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CN115487139B - 一种葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液及制备方法 - Google Patents

一种葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液及制备方法 Download PDF

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CN115487139B CN202211118746.3A CN202211118746A CN115487139B CN 115487139 B CN115487139 B CN 115487139B CN 202211118746 A CN202211118746 A CN 202211118746A CN 115487139 B CN115487139 B CN 115487139B
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Abstract

本发明公开了一种葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液及其制备方法，滴眼液以水为溶剂，以100mL计，包括以下原料组分：葛根素0.3‑1.5g；结冷胶0.4‑0.55g；增溶剂4‑10g；pH调节剂0.05‑0.25g；渗透压调节剂2‑4.5g；抗氧化剂0.1‑0.3g；抑菌剂0‑0.2g；所述增溶剂为聚乙烯吡咯烷酮。本发明的葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液稳定性好、刺激性小生物利用度好、眼内药物浓度高且持续时间长。

Description

一种葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液及制备方法
技术领域
本发明涉及滴眼液技术领域，尤其涉及一种葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液及制备方法。
背景技术
眼睛的生理解剖结构复杂，存在泪液、角膜、结膜、血-房水及血-视网膜等诸多生理屏障。临床上主要通过口服、局部和注射给药治疗眼部疾病，口服或注射给药需透过血眼屏障，给药剂量大，在达到有效治疗浓度的同时，容易产生毒副作用，因此，眼局部给药成为必然趋势。眼局部给药剂型包括滴眼液、软膏、凝胶、植入剂以及玻璃体注射等。凝胶或软膏剂型，存在给药不便、剂量不准、容易糊眼等缺点，病人接受性差；植入剂和玻璃体内注射均属侵入性治疗手段，患者接受度低，某些慢性疾病(如年龄相关性黄斑变性)需反复多次注射给药，存在眼内炎、玻璃体出血和视网膜脱落等诸多风险。因此，相比于其它的给药剂型和方式，滴眼液具有使用简便、患者顺应性好、安全性高等优点，是临床上最常用的治疗手段。
传统滴眼液一般是药物的水溶液剂型，入眼后由于泪液冲刷和眨眼反射，会迅速从眼表中流失，并且由于角膜等诸多生理屏障的存在，药物不易进入眼组织，生物利用度较低。现阶段急需开发眼部新剂型，以在方便给药的同时，可抵抗泪液稀释，并对角膜、巩膜具有一定的渗透性。研究表明，纳米粒、胶束、脂质体、原位凝胶等眼部新型给药系统在提高生物利用度、降低不良反应方面显示出良好的应用前景。其中原位凝胶在偏水溶性且剂量较大的药物递送方面更具优势。
原位凝胶在给药前是液体状态，在外界环境条件改变时，发生由溶液到凝胶的相变，根据响应条件的不同，可分为温度、pH和离子敏感型。该剂型可较好地控制给药剂量，眼部滞留时间长，已被广泛用于药物的眼部递送。温度敏感型原位凝胶是聚合物对温度的变化产生响应，在眼表温度(34℃)下由溶液变为凝胶，应用较多的聚合物有泊洛沙姆和纤维素衍生物。pH敏感型原位凝胶是在环境pH改变时发生胶凝反应的制剂，壳聚糖和卡波姆是常用的聚合物，但由于卡波姆溶液酸性强，所以通常和甲基纤维素等增粘剂联用，以降低使用浓度，减小眼刺激性。离子敏感型原位凝胶是某些聚合物在接触到泪液中的阳离子时发生溶液到凝胶的相变，常用的聚合物有结冷胶和海藻酸钠。其中离子型原位凝胶尤以结冷胶(Gellan Gum)为基质的发展前景最优。低浓度的结冷胶在水溶液中形成阴离子多糖，当环境离子强度增加后，如与泪液接触，则由溶液剂变为凝胶剂，泪液中阳离子增加，凝胶形成的比例也随之增加。作为眼用原位凝胶基质，结冷胶突出的特点有(1)用量低：一般0.6％以下，对眼刺激小；(2)便于给药，形成凝胶快：低浓度的结冷胶水溶液是一种低黏度的溶液，表现出非常好的流动性，点入眼内碰到微量的泪液后，泪液中的阳离子诱使结冷胶从无规线团形成链桥转变成双螺旋，接着由双螺旋聚集形成结合区从而形成凝胶。(3)舒适性增强，分布均匀：其在人工泪液中表现出剪切稀释特性，即搅拌或眼皮频繁眨动会使粘度下降，静止则粘度又会升高呈现凝胶状，有利于眼部给药以及在眼球表面的分布。
药用结冷胶最初是由美国CP Kelco公司20世纪80年代开发的一种微生物食用胶，是一种线性的阴离子杂多糖，由葡萄糖、葡糖醛酸、鼠李糖以2∶1∶1的摩尔比连接成四元重复单元，形成聚合物主链，相对分子质量约0.5×106，结构式如式(1)所示，已用于多种药物的研究。
