CN115505037B - 一种利用糖基化改良的鱼皮胶原蛋白抗冻肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用糖基化改良的鱼皮胶原蛋白抗冻肽及其制备方法和应用，属于食品生物化学与水产品保鲜领域。该制备方法包括以下步骤：向鱼皮胶原蛋白肽溶液中加入单糖，搅拌后得糖肽混合物，之后调节糖肽混合物的pH，并于50‑80℃温度下进行搅拌反应，反应结束后，得到所述的利用糖基化改良的鱼皮胶原蛋白抗冻肽。本发明基于糖基化反应原理，通过罗非鱼胶原蛋白肽糖基化反应工艺制备糖基化肽，使罗非鱼胶原蛋白肽与糖发生充分交联，从而改变罗非鱼胶原蛋白肽的质荷比及二级结构，增强其胶原蛋白肽的热滞活性，应用接枝反应改善其抗冻活性的同时提高产品稳定性，为水产品冷冻加工业无磷抗冻剂的开发提供新的思路和途径。

Description

一种利用糖基化改良的鱼皮胶原蛋白抗冻肽及其制备方法和 应用

技术领域

本发明涉及食品生物化学与水产品保鲜领域，特别是涉及一种利用糖基化改良的鱼皮胶原蛋白抗冻肽及其制备方法和应用。

背景技术

我国水产品资源丰富，其主要通过冷冻的加工方式进行运输贮藏，但是，水产品在运输过程中易发生冰晶化、重结晶化导致蛋白质冷冻变性，造成水产品品质劣变，功能特性减弱，如发生汁液流失以及改变水产品原有风味和性质。添加抗冻剂可以最大限度的防止水产品冷冻变性，食品工业中的抗冻剂主要包括糖类和多聚磷酸盐。这些抗冻剂虽然可以有效增加食物持水性，防止食物冷冻变性，但仍存在一定缺陷，糖类抗冻剂会增加不必要的甜味和热量，多聚磷酸盐过量摄入会给消费者带来健康风险。

近年来，抗冻肽成为开发绿色抗冻剂的研究热点。抗冻肽可以与冰晶表面结合，抑制冰晶的生长，还可以通过氢键、疏水相互作用和范德华力等分子间作用力吸附在冰晶表面，抑制冰晶重结晶，这使得抗冻肽可以降低溶液冰点，导致溶液的冰点和熔点产生差值，这种特性称为热滞活性(Thermal hysteresis activity，THA)，热滞活性是抗冻肽的重要评价指标。虽然抗冻肽具有巨大潜力成为新型食品抗冻剂，但由于其活性成分低，成本高，限制大规模应用。因此，开展改良抗冻肽活性的研发具有重要意义。

糖基化反应是羰基和氨基之间的化学反应，安全性高，操作简单。在一定的温度和湿度条件下，糖基化反应可以将糖中的C＝O引入到胶原蛋白肽的结构中，从而显著提高抗胶原蛋白肽的生物活性。2021年《中国渔业统计年鉴》报告，我国淡水鱼养殖产量中罗非鱼位列第五，2020年全国罗非鱼产量达16.6万吨，其加工副产物占总产量50％，鱼皮、鱼鳞作为主要加工副产物，可用来提取胶原蛋白肽。并且罗非鱼胶原蛋白肽具有一定的抗冻活性，但现有的技术中尚未有通过糖基化反应改良其活性的方法报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用糖基化改良的鱼皮胶原蛋白抗冻肽及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明基于糖基化反应原理，通过罗非鱼胶原蛋白肽糖基化反应工艺制备糖基化肽，在富含游离氨基的罗非鱼胶原蛋白肽溶液中，加入不同比例的葡萄糖、半乳糖或木糖，引入大量羟基基团。在特定温度与时间条件下，使其与糖发生充分交联，从而改变罗非鱼胶原蛋白肽的质荷比以及二级结构，增强其胶原蛋白肽的热滞活性，应用接枝反应改善其抗冻活性的同时提高产品稳定性。本发明制备的糖基化肽呈白色，无异味，热量、甜度较低，溶解性好，易被吸收利用，因此其可作为一种安全、高效的绿色抗冻剂在食品中应用。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种利用糖基化改良的鱼皮胶原蛋白抗冻肽的制备方法，包括以下步骤：

