CN115461470A - 用于从组织中分离核和细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
从急速冷冻的生物组织中提取且分离固定的生物颗粒例如固定的细胞和/或固定的核的方法产生显著改善量的连接产物，以及靶向单一细胞RNA序列数据质量和后续RNA模板化连接灵敏度的增加。该方法通过减少与常规方法相关的细胞降解和RNA泄漏量，在提取和分离期间保存生物颗粒，例如来自生物组织样品的细胞和/或核的完整性。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年2月28日提交的美国临时申请号62/983,278的优先权利益，所述美国临时申请的内容以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及用于从生物组织中分离固定的生物颗粒，包括固定的细胞和/或核的方法，其中所述生物颗粒，包括细胞和/或核，能够成功地用于某些单一生物颗粒(例如，单一细胞或单一核)基因组学、表观基因组学、转录组学和蛋白质组学测定中。
背景技术
从组织中回收细胞和或核是活跃的研究领域，其中所述细胞可以支持各种生物反应或生物化学反应。在一些例子中，现有方法可以从组织中解离细胞并随后使解离的细胞固定。然而，所得到的细胞和/或核在用于基因组、表观基因组、转录组和蛋白质组分析的单一细胞测定中可能并不产生良好的结果。例如通过在解离/固定步骤之前在例如液氮中使用生物组织的快速(“闪速”或“急速”)冷冻，改善常规细胞回收方法的尝试，并未产生令人满意的结果。
用于从组织产生单一细胞和/或核的方法将有利于单一细胞分析领域的研究、开发和诊断，其中细胞/组织、其基因组、分析物等等可以维持一段时间，然后可以用于单一细胞工作流中，以产生成功的结果(例如，与用新鲜细胞获得的结果相当)。
发明内容
此处公开的是用于从组织中获得单一生物颗粒(例如，单一细胞和/或单一核)的方法，其中单一生物颗粒(例如，细胞/核)能够支持某些生物反应/生物化学反应。一般地，使用该方法从组织中获得的生物颗粒，包括细胞和/或核是固定的。一般地，所公开的方法可能不包括用于逆转固定过程的特定步骤(例如，使用解交联剂、解除固定剂或可逆固定试剂)。如通过某些单一细胞基因组、表观基因组、转录组和/或蛋白质组测定的结果所评价的，实现了从所公开的过程获得高质量生物颗粒，例如细胞/核。在一些例子中，所公开的方法产生具有能够支持某些酶促反应的分析物(例如，mRNA、蛋白质)和/或基因组的固定的单一生物颗粒(例如，单一细胞和/或单一核)。测定可以是单一生物颗粒(例如，单一细胞或单一核)测定，包括基于分隔的测定、流式细胞术测定等等。在一些例子中，回收的单一生物颗粒(例如，单一细胞/核)可能具有目的核酸分子(例如，mRNA分子)，其可以用于核酸反应，包括使用核酸探针的模板化核酸连接反应中。在一个实施例中，模板化核酸连接是RNA模板化连接反应(即，连接两个DNA探针同时与RNA模板杂交)。在一些例子中，回收的单一生物颗粒(例如，单一细胞/核)可能具有蛋白质或其它抗原，其可以通过各种方法包括用抗体的特异性染色进行染色。
在一些例子中，公开的是用于组织样品的核酸分析的方法，其包括(a)使组织样品与固定试剂接触；(b)在固定试剂的存在下，将组织样品分成组织区段，以允许固定试剂灌注到组织区段内；(c)使组织区段解离，以提供多个生物颗粒，其中所述生物颗粒包含多个样品核酸分子；并且(d)使用所述多个样品核酸分子和多个核酸条形码分子生成多个加条形码的核酸分子。在一些例子中，在步骤(d)之前，该方法还包括使多个核酸探针与多个生物颗粒的多个样品核酸分子杂交。
在一些例子中，公开的是从生物组织中提取且分离固定的细胞和/或核的方法，其包括获得固定的组织样品；并且使固定的组织样品解离，以获得细胞和/或核。在一些例子中，该方法还包括形成细胞和/或核的悬浮液并过滤悬浮液。在一些例子中，该方法还包括使用细胞和/或核执行单一细胞测定。
在一些例子中，公开的是在生物组织样品中的核糖核酸(RNA)分析的方法，其包括使生物组织样品与有机固定试剂接触；在有机固定试剂的存在下，将生物组织样品分成组织区段，以允许有机固定试剂灌注到组织区段内；使组织区段解离，以提供多个单一细胞和/或单一核；并且对多个单一细胞和/或单一核执行RNA分析。
还公开的是通过本文公开的任何方法获得的细胞和/或核的组合物。
以引用的方式并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都以引用的方式并入本文，其程度与每个个别出版物、专利或专利申请特异性地且个别地指示以引用的方式并入相同。在以引用方式并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的公开内容相矛盾的范围内，说明书预期取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。
下述美国专利和美国公开专利申请各自以引用的方式整体并入本申请内：
于2017年5月9日颁发，且名称为“Partitioning And Processing Of AnalytesAnd Other Species”的美国专利号9,644,204(序列号14/175,935)；
于2018年5月22日颁发，且名称为“Instrument Systems For Integrated SampleProcessing”的美国专利号9,975,122(序列号14/934,044)；
于2018年8月21日颁发，且名称为“Capsule Array Devices And Methods OfUse”的美国专利号10,053,723(序列号15/719,459)；和
于2018年9月11日颁发，且名称为“Fluidic Devices,Systems,And Methods ForEncapsulating And Partitioning Reagents,And Applications Of Same”的美国专利号10,071,377(序列号15/687,856)。
以引用的方式并入的其它参考文献可以在申请各处列出。
附图说明
在并入说明书中且构成说明书的部分的附图中，示出了本发明的实施例。应了解，附图中所示的实施例显示用于说明的目的而不是用于限制。应了解，可以制备附图中所示的实施例的改变、修改和偏离，而不背离如下文公开的本发明的精神和范围。
图1是用于从组织产生单个固定细胞的示例方法中的步骤的示意图。
图2显示了用于分隔个别生物颗粒的微流体通道结构的例子。
图3显示了用于将携加条形码的珠递送至液滴的微流体通道结构的例子。
图4显示了用于共分隔生物颗粒和试剂的微流体通道结构的例子。
图5显示了用于将珠受控分隔到离散液滴内的微流体通道结构的例子。
图6显示了用于增加液滴生成流通量的微流体通道结构的例子。
图7显示了用于增加液滴生成流通量的微流体通道结构的另一个例子。
图8是在使用RNA模板化连接方案的进一步加工之后，关于根据本发明产生的固定的解离的组织细胞和细胞核的图像强度相对于碱基对大小的生物分析仪图。
图9是单独的3000细胞装载电泳图的复制品，其中对于以230bp的连接产物突出显示了bp大小。
图10是在使用RNA模板化连接方案的进一步加工之后，关于根据常规方法产生的固定的解离的细胞核的图像强度相对于碱基对大小的生物分析仪图。
图11是在使用RNA模板化连接方案的进一步加工之后，关于根据本发明产生的固定的解离的组织细胞和固定的核的UMI计数相对于条形码的条形码等级图。
图12是在使用可从10X Genomics获得的Single Cell 3’Regent Kit，版本3的进一步加工之后，关于根据常规方法产生的解离的细胞核的UMI计数相对于条形码的条形码等级图。
图13示意性地示出了示例微孔阵列。
图14示意性地示出了用于加工核酸分子的示例微孔阵列工作流。
图15描绘了携加条形码的珠的例子。
图16示意性地示出了标记试剂的例子。
图17A和图17B示意性地描绘了用于加工核酸的示例工作流。
具体实施方式
本文公开的方法设计为从组织样品中产生解离的生物颗粒(例如，细胞和/或核)，使得生物颗粒(例如，细胞/核)具有足够的质量，以在某些单一细胞工作流中产生良好的结果，所述单一细胞工作流包括用于基因组、表观基因组、转录组和蛋白质组分析的工作流。在一些例子中，如图1中所示，可以获得组织样品并闪速冷冻。可以对冷冻的组织样品进行固定。在一些例子中，可以无需闪速冷冻步骤对新鲜组织进行固定。在固定之前和/或在固定期间，组织的细胞可以从组织中解离或部分解离。在一些例子中，可以机械地执行解离/部分解离。在一些例子中，固定可以通过淬灭进行终止。在一些例子中，可以使用酶，伴随或不伴随机械解离，执行将来自组织的生物颗粒(例如，细胞或核)解离成单一生物颗粒(例如，单一细胞和/或核)。先前已固定的生物颗粒(例如，细胞或核)可能在该解离步骤处进入步骤序列。在一些例子中，可以过滤得自解离步骤的解离的生物颗粒(例如，细胞/细胞团块)，以获得单一生物颗粒(例如，细胞和/或核)。
在该方法的一些实施例中，该方法中使用的组织样品可以是新鲜的或固定的。在一些实施例中，组织可以是冷冻的(例如，急速冷冻或闪速冷冻的)或不是冷冻的(例如，新鲜的)。在一些实施例中，进入固定步骤的组织可以解离成生物颗粒例如细胞和/或核，部分解离(例如，成为细胞和/或核)，或并不解离成单一生物颗粒(例如，单一细胞和/或核)。在一些实施例中，可以在固定步骤之前、期间和/或之后执行组织样品的解离(例如，成为单一生物颗粒，例如单一细胞或核)。在一些实施例中，组织样品的解离可以在使固定淬灭的步骤期间执行或不执行。在一些实施例中，组织样品的解离可以机械地执行。在一些实施例中，组织样品的解离可以酶促执行。在一些实施例中，组织样品的机械解离和酶促解离可以同时执行。一般地，酶促解离在固定步骤期间或在并未淬灭的固定剂的存在下不起作用。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例，而不预期是限制性的。为了解释本公开内容的目的，将应用术语的下述描述，并且适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，且反之亦然。
在本文中，“扩增产物”指得自另一种分子的复制或拷贝的分子。一般地，拷贝或复制的分子是核酸分子，具体是DNA或RNA分子。在一些例子中，复制或拷贝的分子可以用作所产生分子的模板。在一些例子中，由寡核苷酸的捕获结构域捕获的分析物可以用作模板以产生扩增产物。在一些例子中，由寡核苷酸的捕获结构域捕获的mRNA可以用作模板以产生cDNA扩增产物。各种酶(例如逆转录酶)可以用于该过程。cDNA扩增产物转而又可以充当扩增的模板，其也可以称为扩增产物。各种酶(例如，Taq聚合酶)可以用于该过程。
在本文中，“分析物”指其化学组成成分待鉴定和/或测量的物质。一般地，这种应用指来自细胞和/或由细胞产生的分析物。来自细胞或由细胞产生的任何或所有分子或物质在本文中可以被称为分析物。化学上，细胞分析物可以包括蛋白质、多肽、肽、糖、多糖、脂质、核酸和其它生物分子。
在本文中，“条形码”一般指标记或标识符，其传达或能够传达关于分析物的信息。条形码可以是分析物的部分。条形码可以独立于分析物。条形码可以是附着到分析物(例如，核酸分子)的标签，或者是标签加上分析物的内源特性(例如，分析物的大小或端部序列)的组合。条形码可以具有各种不同的形式。例如，条形码可以包括多核苷酸条形码；随机核酸和/或氨基酸序列；以及合成的核酸和/或氨基酸序列。条形码可以以可逆或不可逆的方式附着到分析物。条形码可以在样品测序之前、期间和/或之后加入例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)样品的片段中。条形码可以允许各个测序读数的鉴定和/或定量。在一些例子中，条形码可以是由一种或多种寡核苷酸编码、与之相连接或结合的核苷酸序列。在一些例子中，特定的条形码可以与例如支持物上的条形码定位相关联。用于传达定位信息的条形码可以称为空间条形码。
在本文中，“条形码分子”或在一些例子中的“加条形码的核酸分子”一般指这样的分子或核酸分子，其得自例如用核酸序列(例如，与由核酸条形码分子涵盖的核酸引物序列互补的核酸序列)对核酸条形码分子的加工。核酸序列可以是靶向序列(例如，由引物序列靶向)或非靶向序列。例如，在本文所述的方法、系统和试剂盒中，细胞的核酸分子(例如，信使RNA(mRNA)分子)与核酸条形码分子(例如，含有条形码序列以及与mRNA分子的核酸序列互补的核酸引物序列的核酸条形码分子)的杂交和逆转录，得到具有对应于mRNA的核酸序列的序列和条形码序列(或其反向互补体)的加条形码的核酸分子。加条形码的核酸分子可以是核酸产物，例如核酸连接产物。连接产物可以包含使用RNA模板连接的两种探针(例如，DNA或含DNA的探针)。连接产物的加条形码可以通过作为一种或两种探针的部分的条形码序列，或者通过条形码序列对连接产物的后续附加而发生。加条形码的核酸分子可以充当模板，例如模板多核苷酸，其可以进行进一步加工(例如，扩增)且测序，以获得靶核酸序列。例如，在本文所述的方法和系统中，加条形码的核酸分子可以进行进一步加工(例如，扩增)且测序，以获得mRNA的核酸序列以及空间条形码的序列，从而确定mRNA的定位位置连同其身份。在本文中，陈述为具有“通用条形码序列”的分子指用相同的条形码序列标记或鉴定的分子。
在本文中，“碱基配对”一般指其中两种互补核酸在不同链的互补核苷酸之间已形成氢键的情形。两条此类核酸链可以被称为彼此杂交。
在本文中，“分支的”一般指在组装内的寡核苷酸捕获探针的特定排列，其增加了空间中的捕获结构域密度。
本文中，“结合”一般指物质之间稳定的物理相互作用。细胞可以与其它细胞结合。细胞可以与分子结合。分子可以与细胞结合。分子可以与其它分子结合。在一些例子中，物质的结合可能是特异性的。示例特异性结合事件包括配体的细胞受体结合和抗原的抗体结合。在一些例子中，与彼此非特异性结合或彼此并不结合的两种物质相比，彼此特异性结合的两种物质可以对于彼此具有更高的亲和力。在某些条件下，可能发生物质的特异性结合，同时可能不发生物质的非特异性结合。“结合”指促使物质结合。