葛根素是一种异黄酮类化合物，来源于豆科植物野葛的根，在水中微溶，分子式为C21H20O9，相对分子量为416.38，结构式如式(2)所示。药理学研究表明，葛根素具有抗氧化、抗炎、抗糖、扩张冠状血管、改善微循环、保护视神经细胞等作用，可用于治疗青光眼、视网膜血管阻塞、糖尿病性视网膜病变等眼部疾病。葛根素可抑制睫状体上皮细胞的β受体，减少房水生成，降低眼压，促进血流循环，保护视神经，用于视网膜动静脉栓塞、眼底缺血性疾病的治疗。有研究在通过全身注射给药方式用葛根素治疗青光眼后，利用多普勒血流显像技术，观察眼动脉、睫状后短动脉及视网膜中央动脉的血流情况，结果表明，上述各动脉的血流速度均显著增加，血管阻力明显降低，缓解了青光眼造成的缺血性视神经损害和视网膜血管的栓塞。糖尿病性视网膜病变患者的视网膜会高表达白介素因子1、肿瘤坏死因子α等炎症因子，导致炎症反应，损伤视网膜，同时丙二醛的水平增加，超氧化物歧化酶活性降低，表现出氧化应激反应，研究表明，葛根素可显著降低炎症因子及丙二醛水平，提高超氧化物歧化酶水平，从而减轻视网膜屏障损伤，延缓糖尿病性视网膜病变的发生。
目前葛根素制剂有注射液和滴眼液，由于葛根素在水中微溶，注射液中需加入高浓度丙二醇助溶，长期静脉注射容易造成不良反应；而普通溶液剂眼部给药后易流失，难以渗透进入眼内，生物利用度低。因此，需要设计新的给药系统以提高药物生物利用度，以应用于眼部疾病的治疗。有研究将葛根素溶解在聚酰胺-胺型聚合物的溶液中，得两者的混合溶液，兔眼前房药动学表明，相比于葛根素溶液，该混合溶液的AUC(0-∞)提高了2倍。以甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸甲酯和聚乙烯吡咯烷酮为基质合成空白隐形眼镜，然后浸泡在0.802mg·mL-1葛根素的磷酸盐缓冲液中，制备成载药制剂，结果表明该隐形眼镜的角膜前滞留时间是葛根素溶液的6.04倍，但生物利用度与1％的葛根素溶液无明显差异，这也说明该隐形眼镜能以更低剂量达到同样的眼内药物浓度。
原位凝胶制剂方面，有研究以21％的泊洛沙姆407和5％的泊洛沙姆188为基质制备了葛根素温度敏感型原位凝胶，与葛根素溶液相比，该制剂的眼部滞留时间延长了7.50倍；还有研究以0.1％的卡波姆940和0.4％的羟丙基甲基纤维素为基质制备葛根素的pH敏感型原位凝胶，药动学试验结果表明，凝胶组的AUC(0-24h)是溶液组的2.17倍，显著提高了生物利用度。此外有专利以泊洛沙姆407和泊洛沙姆188制备葛根素温度敏感型原位凝胶，与静注葛根素注射液相比，原位凝胶制剂眼部给药后显著增强视网膜血流强度，同时视网膜和脉络膜内的药物浓度也显著提高；也有专利以卡波姆为基质制备葛根素的pH敏感型原位凝胶，相比于葛根素溶液，原位凝胶制剂不仅具有更强的降眼压作用，而且显著改善微循环，降低血浆粘度，保证眼部血流供应。
与温度敏感原位凝胶相比，离子敏感原位凝胶所需聚合物浓度较低；与pH敏感的原位凝胶相比，离子敏感原位凝胶可将处方pH调至眼部最适pH，故对眼部刺激性最小。例如以结冷胶为基质制备的苄达赖氨酸离子型原位凝胶，药动学研究表明，相比市售滴眼液，苄达赖氨酸离子型原位凝胶的Cmax与AUC(0-t)分别提高了2.38和2.20倍；还有研究表明以结冷胶为基质制备的布林佐胺离子型原位凝胶对兔眼无明显刺激，相比于布林佐胺溶液，离子型原位凝胶制剂显著增强眼压降低的强度和持续时间；而且目前唯一一款获美国FDA批准上市的原位凝胶滴眼液—马来酸噻吗洛尔离子型原位凝胶，就是以结冷胶为基质的制剂。
但目前未有关于葛根素离子型原位凝胶的文献或专利报道。
发明内容
针对现有技术中葛根素滴眼液眼部生物利用度较差，需要频繁使用，患者依从性差的问题，本发明提供了一种生物利用度好、眼内药物浓度高且持续时间长的葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液及其制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液，以水为溶剂，以100mL计，包括以下原料组分：
所述增溶剂为聚乙烯吡咯烷酮。
眼表应用的眼用制剂停留时间有限，要考虑眼用制剂的释放速度不能太慢，制备的眼用制剂要有快速释放和持续释放的双重特点，以产生更好的技术效果。
本发明的葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液中，结冷胶浓度为0.4-0.55g/mL，增溶剂特定为4-10g/mL的聚乙烯吡咯烷酮，葛根素浓度为0.3-1.5g/mL，特定浓度的结冷胶、增溶剂和葛根素三者共同作用，使得本发明的葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液具有快速释放和持续释放的双重特点，让药物较快释放，通过眼角膜、巩膜吸收入眼内中起效，又能长时间维持眼内的较高浓度，保证长时间的眼内效果。
优选的，所述pH调节剂为氨基丁三醇。
关于pH调节剂，一般报道是用缓冲盐体系，比如现有葛根素普通溶液滴眼液是含钠盐的缓冲液体系，而本发明因为要采用结冷胶制成眼用原位凝胶，离子型的原位凝胶遇到钠、钾、镁、钙等离子会由液体转变成凝胶，所以要避免采用，本发明以氨基丁三醇等作为pH调节剂为佳。