向鱼皮胶原蛋白肽溶液中加入单糖，搅拌后得糖肽混合物，之后调节糖肽混合物的pH，并于50-80℃温度下进行搅拌反应，反应结束后，得到所述的利用糖基化改良的鱼皮胶原蛋白抗冻肽。

进一步地，所述鱼皮胶原蛋白肽溶液的质量浓度为7-9％。

进一步地，所述鱼皮胶原蛋白肽溶液和葡萄糖的质量比为1：(1-4)；所述单糖包括葡萄糖、木糖或半乳糖。

进一步地，所述搅拌的条件为常温下搅拌10-40min；所述pH调节为7.5-8.5，所述搅拌反应的时间为60-120min。

进一步地，反应结束后，进行分离纯化，得到所述的利用糖基化改良的鱼皮胶原蛋白抗冻肽。

进一步地，所述分离纯化为：向反应结束后的产物中加水，配制成浓度为10-50mg/mL的溶液，将其送至葡聚糖凝胶色谱柱进行分离纯化，收集活性峰进行冷冻干燥；其中，进行分离纯化的色谱条件如下：流动相为超纯水，上样量为所述葡聚糖凝胶色谱柱的柱床体积的1-5％，流速为1mL/min，检测波长为220nm。

进一步地，所述鱼皮胶原蛋白肽包括罗非鱼皮胶原蛋白肽。

进一步地，所述罗非鱼皮胶原蛋白肽分子量为500-3000Da，易与糖分子发生接枝反应。

本发明还提供一种根据上述的制备方法获得的鱼皮胶原蛋白抗冻肽。

本发明还提供一种根据上述的鱼皮胶原蛋白抗冻肽在制备食品抗冻剂中的应用。

本发明还提供一种食品抗冻剂，包含上述的鱼皮胶原蛋白抗冻肽。

本发明公开了以下技术效果：

1.本发明采用罗非鱼加工副产物为原料来源，充分利用生物资源的同时减少了食品加工对环境造成的伤害。

2.本发明在糖基化肽的制备中使用葡萄糖等单糖接枝改良了罗非鱼胶原蛋白肽的抗冻活性，同时增强其稳定性，使其作为抗冻剂可以更好的维持食品原有的风味和营养价值，提高了安全性，增加冷冻食品保存期。

3.本发明提供了一种制备糖基化改良的鱼皮胶原蛋白抗冻肽的方法，该方法操作简单，易制备，原料成本低，易于实现工业化生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为糖基化反应程度对热滞活性的影响；

图2为不同反应温度下糖基化产物的接枝度；

图3为不同反应时间下糖基化产物的接枝度；

图4为不同胶原蛋白肽浓度下糖基化产物的接枝度；

图5为不同糖肽比的糖基化产物的接枝度；

图6为糖基化产物及对照样品的DSC热流曲线；

图7为糖基化产物及对照样品的傅立叶红外光谱，图中a：葡萄糖；b：胶原蛋白肽；c：胶原蛋白肽-葡萄糖混合物；d：糖基化产物；

图8为胶原蛋白肽、胶原蛋白肽-葡萄糖混合物与糖基化产物酰胺Ⅰ带的红外光谱分析(A)及二级结构组成(B)；

图9为胶原蛋白肽及其糖基化产物的总离子流图谱；

图10为胶原蛋白肽及其糖基化产物的0-3min MS图谱；

图11为胶原蛋白肽及其糖基化产物的5.5-9min MS图谱；

图12为经糖基化肽、胶原蛋白肽处理组和空白对照组的过氧化氢的残余酶活力统计结果；

图13为糖基化肽、胶原蛋白肽及空白对照组对扇贝闭壳肌冻藏过程中解冻失水率的影响；

图14为糖基化肽、胶原蛋白肽及空白对照组对扇贝闭壳肌冻藏过程中盐溶性蛋白含量的影响；

图15为糖基化肽、胶原蛋白肽及空白对照组组对扇贝闭壳肌冻藏过程中总巯基含量的影响；

图16为糖基化肽、胶原蛋白肽及空白对照组对扇贝闭壳肌冻藏过程中Ga²⁺-ATPase酶活力的影响。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