如本文使用的，术语“生物颗粒”一般指源自生物样品的离散生物系统。生物颗粒可以是大分子、小分子、病毒、细胞、细胞衍生物、细胞核、细胞器、细胞组成成分等等。细胞器的例子包括但不限于核、内质网、核糖体、高尔基体、内质网、叶绿体、胞吞小泡、胞泌小泡、液泡和溶酶体。生物颗粒可以含有多重个别组分，例如大分子、小分子、病毒、细胞、细胞衍生物、细胞核、细胞器和细胞组成成分，包括这些组分和其它组分的不同组合。生物颗粒可以是或可以包括DNA、RNA、细胞器、蛋白质或其任何组合。这些组分可能是细胞外的。在一些例子中，生物颗粒可以被称为组分组合的团块或聚集体。在一些情况下，生物颗粒可以包括细胞的一种或多种组成成分，但可以不包括细胞的其它组成成分。此类组成成分的例子包括核或细胞器。细胞可以是活细胞或存活细胞。活细胞可以能够被培养，例如，当封装在凝胶或聚合物基质中时被培养，或者当包含凝胶或聚合物基质时被培养。生物颗粒可以包括单一细胞和/或来自细胞的单一核。
在本文中，“能够”意指具有做某事的能力或品质。
在本文中，“捕获”一般指第一物质与第二物质相互作用和/或结合的能力，其中例如，第二物质是其它物质群体的部分。可以捕获分析物。在一些例子中，捕获指通过靶核酸与捕获探针的杂交，和/或使用例如聚合酶链反应(PCR)，靶核酸分子或与其杂交的核酸探针(例如，RNA或与RNA杂交的探针)的扩增，和/或使用例如逆转录反应，靶核酸分子或与其杂交的捕获探针的核酸延伸，来鉴定靶核酸分子(例如，RNA)。
在本文中，“捕获探针”指含有捕获结构域的分子(例如，寡核苷酸)。
在本文中，“捕获结构域”意指能够结合或捕获物质的分子的部分。分析物捕获结构域可能能够捕获分析物，其可以包括蛋白质、多肽、肽、糖、多糖、脂质、核酸和其它生物分子。在一些例子中，分析物捕获结构域可以是能够与含有互补核苷酸序列的分析物杂交的核苷酸序列。在本文中，“核苷酸捕获序列”指能够捕获(例如，通过杂交)第二核苷酸序列的第一核苷酸序列。在一些例子中，分析物捕获结构域可以含有修饰的核苷酸。
在本文中，“细胞类型”是用于描述具有至少一个共同特性的细胞群或细胞群体的表征。在一些例子中，来自组织的细胞可以具有相同的细胞类型。在一些例子中，不同的细胞类型可以在组织中。
在本文中，在一个核酸序列与另一个序列互补的上下文中，“互补”指单链核酸的两条链沿着其长度在两条链之间形成氢键的能力。一般使用另一条核酸链作为模板来制备核酸的互补链。能够与第二核苷酸序列杂交的第一核苷酸可以被说成第二核苷酸序列的互补体。与第二核酸序列互补的第一核酸序列也可以被称为第二核酸序列的反向互补体，例如第一核酸序列或其反向互补体。
在本文中，“配置为”一般指可以执行某一功能的系统的组分。
在本文中，“接触”指分开的物质或物体的物理接触。“接触”指促使分开的物质彼此物理上接触。
在本文中，“交联”意指将两种或更多种分开的物质彼此连接或附着。连接或附着是由于交联的形成。在一些例子中，交联指在分子或不同分子中的两个或更多个原子之间的化学键形成。
在本文中，“解离”一般指这样的过程，由此彼此结合(例如，如在组织样品中彼此接触)的多重生物颗粒(例如，细胞和/或核)被分开，使得它们彼此不接触，或者至少不像一些组织中配置的在团块中保持在一起。在一些例子中，如在光学显微镜中显现的，解离的细胞和/或核可能在溶液中以及在盖玻片下显示为单一细胞和/或核。解离可以使用化学、酶促和/或机械方法。例如，最初可以将组织切碎或切割成更小的组织区段，并且可以将组织区段解离成生物颗粒(例如，细胞或核)。
在本文中，“双链体”指双链核酸。在本文中，双链体一般在互补杂交核苷酸序列之间形成。双链(或双链的)核酸可以包含具有相同或不同长度的两条链。双链体可以是完全或部分双链的核酸双链体。
在本文中，“酶”一般指能够催化生物化学反应的分子。在本文中，酶可以用于催化可以引起或促成细胞解离的生物化学反应。此类酶可以被称为解离酶。
在本文中，“提取物”一般用于从组织中提取生物颗粒(例如，细胞和/或核)的上下文中。在这个意义上，提取物可能具有类似于使生物颗粒(例如，细胞和/或核)解离的含义。
在本文中，“新鲜的”在新鲜组织的上下文中一般意指组织是最近从生物中获得的，一般在任何加工步骤如闪速冷冻或固定之前。
在本文中，“固定”指在生物分子之间或在分子内的共价键例如交联形成。例如，固定组织样品或生物颗粒(例如，细胞和核)的过程称为“固定”。引起固定的试剂一般被称为“固定剂”或“固定试剂”。“固定的生物颗粒”(例如，固定的细胞或核)或“固定的组织”指在足以允许或导致形成生物样品中的生物分子之间的分子内和分子间交联的条件下，已与固定剂接触的生物颗粒(例如，细胞或核)或组织。固定可以被逆转，并且逆转固定的过程可以被称为“解除固定”或“解交联”。解除固定或解交联指破坏或逆转由固定剂形成的生物分子中的共价键形成。固定剂或固定试剂的非限制性例子包括甲醇、低聚甲醛、福尔马林和丙酮。其它固定试剂可以包括醇、酮、醛、交联剂、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、辛二亚氨酸二甲基酯(DMS)、福尔马林、己二亚氨酸二甲基酯(DMA)、二硫代-双(-丙酸琥珀酰亚胺酯)(DSP)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、乙二醇双(琥珀酸琥珀酰亚胺酯)(EGS)、双咪唑羧酸酯化合物及其组合。
本文中，“杂交”指单链核酸分子的核苷酸序列与具有互补核苷酸序列的核酸分子形成复合物。一般地，复合物通过分开的核酸分子中的互补核苷酸碱基之间的氢键合形成。
在本文中，“杂交核苷酸序列”指例如寡核苷酸内的核苷酸序列，其能够与来自组织样品的细胞上或其内的靶核酸分子(例如，细胞RNA)中的互补核苷酸序列杂交。当杂交核苷酸序列具有这样的长度，使得它与靶核酸分子(例如，细胞RNA或RNA家族)所特有的完全或部分互补的核苷酸序列杂交时，杂交核苷酸序列可以被说成与相同的靶核酸分子(例如，相同的RNA)杂交。
在本文中，“固定化”意指限制或防止移动。
在本文中，“文库”指具有核苷酸序列的分子集合，所述核苷酸序列一般代表来自靶核酸的分子中存在的核苷酸序列(例如，包含相同的核苷酸序列或互补的核苷酸序列)。一般地，文库由其构建的分子充当用于合成构成文库的分子集合的模板。“文库”可以是靶核酸的扩增产物，或可以由其产生。在本文中，文库可以由在阵列上捕获的mRNA分析物或其拷贝的扩增来创建。因此，文库可以源自捕获的靶核酸。
在本文中，“分离的”意指将第一物质与一种或多种其它物质分开，使得第一物质是纯的、部分纯的或处于游离状态。
在本文中，“寡核苷酸”意指核苷酸(在一些例子中2'-脱氧核糖核苷酸)的线型聚合物。寡核苷酸是单链的。寡核苷酸可以具有各种长度。寡核苷酸可以包括如本领域已知的修饰的核苷酸。
在本文中，“分隔”一般指可能适合容纳一种或多种物种或者进行一种或多种反应或过程的空间或体积。分隔可以是物理区室，例如液滴或孔(例如微孔)。分隔可以将空间或体积与另一个空间或体积分离。液滴可以是与第一相不混溶的第二相(例如油)中的第一相(例如水相)。液滴可以是不与第一相相分离的第二相中的第一相，例如水相中的胶囊或脂质体。
在本文中，“灌注”意指促使或促进液体流入物质内。
在本文中，“可渗透的”指允许某些材料通过其的事物。“可渗透的”可以用于描述生物颗粒，例如细胞或核，其中生物颗粒中的分析物可以离开生物颗粒。“渗透化”是为了促使例如生物颗粒(例如细胞)释放其分析物而采取的行动。在一些例子中，例如通过应用蛋白酶或能够干扰允许分析物从生物颗粒中扩散出来的膜的其它酶，通过影响生物颗粒膜(例如，细胞膜或核膜)的完整性来完成生物颗粒的渗透化。
在本文中，“引物”意指对于DNA合成提供起点的单链核酸序列。一般地，引物具有与模板互补的核苷酸序列，并且具有可用的3'-羟基，转录酶或聚合酶可以向其添加与模板中的相应核苷酸互补的另外核苷酸，以在3'到5'方向上合成核酸链。
在本文中，“粉碎”指机械组织解离。
在本文中，“淬灭”指停止或终止固定试剂对组织中的生物颗粒(例如，细胞)的活性。
在本文中，“核酸探针”指能够与核酸模板分子例如样品核酸模板分子杂交的核酸寡核苷酸或分子。核酸探针可以包含RNA或DNA。核酸探针可以包含核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。在一个实施例中，核酸探针包含末端核糖核苷酸。
在本文中，“样品”或“生物样品”一般指细胞的集合或组织。一般地，组织含有多重生物颗粒(例如，细胞和核)，经常是可以执行相同或相似功能的相似生物颗粒(例如，细胞)。样品可以是细胞样品。样品可以是细胞系或细胞培养样品。样品可以包括一种或多种细胞，或者一种或多种细胞聚集体或簇。生物样品可以源自另一种样品。样品可以是组织样品，例如活组织检查、核心活组织检查、针抽吸物或细针抽吸物。动物中的示例组织类型可以包括结缔组织、上皮组织、脑组织、脂肪组织、肌肉组织和神经组织。样品可以是流体样品，例如血液样品、尿样品或唾液样品。样品可以是皮肤样品。样品可以是颊拭子。样品可以是血浆或血清样品。样品可以是血液样品。在一些例子中，样品可以包含任何数目的大分子，例如细胞大分子或细胞分析物。本公开内容并不限于任何特定类型的组织。
在本文中，“单一生物颗粒”例如单一细胞或单一核，一般指不以聚集形式或团块存在的生物颗粒。单一生物颗粒例如细胞和/或核可能是使组织样品解离的结果。
在本文中，“模板”指充当用于合成另一种互补单链核酸的“模板”的一种单链核酸。例如，RNA可以充当用于使用逆转录酶合成互补DNA链的模板。单链DNA可以充当最经常通过DNA聚合酶用于合成互补DNA链的模板。DNA或RNA分子也可以充当关于使用核酸探针的模板化连接反应的模板。
在本文中，“解除固定”或“解交联”指破坏或逆转由固定剂形成的生物分子中的共价键形成。“解除固定剂”(或“解交联剂”)指促使解除固定的物质。执行这些功能的试剂可以称为解除固定剂或解交联剂。在一些例子中，当使用可逆固定试剂时，以及当由这些试剂引起的固定被逆转时，可能发生解除固定或解交联。
在本文中，“解除固定”指细胞、多个细胞、组织样品或任何其它生物样品的加工状况，其特征在于先前的固定状态，随后为先前的固定状态的逆转。例如，解除固定的细胞也可以被称为“先前固定的”细胞。在一个实施例中，解除固定的细胞的特征在于细胞或样品的生物分子中断裂或逆转的共价键，其中此类共价键先前通过用固定试剂(例如低聚甲醛或PFA)处理而形成。
一般地，本文公开的方法不使用解交联剂或解除固定剂，并且不涉及使细胞、核或生物颗粒解交联或解除固定。
在本文中，“唯一分子标识符”或“UMI”一般指由捕获探针捕获的特定分析物、或如本文所述的特定连接产物的标识符。在一个实施例中，可以与目的样品核酸分子杂交的一对核酸探针中的核酸探针可以包含UMI。可替代地，如本文所述的核酸复合物可以包含例如通过在连接反应之后附加的UMI。另外，UMI可以经由使用分隔特异性核酸条形码分子(例如，包含固定的生物颗粒的分隔和包含核酸条形码分子的支持物，其可以包含UMI)附加到分隔内的核酸复合物。
组织
一般地，组织指结构中的细胞组构，其中所述结构一般充当生物(例如哺乳动物)中的单元并且可以执行特定的功能。在一些例子中，组织中的细胞以团块配置，并且可能不是彼此分离的。本公开内容描述了从组织中获得单一生物颗粒(例如，细胞或核)的方法，其可以用于各种单一生物颗粒(例如，单一细胞/核)工作流中。在一些例子中，血细胞(例如，淋巴细胞)可以被视为组织。然而，血细胞如淋巴细胞一般在血液中彼此分离。本文公开的方法可以用于加工这些细胞以获得细胞和/或核，尽管在使用这些类型的组织时解离步骤可能不是必需的。
一般地，任何类型的组织都可以用于本文所述的方法中。可以在所公开的方法中使用的组织的例子包括但不限于结缔组织、上皮组织、肌肉组织和神经组织。在一些例子中，组织来自哺乳动物。
可以使用含有任何类型的细胞的组织。例如，来自腹部、膀胱、脑、食道、心脏、肠、肾、肝、肺、淋巴结、嗅球、卵巢、胰腺、皮肤、脾、胃、睾丸等等的组织。组织可以是正常组织或肿瘤组织(例如，恶性的)。该列表并不意味着是限制性的。尽管在公开中使用的条件对于不同类型的组织可能是不同的，但这些方法可以应用于任何组织。
在所公开的方法中使用的组织可以处于各种状态。在一些例子中，在所公开的方法中使用的组织可以是新鲜的、冷冻的或固定的。
组织冷冻
在一些例子中，在所公开的方法中使用的组织可以是冷冻的。在一些例子中，在所公开的方法中使用的组织可以是冷冻的新鲜组织。
可以使用用于冷冻组织的不同方法。在一些例子中，使用的方法可以是快速方法(例如，“闪速冷冻”或“急速冷冻”)。在一些例子中，可以使用这些方法将组织降低到低于约-70℃的温度。在一些例子中，快速冷冻可以使用超冷介质。在一些例子中，超冷介质可以是液氮。在一些例子中，这种类型的冷冻可以部分地通过防止冰晶形成来保存组织完整性，所述冰晶将影响组织形态。在一些例子中，超冷介质可以是干冰。
组织固定
组织可以使用一种或多种固定试剂进行固定。在一些例子中，固定的组织是新鲜组织。在一些例子中，固定的组织可以是冷冻组织。在一些例子中，固定的组织可能不是解离的。在一些例子中，固定的组织可以是解离或部分解离的(例如，切碎的、切割的)。在一些例子中，可以使用已快速冷冻并且可能切割或切碎成小片(例如，足够小以装入用于固定的管或容器内)的组织。在一些例子中，组织可以在固定之前或期间是解离或部分解离的(例如，切割的、切碎的)。在一些例子中，固定的组织可能不是解离的。
冷冻的生物组织可以使用固定试剂进行固定，所述固定试剂适当地是有机固定试剂。合适的有机固定试剂包括但不限于醇、酮、醛(例如戊二醛)、交联剂、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、辛二亚氨酸二甲基酯(DMS)、福尔马林、己二亚氨酸二甲基酯(DMA)、二硫代-双(-丙酸琥珀酰亚胺酯)(DSP)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、乙二醇双(琥珀酸琥珀酰亚胺酯)(EGS)、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺)酯(BS3)及其组合。特别合适的固定试剂是基于甲醛的固定试剂，例如福尔马林，其为甲醛和水的混合物。福尔马林可以包括按重量计约1％至约15％的甲醛和按重量计约85％至约99％的水、合适的按重量计约2％至约8％的甲醛和按重量计约92％至约98％的水、或按重量计约4％的甲醛和按重量计约96％的水。在一些例子中，组织可以在4％低聚甲醛中进行固定。
本领域普通技术人员将了解其它合适的固定试剂(例如，国际PCT申请号PCT/US2020/066705，其以引用的方式整体并入本文)。