正常泪液的pH为7.4左右，并具有一定的缓冲容量，滴眼液滴入眼后被泪液稀释，泪液的缓冲作用能中和眼用溶液，所以能减轻明显的不适感。但滴眼液过于偏酸时，可凝固眼黏膜的蛋白质；过于偏碱性，则可使眼黏膜的上皮细胞硬化或膨胀。因此，滴眼剂pH过高或过低对眼都会有刺激性。由pH不当而引起的刺激性，会增加泪液的分泌，导致药物迅速流失，甚至损伤角膜。滴眼液的pH一般可在pH 5.5～7.8范围内。葛根素溶液本身为酸性溶液，但制剂pH调整到6.0以下时稳定性试验表明杂质会增多。
优选的，所述的葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液的pH值为6.2-7.4；渗透压为260-320mOsmol/kg。
适宜的pH值和渗透压，可以减少滴眼液对眼的刺激，从而减少泪液的分泌，让结冷胶在眼表长时间滞留。选择0.4-0.55g/mL的结冷胶的好处就是既能快速起效，又能防止泪液冲刷导致药物流失而浓度下降。
优选的，所述的渗透压调节剂为甘露醇、甘油和1,2-丙二醇中的至少一种；所述的抗氧化剂为维生素C、焦亚硫酸钠中的至少一种；所述的抑菌剂为苯扎氯铵、苯扎溴铵和对羟基苯甲酸酯中的至少一种。
进一步优选的，所述的渗透压调节剂为甘露醇；所述的抗氧化剂为维生素C。
抑菌剂，也可以称为防腐剂，用于在滴眼液包装打开后起到避免细菌滋生，使滴眼液变质的作用。由于一些病人可能会对防腐剂敏感，引起眼部不适，所以也可以去掉防腐剂成分，改成单日剂量的包装，开封后尽快使用即可。
一种优选的技术方案如下：
一种葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液，以水为溶剂，以100mL计，包括以下原料组分：
所述增溶剂为聚乙烯吡咯烷酮；所述pH调节剂为氨基丁三醇；所述的渗透压调节剂为甘露醇；所述的抗氧化剂为维生素C。
本发明还提供了所述的葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液的制备方法，包括以下步骤：
(1)向配方量的结冷胶中加入部分水，搅拌溶胀；
(2)将配方量的增溶剂与葛根素用部分水溶解，搅拌均匀；
(3)将其他辅料用剩余部分水溶解，加入步骤(2)的溶液中；或将其他辅料直接加入步骤(2)的溶液中溶解，搅拌均匀；
(4)将步骤(3)得到的溶液加入到步骤(1)溶胀后的结冷胶中，或将步骤(1)中溶胀的结冷胶加入步骤(3)得到的溶液中，补足余量的水，搅拌至溶液澄清透明，即得所述的葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液。
优选的，步骤(1)中加入的水量为总水量的50～60％；温度为90±5℃；搅拌溶胀时间为15～20min。
优选的，步骤(4)中，搅拌至溶液澄清透明后，保持溶液40℃以上过滤除菌。
过滤除菌可以采用0.1μm～0.22μm孔径的滤膜进行过滤除菌。
由于结冷胶遇较高温度的水才能比较快地溶散，所以在制备时先将结冷胶用较高的温度制备成浓度高的溶液，同时此时由于不含有主药物葛根素，高温度对药物的影响相对较小；然后将主药与其它成分溶解混合，加入到结冷胶溶液中。最后需保持40℃以上过滤除菌，因为此温度以上时，滴眼液溶液的粘度相对来说比25℃室温左右的要小很多(结冷胶溶液温度越高粘度越小，如在10rpm转速时，35℃的粘度为8cP左右，25℃的粘度为120cP左右)，40℃以上的粘度可在4cP以下，粘度小可以顺利地通过微孔滤膜过滤。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液通过将葛根素药物制成结冷胶离子型原位凝胶滴眼液，能较快释放药物，并有快速渗透和持续渗透的双重特点，相比于现有技术葛根素普通溶液滴眼液，能够在较长时间内使房水内药物浓度保持在较高水平，最高药物浓度和累积药物量均大大提高，增加生物利用度，可以减少药物使用频次，提高患者依从性。
附图说明
图1为实施例1中不同离子强度对处方2粘度的影响检测结果图(34℃,10rpm，n＝4)。
图2为实施例1中不同离子强度对处方3粘度的影响检测结果图(34℃,10rpm，n＝4)。
图3为实施例1中不同离子强度对处方4粘度的影响检测结果图(34℃,10rpm，n＝4)。
图4为实施例1中不同离子强度对处方5粘度的影响检测结果图(34℃,10rpm，n＝4)。
图5为实施例1中不同离子强度对处方6粘度的影响检测结果图(34℃,10rpm，n＝4)。
图6为实施例1中处方3在与人工泪液体积配比为40∶21时，不同剪切速率对粘度影响检测结果图(34℃，n＝4)。
图7为实施例2制得的不同葛根素制剂在兔离体巩膜的累积渗透率-时间曲线图(n＝3,)。
图8为实施例3制得的不同葛根素制剂体外累积释放率-时间曲线图(n＝4,)。
图9为实施例3制得的不同葛根素制剂在兔离体巩膜的累积渗透率-时间曲线图(n＝4,)。
图10为实施例5得的葛根素原位凝胶与溶液滴眼液在兔离体角膜的体外累积渗透率-时间曲线图(n＝4,)。
图11为实施例6制得的葛根素原位凝胶与溶液滴眼液在兔眼房水内药物浓度-时间曲线图(n＝8,注：**p<0.01,*p<0.05,原位凝胶vs溶液)。
具体实施方式
对处方中的主要辅料及其合理范围，主要通过以葛根素1％的情况下，进行了摸索，首先要解决的是葛根素水中溶解度小的问题，其次是释放和渗透速率的问题。