1材料与方法

1.1材料与试剂

罗非鱼皮胶原蛋白肽(型号规格：CF-500-S-02)，购自海南盛美诺生物技术有限公司；无水葡萄糖，广东光华科技股份有限公司；邻苯二甲醛(OPA)、β-巯基乙醇，上海麦克林生化科技有限公司；牛血清蛋白，北京索莱宝科技有限公司；十二烷基硫酸钠(SDS)，北京酷来博科技有限公司；乙腈，美国Supelco公司；乙腈、甲酸为质谱纯，其它试剂皆为分析纯。

1.2材料与试剂

超高效液相飞行时间质谱联用仪，美国waters公司；傅立叶红外光谱仪，德国BRUKER公司；FE28型pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；Varioskan Flash全自动酶标仪，赛默飞世尔科技有限公司；XP205型分析天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；QL-905漩涡混匀器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；DTT-A1000电子天平，福州华志科学仪器有限公司；SHJ-6AB磁力搅拌水浴锅，常州金坛良友仪器有限公司；DSC-300C差示扫描量热仪，南京大展检测仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1糖基化产物的制备

将胶原蛋白肽溶解于纯水中，配制成不同浓度(5、6、7、8、9％)的溶液，加入一定比例(糖肽比为1:2、1:1、2:1、3:1、4:1)的葡萄糖，置于25℃磁力搅拌水浴锅中搅拌20min，搅拌均匀后取部分混合液进行冷冻干燥，得到胶原蛋白肽-葡萄糖混合物。剩余混合液用0.1mol/L的氢氧化钠和盐酸溶液调节pH值为8.0，将其置于磁力搅拌水浴锅中，并设置相应的反应时间及反应温度。待反应结束后迅速冷却至室温，得到糖基化产物，冷冻干燥备用。配制同等浓度的葡萄糖溶液为葡萄糖样品组，冷冻干燥备用。

1.3.2胶原蛋白肽糖基化反应单因素实验

以接枝度(Degree of Graft,DG)为测定指标，对胶原蛋白肽进行单因素实验，设置糖基化反应的温度为40、50、60、70、80℃、反应时间为30、60、90、120、150min、胶原蛋白肽浓度为5、6、7、8、9％，糖肽比为1:2、1:1、2:1、3:1、4:1，探究以上4个因素对DG的影响。

1.3.3正交优化胶原蛋白肽糖基化反应工艺

在单因素的基础上，选择反应温度、反应时间、胶原蛋白肽浓度和糖肽比进行四因素三水平L₉(3⁴)正交试验，设计表如下，以DG为指标，通过正交试验对糖基化反应条件进行优化，确定最佳工艺条件。

表1葡萄糖糖基化反应正交试验因素水平编码表

1.3.4接枝度的测定

根据OPA法测量DG。取80mg OPA样品于2mL甲醇中，搅拌至完全溶解，加入0.1mol/L的硼砂和20％SDS各5mL，最后加入200μLβ-巯基乙醇，混合均匀后加入纯水定容至100mL得到OPA试剂，现用现配。测定DG时，取4mL OPA溶液，加入200μL糖基化产物置于漩涡仪上混合均匀，以纯水为对照组，在35℃水浴锅中避光反应2min，待反应结束后，于340nm下测定糖基化产物吸光值，并以赖氨酸作标准曲线，按照公式(1)计算DG。

