱落氨基酸混合物，8-10g KH2PO4，2-3g MgSO4，3-4gK2SO4，0.2-0.35g Na2SO4，8-12mL微量金属溶液，10-15mL维生素溶液；
在本发明的一个具体实施方式中，维生素溶液每升包括：生物素0.01-0.1g，泛酸钙0.5-2g，烟酸0.5-2g，肌醇20-30g，盐酸硫胺素0.5-2g，盐酸吡哆醛0.5-2g，对氨基苯甲酸0.1-0.3g；
在本发明的一个具体实施方式中，微量金属溶液每升包括：EDTA 10-20g，ZnSO4•7H2O 5-6g，MnCl2•4H2O 0.2-0.4g，无水CuSO40.1-1g，CoCl2•6H2O 0.2-0.6g，Na2MoO4•2H2O0.3-0.8g，CaCl2•2H2O 2-3.5g，FeSO4•7H2O 2-3.5g。
优选的，所述发酵的过程中pH维持5-6，例如5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6。
优选的，所述发酵的过程中温度维持25-35℃，例如25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35℃。
优选的，所述发酵的过程中溶氧为30-40%，例如30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40%。进一步优选溶氧串级转速控制发酵液的溶氧为30-40％。
优选的，所述发酵的过程中搅拌转速控制在300-800rpm，例如300、400、500、600、700、800rpm。在本发明的一个具体实施方式中，在发酵的初始控制搅拌转速300rpm，1-5h（例如1、2、3、4、5h）后搅拌转速控制在300-800rpm。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的搅拌转速与溶氧偶联，在保证溶氧为30-40％的前提下，搅拌速度在300-800rpm范围内波动。
优选的，所述发酵的过程中空气流量控制在2-5vvm，例如2、3、4、5vvm。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的生产方法包括：
A）菌种活化：从-80℃超低温冰箱中取出冻藏的甘油菌，在SD缺陷型固体培养基上培养至出现单菌落；
B）种子液培养：挑取单菌落接种于种子培养基中，在25-35℃、150-250rpm的摇床中培养30-40h；
C）第一阶段发酵培养：按照8%-12%的接种量接种于以葡萄糖为碳源，以不含氨基酸的酵母氮源为氮源的发酵初始培养基中，在pH维持5-6，温度维持25-35℃，溶氧为30-40%的条件下培养，待培养10-12h开始流加葡萄糖补料培养基，流加速率为30-80mL/h，且在第35-38h停止流加；优选的，搅拌转速控制在300-800rpm，空气流量控制在2-5vvm。
D）第二阶段发酵培养：以乙醇为碳源，以不含氨基酸的酵母氮源为氮源，其中，流加乙醇的时间为40-50h，流加速率为28-36mL/h。并且加入乙醇后，控制乙醇的浓度维持5g以下；
其中，在发酵的第35-45h开始加入半乳糖作为诱导剂，加入后，半乳糖的终浓度为55-65g/L；并且在所述发酵第40-50h后每隔10-12h加入半乳糖补料培养基、维生素溶液以及微量金属溶液；
在本发明的一个具体实施方式中，SD缺陷型固体培养基每升包括：5-8g不含氨基酸的酵母氮源、15-25g葡萄糖、0.5-1g脱落氨基酸混合物，琼脂粉15-25g，调节培养基pH至6-6.5；
在本发明的一个具体实施方式中，种子培养基每升包括：15-25g/L不含氨基酸的酵母氮源、50-70g/L葡萄糖、2-3g/L脱落氨基酸混合物；
在本发明的一个具体实施方式中，发酵初始培养基每升包括：50-70g葡萄糖，15-25g不含氨基酸的酵母氮源，2-3g脱落氨基酸混合物，7-10g KH2PO4，2-4g MgSO4，0.5-1gZnSO4·7H2O，8-12mL微量金属溶液，10-15mL维生素溶液，培养基pH为5-6（优选5.5）。
优选的，所述的发酵周期为5-10天，例如5、6、7、8、9、10天。
优选的，所述的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）表达CYP450酶、CPR酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和NADH依赖性的羟甲基戊二酸还原酶。其中，