葛根素在水中微溶，经测定知其在如表1所示的溶解介质中的饱和溶解度不高，所以需要添加增溶剂，以满足制剂浓度的需求。
表1.葛根素在不同介质中的溶解度(34℃)
以制备1％浓度的葛根素为例，5％的羟丙基-β-环糊精或聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP-K30)都可溶解1％的葛根素，即制剂若要达到预期含量，可加入高分子材料羟丙基-β-环糊精、PVP-K30对药物进行包裹来增加溶解度。有文献报道在处方中加入一定量的吐温80也可增加溶解度。通过查询美国FDA网和药智网提供的眼用辅料限度，获悉羟丙基-γ-环糊精在眼用制剂中的使用限度为1.5％(羟丙基-β-环糊精可以参照此限度)，PVP-K30为15％，吐温为4％。鉴于眼部长期给药，辅料浓度超限可能会对眼睛产生刺激，影响药物的安全性和有效性，所以采用PVP-K30或吐温80作为增溶剂来进一步试验。
吐温80是一种表面活性剂，理论上不仅可以增溶，而且可以促进药物的渗透，但实际上对于葛根素，兔离体巩膜渗透试验表明，吐温80并未起到促进渗透的作用，所以不予添加。见实施例2。
表1中表明34℃时葛根素在5％PVP-K30的饱和溶解度略高于1％，由于制剂需长期存放，为避免储存过程中药物析出，针对葛根素1％浓度时的PVP-K30浓度可为6％，此浓度时制备的葛根素溶液冰箱4℃冷藏一年也未见有药物析出。对于低于1％浓度或高于1％浓度的葛根素，可以适当降低或增加PVP-K30的使用量。
眼表应用的眼用制剂总体来说停留时间有限，所以要考虑制剂的释放不能太慢，并对巩膜和角膜有快速渗透和持续渗透的双重特点，以产生更好的技术效果。也就是说本发明重在让药物能较快释放，迅速通过眼角膜、巩膜渗透吸收入眼内起效，又能长时间维持眼内的较高浓度，保证长时间的眼内效果。
选择0.4-0.55％结冷胶的好处就是既能快速起效，又能防止泪液冲刷导致药物流失而浓度下降。配合适宜的pH值和渗透压，减少对眼的刺激，就能减少泪液的分泌，让结冷胶在眼表长时间滞留。
虽然结冷胶可以增加制剂在眼表的滞留时间，但是由于人的眨眼频率较高，泪液也在不断分泌，会加速制剂的流失，所以药物应尽快从制剂中释放，并比较快地透过巩膜、角膜进入房水。以制剂的体外释放速率和离体巩膜渗透速率为考察指标，考察了不同浓度的结冷胶、PVP-K30对葛根素的体外释放和渗透情况，研究表明，随PVP-K30和结冷胶量的增加，葛根素的体外释放，在起始时间段(0.5-4h)的量会有所下降，但10h累积释放量趋于一致。在兔离体巩膜渗透上的表现与体外释放不完全一致，PVP-K30含量增加(10％)加上结冷胶，对葛根素的渗透就有较大影响。也就是说PVP-K30和结冷胶的浓度变化，都会对葛根素的兔离体巩膜渗透造成一定的影响，需将两者控制在合适的范围内，PVP-K30在10％之内，结冷胶在0.55％之内，才能起到较快释放，并且具有快速和足够量的渗透能力。具体可见实施例3。
经稳定性研究发现，葛根素对温度较为敏感，光照也会对其产生影响。一般要求制剂的稳定性至少能维持两年，为此要解决葛根素制剂生产过程中遇到的因各种原因引起氧化所致pH不断下降、色泽变黄变深等问题。我们以制剂的外观、pH、渗透压、含量和有关物质为指标，进行了稳定性考察，限度参照中国药典2020版二部中的葛根素注射液标准(供试品溶液色谱图中如有杂质峰，杂质I与杂质II的峰面积均不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍(1.5％)，其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍(0.5％)，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的3倍(3.0％))。在前期稳定性试验中，未在制剂中加入抗氧化剂，试验结果表明，在4500±500lx光照条件下，制剂中葛根素的含量略有降低，其他单杂含量增高，杂质Ⅰ、Ⅱ和其它指标变化不大；在60℃高温条件下，制剂含量明显降低，有关物质明显增加，其他单杂超过0.5％的限度，pH明显降低，制剂溶液由浅棕色逐渐加深；在温度40±2℃、湿度25％±5％的加速试验条件下，2个月时，其他单杂超过限度(0.5％)，3个月时，其他单杂达1.0％，制剂含量及pH均明显降低，但是总杂及杂质Ⅰ、Ⅱ均未超过限度，6个月时，总杂也超过3.0％；在温度为25±2℃、相对湿度为40％±5％的条件下放置6个月，制剂的含量明显降低，有关物质增高，其他单杂超限；而同批次样品在4℃冰箱中放置3个月，各项指标均未有明显变化。在上述试验过程中，发现温度对葛根素结冷胶离子型原位凝胶的稳定性影响较大，并且随杂质的增多，制剂的pH也随之降低，推测在储存过程中，产生某种酸性杂质。加入焦亚硫酸钠或维生素C等抗氧剂，可以抑制药物氧化，故通过试验考察pH以及抗氧剂对制剂稳定性的影响。试验结果表明，维生素C具有更好的抗氧化效果，对于1％的葛根素原位凝胶制剂，加入0.2％的维生素C可以显著抑制杂质的产生，加速3个月后，制剂的含量、有关物质、pH等略有变化，但相比于未添加抗氧化剂的处方，稳定性明显加强，各指标都在限度之内。此外还发现，当pH为6.0以下时，制剂会产生更多的杂质，所以最终处方的pH调节至6.2-7.4之间。中间条件试验中(30℃)，6个月时，制剂的各项指标均在合格范围内，而40℃加速6个月时，其他单杂超限。见实施例9。