式中：DG为接枝度，％；A₀为糖基化反应前游离氨基含量，mol/L；A₁为糖基化反应后游离氨基含量，mol/L。

1.3.5热滞活性的测定

采用差示扫描量热法(Differential scanning calorimetry,DSC)进行THA的评价。将待测样品溶于纯水中，配成10mg/mL的溶液，用移液枪精准移取10μL样品于坩埚中，以牛血清蛋白为对照，测定样品的THA。仪器稳定后，以10℃/min的速率从25℃降至-25℃，再升温至25℃，得到样品的熔点(T_m)和融熔晗(ΔH_m)。然后，以10℃/min的速率降温至-25℃，以3℃/min的速率缓慢升温至样品呈固液混合状态，称为保留温度(T_h)，恒温2min，以同样速率降温至-25℃，记录样品的起始结晶温度(T₀)和结晶晗(ΔH_f)，按照公式(2)和公式(3)计算THA和冰晶含量Ф。

THA/℃＝T_h-T₀ (2)

式中：THA为热滞活性，℃；T_h为保留温度，℃；T₀为起始结晶温度，℃；Ф为冰晶含量；ΔH_m为融熔晗；ΔH_f为结晶晗。

1.3.4红外光谱分析

进行傅立叶红外光谱扫描(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)。称100mg溴化钾研磨烘干，加入1mg样品混合均匀，研磨压片。在4000-400cm^-1范围内进行红外光谱扫描，分辨率设置为4cm^-1。

1.3.4质谱分析

采用串联四极杆飞行时间质谱进行结构鉴定，设置流动相A为超纯水(含0.1％甲酸)，B为乙腈(含0.1％甲酸)，色谱柱：Waters UPLC BEH C18(2.1mm×50mm,1.7μm)，柱温：30℃，流速：0.2mL/min，将样品配成0.1mg/mL的溶液，上样10μL。梯度洗脱条件：96％A→50％；50％A→0％；0％A→96％A。

1.4数据处理

每组试验重复3次取平均值，采用SPSS进行方差分析，P<0.05代表具有显著性差异，利用Origin 2021作图。

2结果与分析

2.1糖基化反应程度对热滞活性的影响

胶原蛋白肽和葡萄糖的糖基化反应程度对糖基化产物的生物活性起着至关重要的作用，通过DG值可以评估胶原蛋白肽糖基化反应程度，通过THA值可以评估糖基化产物的热滞活性。固定糖基化反应时间和糖肽比，改变其他反应条件，测定不同反应条件下得到的糖基化产物的接枝度和热滞活性，探究糖基化反应程度与热滞活性之间的关系。如图1所示，糖基化产物的接枝度与热滞活性呈正相关，随着糖基化产物DG的增大，其THA逐步增加，这证明胶原蛋白肽与葡萄糖糖基化反应程度越大，其产物的热滞活性越大。

2.2胶原蛋白肽糖基化反应单因素试验结果

2.2.1反应温度对糖基化DG的影响

温度是影响糖基化反应的关键性因素，不同反应温度对DG的影响如图2所示，由图2可以看到不同反应温度下得到的糖基化产物的DG结果分别为(27.73±0.72)、(32.87±0.88)、(36.37±0.07)、(38.7±0.32)、(32.21±1.12)％。随着反应温度从40℃上升至70℃，DG逐步增大。这是因为由于温度升高，胶原蛋白肽的结构开始变得松散，使得胶原蛋白肽内的自由氨基暴露出来，同时温度越高，肽分子和糖分子运动越快，增加了体系内自由氨基和羧基的碰撞几率。但70-80℃时，DG出现下降趋势，推测糖基化反应活性位点趋于在70℃饱和，温度持续升高，反应进入到后期，糖被降解并且氨基化合物经过一系列反应生成晚期化合物，从而DG开始下降。