所述的CYP450酶来源于枇杷；
所述的CPR酶来源于百脉根；
所述的甘油醛-3-磷酸脱氢酶来源于乳酸克鲁维酵母；
所述的NADH依赖性的羟甲基戊二酸还原酶来源于硅酸杆菌。
优选的，所述的生产方法获得的产物还包括α-香树脂醇。
本发明的第二方面，提供了一种第一方面所述生产方法获得的熊果酸（见图1）。
本发明的第三方面，提供了一种同时生产熊果酸和α-香树脂醇的方法，所述的方法包括第一方面所述的生产方法。
本发明的第四方面，提供了一种第三方面所述方法获得的熊果酸和α-香树脂醇。
本发明的第五方面，提供了一种上述的生产方法或方法获得的熊果酸在制备抗炎症、抗氧化或抗肿瘤的产品中的应用。
本发明的生产方法具有以下优点：
1、本发明中通过发酵条件优化包括半乳糖诱导条件和添加规律、培养基条件、补料添加及添加时机、发酵条件（温度、pH、转速、溶氧等）、发酵周期的优化使得熊果酸产量在发酵罐条件下产量即可达到2331.44±180.87mg/L，相比于摇瓶水平产量提高了大概25倍，极大地释放了菌株的生产能力，同时，α-香树脂醇的产量可达到1.21 g/L。
2、本发明的碳源补料方式有一个显著的特点，在酿酒酵母发酵过程中间歇性的添加半乳糖，不仅可以作为发酵过程的诱导剂，同时又能够更加有效的补充发酵碳源。
本发明所述的“间歇”代表一次性投料，但是在整个发酵周期中可以包含若干次的一次性投料。当然，具体投料的时间可以根据实际情况确定，例如投入的物料消耗情况或者投入的物料需要保证的一定浓度等，也可以确定一定的间隔时间进行投料。而且，每次的投入量可以相同也可以不同。
本发明所述的“对数生长期前期”为将对数生长期按照时间将其平均分为3段，其中，第一段即为对数生长期前期。
本发明所述的“流加”代表将物料连续不断的加入发酵体系中，可以在发酵初始开始流加，也可以在发酵过程中的某个特定时刻开始流加，可以在发酵结束流加，也可以在发酵过程中的某个特定时刻结束流加。但是在整个发酵周期中可以有同一物料的多次流加，以及多种物料的同时流加或分别流加。例如，同一物料的多次流加可以在整个发酵周期中的某个特定的时刻开始流加，一定时间后结束流加，停止一定时间后再开始流加，一定时间后结束流加等等。关于流加的开始时间、结束时间、流加时长根据实际需要调整，例如流加的速度、流加物料的浓度、发酵体系中所需的浓度等等。流加的速度也可以根据具体需求调整。
本发明所述的“物料”可以为培养基或其各成分、水、调节pH所需试剂等等常规发酵需要的物质，其可以为气体、液体、固体、半固体等等。
本发明所述的“炎症”可以是任何组织出现的炎症，所述的组织包括但不限于肾上腺、肾上腺髓质、肛门、阑尾、膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、盲肠、中枢神经系统(包括或排除大脑)、小脑、子宫颈、结肠、十二指肠、子宫内膜、上皮细胞(例如肾上皮细胞)、胆囊、食道、神经胶质细胞、心脏、回肠、空肠、肾、泪腺、喉、肝、肺、淋巴、淋巴结、淋巴母细胞、上颌骨、纵隔、肠系膜、子宫肌层、鼻咽、网膜、口腔、卵巢、胰腺、腮腺、周围神经系统、腹膜、胸膜、前列腺、唾液腺、乙状结肠、皮肤、小肠、软组织、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、舌、扁桃体、气管、子宫、外阴、白细胞。进一步优选的，所述的炎症选自系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、硬皮病、哮喘、特应性皮炎、器官特异性炎性疾病、过敏（例如过敏性鼻炎）、毛囊炎、扁桃体炎、肺炎、肝炎、肾炎、痤疮、自身免疫性疾病、慢性前列腺炎、肾小球肾炎、超敏反应、结肠炎、炎性肠道疾病、盆腔炎、再灌注损伤、移植排斥反应、血管炎或间质性膀胱炎。