综上所述，葛根素结冷胶离子型原位凝胶制剂对温度较为敏感，光照也会对其产生影响，所以长期放置应保存在阴凉避光处。
实施例1
按下表2配制不同处方，可筛选不同结冷胶和聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP-K30)的量。
表2.不同辅料配比的胶凝能力
注：+：胶凝，但晃动易散；++：迅速胶凝，晃动不易散。
制备方法：先取结冷胶加入90℃左右纯化水中，制成重量百分比含量0.8％的结冷胶溶液，搅拌溶胀完全。按表中数值将不同量的PVP-K30和葛根素(终浓度1％)用适量水溶解，然后取上述0.8％结冷胶溶液适量加入搅拌均匀，甘露醇调等渗，氨基丁三醇调节pH至7.0左右，去离子水补足体积至20mL，混合均匀，即得。
胶凝能力测定：取2mL人工泪液(34℃，氯化钠水溶液6.7g·L-1、碳酸氢钠水溶液2.0g·L-1、二水合氯化钙水溶液0.8g·L-1)置于具塞试管中，水浴34℃保温，将100μL原位凝胶加入试管中，观察并记录凝胶形成及溶解的情况。
另外，采用Brookfield DV-2T粘度计可以测定不同处方的粘度随泪液配比(离子强度)和转速(剪切速率)的变化情况。由于给药后眼部会不断分泌泪液，故将原位凝胶与不同比例的人工泪液混合均匀，加入样品杯中，平衡5min后开始测定其在温度为34℃、转速为10rpm下、粘度随时间变化的情况，每个样品分别测定4次。以处方2～6为例，其粘度随离子强度变化的情况见图1～5，在未加入人工泪液前，原位凝胶的粘度为8cP左右，加入不同配比的人工泪液后，粘度会随离子强度的变化而起很大的变化。这是一个随泪液量的增多而升高或降低的过程，体现了离子原位凝胶的特性。处方在与人工泪液的体积配比为40∶21时总体粘度最高。剪切速率对处方粘度的影响也很高，以处方3为例，其对处方与人工泪液的体积配比为40∶21时的粘度变化见图6，剪切速率越高，粘度显示越小，这验证了结冷胶在人工泪液中能表现出剪切稀释的特性，即搅拌或眼皮频繁眨动会使粘度下降，静止则粘度又会升高呈现凝胶状，有利于眼部给药以及在眼球表面的分布。
结冷胶浓度在0.30％及以下时，胶凝能力较弱，0.60％以上时，室温下比较粘稠，又因结冷胶需要与PVP-K30混合，PVP-K30是一种高分子聚合物，本身也具有一定的粘度，在综合考虑处方自身粘度不宜过高的基础上，结冷胶最佳浓度范围为0.40％～0.50％。泪液中离子强度对各葛根素结冷胶制剂处方的粘度影响结果见图1至5，由图可以看出，随人工泪液所占比例增加，各处方的粘度呈现先增加后降低的状态，在结冷胶制剂与人工泪液比例为40:21时粘度最大；结冷胶浓度为0.45％和0.50％时，比浓度为0.40％时具备更强的抗泪液稀释能力。
这几种比例的结冷胶与PVP-K30配比实验结果可作为选择结冷胶重量百分比含量的依据，结冷胶优选可为0.4-0.5％，PVP-K30优选可为6-8％。
实施例2
吐温80是一种表面活性剂，不仅可以增溶，而且有研究表明可以促进药物的渗透。按下表3配制处方，比较吐温80不同含量时的兔离体巩膜渗透情况。
表3.含不同浓度吐温80的处方
制备方法：先取结冷胶加入适量90℃左右纯化水中，制成重量百分比含量0.8％的结冷胶溶液，搅拌溶胀完全；另取处方量的PVP-K30和葛根素(终浓度1％)，用适量纯化水溶解，搅拌均匀，然后加入适量上述结冷胶溶液，搅匀，加甘露醇调等渗、氨基丁三醇调pH，再加纯化水至20mL。搅拌均匀，即得。
兔离体巩膜渗透研究：取健康无眼疾的新西兰大白兔，处死取眼球，去除表面多余组织，分离出巩膜，生理盐水洗净备用。试验采用自制的弧形口Franz渗透池，包括接受池和供给池。设置接受池外管路的水浴循环温度为34℃，排尽外管路内气泡。向接受池中加入磁力搅拌子和约3mL的释放介质林格氏溶液，将巩膜绷紧于渗透池池口，使巩膜外表面面向供给池，弹簧夹固定，排尽接受池内的气泡。葛根素制剂与人工泪液按40:7的比例混合均匀，移液枪吸取94μL加入供给池，分别在1、2、4、6、8、10h时，从接受池取样100μL，然后补加等温等体积的空白释放介质。样品进HPLC测定，色谱条件如下，色谱柱：Diamonsil C18柱(4.6mm×150mm,5μm)；流动相：乙腈-1％冰乙酸(15:85)；检测波长：249nm；流速：1.0mL·min-1；柱温：30℃；进样量：20μL。以累积渗透率(％)与时间t做图。
结果见图7所示。结果表明，1％吐温和4％吐温体外渗透没有显著性差异。增加PVP-K30和结冷胶的量有降低渗透率的趋势，在此基础上加上吐温，并没有促进渗透的作用，反而含吐温高的制剂渗透更低一些。吐温80并未起到促进渗透的作用，鉴于眼用制剂辅料不宜过多，因此只以PVP-K30作为增溶剂，制剂不含吐温80为宜。
实施例3
按下表4配制处方，比较含不同浓度PVP-K30、结冷胶、羟丙基-β-环糊精的处方，在体外释放和兔离体巩膜上的渗透情况。
表4.不同浓度PVP-K30、结冷胶、羟丙基-β-环糊精的处方
制备方法：取结冷胶加入适量90℃左右纯化水中，搅拌溶胀完全；另取处方量的PVP-K30和葛根素(终浓度1％)，用纯化水溶解，搅拌均匀，然后取适量上述结冷胶溶液加入搅匀，甘露醇调等渗、氨基丁三醇调pH，再加纯化水至20mL。搅拌均匀，即得。