2.2.2反应时间对糖基化DG的影响

胶原蛋白肽在70℃条件下，分别在不同反应时间30、60、90、120、150min进行了糖基化反应，结果如图3，DG分别为(30.95±0.61)、(34.43±0.61)、(38.70±0.32)、(35.66±0.57)、(33.45±1.07)％。随着反应时间增加，糖基化反应程度逐步增大，在90min处达到峰值，随后趋于平缓。这是因为在反应前期胶原蛋白肽经过高温水解造成肽链断裂，暴露出更多的游离氨基，从而促进了糖基化反应进程，而随着反应进行到90min之后，糖基化反应结束，进入到下一阶段，导致氨基被消耗，从而DG开始下降。

2.2.3胶原蛋白肽浓度对糖基化DG的影响

不同胶原蛋白肽浓度对DG的影响如图4所示，由图可以发现，随着胶原蛋白肽浓度不断升高，DG先增大后减小，当浓度达到8％时，DG达到峰值(46.61±0.63)％。这可能是因为相同反应温度和时间的条件下，肽浓度增高，体系内游离氨基也会增加，导致与游离羧基进行缩合反应的机会增加，所以DG增大。但由于葡萄糖含量是固定的，即羧基含量固定，胶原蛋白肽浓度达到8％时，糖基化反应已经趋于饱和，超过8％后，DG不再增加，逐步趋于平衡。

2.2.4糖肽比对糖基化DG的影响

图5显示了糖肽比对糖基化产物DG的影响，随着葡萄糖和胶原蛋白肽比例增加，DG先上升，后下降。糖肽比为3:1时，DG达到最大值(51.16±0.79)％。这是因为当体系中糖比例较低时，随着糖含量增加，糖基化反应进程被推动，DG变高。糖比例较高时，体系内溶液粘度增大，反而阻碍了游离氨基和羧基的碰撞几率，导致生成的糖基化产物减少。

2.3糖基化反应正交试验优化

为进一步探究糖基化反应最佳条件，在单因素试验结果的基础上，以DG为评价指标，以L₉(3⁴)正交表(编码表见表1)优化糖基化反应工艺条件，结果如表2所示。观察表2可知，温度、时间、浓度和糖肽比四个因素在不同程度上影响着糖基化反应进程。根据极差(R)结果显示各因素对糖基化反应的影响大小为：温度>时间>浓度>糖肽比，即反应温度对实验影响最大。正交优化得到最佳糖基化工艺参数为：A₂B₂C₃D₃，即反应温度为70℃、反应时间为90min、浓度为9％、糖肽比为4:1。此条件不在正交表中，进行验证该条件DG为(52.06±1.50)％，优于正交表中的各试验号。

表2胶原蛋白肽糖基化反应正交设计及结果

2.4糖基化反应对胶原蛋白肽热滞活性的影响

具有抗冻活性的胶原蛋白肽可以特异性的降低溶液的冰点，但不改变其熔点，这会导致溶液的冰点和熔点之间产生差值，此差值被称为THA。本研究采用DSC法探究糖基化反应前后胶原蛋白肽的THA，以牛血清蛋白作为参照，图6展示了牛血清蛋白、葡萄糖、胶原蛋白肽、胶原蛋白肽-葡萄糖混合物和糖基化产物的DSC热流曲线图，基于DSC曲线计算Th下的THA和Ф，结果如表3所示。