本发明所述的“肿瘤”可以是任何不良的细胞增殖(或本身表现为不良细胞增殖的任何疾病)、赘生物，或不良细胞增殖、赘生物或肿瘤的倾向性或风险增加。其可以是良性或恶性的，也可以是原发性或继发性(转移性)。赘生物可以是细胞的任何异常生长或增殖，并且可以位于任何组织中。组织的实例包括肾上腺、肾上腺髓质、肛门、阑尾、膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、盲肠、中枢神经系统(包括或排除大脑)、小脑、子宫颈、结肠、十二指肠、子宫内膜、上皮细胞(例如肾上皮细胞)、胆囊、食道、神经胶质细胞、心脏、回肠、空肠、肾、泪腺、喉、肝、肺、淋巴、淋巴结、淋巴母细胞、上颌骨、纵隔、肠系膜、子宫肌层、鼻咽、网膜、口腔、卵巢、胰腺、腮腺、周围神经系统、腹膜、胸膜、前列腺、唾液腺、乙状结肠、皮肤、小肠、软组织、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、舌、扁桃体、气管、子宫、外阴、白细胞。进一步优选的，所述的肿瘤选自前列腺癌、乳腺癌、肝癌、胶质瘤（例如神经胶质瘤）、肠癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、皮肤癌、横纹肌癌、舌鳞癌、鼻咽癌、卵巢癌、胎盘绒毛癌、淋巴瘤（例如非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤）、白血病、直肠腺癌、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤（例如神经纤维肉瘤）、室管膜瘤、神经鞘瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、骨髓瘤、慢性粒细胞白血病、急性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、慢性淋巴细胞白血病、表皮样癌、结肠癌、胸腺癌、血液癌、头颈癌或口咽癌。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：为发酵产物熊果酸的结构式。
图2：培养基浓度优化的结果图。
图3：pH优化结果图。
图4：半乳糖诱导时间优化结果图。
图5：42h开始流加乙醇，酿酒酵母WN85菌株在5L发酵罐条件下的发酵曲线。
图6：48h开始流加乙醇，酿酒酵母WN85菌株在5L发酵罐条件下的发酵曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实验中所用菌株为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）工程菌株WN85（简称WN85），其表达CYP450酶、CPR酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和NADH依赖性的羟甲基戊二酸还原酶，具体见专利CN202210432868.3。
不含氨基酸的酵母氮源购自北京索莱宝科技有限公司，货号：Y8040。
脱落氨基酸混合物自北京索莱宝科技有限公司购置各种氨基酸成分后自行配制，配方见表1。
表1
Figure 224495DEST_PATH_IMAGE001
实施例1：摇瓶发酵条件培养基优化
本发明首先在摇瓶水平进行培养基条件的优化，为了平衡菌株生长和熊果酸的生物合成，将整个发酵过程分为两个阶段：第一阶段是为以葡萄糖作为碳源的菌株生长阶段，第二阶段是待葡萄糖耗尽后添加半乳糖诱导熊果酸的积累。其中发酵培养基成分组成如下：1X SD葡萄糖培养基分别含有6.7 g/L不含氨基酸的酵母氮源、20 g/L葡萄糖、0.8 g/L脱落氨基酸混合物。对应1X SD半乳糖培养基同样含有6.7 g/L不含氨基酸的酵母氮源、20g/L半乳糖、0.8 g/L脱落氨基酸混合物。2X、3X、4X、5X培养基参照以上配比依次乘以2、3、4、5。
取活化后的平板，挑取单菌落接种于1X SD葡萄糖培养基中制备发酵种子液，按照初始OD600=0.1的接种量将WN85菌株分别转接于2X、3X、4X、5X葡萄糖培养基中，30℃振荡培养48小时后更换到相同条件的2X、3X、4X、5X半乳糖培养基继续培养3天提取产物，其中，转速为200rpm，发酵过程中pH维持在6.2，结果见图2。
进一步进行pH值的优化，按照OD600=0.1的接种量在WN85菌株转接于3X葡萄糖培养基中，30℃振荡培养48小时后更换到相同条件的3X半乳糖培养基继续培养3天提取产物，其中，转速为200rpm，结果见图3。
进一步进行半乳糖加入时间的优化，按照OD600=0.1的接种量在WN85菌株转接于3X葡萄糖培养基中，30℃振荡培养10-60小时后更换到相同条件的3X半乳糖培养基继续培养，培养总天数为5天，提取产物，其中，转速为200rpm，发酵过程中维持pH为5.5，结果见图4。