体外释放实验：分别精密移取0.5mL葛根素制剂，于分子截留量为14KD的透析袋中，将透析袋口扎紧后置于西林瓶中。加入20mL人工泪液作为扩散介质，并将西林瓶置于恒温摇床中，温度控制在34℃，震荡频率100rpm。每隔一定时间(0.5、1、2、4、6、8、10h)，取样1mL，并及时补加等温等体积人工泪眼。样品经离心后，采用高效液相法测定药物含量。
兔离体巩膜渗透研究：做法同前例描述。
结果见图8所示。结果表明，随PVP-K30和结冷胶量的增加，葛根素的体外释放，在起始时间段(0.5-4h)的量会有所下降，但10h累积释放量趋于一致。结冷胶浓度提高至0.6％、PVP-K30提高到13％时(处方8)，10h累积释放量(释放总量)会明显下降(P<0.01)。羟丙基-β-环糊精8％和PVP-K30 13％时(处方9)，起始时间段的释放量虽然下降比较多，但10h累积释放量并没有明显下降(P>0.05)。
在兔离体巩膜上的渗透结果与体外释放不完全一致，PVP-K30含量增加(10％)、结冷胶0.45％(处方7)对葛根素的渗透就有较大影响，10h累积渗透量为处方3(PVP-K30 6％、结冷胶0.45％)的71％。PVP-K30含量增加至13％、结冷胶增加至0.6％(处方8)时更为明显，10h累积渗透量仅为处方3的42％。而0.6％结冷胶加上8％羟丙基-β-环糊精(处方9)会使葛根素的巩膜渗透大大下降，10h累积渗透量仅为处方3的17％。结果见图9。也就是说羟丙基-β-环糊精不适合做为葛根素的增溶剂，包裹性太强，在巩膜上的渗透不良。而PVP-K30和结冷胶的浓度变化，都会对葛根素的兔离体巩膜渗透造成一定的影响，其中PVP-K30的影响更强，例如图9中可见，处方2和3都为6％PVP-K30，处方4和5都为8％PVP-K30，分别与不含结冷胶6％或8％PVP-K30葛根素溶液的渗透相近。所以需将两者控制在合适的范围内(PVP-K30为10％以内为宜，结冷胶为0.55％以内为宜)，才能起到较快释放，并且有快速和足够量的渗透。
实施例4
葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液的配方如下：
制备方法：取结冷胶加入适量90℃左右纯化水中，搅拌溶胀完全；另取处方量的PVP-K30用适量纯化水溶解，加入葛根素、甘油、氨基丁三醇、对羟基苯甲酸酯，搅拌溶解，加入上述结冷胶的溶液中，再加纯化水至100mL，0.22μm微孔滤膜过滤，分装即得，葛根素重量百分比含量为0.3％，结冷胶最终重量百分比浓度0.4％。pH值为6.2，渗透压为261mOsmol/kg。
实施例5
葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液的配方如下：
制备方法：取处方量结冷胶加入90℃左右60mL的纯化水中，搅拌溶胀完全；另取葛根素、PVP-K30、甘露醇、氨基丁三醇、苯扎氯铵置小瓶中，取约30mL纯化水搅拌使溶解。再将结冷胶溶液加入此溶液中，搅拌均匀，余量水荡洗加入定容，40℃以上0.22μm微孔滤膜过滤，分装即得。葛根素重量百分比含量为1.0％，结冷胶最终重量百分比浓度0.45％。pH值为7.2，渗透压为300mOsmol/kg。
兔离体角膜渗透研究：以谷胱甘肽-林格氏溶液为渗透介质，可保护离体角膜防止其过度水化。其他实验操作同前兔离体巩膜的描述。
结果见图10所示，结果表明，自制结冷胶组与溶液组(含6％PVP-K30)在6h的角膜累积渗透率分别为37％和39％，两者之间无显著性差异(P>0.05)，渗透符合零级动力学特征。结合实施例3可以看出巩膜的渗透性要优于角膜，这是因为角膜在组织学上由外向内分为5层，而巩膜只有3层，而且角膜结构较为复杂，细胞排列结构致密；在试验过程中，角膜进一步水化也会增加角膜的厚度，使药物跨膜困难，渗透率低于巩膜。
由于体外渗透实验在上下垂直式的供给池中进行，溶液制剂也不会流失，从而无法体现原位凝胶可延长眼表滞留时间，提高眼内药物浓度的特点。所以需进一步进行眼内的药动学研究，见实施例6。
实施例6
葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液的配方如下：
制备方法：取处方量结冷胶加入90℃左右50mL的纯化水中，搅拌溶胀完全；另取葛根素、PVP-K30置于小烧杯中加入30mL约50℃左右纯化水搅拌溶解，再加入氨基丁三醇、甘露醇搅拌均匀，然后将此溶液加入上述结冷胶溶液中，取约10mL水分2-3次荡洗小烧杯再次加入。混合溶液加纯化水至100mL，50-60℃0.22μm微孔滤膜过滤，分装即得。葛根素百分比含量为1％，结冷胶的最终质量百分比浓度为0.45％。pH值为6.9，渗透压为286mOsmol/kg。
兔眼房水内药动学实验：16只2.5-3.0kg的健康新西兰兔随机分为两组，一组为葛根素结冷胶原位凝胶组，另一组为葛根素溶液组，每组各8只。取新西兰兔，耳缘静脉注射25％乌拉坦(1g·kg-1)麻醉，裸露眼周边皮肤，固定头部，置于恒温垫上(37℃)。首先散瞳(复方托吡卡胺滴眼液)，眼睑器撑开眼睑，将25G注射引导针穿过前房，然后从引导针的斜面端孔插入微透析探针的出液端，一直到出液端从针头的另一端穿出，移去引导针，调整微透析探针位置，使透析膜窗口完全浸没在前房内，用医用粘合剂封闭穿线洞。然后微透析泵推注pH7.4林格氏缓冲盐溶液(流速1.0μL·min-1)灌流微透析探针，平衡1h，使眼的状态得到充分恢复。待眼球状态恢复后，用医用棉签将眼球表面的泪液轻轻擦干，在单侧眼睛内滴入40μL制剂(葛根素约0.4mg)，另一侧眼睛作为空白。在给药后10h内，每隔30min收集一次微透析样品。