固定试剂可以是冷却的，并且可以处于约零至约100℃、适当地约零至约50℃、或约1至约50℃的温度。可以通过将固定试剂置于冰床上使其冷却，以使其温度维持尽可能接近0℃。冷冻的生物组织可以使用任何合适的技术用固定试剂进行处理，适当地通过将其浸入固定试剂中一段时间。取决于生物组织样品的类型和大小，处理时间范围可以为约5分钟至约60分钟、适当地约10分钟至约30分钟、或约15分钟至约25分钟、或约20分钟。在一些例子中，处理时间可以是过夜。在固定期间，急速冷冻组织将解冻，但由于固定试剂的低温环境，将适当地保持在低温下。
在一些例子中，固定试剂的类型/特性、固定试剂的量/浓度、它在其下使用的温度、它使用的持续时间等等可以凭经验确定或滴定。这些参数和其它参数可能需要改变，以对于不同组织、不同生物或在其下执行实验的不同天数获得最佳结果。在一些例子中，不充分的固定(例如，固定试剂太少、温度太低、持续时间太短)可能例如并不稳定/保存组织的细胞/细胞器/分析物。在一些例子中，过度固定(例如，固定试剂太多、温度太高、持续时间太长)可能导致从该方法获得的单一生物颗粒(例如，细胞/核)在单一生物颗粒(例如，单一细胞或单一核)工作流或其中使用生物颗粒(例如，细胞或核)的测定中并不得到良好的结果。一般地，在这些工作流/测定中获得的数据质量可能是固定过程的程度的良好量度。
一般地，本文公开的方法不使用解交联剂或解除固定剂，并且不涉及使细胞、核或生物颗粒解交联或解除固定。
在固定期间，在生物组织样品浸没在固定溶液中的同时，它可以被周期性地切割成连续更小的区段，以促进生物组织样品通过有机固定试剂的灌注和固定。例如，组织样品可以具有约0.25cm至约1.5cm的初始长度、宽度和/或直径，或者可以最初切割成具有此类合适尺寸的区段。在第一个周期性间隔后，可以将组织样品或区段切成更小的区段，并且更小的区段可以保持浸入固定试剂中。这个过程可以在第二个周期性间隔后、在第三个周期性间隔后、在第四个周期性间隔后等等进行重复。周期性间隔范围可以为约1至约10分钟、或约2至约8分钟、或约4至约6分钟。例如，周期性间隔的总和可以等于整个固定时间，并且范围可以为约5至约60分钟、或约10至约30分钟、或约15至约25分钟。例如，所得到的固定的组织区段可以具有在小于1mm至约10mm范围内的长度、宽度和/或直径。
然而，在一些例子中，组织在固定期间并不被切割成更小的区段。在一些例子中，这可以在固定之前执行。在一些例子中，这可以在固定之后执行。
使固定淬灭
一旦生物组织区段已充分固定，就可以停止固定过程和/或可以从固定中取出组织并且可以洗涤组织。一般地，停止固定以终止固定剂对组织的额外活性。也可以停止固定，使得对组织执行的任何后续生物化学反应(例如，酶促细胞解离)可以发挥功能。
在一些例子中，组织区段可以进行处理或与淬灭介质接触，以使固定淬灭。术语“淬灭”意指停止固定反应，即导致固定的化学相互作用。可以通过将固定的组织区段浸入合适的淬灭介质中，来完成使固定淬灭。固定淬灭介质可以是冷却的，并且可以具有约零至约100℃或约1至约50℃的温度。
一种合适的淬灭介质是磷酸盐缓冲溶液(PBS)。一种合适的磷酸盐缓冲溶液是可从Sigma Aldrich Corp获得的1X PBS。1XPBS具有约7.4的pH，以及在水中的下述组成：NaCl-137mM、KCl-2.7mM、Na2HPO4-10mM、KH2PO4-1.8mM。在一个实施例中，磷酸盐缓冲溶液可以与胎牛血清(FBS)组合，以帮助淬灭固定反应。FBS是来自胎牛的凝固血液的液体级分，不含细胞、纤维蛋白和凝血因子，但含有对于细胞生长必需的许多营养因子和大分子因子。牛血清白蛋白是FBS的主要组分。胎牛血清可以与磷酸盐缓冲溶液组合，其浓度为按重量计约1％至约25％的FBS和按重量计约75％至约99％的PBS、适当地按重量计约5％至约15％的FBS和按重量计约85％至约95％的PBS、或按重量计约10％的FBS和按重量计约90％的PBS。在又一个实施例中，可以使用浓乙醇的水溶液代替淬灭介质中的PBS。乙醇溶液可以含有按重量计约50％至约90％的乙醇，或按重量计约55％至约85％的乙醇，或按重量计约60％至约80％的乙醇，或按重量计约70％的乙醇。
在一些例子中，可以使用不含血清的淬灭溶液来淬灭固定。在一些例子中，可以使用基于Tris的缓冲液。在一些例子中，可以使用PBS+50mM Tris pH 8.0+0.02％ BSA(不含RNA酶)+0.1U/ul RNA酶抑制剂。在一些例子中，组织可以从固定剂中取出并使用淬灭溶液或生物缓冲液洗涤。
生物组织区段的解离
可以使用酶促或化学解离处理和粉碎(例如，机械解离)的组合来解离固定的生物组织区段。不同类型的解离方法可以分开、连续或同时使用。
在一些例子中，机械解离可以包括共混、切碎、切割、捣碎、混合、杵均质化、研磨和其它方法。
在一些例子中，酶促解离处理可以通过用解离酶混合物处理固定的生物组织区段来执行。解离酶混合物可以包括单独或组合可以用于解离的酶，例如木瓜蛋白酶、分散酶、胶原酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、过氧化氢酶、弹性蛋白酶、蛋白酶、溶菌酶等等。合适的酶包括但不限于可从Sigma Aldrich Corp.获得的LiberaseTM，其为具有约7.4的pH的胶原酶I和II的冻干共混物。在一些例子中，LiberaseTM可以与一种或多种其它酶组合使用。
酶可以与生长培养基组合使用，所述生长培养基帮助在解离期间稳定且保存生物颗粒(例如，细胞和细胞核)。一种合适的生长培养基是可从Thermo Fisher ScientificCorp.和各种其它来源获得的Roswell Park Memorial Institute(RPMI 1640)。RPMI 1640每升含有下述成分：
a.葡萄糖(2g)
b.pH指示剂，酚红(5mg)
c.盐(6g氯化钠、2g碳酸氢钠、1.512g磷酸二钠、400mg氯化钾、100mg硫酸镁和100mg硝酸钙)
d.氨基酸(300mg谷氨酰胺；200mg精氨酸；各50mg天冬酰胺、胱氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；40mg盐酸赖氨酸；30mg丝氨酸；各20mg天冬氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸、脯氨酸、苏氨酸、酪氨酸和缬氨酸；各15mg组氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸；10mg甘氨酸；5mg色氨酸；1mg还原型谷胱甘肽)
e.维生素(35mg i-肌醇；3mg氯化胆碱；各1mg对氨基苯甲酸、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇和盐酸硫胺素；0.25mg泛酸钙；各0.2mg生物素和核黄素；和0.005mg氰钴胺)。
当酶与酶生长培养基组合时，组合可以包括按重量计约4％至约96％的酶和按重量计约4％至约96％的生长培养基、适当地按重量计约6％至约50％的酶和按重量计约50％至约94％的生长培养基、或按重量计约8％至约20％的酶和按重量计约80％至约92％的生长培养基、或按重量计约10％的酶和按重量计约90％的生长培养基。在一个实施例中，组合包括在RPMI中的约0.1mg/ml释放酶。
酶可以与酶稳定剂混合。合适的酶稳定剂包括但不限于二硫苏糖醇(DTT)、海藻糖、Nγ-乙酰基二氨基丁酸酯(NADA)、四氢嘧啶、羟基四氢嘧啶、二氨基丁酸钾、由式P(CH2CH2COOH)3表示的三(2-羧乙基)膦(TCEP)及其组合。酶稳定剂可以与酶组合，并且以约2mM至约25mM、适当地约5mM至约15mM、或约10mM的浓度存在于酶混合物中。一种特别合适的酶稳定剂是DTT。
酶可以与核糖核酸酶抑制剂混合。少量的核糖核酸酶(RNA酶)有时与分离的RNA共纯化并影响下游加工。此类污染也可以经由吸头、管和过程中使用的其它试剂引入。RNA酶抑制剂是用于抑制且控制此类污染物的细胞溶质蛋白质。核糖核酸酶抑制剂可以以约0.05至约1.0单位/μl，或约0.1至约0.5单位/μl，或约0.2单位/μl的量存在于酶混合物中。
生物组织区段可以在解离酶混合物中，在约250℃至约450℃、适当地约32℃至约42℃或约37℃的温度下，温育约3分钟至约30分钟、或约5分钟至约15分钟、或约10分钟的时间段，并且伴随间歇滴定。在解离处理之后，使组织区段经受粉碎以形成解离的组织颗粒。粉碎可以通过使用活塞、柱塞或其它合适的加力装置推动组织区段通过小孔滤器来完成。小孔滤器可以具有约1微米至约1000微米、适当地约5微米至约200微米，或约50微米至约100微米的中值孔径。一种合适的滤器是中值孔径约为70微米的
MACs滤器。粉碎也可以可替代地经由douncing(例如，使用Dounce均质机)或其它合适的机械手段来完成。
在一些例子中，酶的量/浓度、酶在其下使用的温度、它们使用的持续时间等等可以凭经验确定或滴定。在一些例子中，过度的酶消化可能影响根据所公开的方法获得合适的细胞和/或核的能力。
可以强迫组织区段通过滤器，使得在管或其它合适的容器中收集解离的组织颗粒。然后可以用缓冲溶液冲洗滤器，并且可以将流出物与收集的解离的组织颗粒组合，以产生混合物或悬浮液。缓冲溶液可以是磷酸盐缓冲溶液(PBS)，并且可以是具有约7.4的pH和在水中的下述组成的上述1X PBS：NaCl-137mM、KCl-2.7mM、Na2HPO4-10mM、KH2PO4-1.8mM。也可以使用其它合适的缓冲溶液。缓冲溶液可以与细胞营养素例如牛血清白蛋白(BSA)组合，所述牛血清白蛋白(BSA)既充当蛋白质细胞营养素，又帮助稳定酶。蛋白质细胞营养素(例如，BSA)可以以任何合适的浓度加入缓冲溶液中，所述浓度例如按重量计约0.01至约1％、或按重量计约0.02至约0.5％、或按重量计约0.03至约0.1％、或按重量计约0.04％。缓冲溶液可以是冷却的，并且可以具有约0℃至约10℃或约1至约5℃的温度。缓冲溶液的量应该足以致使解离的组织颗粒能够随后离心。例如，缓冲溶液的量应该是解离的组织颗粒重量的至少约三倍、或解离的组织颗粒重量的至少约五倍、或解离的组织颗粒重量的至少约七倍、或解离的组织颗粒重量的至少约10倍。在缓冲溶液中所得到的解离的组织颗粒混合物准备用于离心。
在一些例子中，取决于组织，酶可能并不用于从组织中解离细胞。例如，机械方法(例如，使用剪刀、剃须刀片切割、切碎等)可能是足够的。
一般地，产生良好结果的解离类型(例如，机械的、酶促的、机械的和酶促的)可以根据所使用的组织(例如，其大小、形状、厚度、纤维度(fibrosity))、组织如何进行加工(例如，新鲜、冷冻、固定程度)等等而变。一般地，对于酶促解离，具体的酶和/或酶的组合可以根据所使用的组织而变。
离心和过滤
解离的组织颗粒和缓冲溶液的悬浮液可以在适当倍数的重力(g力)下离心，以将相对完整的解离的细胞和细胞核与碎裂的细胞和核以及其它杂质分开。可以以约50g至约2500g、或约100g至约1500g、或约200g至约1000g、或约300g至约700g、或约500g的力执行离心。可以在将悬浮液的温度维持在约0℃至约10℃或约1°至约5℃下的同时执行离心。离心可以执行足够长的时间段，以从更轻重量的受损解离材料和其它杂质中富集和/或分开更高质量、相对完整的解离的生物颗粒(例如，细胞和/或细胞核)。例如，离心可以执行约1分钟至约15分钟、或约2分钟至约10分钟、或约3分钟至约7分钟、或约5分钟。离心可以使用任何合适的离心仪器来执行，并且产生附聚的解离的生物颗粒(例如细胞和细胞核)的一种或多种丸粒。
然后可以将一种或多种丸粒重悬浮于缓冲溶液中，以形成悬浮液。缓冲溶液可以是磷酸盐缓冲溶液(PBS)，并且可以是具有约7.4的pH和在水中的下述组成的上述1X PBS：NaCl-137mM、KCl-2.7mM、Na2HPO4-10mM、KH2PO4-1.8mM。也可以使用其它合适的缓冲溶液。缓冲溶液可以与细胞营养素例如牛血清白蛋白(BSA)组合。蛋白质细胞营养素(例如，BSA)可以以任何合适的浓度加入缓冲溶液中，所述浓度例如按重量计约0.01至约1％、或按重量计约0.02至约0.5％、或按重量计约0.03至约0.1％、或按重量计约0.04％。缓冲溶液可以是冷却的，并且可以具有约零至约100C或约10至约50C的温度。缓冲溶液的量应该足以致使来自悬浮液的组织的解离的生物颗粒能够洗涤，随后为后续过滤。例如，缓冲溶液的量可以是解离的生物颗粒重量的至少约三倍、或解离的组织颗粒重量的至少约五倍、或解离的生物颗粒重量的至少约七倍、或解离的生物颗粒重量的至少约10倍。所得到的解离的生物颗粒在缓冲溶液中的悬浮液准备用于过滤。
可以过滤悬浮液，以将解离的生物颗粒(例如，细胞和细胞核)与任何剩余的杂质分开，产生解离的生物颗粒(例如，细胞和细胞核)的集合或多个解离的生物颗粒(例如，细胞和细胞核)。悬浮液可以通过孔径为约1微米至约500微米，或约5微米至约200微米，或约10微米至约100微米，或约25微米至约75微米，或约40微米的过滤器。在一些例子中，过滤器尺寸可以为5μM到70μM。一种示例性过滤器是可从Sigma Aldrich Corp.获得的
过滤器，并且具有约40微米的孔径。过滤将解离的生物颗粒(例如，细胞和细胞核)与杂质分开。在各个实施例中，悬浮、离心和过滤可以重复所需的多次，以获得解离的生物颗粒(例如，细胞和细胞核)的最纯组合。
所得到的解离的生物颗粒(例如，细胞和细胞核)可以包括例如大部分解离的细胞、大部分解离的细胞核、或解离的细胞和细胞核的任何组合。在一个实施例中，取决于过程变量的设置，解离材料的范围可以为约100％解离的细胞至约100％解离的细胞核，并且可以包括两者之间的任何组合。
在一些例子中，从所公开的方法或从所公开方法的各个步骤回收的生物颗粒(例如，细胞和/或核)，可以使用光学显微镜、颗粒分析仪、流式细胞仪等等进行显现。在一些例子中，这些方法可以用于检查且确定所公开的方法中的各个步骤的最佳参数。在一些例子中，可以基于它们在各种单一细胞工作流和/或测定中如何表现来检查回收的生物颗粒(例如，细胞和/或核)。
使用回收的细胞和核的单一生物颗粒测定
本发明提供了用于进一步分析通过本文所述的方法获得的单一生物颗粒(例如，单一细胞和/或单一核)的方法。回收的生物颗粒(例如，细胞和/或核)一般能够支持与例如基因组学、表观基因组学、转录组学、蛋白质组学等等中的一种或多种有关的某些单一生物颗粒测定(例如，单一细胞或核测定)。可以支持各种单一细胞生物/生物化学测定。