将冻结的样品溶液升温至Th，即保持在固液共存状态下，然后立即降温至-25℃以达到完全结晶状态。在相同的Th(0.1℃)下，由于牛血清蛋白没有抗冻活性，当温度再次下降时，放热峰立即出现，几乎没有THA(0.3℃)，而葡萄糖、胶原蛋白肽、胶原蛋白肽-葡萄糖混合物和糖基化产物的放热峰出现延迟，THA分别为1.2、1.1、2.3、0.4℃，THA在0.2–0.5℃范围内为“中度活跃”抗冻蛋白，0.6–6℃范围内为“极度活跃”抗冻蛋白，胶原蛋白肽、胶原蛋白肽-葡萄糖混合物以及糖基化产物都属于“极度活跃”抗冻肽。经过糖基化反应后，胶原蛋白肽的THA升高了1.1℃，较反应前提高了47.8％，Ф降低了29.94％。我们发现样品的THA越高，其Ф越低，即THA与Ф之间存在线性负相关关系。推测因为糖基化反应会增加溶液粘度，从而降低样品的Ф，增大THA。除此之外，糖基化反应可以引进大量羟基，而抗冻肽主要通过氢键相互作用与冰晶中的水结合达到抑制冰晶形成的作用，大量羟基存在会增加其以氢键形式与冰晶结合的能力，从而导致糖基化产物的THA增强。

表3糖基化产物及对照样品的THA和Ф

2.5红外光谱分析

FTIR光谱是检测糖基化反应的有效技术，胶原蛋白肽经过葡萄糖修饰后，会使其吸收峰位置或者强度发生变化。图7显示了葡萄糖(a)、胶原蛋白肽(b)、胶原蛋白肽-葡萄糖混合物(c)和糖基化产物(d)的FTIR光谱，1700-1600cm^-1的吸收峰(酰胺Ⅰ)主要代表了C＝O伸缩振动，1600-1500cm^-1的吸收峰(酰胺Ⅱ)主要代表了C-N伸缩振动和N-H变角振动，胶原蛋白肽经过糖基化反应后，在1662.6cm^-1的吸收峰蓝移到1631.7cm^-1，在1562.3cm^-1处的吸收峰红移到1587.3cm^-1，这证明胶原蛋白肽的二级结构发生了变化，葡萄糖通过疏水相互作用与胶原蛋白肽的C＝O、C-N和N-H基团结合。相比于胶原蛋白肽，糖基化产物在3600-3100cm^-1(O-H伸缩振动)和1200-950cm^-1(C-O伸缩振动，O-H变角振动)范围内的吸收峰位置均发生蓝移并且强度增加，这是形成糖基化产物的明显特征，胶原蛋白肽与葡萄糖进行糖基化反应后生成大量的C-OH，证明葡萄糖成功接枝到胶原蛋白肽上，糖基化产物通过共价键含有更多的-OH基团。烷烃的-CH伸缩振动频率位于2960-2850cm^-1范围内，1410-1260cm^-1附近的吸收峰代表了O-H变角振动，糖基化产物在2929.8、2823.7和1354.0cm^-1处有新峰出现，这代表胶原蛋白肽在经过糖基化反应后，可能生成了R-CH-OH结构。抗冻肽分子中的特定结构可以与冰晶中的水分子形成氢键，从而抑制冰-水之间形成的氢键相互作用。在低温环境下，游离水首先结冰，此时糖基化产物中的-OH基团与冰晶中的水分子形成稳定的氢键结构，抑制冰晶生成，增强其THA。

通过傅立叶自反褶积和高斯函数计算胶原蛋白肽和糖基化产物位于酰胺Ⅰ带的二级结构组成，结果如图8中A、B，胶原蛋白肽的二级结构主要由β-转角和β-折叠组成，分别占40.00％和60.00％，胶原蛋白肽-葡萄糖混合物与胶原蛋白肽的二级结构差异性不大，β-转角占59.15％，β-折叠占40.85％。而经过葡萄糖糖基化反应后，β-转角降低至4.82％，β-折叠增加至95.18％。这一结果表明，葡萄糖和胶原蛋白肽之间的相互作用会影响胶原蛋白肽的二级结构。推测β-折叠增加可以推进糖基化产物与冰晶结合，从而增强抗冻肽的THA。