液相条件：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(3.0×150mm，3.5μm)；流动相：0.1％甲酸水(A)：乙腈(B)，梯度洗脱：0.01～0.10min，85％A；0.10～1.20min，85％～75％A；1.20～2.80min，75％～5％A；2.80～4.50min，5％A；4.50～4.51min，5％～85％A；4.51～5.80min，85％A；流速：0.6mL·min-1；进样量：5.0μL；柱温：35℃。
质谱条件：以金雀异黄酮为内标，采用多重反应监测模式下的负离子电喷雾离子源，参数设定如下：离子喷雾电压：-4500V；离子源温度：600℃；碰撞气压力：8psi；气帘气压力：20psi；雾化气压力：55psi；辅助气压力：60psi；葛根素的监测离子对分别为415.1→267.1；射入电压：-10V；碰撞电压：-45V；碰撞室射出电压：-10V；内标的监测离子对：269.2→133.1；射入电压：-7V；碰撞电压：-42V；碰撞室射出电压：-10V。
将测得的药物浓度按事先测得的探针回收率回代计算房水真实药物浓度，然后用DAS2.0药动学软件处理计算药动学参数，两组数据进行对比分析。房水内药物浓度-时间曲线结果见图11，见表5(n＝8)。结果显示，葛根素溶液滴眼液房水内浓度一直在比较低的水平，浓度-时间曲线下面积(AUC0-t)为3.13mg/L·min，最高浓度(Cmax)为0.77mg/L，而本发明实施例6制备的原位凝胶能在较长时间内使房水药物浓度保持于较高的药物浓度水平，AUC为13.78mg/L·min，Cmax为2.90mg/L。原位凝胶的AUC是市售滴眼液的4.40倍，Cmax是市售滴眼液的3.77倍，两者有极显著性差异(p<0.01)。药动学曲线图上，各时间点房水内的药物浓度，两制剂在第一和最后时间点没有差异(p>0.05)，在第二和最后倒数第二时间点有显著性差异(p<0.05)，其他时间点两制剂均有极显著性差异(p<0.01)。研究表明葛根素结冷胶离子型原位凝胶显著提高了房水中的药物浓度，具有较好的眼部药物递送能力，显著提高了眼内生物利用度，显示出良好的临床应用前景。
表5.葛根素结冷胶原位凝胶与溶液滴眼液在兔眼内的药动学参数比较(n＝8)
注：*原位凝胶VS溶液P<0.05；**原位凝胶VS溶液P<0.01。
实施例7
葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液的配方如下：
制备方法：取处方量结冷胶加入约60mL纯化水中，升温至90-95℃，搅拌至澄清；另取葛根素、PVP-K30、1,2-丙二醇、氨基丁三醇、焦亚硫酸钠，加适量水搅拌均匀，加入上述结冷胶溶液中。再用纯化水10mL分两次荡洗药液瓶加入混合液中。混合液加纯化水至100mL，保持温度50-60℃，0.22μm微孔滤膜过滤，分装即得，葛根素百分比含量为1.2％，结冷胶的最终质量百分比浓度为0.50％。pH值为6.7，渗透压为291mOsmol/kg。
实施例8
葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液的配方如下：
制备方法：取处方量结冷胶加入约60mL纯化水中，升温至90℃左右，搅拌摇匀；另取其他辅料与葛根素，加20mL约50℃左右纯化水，搅拌使溶解，加入上述结冷胶溶液中。再用少量纯化水分两次荡洗药液瓶加入混合液中。混合液加纯化水至100mL，40℃以上过0.22μm微孔滤膜即得，葛根素百分比含量为1.5％，结冷胶的最终质量百分比浓度为0.55％。pH值为7.4，渗透压为320mOsmol/kg。
家兔眼刺激性试验：取检疫合格、健康的新西兰兔4只，雌雄各半。采用同体左右侧自身对照，每兔左眼给予供试品，右眼给予对照。使动物的头右倾，让受试的左眼向斜上方，轻提一侧眼睛的下眼睑，将供试品(实施例8制备得到的葛根素眼用结冷胶原位凝胶剂)1滴(约50μL)直接滴于结膜囊内，轻合眼睑10s。右侧眼睛用相同方法滴加0.9％NaCl水溶液作为对照。连续给药14天。于每天第一次给药前以及最后一次给药后1、2、4、24、48和72小时用检眼镜进行眼刺激反应检查并评分。眼刺激性试验表明无刺激性。
实施例9
葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液的配方如下：
制备方法：取结冷胶加入90℃左右500-600mL的纯化水中，搅拌溶胀完全；另取葛根素、PVP-K30用350mL纯化水溶解，加入甘露醇、氨基丁三醇、苯扎氯铵，搅拌均匀。再将适量高浓度结冷胶溶液加入此溶液中，补足余量的纯化水，搅拌均匀，40℃以上0.22μm微孔滤膜过滤，分装即得。葛根素重量百分比含量为1.0％，结冷胶最终重量百分比浓度0.45％。pH值为7.0，渗透压为294mOsmol/kg。
稳定性试验：将制剂分装入浅蓝色高密度聚酯滴眼液瓶密封(每支5mL)后作为样品，做初步影响因素试验和加速试验，
1.影响因素试验
(1)高温试验：将样品分别置于40℃、60℃的恒温箱中放置15天。并在第0、5、10、15天取样，考察制剂各项指标。