在一些例子中，本文公开的回收的细胞和/或核可以含有mRNA，其可以充当用于RNA模板化的DNA连接反应(RTL；例如，如Mats Nilsson,Dan-Oscar Antson,GiselaBarbany,Ulf Landegren,RNA-templated DNA ligation for transcript analysis,Nucleic Acids Research，第29卷，第2期，2001年1月15日，第578-581页中)的模板。在一些例子中，得自这些测定的连接的DNA可为mRNA的代表，并且可以用于在单一细胞基础上分析基因表达。在一些例子中，得自通过所公开的方法产生的单一细胞的DNA可以通过基于液滴的方法进行加工，如本申请的下一节段中所述。
在一些例子中，使用从所公开的方法获得的生物颗粒(例如，细胞/核)、以及与生物颗粒(例如，mRNA)中的核酸分子区域互补的连接探针的RTL反应，产生预计大小的大量连接产物。连接产物的单一细胞测序证实了产生预计读数的大量生物颗粒(例如，细胞/核)，以及大量预计读数/生物颗粒(例如，细胞/核)。
在一些例子中，本文公开的回收的生物颗粒(例如，细胞和/或核)可以与某些检测分子接触，所述检测分子如特异性结合细胞和/或核中的某些分析物的抗体。在一些例子中，用例如荧光抗体染色的生物颗粒(例如，细胞/核)可以用于检测且定量抗体结合的抗原。在一些例子中，可以使用分析细胞学仪器(Jacobberger,J.W.,Fogleman,D.和Lehman,J.M.(1986),Analysis of intracellular antigens by flow cytometry.Cytometry,7:356-364)，来检测且定量生物颗粒(例如，细胞/核)中的抗体结合的抗原。
解离的单一细胞和/或单一核的加工和分析
如先前节段中所述，一些单一细胞测定可以在测定的执行中使用基于液滴的分隔。
基于液滴的(和其它基于分隔的方法)基因组测定通常涉及分离且分隔为乳状液中的离散液滴中的单一细胞和/或单一核的生物样品。离散液滴通常还包括用于样品的唯一标识符，其形式为离散液滴中还含有的唯一寡核苷酸序列。离散液滴还可以含有测定试剂，其用于从样品中生成可检测分析物(例如，3'cDNA序列)并提供关于其的有用基因组信息(例如，RNA转录物谱)。用于进行基于液滴的测定的方法和组合物的进一步细节在本文其它地方提供。在一个实施例中，本发明提供了含有单一细胞或单一核(通过本文所述的方法制备)的离散液滴，其包含多个连接产物。
如本文使用的，术语“分隔”一般指可能适合容纳一种或多种物种或者进行一种或多种反应的空间或体积。分隔可以是物理区室，例如液滴或孔(例如微孔)。分隔可以将空间或体积与另一个空间或体积分离。液滴可以是与第一相不混溶的第二相(例如油)中的第一相(例如水相)。液滴可以是不与第一相相分离的第二相中的第一相，例如水相中的胶囊或脂质体。分隔可以包括一个或多个其它(内部)分隔。在一些情况下，分隔可以是虚拟区室，其可以由跨越多重和/或远程物理区室的索引(例如，索引文库)定义且鉴定。例如，物理区室可以包括多个虚拟区室。
一种或多种试剂可以与生物颗粒(例如，细胞或核)共分隔。例如，生物颗粒可以与选自以下的一种或多种试剂共分隔：裂解试剂或缓冲液、渗透化试剂、酶(例如，能够消化一种或多种RNA分子、延伸一种或多种核酸分子、使RNA分子逆转录、使细胞渗透化或裂解或者进行其它作用的酶)、荧光团、寡核苷酸、引物、探针、条形码、核酸条形码分子(例如，包含一个或多个条形码序列的核酸条形码分子)、缓冲液、脱氧核苷酸三磷酸、去污剂、还原剂、螯合剂、氧化剂、纳米颗粒、珠和抗体。在一些情况下，生物颗粒可以与选自以下的一种或多种试剂共分隔：温度敏感酶、pH敏感酶、光敏酶、逆转录酶、蛋白酶、连接酶、聚合酶、限制性酶、核酸酶、蛋白酶抑制剂、外切核酸酶和核酸酶抑制剂。
由可用于基于分隔液滴的基因组测定中的样品制备含有生物颗粒(例如，细胞或核)的分隔涉及通常花费几小时到几天的众多步骤(例如，样品运输、组织解离、液相洗涤和转移、文库制备)。在此制备时间期间，新鲜的(即，解除固定的)生物样品将开始降解且分解，导致基因组信息的显著丧失以及并不反映样品的天然状态的测定结果。本发明提供了用于制备维持其来自生物收集点的完整性的固定的生物样品的组合物和方法，但所述固定的生物样品能够解离成单一生物颗粒(例如，单一细胞和/或单一核)，加工用于批量的核酸分析(例如，RNA分析)，然后封装(例如，在离散液滴中)用于基于分隔的测定(例如，生成用于测序分析的文库)。
如本文其它地方更详细地提供的，在至少一个实施例中，组合物包含已进行分隔(例如，封装在离散液滴中)的固定的单一生物颗粒(例如，固定的单一细胞或固定的单一核)，其中所述固定的单一生物颗粒(例如，单一细胞或单一核)包含多种核酸产物(例如，探针结合的核酸分子和/或核酸连接产物)。在一个实施例中，多种核酸产物是多种核酸模板化连接产物(例如，RNA模板化连接产物)。在至少一个实施例中，用于制备此类组合物的方法包括：提供批量的多个固定的单一生物颗粒(例如，单一细胞或单一核)，并且使其与靶向多个样品核酸分子(例如样品RNA序列)的核酸探针对接触，并且允许核酸探针对与多个样品核酸分子(例如样品RNA序列)杂交，从而形成多个核酸复合物。在一个实施例中，多个核酸复合物的核酸复合物包含第一探针、第二探针和样品核酸分子。在另一个实施例中，第一探针可以与样品核酸分子的第一区域杂交(hybridize)(或杂交(hybridizes))，并且第二探针可以与样品核酸分子的第一区域杂交(hybridize)(或杂交(hybridizes))，其中第一区域和所述第二区域彼此相邻。在另一个实施例中，第一区域和第二区域存在于邻接的核酸分子上。
在另一个实施例中，该方法还包括连接其为核酸复合物的部分的杂交探针(即，针对第一区域的第一探针和针对第二区域的第二探针)，以提供包含模板化连接产物的多个固定的生物颗粒(例如，单一细胞或单一核)。在一个实施例中，固定的单一生物颗粒(例如，固定的单一细胞或固定的单一核)包含多个模板化连接产物，其包含与样品核酸分子上的第二探针连接的第一探针。在一个实施例中，模板化连接产物RNA模板化连接产物。
在另一个实施例中，本公开内容提供了测定方法，其中所述方法包括(a)生成包含固定的生物颗粒(例如，固定的单一细胞或固定的单一核)和用于加工核酸产物的测定试剂的离散分隔(例如，液滴或微孔)，所述固定的生物颗粒包含核酸产物，例如连接产物，例如模板化连接产物，包括RNA模板化连接产物(如本文所述)；并且(b)检测来自测定试剂和核酸产物的反应的核酸产物(例如，连接产物)。
普通技术人员将了解用于核酸(例如，RNA)模板化连接的其它合适方法(参见例如，美国公开号20200239874A1、WO/2019/157529和WO/2019/165318，所述专利各自以引用的方式整体并入)。
本公开内容的组合物和方法可以允许在基于单一细胞液滴的测定中使用广泛范围的生物样品。如本文使用的，术语“生物样品”指生物起源的任何样品，其包括生物分子，例如核酸、蛋白质、碳水化合物和/或脂质。在本公开内容的方法和组合物中使用的生物样品包括生物起源的血液样品和其它液体样品、固体组织样品例如组织样品(即，组织样本)、活组织检查(即，活组织检查样本)、或组织培养物或由其衍生的细胞及其后代。这包括在从生物来源中分离后已以任何方式操纵的样品，例如冷冻；洗涤；或富集某些细胞群体，例如癌细胞、神经元、干细胞等。该术语还涵盖已富集特定类型的分子例如核酸、多肽等的样品。“生物样品”涵盖临床样品，并且还包括通过手术切除获得的组织、通过活组织检查获得的组织、培养中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、组织样品(即，组织样本)、器官、骨髓、血液、血浆、血清等等。“生物样品”还包括从患者的癌细胞获得的样品，例如，包含从患者的癌细胞获得的多核苷酸和/或多肽的样品(例如，包含多核苷酸和/或多肽的细胞裂解物或其它细胞提取物)；以及具有来自患者的细胞(例如癌细胞)的样品。
考虑了在本公开内容的组合物和方法中使用的生物样品可以源自另一种样品。生物样品可以包括组织样品，例如活组织检查、核心活组织检查、针抽吸物或细针抽吸物。生物样品还包括生物流体样品，例如血液样品、尿样品或唾液样品，或者生物样品可以是皮肤样品、颊拭子。生物样品可以是血浆或血清样品。生物样品可以包括细胞或者是无细胞样品。无细胞样品可以包括细胞外多核苷酸。细胞外多核苷酸可以从身体样品中分离，所述身体样品可以选自血液、血浆、血清、尿、唾液、粘膜排泄物、痰、粪便和泪。
本领域描述了可用于将来自样品的生物颗粒(例如，个别细胞或核、细胞的生物分子内容物等)分隔到离散液滴内的方法、技术和方案。所生成的离散液滴充当纳升级容器，其可以维持液滴内容物与乳状液中的其它液滴内容物的分开。在例如美国专利申请公开号2010/0105112和2019/0100632中描述了用于从非水或油乳状液中的生物样品产生封装个别生物颗粒(例如，细胞或核)的稳定离散液滴的方法和系统，所述美国专利申请各自以引用的方式整体并入本文用于所有目的。
简言之，通过将含有生物样品(即，生物颗粒)的水性流体的流动流引入它与之不混溶的非水性流体的流动流或储库内，使得生成液滴，来完成封装生物样品(即，生物颗粒)的乳状液中的离散液滴的提供(一般参见例如图2-7)。通过以生物样品的特定浓度和/或流速提供水性流，可以控制所得到的液滴的占有率。例如，可以选择不混溶流体的相对流速，使得平均而言，离散液滴各自含有少于一个生物颗粒(例如，一个细胞或一个核)。此类流速确保被占据的液滴主要被单一生物颗粒(例如，单一细胞或单一核)占据。在一些情况下，以这种方式形成的多个离散液滴中的液滴最多含有一个颗粒(例如，一个珠、一个细胞或一个核)。还可以控制流动和微流体通道体系结构，以确保给定数目的单独占据的液滴、少于特定水平的未占据液滴、和/或少于特定水平的多重占据的液滴。
如本文使用的，术语“珠”一般指颗粒。珠可以是固体或半固体颗粒。珠可以是凝胶珠。凝胶珠可以包括聚合物基质(例如，通过聚合或交联形成的基质)。聚合物基质可以包括一种或多种聚合物(例如，具有不同官能团或重复单元的聚合物)。聚合物基质中的聚合物可以是随机排列的，例如在随机共聚物中，和/或具有有序结构，例如在嵌段共聚物中。交联可以是经由共价、离子或感应、相互作用或物理缠结。珠可以是大分子。珠可以由结合在一起的核酸分子形成。珠可以经由分子(例如，大分子)例如单体或聚合物的共价或非共价组装形成。此类聚合物或单体可以是天然的或合成的。此类聚合物或单体可以是或包括例如核酸分子(例如DNA或RNA)。珠可以由聚合材料形成。珠可以是磁性的或非磁性的。珠可以是刚性的。珠可以是柔性的和/或可压缩的。珠可以是可破坏的或可溶解的。珠可以是覆盖有包含一种或多种聚合物的涂层的固体颗粒(例如，基于金属的颗粒，包括但不限于氧化铁、金或银)。此类涂层可以是可破坏的或可溶解的。
图2显示了示例性微流体通道结构200，其可用于生成封装来自生物样品的颗粒例如单一细胞的离散液滴。通道结构200可以包括在通道连接点210处连通的通道区段202、204、206和208。在操作中，包括来自生物样品214的悬浮颗粒(例如，细胞或核)的第一水性流体212沿着通道区段202传送到连接点210内，而与水性流体212不混溶的第二流体216(或“分隔流体”)从通道区段204和206各自递送到连接点210，以产生第一208的离散液滴218、220，并且从连接点210流出。通道区段208可以流体联接到出口储库，离散液滴可以在其中贮存和/或收获。所生成的离散液滴可以包括来自生物样品214的个别颗粒(例如液滴218)，或者可以生成包括多于一个颗粒214的离散液滴(图2中未示出)。离散液滴可以不含生物颗粒214(例如液滴220)。每个离散液滴能够维持其自身内容物(例如，个别生物样品颗粒214)与其它液滴内容物的分开。
通常，第二流体216包含油例如氟化油，其包括帮助稳定所得到的液滴的含氟表面活性剂。有用的分隔流体和含氟表面活性剂的例子在例如美国专利申请公开号2010/0105112中进行描述，所述美国专利申请以引用的方式整体并入本文用于所有目的。
如图2中例示的用于生成离散液滴的微流体通道可以联接到各种不同流体源或接收部件中的任一种，包括储库、管道、歧管或其它系统的流体部件。另外，微流体通道结构200可以具有其它几何形状，包括具有多于一个通道连接点的几何形状。例如，微流体通道结构可以具有2、3、4或5个通道区段，其各自携带在通道连接处相遇的来自样品的生物颗粒(例如，细胞或核)、测定试剂和/或凝胶珠。
一般地，用于生成离散液滴的流体被引导经由一个或多个流体流动单元沿着一个或多个通道或储库流动。流体流动单元可以包括压缩机(例如，提供正压)、泵(例如，提供负压)、致动器等等，以控制流体的流动。流体也可以或以其它方式经由施加的压差、离心力、电动泵送、真空、毛细管或重力流动等等进行控制。
普通技术人员将认识到众多不同的微流体通道设计是可用的，其可以与本公开内容的方法和组合物一起使用，以提供含有固定的生物颗粒(例如，细胞或核)、和/或具有条形码的珠和/或其它测定试剂的离散液滴。
条形码连同生物样品一起包括在离散液滴中提供了唯一标识符，其允许区分且个别地分析来自生物样品的数据。条形码可以在离散液滴中的生物样品之前、之后或同时递送。例如，条形码可以在液滴生成之前、之后或同时注入液滴内。可用于本公开内容的方法和组合物中的条形码通常包含核酸分子(例如，寡核苷酸)。核酸条形码分子通常经由微胶囊例如珠递送至分隔。在一些情况下，条形码核酸分子在离散液滴生成时最初与珠结合，然后在对液滴施加刺激时从珠中释放。可用于本公开内容的方法和组合物中的携带条形码的珠在本文其它地方进一步详细地进行描述。