2.6质谱分析

质谱是测定蛋白质和胶原蛋白肽相对分子质量的核心手段，通过分子量转移分析胶原蛋白肽结构变化。图9是罗非鱼皮胶原蛋白肽和糖基化产物的基峰离子色谱图(Basepeak ion chromatogram,BPI)，色谱峰在9min内全部流出，经过糖基化反应后，0-3min内胶原蛋白肽离子峰明显减弱(图10)，5.5-9min时，离子峰数量增加，且其相对丰度增强(图11)。对胶原蛋白肽以及糖基化产物进行MS图谱分析，结果如图10和图11，其结果与BPI图相对应，经过糖基化反应后的胶原蛋白肽和糖基化产物的质荷比以及峰强度发生变化，胶原蛋白肽的m/z值由300-700转移到400-800附近。这可能是由于葡萄糖与罗非鱼皮胶原蛋白肽发生了接枝反应，其质荷比发生迁移。

理论上，肽被一个葡萄糖修饰时，m/z会增加162，如果肽被两个或者三个葡萄糖修饰时，其质荷比也成倍数增加。葡萄糖与胶原蛋白肽进行糖基化反应时并非简单分子量加成，此过程中葡萄糖分子可能会携带或失去部分离子。以图11糖基化产物中响应值较高的两个峰为例，我们推测质荷比为318.30的胶原蛋白肽与一个葡萄糖结合并脱去两个O离子，生成质荷比为448.27的糖基化产物。质荷比为274.28的胶原蛋白肽与3个葡萄糖分子和两个H离子结合，生成质荷比为762.42的糖基化产物。

2.7验证糖基化肽的抗冻性能

2.7.1糖基化肽对过氧化氢酶抗冻效果

向糖基化产物粉末中加入超纯水，将其配成浓度为10～50mg/mL的溶液。使用葡聚糖凝胶色谱柱进行分子筛层析，按如下分子筛层析条件：以超纯水作为流动相平衡色谱柱，按柱床体积1～5％上样，流速：1mL/min，检测波长：220nm；收集活性峰进行冷冻干燥得到糖基化肽粉末。

将过氧化氢酶液(≥20 000unit/g)的浓度稀释至0.1％，向稀释过的过氧化氢酶液中添加3mg/mL的糖基化肽，以罗非鱼胶原蛋白肽和空白处理为对比，在240nm下测定未经冻藏的过氧化氢酶初始酶活力，每隔1min记录一次吸光值，共计时5min。以1min内A 240减少0.1为1个酶活力单位(U)。将过氧化氢酶液放入-20℃冰箱冷冻12h，然后快速解冻，通过下述公式测定过氧化氢残余酶活力，其可表示抗冻活性。

式中：Δ240为5分钟内减少的酶活力；t为5min。

结果如图12所示，糖基化肽处理组相较于胶原蛋白肽样品和空白处理组，过氧化氢残余酶活力最高，证实糖基化肽对过氧化氢酶具有显著的抗冻效果。

2.7.2糖基化肽对扇贝闭壳肌冻藏保护效果

2.7.2.1将扇贝闭壳肌清洗干净，按闭壳肌质量的2％添加糖基化肽，以罗非鱼胶原蛋白肽和空白处理为对比，将处理好的闭壳肌放入冰箱进行冻藏，对经过冻藏的闭壳肌进行冻藏保护效果评价。将解冻完全的样品用滤纸吸干表面水分进行称重，按照公式(6)测定其解冻失水率。

结果如图13。

2.7.2.2称取1～3g解冻后的扇贝闭壳肌加入10～30mL磷酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH 7.0～8.0)研磨提取5～15min后，在4℃、10 000r/min下离心10～15min，除去上清液，再次加入磷酸盐缓冲液研磨提取离心，重复三次。在离心后得到的沉淀中加入10～30mL NaCl溶液(0.6mol/L，pH 7.0～8.0)，混匀后在4℃下提取10～18h，将所得到的提取液于4℃、10000r/min下离心10～15min，所得上清液即为盐溶性蛋白溶液，按采用Folin试剂盒测定其盐溶性蛋白含量。结果如图14。