实施例2：酿酒酵母熊果酸发酵工艺的放大与优化
由于菌株在3X和4X培养基中所合成的熊果酸产量差别不大，综合考虑到经济成本，最终选择3X发酵培养基进行分批补料发酵。
菌株活化：从-80℃超低温冰箱中取出冻藏的甘油菌，平板划线后置于30℃培养箱中培养3天至出现单菌落。
SD缺陷型固体培养基（1X）：6.7 g/L不含氨基酸的酵母氮源、20 g/L葡萄糖、0.8g/L脱落氨基酸混合物，琼脂粉20 g/L，调节培养基pH至6.2，115℃灭菌15分钟。
试管培养一级种子液：挑取活化后平板上的单菌落接种于盛有培养基（3X SD葡萄糖培养基）的试管中，置于摇床中200 rpm，30℃培养16小时，得到成熟的一级种子液。
摇瓶培养二级种子液：按照10％的接种比例将得到的一级种子液转接至盛有培养基（3X SD葡萄糖培养基）的100 mL摇瓶中，置于摇床中200 rpm，30℃培养36小时，得到成熟的二级种子液。
摇瓶培养三级种子液：按照10％的接种比例将得到的二级种子液转接至盛有培养基（3X SD葡萄糖培养基）的500 mL摇瓶中，置于摇床中200 rpm，30℃培养36小时，得到成熟的三级种子液。
发酵罐培养：5L发酵罐装液量为2.1L，将成熟的三级种子液按照10％的接种比例（接入发酵罐后初始OD600=10.35）接种于发酵罐中，添加适量消泡剂，使用冷凝水控制罐温为30℃，控制空气流量3 vvm，控制初始搅拌转速为300rpm，溶氧控制在30％左右，使用氨水自动控制发酵罐pH始终维持在5.5左右，待发酵两小时后设置溶氧串级转速在300-800rpm之间，发酵12小时葡萄糖耗尽后开始向发酵罐中流加葡萄糖补料发酵培养基（流加速率为30-80mL/h，保证乙醇的浓度为10g/L以下），在发酵36小时停止补料葡萄糖，在发酵过程的38小时一次性补加半乳糖至体系终浓度为60g/L，随后自发酵第3天开始，每间隔12小时一次性补加50mL半乳糖，在发酵过程的42小时开始流加补料乙醇，控制发酵过程中的乙醇浓度始终维持在5g/L以下，具体为每25min补料12mL，菌株发酵周期为8天，自发酵第3天开始，每隔12小时使用医用注射器一次性补加8mL维生素溶液和8mL微量金属离子溶液，整个发酵过程中始终控制乙醇浓度始终维持在5g/L以下，培养8天后进行产物提取，结果见图5。具体的，熊果酸产量可达到2331.44±180.87mg/L，α-香树脂醇的产量可达到1.21 g/L。
另外，其他条件不同，将流加乙醇的时间替换为在发酵过程的48h开始流加，结果见图6。具体的，熊果酸产量可达到1567.4 ±329.45mg/L，α-香树脂醇的产量可达到1.75g/L。
发酵罐中使用的初始发酵培养基组成如下：60g/L葡萄糖，20.1g/L不含氨基酸的酵母氮源，2.4g/L脱落氨基酸混合物，8g/L KH2PO4，3g/L MgSO4，0.72g/L ZnSO4·7H2O，10mL/L微量金属溶液，12mL/L维生素溶液，培养基pH为5.5。
发酵第一阶段使用的葡萄糖补料培养基组成如下：500g/L葡萄糖，13.4g/L不含氨基酸的酵母氮源，1.6g/L脱落氨基酸混合物，9g/L KH2PO4，2.5g/L MgSO4，3.5g/L K2SO4，0.28g/L Na2SO4，10mL/L微量金属溶液，12mL/L维生素溶液。
发酵过程中使用的诱导型半乳糖补料培养基组成如下：500g/L半乳糖，13.4g/L不含氨基酸的酵母氮源，1.6g/L脱落氨基酸混合物，9g/L KH2PO4，2.5g/L MgSO4，3.5g/LK2SO4，0.28g/L Na2SO4，10mL/L微量金属溶液，12mL/L维生素溶液。
维生素溶液成分组成（1L）：生物素0.05g，泛酸钙1g，烟酸1g，肌醇25g，盐酸硫胺素1g，盐酸吡哆醛1g，对氨基苯甲酸0.2g。
微量金属溶液成分组成（1L）：EDTA 15g，ZnSO4•7H2O 5.75g，MnCl2•4H2O 0.32g，无水CuSO40.5g，CoCl2•6H2O 0.47g，Na2MoO4•2H2O 0.48g，CaCl2•2H2O 2.9g，FeSO4•7H2O 2.8g。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (7)