图3显示了示例性微流体通道结构300，其用于生成封装携带条形码的珠314连同生物样品颗粒316一起的离散液滴。通道结构230包括在通道连接点310处流体连通的通道区段301、302、304、306和308。在操作中，通道区段301将可以包括多个珠314(例如携带条形码寡核苷酸的凝胶珠)的水性流体312沿着通道区段301传送到连接点310内。多个珠314可以来源于珠的悬浮液。例如，通道区段301可以连接到包含珠314的水性悬浮液的储库。通道区段302将包括多个生物样品颗粒316的水性流体312沿着通道区段302传送到连接点310内。多个生物样品颗粒316可以来源于生物样品颗粒的悬浮液。例如，通道区段302可以连接到包含生物样品颗粒316的水性悬浮液的储库。在一些情况下，第一通道区段301或第二通道区段302或两个区段中的水性流体312，可以包括一种或多种试剂，如本文其它地方进一步描述的。例如，在本公开内容的一些实施例中，其中生物样品颗粒是固定的生物样品颗粒，第一通道区段和/或第二通道区段中的水性流体分别递送生物样品和珠。与水性流体312不混溶的第二流体318从通道区段304和306各自递送到连接点310。在来自通道区段301和302各自的水性流体312与来自通道区段304和306各自的第二流体318(例如，氟化油)在通道连接点310处相遇时，水性流体312在第二流体318中分隔成离散液滴320，并且沿着通道区段308从连接点310流出。然后，通道区段308可以将封装生物样品颗粒和携带条形码的珠的离散液滴递送到与通道区段308流体联接的出口储库，它们可以在其中进行收集。
作为替代方案，通道区段301和302可以在连接点310上游的另一个连接点处相遇。在此类连接点处，珠和生物颗粒可以形成混合物，其沿着另一个通道被引导到连接点310，以产生液滴320。混合物可以以交替方式提供珠和生物颗粒，使得例如液滴包含单一珠和单一生物颗粒。
使用如图3中例示的此类通道系统，可以生成封装生物样品的个别颗粒和一个珠的离散液滴320，其中所述珠可以携带条形码和/或另一种试剂。还考虑了，在一些情况下，可以使用图3的通道系统生成离散液滴，其中液滴包括多于一个的个别生物样品颗粒或不包括生物样品。类似地，在一些实施例中，离散液滴可以包括多于一个珠或不包括珠。离散液滴也可能完全未被占据(例如，没有珠或生物样品)。
在一些实施例中，期望珠、单一细胞或核、以及所生成的离散液滴以基本上规律的流速沿着通道流动，其生成含有单一珠和单个生物样品颗粒的离散液滴。规律流速和可以用于提供此类规律流速的装置是本领域已知的，参见例如美国专利公开号2015/0292988，其在此以引用的方式整体并入本文。在一些实施例中，设定流速以提供含有单一珠和生物样品颗粒的离散液滴，其产率大于5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
在一些实施例中，生物样品颗粒可以连同其它试剂一起共分隔。图4显示了微流体通道结构400的例子，所述微流体通道结构用于共分隔生物样品颗粒和其它试剂包括裂解试剂。通道结构400可以包括通道区段401、402、404、406和408。通道区段401和402在第一通道连接点409处连通。通道区段402、404、406和408在第二通道连接点410处连通。在示例性共分隔操作中，通道区段401可以将包括多个生物样品颗粒414(例如，固定的生物样品)的水性流体412沿着通道区段401传送到第二连接点410内。作为替代或附加，通道区段401可以传送珠(例如，携带条形码的凝胶珠)。例如，通道区段401可以连接到包含生物样品颗粒414的水性悬浮液的储库。在第二连接点410的上游并且紧在到达第二连接点之前，通道区段401可以在第一连接点409处与通道区段402相遇。通道区段402可以将水性流体412中的多种试剂415(例如，裂解试剂)沿着通道区段402传送到第一连接点409内。例如，通道区段402可以连接到包含试剂415的储库。在第一连接点409后，通道区段401中的水性流体412可以携带生物样品颗粒414和试剂415两者朝向第二连接点410。在一些情况下，通道区段401中的水性流体412可以包括一种或多种试剂，其可以是与试剂415相同或不同的试剂。与水性流体412不混溶的第二流体416(例如，氟化油)可以从通道区段404和406各自递送到第二连接点410。在来自通道区段401的水性流体412以及来自通道区段404和406各自的第二流体416在第二通道连接点410处相遇时，水性流体412在第二流体416中分隔为离散液滴418并且沿着通道区段408从第二连接点410流出。通道区段408可以将离散液滴418递送到与通道区段408流体联接的出口储库，它们可以在其中进行收集用于进一步分析。
取决于通道区段402中包括何种试剂，所生成的离散液滴可以包括个别生物样品颗粒414和/或一种或多种试剂415。在一些情况下，所生成的离散液滴还可以包括携带条形码的珠(未示出)，例如可以经由本文其它地方描述的其它通道结构添加。在一些情况下，离散液滴可能是未被占据的(例如，无试剂、无生物颗粒)。一般地，本文所述的通道区段可以联接到各种不同流体源或接收部件中的任一种，包括储库、管道、歧管或其它系统的流体部件。如将了解的，微流体通道结构400可以具有其它几何形状。例如，微流体通道结构可以具有多于两个通道连接点。例如，微流体通道结构可以具有2、3、4、5个或更多个通道区段，其各自携带在通道连接处相遇的相同或不同类型的珠、试剂和/或生物样品颗粒。可以控制每个通道区段中的流体流动，以控制不同元素分隔到液滴内。流体可以被引导经由一个或多个流体流动单元沿着一个或多个通道或储库流动。流体流动单元可以包括压缩机(例如，提供正压)、泵(例如，提供负压)、致动器等等，以控制流体的流动。流体也可以或以其它方式经由施加的压差、离心力、电动泵送、真空、毛细管或重力流动等等进行控制。
图5显示了用于将珠受控分隔到离散液滴内的微流体通道结构的例子。通道结构500可以包括通道区段502，其在通道连接点506(或交叉点)处与储库504连通。储库504可以是腔室。如本文使用的，对“储库”的任何提及也可以指“腔室”。在操作中，包括悬浮珠512的水性流体508可以沿着通道区段502传送到连接点506内，以与储库504中的与水性流体508不混溶的第二流体510相遇，以产生水性流体508流动到储库504内的液滴516、518。在其中水性流体508和第二流体510相遇的连接点506处，液滴可以基于因素例如在连接点506处的流体动力，两种流体508、510的流速，流体性质和通道结构500的某些几何参数(例如，w、h0、α等)而形成。通过来自通道区段502通过连接点506连续注入水性流体508，可以在储库504中收集多个液滴。
图6显示了用于增加液滴生成流通量的微流体通道结构的例子。微流体通道结构600可以包括多个通道区段602和储库604。多个通道区段602各自可以与储库604流体连通。通道结构600可以包括在多个通道区段602和储库604之间的多个通道连接点606。每个通道连接点可以是液滴生成点。来自图5中的通道结构500的通道区段602以及对其部件的任何描述，可以对应于通道结构600中的多个通道区段602中的给定通道区段以及对其对应部件的任何描述。来自通道结构500的储库504以及对其部件的任何描述，可以对应于来自通道结构600的储库604以及对其对应部件的任何描述。
图7显示了用于增加液滴生成流通量的微流体通道结构的另一个例子。微流体通道结构700可以包括多个通道区段702，其一般围绕储库704的周边呈圆形排列。多个通道区段702各自可以与储库704流体连通。通道结构700可以包括在多个通道区段702和储库704之间的多个通道连接点706。每个通道连接点可以是液滴生成点。来自图5中的通道结构500的通道区段502以及对其部件的任何描述，可以对应于通道结构700中的多个通道区段702中的给定通道区段以及对其对应部件的任何描述。来自通道结构500的储库504以及对其部件的任何描述，可以对应于来自通道结构700的储库704以及对其对应部件的任何描述。图5-7中描绘的此类微流体结构的另外方面，包括实现其的系统和方法，在美国公开专利申请号20190323088中提供，所述美国公开专利申请以引用的方式整体并入本文。
基于微孔的分析
如本文所述，一个或多个过程可以在分隔中执行，所述分隔可以是孔。孔可以是基底的多个孔中的孔，例如微孔阵列或板的微孔，或者孔可以是包含基底的装置(例如，微流体装置)的微孔或微腔室。孔可以是孔阵列或板的孔，或者孔可以是装置(例如，流体装置)的孔或腔室。相应地，孔或微孔可以采取“开放”配置，其中孔或微孔暴露于环境(例如，含有开放表面)，并且在基底的一个平面表面上是可接近的，或者孔或微孔可以采取“关闭”或“密封”配置，其中微孔在基底的平面表面上是不可接近的。在一些情况下，孔或微孔可以配置为在“开放”和“关闭”配置之间切换。例如，一个“开放”微孔或一组微孔可以使用膜(例如，半透膜)、油(例如，覆盖水溶液的氟化油)或盖子进行“关闭”或“密封”，如本文其它地方所述。孔或微孔最初可以以“关闭”或“密封”配置提供，其中如果没有外力，它们在基底的平面表面上是不可接近的。例如，“关闭”或“密封”配置可以包括基底例如密封膜或箔，其可通过移液管吸头刺穿或穿透。用于基底的合适材料包括但不限于聚酯、聚丙烯、聚乙烯、乙烯基和铝箔。
在一些实施例中，孔可以具有小于1毫升(mL)的体积。例如，孔可以配置为容纳最多1000微升(μL)、最多100μL、最多10μL、最多1μL、最多100纳升(nL)、最多10nL、最多1nL、最多100皮升(pL)、最多10(pL)或更少的体积。孔可以配置为容纳约1000μL、约100μL、约10μL、约1μL、约100nL、约10nL、约1nL、约100pL、约10pL等的体积。孔可以配置为容纳至少10pL、至少100pL、至少1nL、至少10nL、至少100nL、至少1μL、至少10μL、至少100μL、至少1000μL或更多的体积。孔可以配置为容纳在本文中列出的体积范围内的体积，例如，约5nL至约20nL、约1nL至约100nL、约500pL至约100μL等。孔可以是具有不同体积的多个孔，并且可以配置为容纳适合容纳本文所述的任何分隔体积的体积。
在一些情况下，微孔阵列或板包括单一种类的微孔。在一些情况下，微孔阵列或板包括各种各样的微孔。例如，微孔阵列或板可以包括在单个微孔阵列或板内的一种或多种类型的微孔。微孔的类型可以具有不同的尺寸(例如，长度、宽度、直径、深度、横截面积等)、形状(例如，圆形、三角形、正方形、矩形、五边形、六边形、七边形、八边形、九边形、十边形等)、长宽比或其它物理特性。微孔阵列或板可以包括任何数目的不同类型的微孔。例如，微孔阵列或板可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000种或更多种不同类型的微孔。孔可以具有任何尺寸(例如，长度、宽度、直径、深度、横截面积、体积等)、形状(例如，圆形、三角形、正方形、矩形、五边形、六边形、七边形、八边形、九边形、十边形、其它多边形等)、长宽比或本文关于任何孔描述的其它物理特性。
在某些情况下，微孔阵列或板包括在阵列或板内彼此相邻定位的不同类型的微孔。例如，具有一组尺寸的微孔可以与具有一组不同尺寸的另一个微孔相邻并接触定位。类似地，不同几何形状的微孔可以彼此相邻或接触放置。相邻的微孔可以配置为容纳不同的物品；例如，一个微孔可以用于容纳生物颗粒，例如细胞、核或其它样品(例如，细胞组分、核酸分子等)，而相邻的微孔可以用于容纳支持物(例如珠，例如凝胶珠)、液滴或其它试剂。在一些情况下，相邻的微孔可以配置为例如在施加刺激时或在每个微孔中的物品接触时自发地合并在其中容纳的内容物。
如本文其它地方所述，多个分隔可以用于本文所述的系统、组合物和方法中。例如，可以生成或以其它方式提供任何合适数目的分隔(例如，孔或液滴)。例如，在使用孔时的情况下，可以生成或以其它方式提供至少约1,000个孔、至少约5,000个孔、至少约10,000个孔、至少约50,000个孔、至少约100,000个孔、至少约500,000个孔、至少约1,000,000个孔、至少约5,000,000个孔至少约10,000,000个孔、至少约50,000,000个孔、至少约100,000,000个孔、至少约500,000,000个孔、至少约1,000,000,000个孔或更多个孔。此外，多个孔可以包括未被占据的孔(例如，空孔)和占据的孔两者。
孔可以包括本文所述的任何试剂或其组合。这些试剂可以包括例如条形码分子、酶、衔接子及其组合。试剂可以与置于孔中的生物颗粒(例如，细胞、核或细胞组分，例如蛋白质、核酸分子等)在物理上分开。这种物理分开可以通过在支持物(例如珠，例如凝胶珠)内含有试剂或联接到支持物来完成，所述支持物置于孔内。物理分离也可以通过在孔中分配试剂并用层上覆试剂来完成，所述层在将多核苷酸样品引入孔内之前是例如可溶解的、可熔化的或可渗透的。该层可以是例如油、蜡、膜(例如半透膜)等等。孔可以在任何点进行密封，例如在添加支持物或珠后、在添加试剂后、或在添加这些组分中的任一种后。孔的密封可以用于各种目的，包括防止珠或装载的试剂从孔中逸出、允许某些试剂的选择递送(例如，经由半透膜的使用)、用于在进一步加工之前或之后孔的贮存等。
孔可以包括游离试剂和/或封装在支持物(例如珠)或液滴中或者以其它方式与之联接或结合的试剂。在一些实施例中，本公开内容中描述的任何试剂可以封装在支持物(例如珠)或液滴中或者以其它方式与之联接，所述支持物或液滴具有适合于样品加工反应的任何化学品、颗粒和元素，所述样品加工反应涉及生物分子，例如但不限于核酸分子和蛋白质。例如，在用于DNA测序的样品制备反应中使用的珠或液滴可以包括下述试剂中的一种或多种：酶、限制性酶(例如，多重cutter)、连接酶、聚合酶、荧光团、寡核苷酸条形码、衔接子、缓冲液、核苷酸(例如，dNTP、ddNTP)等等。
试剂的另外实例包括但不限于：缓冲液、酸性溶液、碱性溶液、温度敏感酶、pH敏感酶、光敏酶、金属、金属离子、氯化镁、氯化钠、锰、水性缓冲液、温和缓冲液、离子缓冲液、抑制剂、酶、蛋白质、多核苷酸、抗体、糖、脂质、油、盐、离子、去污剂、离子型去污剂、非离子型去污剂、寡核苷酸、核苷酸、脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)、双脱氧核糖核苷酸三磷酸(ddNTP)、DNA、RNA、肽多核苷酸、互补DNA(cDNA)、双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、质粒DNA、粘粒DNA、染色体DNA、基因组DNA、病毒DNA、细菌DNA、mtDNA(线粒体DNA)、mRNA、rRNA、tRNA、nRNA、siRNA、snRNA、snoRNA、scaRNA、微小RNA、dsRNA、核酶、核糖开关和病毒RNA、聚合酶、连接酶、限制性酶、蛋白酶、核酸酶、蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、螯合剂、还原剂、氧化剂、荧光团、探针、生色团、染料、有机物、乳化剂、表面活性剂、稳定剂、聚合物、水、小分子、药物、放射性分子、防腐剂、抗生素、适体和药学药物化合物。如本文所述，孔中的一种或多种试剂可以用于执行一种或多种反应，包括但不限于：生物颗粒(例如，细胞或核)加工，例如裂解、固定、渗透化、核酸反应例如核酸延伸反应、扩增、逆转录反应等。