2.7.2.3取上述步骤中所提取的盐溶性蛋白溶液0.5～1mL，加入4.0～5.0mL的0.2mol/L Tris-HCl缓冲液以及0.1～0.2％二硫-2-硝基苯甲酸溶液，混匀后40℃水浴加热20～30min，在412nm处测定吸光值。按公式(7)计算总巯基含量(mol/L)。

式中：C_c为总巯基含量(mol/L)；A为样品在412nm处的吸光值；D为样品的稀释倍数；ε为摩尔消光系数13600/(mol·L^-1·cm)；c为样品盐溶性蛋白浓度。结果如图15。

2.7.2.4按照Ga²⁺-ATPase酶试剂盒测定其Ga²⁺-ATPase酶活力，并按照公式(8)进行公式计算。

式中：A为样品测定管吸光值；B为对照管吸光值；C为标准管吸光值；D为空白管吸光值。结果如图16。

结合图13-图16可知，经过糖基化的胶原蛋白肽对冷冻扇贝柱的主要抗冻指标如解冻失水率、盐溶性蛋白含量、总巯基含量、盐溶性蛋白Ca²⁺-ATPase活力均极显著地或显著地优于胶原蛋白肽处理组及空白对照组；胶原蛋白肽处理组显著优于空白对照组。这些实验结果表明，罗非鱼皮胶原蛋白肽具有一定的抗冻活性，对其进行糖基化后抗冻活性显著提升。

综合上述，本发明利用葡萄糖对罗非鱼胶原蛋白肽进行糖基化抗冻活性(热滞活性)改良，优化工艺参数下其糖基化DG达(52.06±1.50)％；糖基化后的胶原蛋白肽THA和Ф均发生显著性变化，属于“极度活跃”抗冻肽；胶原蛋白肽与葡萄糖分子结合，使其m/z变大；糖基化反应后，胶原蛋白肽中大部分β-转角转变成β-折叠，改变了胶原蛋白肽的二级结构，引入大量羟基，导致其与冰晶中水分子的结合能力加强，从而致使THA增加。抗冻试验表明糖基化显著地改良了罗非鱼皮胶原蛋白的抗冻活性。本研究结果为糖基化改良罗非鱼皮胶原蛋白肽热滞活性及基于鱼皮胶原蛋白肽开发绿色抗冻剂提供了重要的前期数据，对其它水产胶原蛋白源抗冻剂的开发亦具有重要参考意义。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种利用糖基化改良的鱼皮胶原蛋白抗冻肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

向鱼皮胶原蛋白肽溶液中加入葡萄糖，搅拌后得糖肽混合物，之后调节糖肽混合物的pH，并于70℃温度下进行搅拌反应，搅拌反应的时间为90min，反应结束后，得到所述的利用糖基化改良的鱼皮胶原蛋白抗冻肽；

所述鱼皮胶原蛋白肽溶液的质量浓度为9％；所述鱼皮胶原蛋白肽为罗非鱼皮胶原蛋白肽；所述罗非鱼皮胶原蛋白肽和葡萄糖的质量比为1：4。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述搅拌的条件为常温下搅拌10-40min；所述pH调节为7.5-8.5。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，反应结束后，进行分离纯化，得到所述的利用糖基化改良的鱼皮胶原蛋白抗冻肽。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述分离纯化为：向反应结束后的产物中加水，配制成浓度为10-50mg/mL的溶液，将其送至葡聚糖凝胶色谱柱进行分离纯化，收集活性峰进行冷冻干燥；其中，进行分离纯化的色谱条件如下：流动相为超纯水，上样量为所述葡聚糖凝胶色谱柱的柱床体积的1-5％，流速为1mL/min，检测波长为220nm。

5.一种根据权利要求1-4任一项所述的制备方法获得的鱼皮胶原蛋白抗冻肽。

6.一种根据权利要求5所述的鱼皮胶原蛋白抗冻肽在制备食品抗冻剂中的应用。

7.一种食品抗冻剂，其特征在于，包含权利要求5所述的鱼皮胶原蛋白抗冻肽。