1.一种熊果酸的生产方法，其特征在于，所述的生产方法包括两阶段发酵培养酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），所述的生产方法包括：
A）菌种活化：从-80℃超低温冰箱中取出冻藏的甘油菌，在SD缺陷型固体培养基上培养至出现单菌落；
B）种子液培养：挑取单菌落接种于种子培养基中，在25-35℃、150-250rpm的摇床中培养30-40h；
C）第一阶段发酵培养：按照8%-12%的接种量接种于以葡萄糖为碳源，以不含氨基酸的酵母氮源为氮源的发酵初始培养基中，在pH维持5-6，温度维持25-35℃，溶氧为30-40%的条件下培养，待培养10-12h开始流加葡萄糖补料培养基，且在第35-38h停止流加；
D）第二阶段发酵培养：以乙醇为碳源，以不含氨基酸的酵母氮源为氮源，其中，流加乙醇的时间为发酵的第40-50h开始流加乙醇，流加速率为28-36mL/h，并且加入乙醇后，控制乙醇的浓度维持5g以下；
其中，在发酵的第35-45h开始加入半乳糖作为诱导剂，加入后，半乳糖的终浓度为55-65g/L；并且在所述发酵第40-50h后每隔10-12h加入半乳糖补料培养基、维生素溶液以及微量金属溶液；
SD缺陷型固体培养基每升包括：5-8g不含氨基酸的酵母氮源、15-25g葡萄糖、0.5-1g脱落氨基酸混合物，琼脂粉15-25g，调节培养基pH至6-6.5；
种子培养基每升包括：15-25g/L不含氨基酸的酵母氮源、50-70g/L葡萄糖、2-3g/L脱落氨基酸混合物；
发酵初始培养基每升包括：50-70g葡萄糖，15-25g不含氨基酸的酵母氮源，2-3g脱落氨基酸混合物，7-10g KH2PO4，2-4g MgSO4，0.5-1g ZnSO4·7H2O，8-12mL微量金属溶液，10-15mL维生素溶液，培养基pH为5-6。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，其中，葡萄糖补料培养基每升包括：400-600g葡萄糖，10-15g不含氨基酸的酵母氮源，1-2g脱落氨基酸混合物，8-10g KH2PO4，2-3g MgSO4，3-4g K2SO4，0.2-0.35g Na2SO4，8-12mL微量金属溶液，10-15mL维生素溶液。
3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，其中，
半乳糖补料培养基每升包括：400-600g半乳糖，10-15g不含氨基酸的酵母氮源，1-2g脱落氨基酸混合物，8-10g KH2PO4，2-3g MgSO4，3-4g K2SO4，0.2-0.35g Na2SO4，8-12mL微量金属溶液，10-15mL维生素溶液；
维生素溶液每升包括：生物素0.01-0.1g，泛酸钙0.5-2g，烟酸0.5-2g，肌醇20-30g，盐酸硫胺素0.5-2g，盐酸吡哆醛0.5-2g，对氨基苯甲酸0.1-0.3g；
微量金属溶液每升包括：EDTA 10-20g，ZnSO4•7H2O 5-6g，MnCl2•4H2O 0.2-0.4g，无水CuSO40.1-1g，CoCl2•6H2O 0.2-0.6g，Na2MoO4•2H2O 0.3-0.8g，CaCl2•2H2O 2-3.5g，FeSO4•7H2O 2-3.5g。
4.根据权利要求1-3任一所述的生产方法，其特征在于，所述的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）表达CYP450酶、CPR酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和NADH依赖性的羟甲基戊二酸还原酶。
5.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于，其中，
所述的CYP450酶来源于枇杷；
所述的CPR酶来源于百脉根；
所述的甘油醛-3-磷酸脱氢酶来源于乳酸克鲁维酵母；
所述的NADH依赖性的羟甲基戊二酸还原酶来源于硅酸杆菌。
6.一种同时生产熊果酸和α-香树脂醇的方法，其特征在于，所述的方法包括权利要求1-5任一所述生产方法。
7.一种权利要求1-6任一所述的生产方法或方法获得的熊果酸在制备抗炎症、抗氧化或抗肿瘤的产品中的应用。
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