本文公开的孔可以作为试剂盒的部分提供。例如，试剂盒可以包括使用说明书、微孔阵列或装置以及试剂(例如珠)。试剂盒可以包括用于执行本文所述的过程的任何有用的试剂，所述过程例如核酸反应、核酸分子的加条形码、样品加工(例如，用于生物颗粒裂解、固定和/或渗透化)。
在一些情况下，孔包括支持物(例如珠)或液滴，其包括具有相似属性的一组试剂，例如一组酶、一组矿物质、一组寡核苷酸、不同条形码分子的混合物、或等同条形码分子的混合物。在其它情况下，支持物(例如珠)或液滴包括试剂的异质混合物。在一些情况下，试剂的异质混合物可以包括执行反应所必需的所有组分。在一些情况下，此类混合物可以包括执行反应所必需的所有组分，除了执行反应所必需的1、2、3、4、5种或更多种组分之外。在一些情况下，此类另外的组分包含在不同的支持物(例如珠)或液滴内，或以其它方式与之联接，或在系统的分隔(例如微孔)内的溶液内。
按照本公开内容的一些实施例的微孔阵列的非限制性例子在图13中示意性地呈现。在该例子中，阵列可以包含在基底1300内。基底1300包括多个孔1302。孔1302可以具有任何大小或形状，并且孔之间的间距、每个基底的孔数目以及基底1300上的孔密度可以根据特定应用进行修改。在一个此类示例应用中，可以包括生物颗粒例如细胞、核或细胞组分(例如，核酸分子)的样品分子1306与珠1304共分隔，所述珠可以包括与其联接的核酸条形码分子。可以使用重力或其它装载技术(例如，离心、液体处理器、声学装载、光电等)来装载孔1302。在一些情况下，孔1302中的至少一个含有单一生物颗粒1306(例如，细胞或核)和单一珠1304。
试剂可以序贯地或同时地装载到孔内。在一些情况下，在特定操作之前或之后将试剂引入装置中。在一些情况下，序贯地引入试剂(在某些情况下，其可以在支持物(例如珠)或液滴中提供)，使得不同的反应或操作在不同的步骤处发生。试剂(或支持物(例如珠)或液滴)也可以在散布有反应或操作步骤的操作处装载。例如，可以将包括用于使多核苷酸片段化的试剂(例如限制性酶)和/或其它酶(例如连接酶、聚合酶等)的支持物(例如珠)(或液滴)装载到孔或多个孔内，随后为包括用于将核酸条形码分子附着到样品核酸分子的试剂的支持物(例如珠)或液滴的装载。试剂可以与生物颗粒同时地或序贯地提供，所述生物颗粒例如细胞、核或细胞组分(例如，细胞器、蛋白质、核酸分子、碳水化合物、脂质等)。相应地，孔的使用可以用于执行多步操作或反应。
如本文其它地方所述，核酸条形码分子和其它试剂可以包含在支持物(例如珠，例如凝胶珠)或液滴内。这些支持物或液滴可以在生物颗粒(例如，细胞或核)装载之前、之后或同时装载到分隔(例如微孔)内，使得每个生物颗粒与不同的支持物(例如珠)或液滴接触。这种技术可以用于将唯一核酸条形码分子附着到从每个生物颗粒获得的核酸分子。可替代地或另外，样品核酸分子可以附着到支持物。例如，分隔(例如微孔)可以包括珠，其具有与之联接的多个核酸条形码分子。样品核酸分子或其衍生物可以联接或附着到在支持物上附着的核酸条形码分子。然后，所得到的加条形码的核酸分子可以从分隔中取出，并且在一些情况下，合并且测序。在此类情况下，核酸条形码序列可以用于追踪样品核酸分子的起源。例如，具有等同条形码的多核苷酸可以确定为源于相同的生物颗粒或分隔，而具有不同条形码的多核苷酸可以确定为源于不同的生物颗粒(例如，细胞或核)或分隔。
可以使用各种方法将样品或试剂装载到孔或微孔内。例如，可以使用外力例如重力、电力、磁力或使用将样品或试剂驱动到孔内的机制，例如经由压力驱动的流动、离心、光电子学、声学装载、电动泵送、真空、毛细管流动等，将生物颗粒(例如，细胞、核或细胞组分)或试剂(如本文所述)装载到孔或微孔内。在某些情况下，流体处理系统可以用于将样品或试剂装载到孔内。样品或试剂的装载可以遵循泊松分布或非泊松分布，例如超泊松或亚泊松。可以修改微孔的几何形状、孔之间的间距、密度和大小，以适应有用的样品或试剂分布；例如，可以调整微孔的大小和间距，使得样品或试剂可以以超泊松方式分布。
在一个非限制性例子中，微孔阵列或板包括微孔对，其中每对微孔配置为容纳液滴(例如，包括单一生物颗粒，例如细胞或核)和单一珠(例如本文所述的那些，在一些情况下，其也可以封装在液滴中)。液滴和珠(或含有珠的液滴)可以同时地或序贯地装载，并且例如在液滴和珠接触时、或在施加刺激(例如，外力、搅动、热、光、磁力或电力等)时，液滴和珠可以合并。在一些情况下，液滴和珠的装载是超泊松的。在微孔对的其它例子中，孔配置为容纳包括不同试剂和/或样品的两个液滴，其在接触时或在施加刺激时合并。在此类情况下，该对中的一个微孔的液滴可以包括可以与该对中的另一个微孔的液滴中的试剂反应的试剂。例如，一个液滴可以包括被配置为释放定位于相邻微孔中的另一个液滴中包含的珠的核酸条形码分子的试剂。在液滴合并时，核酸条形码分子可以从珠释放到分隔(例如，处于接触的微孔或微孔对)内，并且可以执行进一步加工(例如，加条形码、核酸反应等)。在其中完整或活的生物颗粒(例如，细胞)装载到微孔中的情况下，液滴之一可以包括用于在液滴合并时裂解生物颗粒(例如，细胞)的裂解试剂。
在一些实施例中，液滴或支持物可以被分隔到孔内。在装载到孔内之前，液滴可以被选择或经受预加工。例如，液滴可以包括生物颗粒(例如，细胞或核)，并且仅某些液滴，例如含有单一生物颗粒(例如，细胞或核)(或至少一种生物颗粒，例如细胞或核)的那些液滴，可以被选择用于孔的装载。此类预选择过程可以用于单一生物颗粒的有效装载，例如以获得非泊松分布，或在孔中的进一步分隔之前就所选特性预过滤生物颗粒(例如，细胞或核)。另外，该技术可以用于在微孔装载之前或期间获得或防止生物颗粒(例如，细胞或核)双重峰或多重峰形成。
在一些实施例中，孔可以包括与其附着的核酸条形码分子。核酸条形码分子可以附着到孔的表面(例如孔的壁)。一个孔的核酸条形码分子(例如，分隔条形码序列)可以不同于另一个孔的核酸条形码分子，其可以允许鉴定单个分隔或孔内包含的内容物。在一些实施例中，核酸条形码分子可以包括空间条形码序列，其可以鉴定孔例如在孔阵列或孔板内的空间坐标。在一些实施例中，核酸条形码分子可以包括用于各个分子鉴定的唯一分子标识符。在一些情况下，核酸条形码分子可以配置为附着或捕获分布在孔中的样品或生物颗粒(例如，细胞或核)内的核酸分子。例如，核酸条形码分子可以包括捕获序列，其可以用于捕获样品或核酸复合物(例如，包含与样品核酸分子杂交的探针的复合物)内的核酸分子(例如，RNA、DNA)或者与之杂交。在一些实施例中，核酸条形码分子可以从微孔中释放。例如，核酸条形码分子可以包括化学交联剂，其可以在施加刺激(例如，光刺激、磁刺激、化学刺激、生物刺激)时被切割。可以与样品核酸分子杂交或配置为与之杂交的释放的核酸条形码分子，可以被收集且合并用于进一步加工，其可以包括核酸加工(例如，扩增、延伸、逆转录等)和/或表征(例如，测序)。在此类情况下，唯一分隔条形码序列可以用于鉴定核酸分子源于其的生物颗粒或分隔。
可以执行孔内的样品的表征。在非限制性例子中，此类表征可以包括生物颗粒(例如，细胞、核或细胞组分)或其衍生物的成像。表征技术例如显微镜检查或成像可以用于测量固定的空间定位中的样品轮廓。例如，当生物颗粒任选地用珠分隔时，每个微孔和其中包含的内容物的成像可以提供关于以下的有用信息：生物颗粒(例如，细胞或核)双重峰形成(例如，频率、空间定位等)、活力、大小、形态、生物标记物(例如，表面标记物、其中荧光标记的分子等)的表达水平、生物颗粒或珠装载率、生物颗粒-珠对的数目等。在一些情况下，成像可以用于表征孔中的活细胞，包括但不限于：动态活细胞跟踪、细胞-细胞相互作用(当两个或更多个细胞共分隔时)、细胞增殖等。可替代地或另外，成像可以用于表征孔中的大量扩增产物。
在操作中，孔可以同时地或序贯地用样品和试剂进行装载。当装载生物颗粒(例如，细胞或核)时，孔可以经受洗涤，例如，以从孔、微孔阵列或板中去除过量的生物颗粒。类似地，可以执行洗涤，以从孔、微孔阵列或板中去除过量的珠或其它试剂。在其中使用活细胞的情况下，细胞可以在各个分隔中进行裂解，以释放细胞内组分或细胞分析物。可替代地，细胞可以在各个分隔中进行固定或渗透化。细胞内组分或细胞分析物可以与例如在微孔的表面上的支持物联接、在固体支持物(例如珠)上联接，或者它们可以进行收集用于进一步的下游加工。例如，在细胞裂解后，细胞内组分或细胞分析物可以转移到各个液滴或其它分隔用于加条形码。可替代地或另外，细胞内组分或细胞分析物(例如，核酸分子)可以联接到包括核酸条形码分子的珠；随后，珠可以进行收集并进一步加工，例如经受核酸反应例如逆转录、扩增或延伸，并且在其上的核酸分子可以例如经由测序进行进一步表征。可替代地或另外，细胞内组分或细胞分析物可以在孔中进行加条形码(例如，使用包括核酸条形码分子的珠，所述核酸条形码分子是可释放的或在包括核酸条形码分子的微孔的表面上)。加条形码的核酸分子或分析物可以在孔中进行进一步加工，或者加条形码的核酸分子或分析物可以从各个分隔中收集，并且经受在分隔外的进一步加工。进一步加工可以包括核酸加工(例如，执行扩增、延伸)或表征(例如，扩增分子的荧光监测、测序)。在任何合适或有用的步骤处，孔(或微孔阵列或板)可以进行密封(例如，使用油、膜、蜡等)，其使得能够贮存测定或选择性引入另外的试剂。
图14示意性地显示了用于加工样品内的核酸分子的示例工作流。可以提供包括多个微孔1402的基底1400。可以包括生物颗粒(例如，细胞、核、细胞组分或分析物(例如，蛋白质和/或核酸分子)的样品1406可以在多个微孔1402中与包括核酸条形码分子的多个珠1404共分隔。在分隔过程期间，样品1406可以在分隔内进行加工。例如，在活细胞的情况下，细胞可以经受足以裂解细胞并释放其中包含的分析物的条件。在过程1420中，珠1404可以进行进一步加工。例如，取决于珠1404的性质，过程1420a和1420b示意性地示出了不同的工作流。
在1420a中，珠包括与其附着的核酸条形码分子，并且样品核酸分子(例如，RNA、DNA)可以例如经由连接的杂交附着到核酸条形码分子。此类附着可以在珠上发生。在过程1430中，可以收集且合并来自多重孔1402的珠1404。可以在过程1440中执行进一步加工。例如，可以执行一种或多种核酸反应，例如逆转录、核酸延伸、扩增、连接等。在一些情况下，衔接子序列与核酸分子或其衍生物连接，如本文其它地方所述。例如，测序引物序列可以附加到核酸分子的每一端。在过程1450中，可以执行进一步的表征例如测序，以生成测序读数。测序读数可以产生关于个别生物颗粒(例如，细胞或核)或生物颗粒群体的信息，所述信息可以在视觉上或用图形例如在图中表示。
在1420b中，珠包括与其可释放地附着的核酸条形码分子，如下所述。珠可以降解核酸条形码分子或以其它方式将核酸条形码分子释放到孔1402内；然后核酸条形码分子可以用于对孔1402内的核酸分子加条形码。可以在分隔内部或在分隔外部执行进一步加工。例如，可以执行一种或多种核酸反应，例如逆转录、核酸延伸、扩增、连接等。在一些情况下，衔接子序列与核酸分子或其衍生物连接，如本文其它地方所述。例如，测序引物序列可以附加到核酸分子的每一端。在过程1450中，可以执行进一步的表征例如测序，以生成测序读数。测序读数可以产生关于个别细胞或细胞群体的信息，所述信息可以在视觉上或用图形例如在图中表示。
多路复用方法
在本公开内容的一些实施例中，本文描述的方法可以以多路复用形式执行。相应地，在一些实施例中，本公开内容提供了用于多路复用、以及以其它方式增加用于分析的样品的流通量的方法和系统。例如，单个或集成的过程工作流可以允许更多或多重分析物、更多或多重类型的分析物、和/或更多或多重类型的分析物表征的加工、鉴定和/或分析。例如，在本文所述的方法和系统中，能够结合或以其它方式联接到一种或多种生物颗粒或生物颗粒的特征(例如，细胞或细胞特征、以及核或核特征)的一种或多种标记试剂可以用于对其进行表征。在一些情况下，细胞或核特征包括细胞表面或核表面(例如，核膜)特征。细胞或核表面特征可以包括但不限于受体、抗原、表面蛋白质、跨膜蛋白质、分化蛋白簇、蛋白质通道、蛋白质泵、载体蛋白质、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞-细胞相互作用蛋白质复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化的T细胞受体、T细胞受体、B细胞受体、嵌合抗原受体、间隙连接、粘着连接或其任何组合。在一些情况下，细胞或核特征可以包括细胞内分析物，例如蛋白质、蛋白质修饰(例如，磷酸化状态或其它翻译后修饰)、核蛋白、核膜蛋白或其任何组合。标记试剂可以包括但不限于蛋白质、肽、抗体(或其表位结合片段)、亲脂性部分(例如胆固醇)、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性T细胞衔接子、T细胞受体衔接子、B细胞受体衔接子、前抗体(pro-body)、适体、单体、affimer、Darpin和蛋白质支架、或其任何组合。标记试剂可以包括(例如，附着到)报道寡核苷酸，其指示结合基团与之结合的细胞表面特征。例如，报道寡核苷酸可以包括允许鉴定标记试剂的条形码序列。例如，对一种类型的细胞或核特征(例如，第一细胞或核表面特征)特异性的标记试剂可以具有与之联接的第一报道寡核苷酸，而对不同细胞或核特征(例如，第二细胞或核表面特征)特异性的标记试剂可以具有与之联接的不同的报道寡核苷酸。关于示例性标记试剂、报道寡核苷酸和使用方法的描述，参见例如美国专利10,550,429；美国专利公开20190177800；和美国专利公开20190367969。
在特定例子中，可以提供潜在的细胞或核特征标记试剂的文库，其中分别的细胞或核特征标记试剂与核酸报道分子结合，使得不同的报道寡核苷酸序列与能够结合特定细胞或核特征的每种标记试剂结合。在其它方面，文库的不同成员可以通过不同寡核苷酸序列标记的存在进行表征。例如，能够与第一蛋白质结合的抗体可以具有与其结合的第一报道寡核苷酸序列，而能够与第二蛋白质结合的抗体可以具有与其结合的不同的报道寡核苷酸序列。特定寡核苷酸序列的存在可以指示特定抗体或者可以由特定抗体识别或结合的细胞/核特征的存在。