(2)强光照射试验：将样品置于光照培养箱中，于照度4500lx±500lx的条件下放置15天，于第5、10、15天取样，考察样品的各项指标。
2.加速试验：将样品置于温度40±2℃、相对湿度为25±5％条件下的恒温培养箱中6个月，分别在1、2、3、6个月时取样，考察样品的各项指标。
试验结果：
影响因素试验：
(1)高温试验：结果见表6。
结果表明，在60℃高温下放置15天后，制剂的含量明显降低，杂质Ⅰ、Ⅱ和总杂含量均在限度范围内，但有其他单个杂质的含量超过限度，pH下降明显，渗透压略有变化，但在人眼承受范围内，表明温度对制剂的稳定具有较为明显的影响，制剂应避免高温环境，于阴凉处保存。
(2)强光照试验：结果见表7。
结果表明，在4500±500lx条件下放置15d，制剂的pH、含量、有关物质均有所变化，虽未超出限度，但单杂含量明显增加，若长期暴露在强光下，单杂可能会超限，因此制剂应该避光保存。
加速与中间试验条件的结果：
结果见表8。结果显示，与初始制剂相比，40℃加速3个月后，制剂的渗透压无明显变化，pH、含量略有降低，杂质含量有所增加，加速6个月后，其他单杂超过0.5％的限度。与40℃相比，30℃条件下加速3个月后，制剂的pH、含量降低和杂质增加的程度均比40℃加速条件下的小，渗透压无明显变化，并且加速6个月后，各指标变化不大，制剂保持稳定。制剂的外观均由浅棕色逐渐加深，变为颜色较深些的棕色，也可能与维生素C氧化变色有关。虽杂质含量均有所增加，pH均降低，但是仍在限度范围内。
表6. 60℃高温条件下葛根素结冷胶原位凝胶的稳定性
表7.光照条件下葛根素结冷胶原位凝胶的稳定性
表8.葛根素结冷胶原位凝胶加速试验与中间试验的结果
以上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液，其特征在于，以水为溶剂，以100 mL计，包括以下原料组分：
葛根素 0.3-1.5 g；
结冷胶 0.4-0.55 g；
增溶剂 4-10 g；
pH调节剂 0.05-0.25 g；
渗透压调节剂 2-4.5 g；
抗氧化剂 0.1-0.3 g；
抑菌剂 0-0.2 g；
所述增溶剂为聚乙烯吡咯烷酮K30；所述pH调节剂为氨基丁三醇；所述的葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液的pH值为6.2-7.4。
2.根据权利要求1所述的葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液，其特征在于，渗透压为260-320 mOsmol/kg。
3.根据权利要求1所述的葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液，其特征在于，所述的渗透压调节剂为甘露醇、甘油和1,2-丙二醇中的至少一种；所述的抗氧化剂为维生素C、焦亚硫酸钠中的至少一种；所述的抑菌剂为苯扎氯铵、苯扎溴铵和对羟基苯甲酸酯中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液，其特征在于，所述的渗透压调节剂为甘露醇；所述的抗氧化剂为维生素C。
5.根据权利要求1所述的葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液，其特征在于，以水为溶剂，以100 mL计，包括以下原料组分：
葛根素 0.3-1.5 g；
结冷胶 0.4-0.55 g；
增溶剂 4-10 g；
pH调节剂 0.05-0.25 g；
渗透压调节剂 2-4.5 g；
抗氧化剂 0.1-0.3 g；
抑菌剂 0-0.2 g；
所述增溶剂为聚乙烯吡咯烷酮K30；所述pH调节剂为氨基丁三醇；所述的渗透压调节剂为甘露醇；所述的抗氧化剂为维生素C。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）向配方量的结冷胶中加入部分水，搅拌溶胀；
（2）将配方量的增溶剂与葛根素用部分水溶解，搅拌均匀；
（3）将其他辅料用剩余部分水溶解，加入步骤（2）的溶液中；或将其他辅料直接加入步骤（2）的溶液中溶解，搅拌均匀；
（4）将步骤（3）得到的溶液加入到步骤（1）溶胀后的结冷胶中，或将步骤（1）中溶胀的结冷胶加入步骤（3）得到的溶液中，补足余量的水，搅拌至溶液澄清透明，即得所述的葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液。
7.根据权利要求6所述的葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液的制备方法，其特征在于，步骤（1）中加入的水量为总水量的50~60%；温度为90±5℃；搅拌溶胀时间为15~20min。
8.根据权利要求6所述的葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，搅拌至溶液澄清透明后，保持溶液40℃以上过滤除菌。
9.根据权利要求8所述的葛根素结冷胶离子型原位凝胶滴眼液的制备方法，其特征在于，采用0.1 μm~0.22 μm孔径的滤膜进行过滤除菌。
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