能够与一个或多个细胞或核结合或以其它方式联接的标记试剂可以用于将细胞或核表征为属于特定细胞组。例如，标记试剂可以用于标记细胞/核样品或一组细胞或核。以这种方式，一组细胞/核可以标记为与另一组细胞/核不同。在一个例子中，第一组细胞/核可以源于第一样品，而第二组细胞/核可以源于第二样品。标记试剂可以允许第一组和第二组具有不同的标记试剂(或与标记试剂相关的报道寡核苷酸)。例如，这可以促进多路复用，其中第一组的细胞/核和第二组的细胞/核可以分开进行标记，然后合并在一起用于下游分析。标记的下游检测可以将分析物指示为属于特定组。
例如，报道寡核苷酸可以连接到抗体或其表位结合片段，并且标记细胞或核可以包括使抗体连接的条形码分子或表位结合片段连接的条形码分子经受适合于抗体与细胞或核的表面上存在的分子结合的条件。抗体或其表位结合片段与表面上存在的分子之间的结合亲和力可以在所需范围内，以确保抗体或其表位结合片段保持与分子结合。例如，结合亲和力可以在所需范围内，以确保抗体或其表位结合片段在各种样品加工步骤(例如分隔和/或核酸扩增或延伸)期间保持与分子结合。抗体或其表位结合片段和它与之结合的分子之间的解离常数(Kd)可以小于约100μM、90μM、80μM、70μM、60μM、50μM、40μM、30μM、20μM、10μM、9μM、8μM、7μM、6μM、5μM、4μM、3μM、2μM、1μM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、400nM、300nM、200nM、100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、900pM、800pM、700pM、600pM、500pM、400pM、300pM、200pM、100pM、90pM、80pM、70pM、60pM、50pM、40pM、30pM、20pM、10pM、9pM、8pM、7pM、6pM、5pM、4pM、3pM、2pM或1pM。例如，解离常数可以小于约10μM。
在另一个例子中，报道寡核苷酸可以与细胞穿透肽(CPP)联接，并且标记细胞可以包括将CPP联接的报道寡核苷酸递送到分析物载体内。标记分析物载体可以包括通过细胞穿透肽将CPP缀合的寡核苷酸递送到细胞或核内。可以用于本文提供的方法中的CPP可以包括至少一个非功能性半胱氨酸残基，其可以是游离的或衍生化的，以与已对于此类键合进行修饰的寡核苷酸形成二硫键。可以用于本文实施例中的CPP的非限制性例子包括渗透素、转运素、plsl、TAT(48-60)、pVEC、MTS和MAP。可用于本文提供的方法中的细胞穿透肽可以具有诱导细胞群体的至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％细胞的细胞穿透的能力。CPP可以是富含精氨酸的肽转运载体。CPP可以是渗透素或Tat肽。在另一个例子中，报道寡核苷酸可以与荧光团或染料联接，并且标记细胞可以包括使荧光团连接的条形码分子经受适合于荧光团与细胞的表面结合的条件。在一些情况下，荧光团可以与脂质双层强烈相互作用，并且标记细胞/核可以包括使荧光团连接的条形码分子经受这样的条件，使得荧光团结合或插入细胞或核的膜内。在一些情况下，荧光团是水溶性有机荧光团。在一些情况下，荧光团是Alexa 532马来酰亚胺、四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺(TMR马来酰亚胺)、BODIPY-TMR马来酰亚胺、磺基-Cy3马来酰亚胺、Alexa 546羧酸/琥珀酰亚胺酯、Atto 550马来酰亚胺、Cy3羧酸/琥珀酰亚胺酯、Cy3B羧酸/琥珀酰亚胺酯、Atto 565生物素、磺基罗丹明B、Alexa 594马来酰亚胺、Texas Red马来酰亚胺、Alexa 633马来酰亚胺、Abberior STAR 635P叠氮化物、Atto 647N马来酰亚胺、Atto 647SE或磺基-Cy5马来酰亚胺。关于有机荧光团的描述，参见例如，Hughes L D等人，PLoS One.2014年2月4日；9(2):e87649。
报道寡核苷酸可以与亲脂性分子联接，并且标记细胞/核可以包括通过亲脂性分子将核酸条形码分子递送至细胞的膜或核膜。亲脂性分子可以与脂质膜结合和/或插入脂质膜内，所述脂质膜例如细胞膜和核膜。在一些情况下，插入可以是可逆的。在一些情况下，亲脂性分子与细胞膜或核膜之间的结合可以是这样的，使得膜在后续加工(例如，分隔、细胞渗透化、扩增、合并等)期间保留亲脂性分子(例如，以及其结合的组分，例如核酸条形码分子)。报道核苷酸可以进入细胞内空间和/或细胞核内。在一些实施例中，与亲脂性分子联接的报道寡核苷酸将经由亲脂性分子保持与脂质膜(如本文所述)结合和/或插入脂质膜内，直到细胞或核的裂解例如在分隔内部发生。与报道寡核苷酸联接的亲脂性分子的示例性实施例在PCT/US2018/064600中进行描述。
报道寡核苷酸可以是核酸分子的部分，所述核酸分子包括任何数目的如本文其它地方所述的功能序列，例如靶捕获序列、随机引物序列等等，并且与其为分析物或源自分析物的另一种核酸分子联接。
在分隔之前，细胞或核可以与标记试剂的文库一起温育，所述标记试剂的文库可以是针对不同细胞或核特征例如受体、蛋白质等的广泛实验对象组的标记试剂，并且包括其相关的报道寡核苷酸。未结合的标记试剂可以从细胞/核中洗掉，然后细胞/核可以连同分隔特异性条形码寡核苷酸(例如，附着到支持物，例如珠或凝胶珠)一起共分隔(例如，到液滴或孔内)，如本文其它地方所述。因此，分隔可以包括细胞/核或多个细胞/核、以及结合的标记试剂及其已知的相关的报道寡核苷酸。
在其它情况下，例如，为了促进样品多路复用，对特定细胞或核特征特异性的标记试剂可以具有与第一报道寡核苷酸联接的第一多个标记试剂(例如，抗体或亲脂性部分)，以及与第二报道寡核苷酸联接的第二多个标记试剂。例如，第一多个标记试剂和第二多个标记试剂可以与不同的细胞/核、细胞/核群体或样品相互作用，允许特定报道寡核苷酸指示特定细胞或核群体(或细胞/核或样品)和细胞特征。以这种方式，不同的样品或组可以独立地进行加工并随后组合在一起用于合并分析(例如，如本文其它地方所述的基于分隔的加条形码)。参见例如，美国专利公开20190323088。
在一些实施例中，为了促进样品多路复用，各个样品可以用脂质标签进行染色，所述脂质标签例如胆固醇修饰的寡核苷酸(CMO，参见例如图16)、抗钙通道抗体或抗ACTB抗体。抗钙通道抗体的非限制性例子包括抗KCNN4抗体、抗BK通道β3抗体、抗a1B钙通道抗体和抗CACNA1A抗体。适合于本公开内容的方法的抗ACTB抗体的例子包括但不限于mAbGEa、ACTN05、AC-15、15G5A11/E2、BA3R和HHF35。
如本文其它地方所述，标记试剂的文库可以与特定细胞/核特征相关，并且可以用于将分析物鉴定为源于特定细胞/核群体或样品。细胞或核群体可以与多个文库一起温育，使得细胞/核或多个细胞/核包括多重标记试剂。例如，细胞或核可以包括与其联接的亲脂性标记试剂和抗体。亲脂性标记试剂可以指示细胞或核是特定细胞/核样品的成员，而抗体可以指示细胞/核包括特定分析物。以这种方式，报道寡核苷酸和标记试剂可以允许执行多分析物、多路复用的分析。
在一些情况下，这些报道寡核苷酸可以包括核酸条形码序列，其允许鉴定报道寡核苷酸与之联接的标记试剂。使用寡核苷酸作为报道分子可以提供以下优点：能够在序列方面生成显著多样性，同时也易于附着到大多数生物分子例如抗体等，以及例如使用测序或阵列技术易于检测。
报道寡核苷酸与标记试剂的附接(联接)可以通过各种直接或间接、共价或非共价结合或附着中的任一种来实现。例如，寡核苷酸也可以使用化学缀合技术(例如可从InnovaBiosciences获得的Lightning-
抗体标记试剂盒)，以及其它非共价附着机制共价附着到标记试剂(例如蛋白质，例如抗体或抗体片段)的一部分，所述其它非共价附着机制例如使用具有抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白接头的生物素化抗体和寡核苷酸(或包括与寡核苷酸联接的一种或多种生物素化接头的珠)。抗体和寡核苷酸生物素化技术是可用的。参见例如，Fang等人，“Fluoride-Cleavable Biotinylation Phosphoramidite for5′-end-Labelling and Affinity Purification of Synthetic Oligonucleotides,”Nucleic Acids Res.2003年1月15日；31(2):708-715。同样地，蛋白质和肽生物素化技术已得到开发并且可容易获得。参见例如，美国专利号6,265,552。此外，点击反应化学如甲基四嗪-PEG5-NHS酯反应、TCO-PEG4-NHS酯反应等等可以用于将报道寡核苷酸联接到标记试剂。商购可得的试剂盒，例如来自Thunderlink和Abcam的试剂盒，以及本领域常用的技术，可以用于将报道寡核苷酸与适当的标记试剂联接。在另一个例子中，标记试剂间接(例如，经由杂交)联接到包括鉴定标记试剂的条形码序列的报道寡核苷酸。例如，标记试剂可以直接联接(例如，共价结合)到杂交寡核苷酸，其包括与报道寡核苷酸的序列杂交的序列。杂交寡核苷酸与报道寡核苷酸的杂交将标记试剂与报道寡核苷酸联接。在一些实施例中，例如在施加刺激时，报道寡核苷酸可从标记试剂中释放。例如，报道寡核苷酸可以通过不稳定键(例如，化学不稳定的、光不稳定的、热不稳定的等)与标记试剂附着，如本文其它地方对于从支持物中释放分子一般描述的。在一些情况下，本文所述的报道寡核苷酸可以包括可以用于后续加工中的一种或多种功能序列，例如衔接子序列、唯一分子标识符(UMI)序列、测序仪特异性流动池附着序列(例如P5、P7、或者部分P5或P7序列)、引物或引物结合序列、测序引物或引物结合序列(例如R1、R2、或者部分R1或R2序列)。
在一些情况下，标记试剂可以包括报道寡核苷酸和标记。标记可以是荧光团、放射性同位素、能够进行比色反应的分子、磁性颗粒、或者能够检测的任何其它合适的分子或化合物。标记可以直接或间接缀合到标记试剂(或报道寡核苷酸)(例如，标记可以缀合到可以结合标记试剂或报道寡核苷酸的分子)。在一些情况下，标记缀合到与报道寡核苷酸的序列互补的寡核苷酸，并且可以允许寡核苷酸与报道寡核苷酸杂交。
附着到支持物(例如珠)的示例性条形码分子显示于图15中。在一些实施例中，多重分析物(例如，使用本文所述的标记试剂的RNA和一种或多种分析物)的分析可以包括如图15中一般描绘的核酸条形码分子。在一些实施例中，核酸条形码分子1510和1520经由可释放键合1540(例如，包括不稳定键)附着到支持物1530，如本文其它地方所述。核酸条形码分子1510可以包括功能序列1511、条形码序列1512和捕获序列1513。核酸条形码分子1520可以包括衔接子序列1521、条形码序列1512和捕获序列1523，其中捕获序列1523包括与捕获序列1513不同的序列。在一些情况下，衔接子1511和衔接子1521包括相同的序列。在一些情况下，衔接子1511和衔接子1521包括不同的序列。尽管显示了包括核酸条形码分子1510和1520的支持物1530，但本文考虑了包括通用条形码序列1512的任何合适数目的条形码分子。例如，在一些实施例中，支持物1530还包括核酸条形码分子1550。核酸条形码分子1550可以包括衔接子序列1551、条形码序列1512和捕获序列1553，其中捕获序列1553包括与捕获序列1513和1523不同的序列。在一些情况下，核酸条形码分子(例如，1510、1520、1550)包括一种或多种另外的功能序列，例如UMI或本文所述的其它序列。核酸条形码分子1510、1520或1550可以与如本文其它地方所述的分析物相互作用，例如，如图17A和17B中描绘的。
参考图16，在一些情况下，与抗原(例如，1610、1620、1630)缀合的报道寡核苷酸1640可以包括功能序列1641(例如，衔接子)、鉴定抗原或抗原结合分子(例如，1610、1620、1630)的条形码序列、以及功能序列(例如，衔接子或捕获柄)1643。捕获柄1643可以配置为与互补序列(例如，捕获序列)杂交，所述互补序列例如存在于分隔特异性条形码分子(未显示)上的互补序列(例如，捕获序列)，例如本文其它地方描述的那些互补序列。捕获柄1643可以包括与分隔特异性条形码分子上的捕获序列互补的序列。在一些情况下，分隔特异性条形码分子附着到支持物(例如珠，例如凝胶珠)，例如本文其它地方描述的那些支持物。例如，分隔特异性条形码分子可以经由可释放的键合(例如，包含不稳定键)，例如本文其它地方描述的那些键合附着到支持物。在一些情况下，报道寡核苷酸1640包括一种或多种另外的功能序列，例如上文描述的那些功能序列。在其它示例性实施例中，分隔特异性条形码分子可以包括下述中的一种或多种：肽标签、寡核苷酸条形码、功能序列、通用条形码、UMI和报道捕获序列。
在一些情况下，抗原1610是与报道寡核苷酸1640缀合的蛋白质或多肽(例如，抗原或前瞻性抗原)。报道寡核苷酸1640含有报道序列(或报道条形码序列)1642，其鉴定蛋白质或多肽1610，并且可以用于推断例如蛋白质或多肽1610的结合配偶体(即，蛋白质或多肽与之结合的分子或化合物)的存在。在一些情况下，1610是包含报道寡核苷酸1640的亲脂性部分(例如胆固醇)，其中这样选择亲脂性部分，使得1610整合到细胞或核的膜内。报道寡核苷酸1640含有鉴定亲脂性部分1610的报道序列1642，在一些情况下，所述亲脂性部分用于给细胞(例如，细胞组、细胞样品等)加上标签，用于如本文其它地方所述的多路复用分析。
在一些情况下，抗原结合分子是抗体1620(或其表位结合片段)，其包括报道寡核苷酸1640。报道寡核苷酸1640包括鉴定抗体1620的报道序列1642，并且可以用于推断例如抗体1620的靶(即，抗体1620与之结合的分子或化合物)的存在。
在一些实施例中，待标记的试剂1630包括MHC分子1631，其包括肽1632和鉴定肽1632的寡核苷酸1640。在一些情况下，MHC分子与支持物1633联接。在一些情况下，支持物1633是链霉抗生物素蛋白(例如，MHC分子1631可以包括生物素)。在一些实施例中，支持物1633是多糖，例如葡聚糖。在一些情况下，报道寡核苷酸1640可以以任何合适的方式直接或间接联接到MHC标记试剂1630，例如联接到MHC分子1631、支持物1633或肽1632。在一些实施例中，标记试剂1630包括多个MHC分子，例如是MHC多聚体，其可以联接到支持物(例如，1633)。存在I类和/或II类MHC多聚体的许多可能构型，其可以与本文公开的组合物、方法和系统一起利用，例如MHC四聚体、MHC五聚体(经由卷曲螺旋结构域组装的MHC，例如
MHC I类五聚体(ProImmune，Ltd.)、MHC八聚体、MHC十二聚体、MHC修饰的葡聚糖分子(例如，MHC
(Immudex))等。关于各种抗原的示例性标记的描述，包括基于抗体和MHC的标记试剂、报道寡核苷酸和使用方法，参见例如美国专利10,550,429和美国专利公开20190367969。
参考图17A，在其中细胞用标记试剂进行标记的情况下，捕获序列1723可以与报道寡核苷酸的衔接子序列互补。可以使细胞与一种或多种报道寡核苷酸1720缀合的标记试剂1710(例如，多肽、抗体或本文其它地方描述的其它物质)接触。在一些情况下，细胞可以在加条形码之前进行进一步加工。例如，此类加工步骤可以包括一个或多个洗涤和/或细胞分选步骤。在一些情况下，与标记试剂1710结合的细胞被分隔到多个分隔(例如，液滴乳状液的液滴或微孔阵列的孔)中的一分隔内，所述标记试剂缀合到寡核苷酸1720和支持物1730(例如珠，例如凝胶珠)，包括核酸条形码分子1790。在一些情况下，分隔最多包括与标记试剂1710结合的单一细胞。在一些情况下，与标记试剂1710(例如，多肽、抗体、pMHC分子例如MHC多聚体等)缀合的报道寡核苷酸1720包括第一功能序列1711(例如，引物序列)、鉴定标记试剂1710(例如，pMHC分子或复合物的多肽、抗体或肽)的条形码序列1712、以及捕获柄序列1713。捕获柄序列1713可以配置为与互补序列杂交，所述互补序列例如存在于核酸条形码分子1790(例如，分隔特异性条形码分子)上的捕获序列1723。在一些情况下，寡核苷酸1720包括一种或多种另外的功能序列，例如本文其它地方描述的那些功能序列。
加条形码的核酸分子可以由图17A-17B中描述的构建体生成(例如经由核酸反应，例如核酸延伸或连接)。例如，捕获柄序列1713然后可以与互补捕获序列1723杂交，以生成(例如经由核酸反应，例如核酸延伸或连接)包括细胞条形码(例如，通用条形码或分隔特异性条形码)序列1722(或其反向互补体)和报道序列1712(或其反向互补体)的加条形码的核酸分子。在一些实施例中，核酸条形码分子1790(例如，分隔特异性条形码分子)还包括UMI(1725)。加条形码的核酸分子然后可以任选地如本文其它地方所述进行加工，例如以扩增分子和/或将测序平台特异性序列附加到片段。参见例如，美国专利公开2018/0105808，其以引用的方式整体并入本文。然后可以在合适的测序平台上，对加条形码的核酸分子或由此生成的衍生物进行测序。
在一些情况下，可以执行多重分析物(例如，使用本文所述的标记试剂的核酸和一种或多种分析物)的分析。例如，工作流可以包括如图17A-17B的任一个中一般描绘的工作流，或如本文其它地方所述的用于各个分析物的工作流组合。例如，通过使用如图17A-17B中一般描绘的工作流组合，可以分析多重分析物。
在一些情况下，分析物(例如，核酸、多肽、碳水化合物、脂质等)的分析包括如图17A中一般描绘的工作流。核酸条形码分子1790可以与一种或多种分析物共分隔。在一些情况下，核酸条形码分子1790附着到支持物1730(例如珠，例如凝胶珠)，例如本文其它地方描述的那些支持物。例如，核酸条形码分子1790可以经由可释放的键合1740(例如，包括不稳定键)，例如本文其它地方描述的那些可释放的键合附着到支持物1730。核酸条形码分子1790可以包括功能序列1721，并且任选地包括其它附加序列，例如条形码序列1722(例如，通用条形码、分隔特异性条形码或本文其它地方描述的其它功能序列)、和/或UMI序列1725。核酸条形码分子1790可以包括捕获序列1723，其可以与另一种核酸序列互补，使得它可以与特定序列杂交。
例如，捕获序列1723可以包括配置为与如本文所述的一种或多种核酸探针杂交的序列。参考图17B，核酸条形码分子1790包括与一种或多种探针(例如一对探针)的序列互补的捕获序列1723，所述探针与来自生物颗粒(例如，细胞或核)的RNA分子1760杂交。探针可以彼此连接，并且任选地与RNA分子杂交用于加条形码过程。捕获序列1723可以包括已知或靶向序列或随机序列。捕获序列1723可以包括与其为探针的部分的条形码序列1770的探针序列互补的序列。在一些情况下，可以执行核酸延伸反应，从而生成加条形码的核酸产物，其包括捕获序列1723、功能序列1721、UMI序列1725、任何其它功能序列、以及对应于作为1760的部分描绘的探针的序列。在这个实施例中，所得到的加条形码的核酸产物将不包括RNA分子的原始序列，而是包括与RNA分子杂交的探针的序列。加条形码的核酸产物缺乏原始RNA分子。
适合于对核酸分子加条形码的另外方法和组合物描述于美国专利公开号2015/0376609、2019/0367969、US 2020-0239874、US 2021-0040551，以及国际PCT申请WO2019/165318和PCT/US20/48620中。
并不意味着限制性的本发明的实施例在下文的编号段落中进行描述。
1.一种从冷冻的生物组织中提取且分离固定的细胞和核的方法，其包括以下步骤：
提供冷冻生物组织的样品；
用有机固定试剂处理生物组织的样品；
将生物组织分离成组织区段，以促进生物组织通过有机固定试剂的灌注和固定；
使组织区段的固定淬灭；
用解离酶混合物处理固定的组织区段；
将固定的组织区段粉碎成解离的组织颗粒；
将第一缓冲溶液加入解离的组织颗粒中，以形成混合物；
将混合物离心以产生至少一种丸粒；
将至少一种丸粒加入第二缓冲溶液中，以形成悬浮液；和
过滤悬浮液以产生多个固定的、分离的细胞和核。
2.段落1的方法，其中所述冷冻的生物组织是急速冷冻的。
3.段落1的方法，其中所述有机固定试剂选自醇、酮、醛、交联剂、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、辛二亚氨酸二甲基酯(DMS)、福尔马林、己二亚氨酸二甲基酯(DMA)、二硫代-双(-丙酸琥珀酰亚胺酯)(DSP)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、乙二醇双(琥珀酸琥珀酰亚胺酯)(EGS)、双咪唑羧酸酯化合物及其组合。
4.段落3的方法，其中所述有机固定试剂包含福尔马林。
5.段落4的方法，其中所述福尔马林包含按重量计约2％至约6％的甲醛水溶液。
6.段落1的方法，其中用有机固定试剂处理包括在约零至约5摄氏度的温度下，将有机固定试剂施加到生物组织。
7.段落1的方法，其中所述处理步骤包括将有机固定试剂置于冰床上，并且将生物组织的样品浸入有机固定试剂中。
8.段落1的方法，其还包括在用有机固定试剂处理期间，以一个或多个周期性间隔，将生物组织的区段分离成更小的区段的步骤，以进一步促进生物组织的灌注和固定。
9.段落7的方法，其中将所述生物组织的区段以两个或更多个周期性间隔分离成连续更小的区段。
10.段落7的方法，其中将所述生物组织的区段以三个或更多个周期性间隔分离成连续更小的区段。
11.段落7的方法，其中将所述生物组织的区段以四个或更多个周期性间隔分离成连续更小的区段。
12.段落1的方法，其中将所述生物组织的样品用有机固定试剂处理约10至约30分钟的时间。
13.段落1的方法，其中将所述生物组织的样品用有机固定试剂处理约15至约25分钟的时间。
14.段落8的方法，其中所述一个或多个周期性间隔的总和为约10至约30分钟。
15.段落8的方法，其中所述一个或多个周期性间隔的总和为约15至约25分钟。
16.段落8的方法，其中所述一个或多个周期性间隔各自为约1至约10分钟。
17.段落8的方法，其中所述一个或多个周期性间隔各自为约3至约7分钟。
18.段落1的方法，其中使组织区段的固定淬灭的步骤包括将固定的组织区段浸入淬灭介质中的步骤。
19.段落18的方法，其中所述淬灭介质包含磷酸盐缓冲溶液。
20.段落19的方法，其中所述磷酸盐缓冲溶液包含1X PBS。
21.段落19的方法，其中所述磷酸盐缓冲溶液还包含胎牛血清。
22.段落21的方法，其中所述胎牛血清以按磷酸盐缓冲溶液的重量计约5％至约15％存在。
23.段落18的方法，其中所述淬灭介质包含按重量计约55％至约85％的乙醇和按重量计约15％至约35％的水。
24.段落18的方法，其中所述淬灭介质具有约零至约10摄氏度的温度。
25.段落1的方法，其中所述解离酶混合物包含胶原酶和二硫苏糖醇。
26.段落25的方法，其中所述解离酶混合物还包含核糖核酸酶抑制剂。
27.段落1的方法，其中所述粉碎步骤包括使固定的组织区段通过滤器。
28.段落27的方法，其中所述滤器具有大小为约5微米至约200微米的开口。
29.段落27的方法，其中所述滤器具有大小为约25微米至约100微米的开口。
30.段落1的方法，其中所述第一缓冲溶液包含磷酸盐缓冲盐水溶液。
31.段落30的方法，其中所述第一缓冲溶液还包含牛血清白蛋白。
32.段落1的方法，其中所述离心在约零至约10摄氏度的温度下执行。
33.段落1的方法，其中所述离心以约50g至约2500g的力执行。
34.段落1的方法，其中所述离心以约200g至约1000g的力执行。
35.段落1的方法，其中所述第二缓冲溶液包含磷酸盐缓冲盐水溶液。
36.段落35的方法，其中所述第二缓冲溶液还包含牛血清白蛋白。
37.段落1的方法，其中所述过滤步骤包括使悬浮液通过中值孔径为约1微米至约500微米的过滤器。
38.段落1的方法，其中所述过滤步骤包括使悬浮液通过中值孔径为约10微米至约100微米的过滤器。
39.一种从冷冻的生物组织中提取且分离固定的细胞和核的方法，其包括以下步骤：
用固定试剂固定源自冷冻的生物组织的多个组织区段；
使组织区段的固定淬灭；
用解离酶处理固定的组织区段；
将固定的组织区段分离成解离的组织颗粒；
将第一缓冲溶液加入解离的组织颗粒中，以形成混合物；
将混合物离心以产生至少一种丸粒；
将至少一种丸粒加入第二缓冲溶液中，以形成悬浮液；和
过滤悬浮液以产生多个固定的、分离的细胞和核。
40.段落39的方法，其中使固定淬灭包括将固定的组织区段暴露于磷酸盐缓冲盐水溶液和胎牛血清的混合物。
41.段落40的方法，其中所述混合物具有约零至约10摄氏度的温度。
42.段落39的方法，其中所述冷冻的生物组织是急速冷冻的。
43.段落39的方法，其中所述固定试剂包含有机固定试剂。
44.段落43的方法，其中所述有机固定试剂包含甲醛。
45.段落39的方法，其中所述解离酶混合物包含胶原酶和二硫苏糖醇。
46.段落45的方法，其中所述解离酶混合物还包含核糖核酸酶抑制剂。
47.段落1的方法，其中所述分离步骤包括强迫固定的组织区段通过滤器。
48.段落47的方法，其中所述滤器具有直径为约5微米至约200微米的开口。
49.段落39的方法，其中所述第一缓冲溶液包含磷酸盐缓冲盐水溶液。
50.段落49的方法，其中所述第一缓冲溶液还包含牛血清白蛋白。
51.段落39的方法，其中所述离心在约零至约10摄氏度的温度下执行。
52.段落51的方法，其中所述离心以约50g至约2500g的力执行。
53.段落39的方法，其中所述第二缓冲溶液包含磷酸盐缓冲盐水溶液。
54.段落53的方法，其中所述第二缓冲溶液还包含牛血清白蛋白。
55.段落39的方法，其中所述过滤步骤包括使悬浮液通过中值孔径为约1微米至约200微米的过滤器。
56.一种从冷冻的生物组织中提取且分离固定的细胞和核的方法，其包括以下步骤：
提供急速冷冻的生物组织的样品；
用有机固定试剂处理生物组织；
将生物组织分离成组织区段，以促进生物组织通过有机固定试剂的灌注和固定；
将固定的组织区段解离成解离的组织颗粒；
将第一缓冲溶液加入解离的组织颗粒中，以形成混合物；
将混合物离心以产生至少一种丸粒；
将至少一种丸粒加入第二缓冲溶液中，以形成悬浮液；和
过滤悬浮液以产生多个固定的、分离的细胞和核。
57.段落56的方法，其中用有机固定试剂处理生物组织的步骤包括在约零至约10摄氏度的温度下，将急速冷冻的生物组织暴露于冷却的有机固定试剂。
58.段落56的方法，其中将生物组织分离成组织区段的步骤在用有机固定试剂处理生物组织的步骤之前和/或期间执行。
59.段落56的方法，其中将固定的组织区段解离成组织颗粒的步骤包括以下步骤：
用解离酶混合物处理固定的组织区段；和
将固定的组织区段粉碎成解离的组织颗粒。
60.段落59的方法，其中所述解离酶混合物包含胶原酶和二硫苏糖醇。
61.段落60的方法，其中所述解离酶混合物还包含核糖核酸酶抑制剂。
62.段落59的方法，其中所述粉碎步骤包括使固定的组织区段通过滤器。
63.段落62的方法，其中所述滤器具有直径为约5微米至约200微米的开口。
64.段落56的方法，其中所述第一缓冲溶液包含磷酸盐缓冲盐水溶液。
65.段落63的方法，其中所述第一缓冲溶液还包含牛血清白蛋白。
66.段落56的方法，其中所述离心在约零至约10摄氏度的温度下执行。
67.段落66的方法，其中所述离心以约50g至约2500g的力执行。
68.段落56的方法，其中所述第二缓冲溶液包含磷酸盐缓冲盐水溶液。
69.段落68的方法，其中所述第二缓冲溶液还包含牛血清白蛋白。
70.段落56的方法，其中所述过滤步骤包括使悬浮液通过中值孔径为约1微米至约200微米的过滤器。
71.一种在生物组织样品中的核糖核酸(RNA)分析的方法，其包括
a)使生物组织样品与有机固定试剂接触；
b)在有机固定试剂的存在下，将生物组织样品分成组织区段，以允许有机固定试剂灌注到组织区段内；
c)使组织区段解离，以提供多个单一细胞和/或单一核；以及
d)对多个单一细胞和/或单一核执行RNA分析。
72.段落71的方法，其中步骤(a)的生物组织是冷冻的或新鲜的生物组织。
73.段落71或72的方法，其中所述RNA分析包括RNA模板化连接。
74.段落73的方法，其中所述RNA模板连接包括检测多个单一细胞和/或单一核中的连接产物。
75.段落73的方法，其中将所述多个单一细胞和/或单一核分隔到多个分隔内。
76.段落75的方法，其中所述多个分隔包含多个连接产物。
77.段落74的方法，其中在检测连接产物之后，将所述多个单一细胞和/或单一核分隔到多个分隔内。
78.段落75的方法，其中所述多个分隔是多个液滴或多个微孔。
79.段落76的方法，其还包括生成多个加条形码的核酸分子，其中所述多个加条形码的分子中的加条形码的核酸分子包含分隔特异性序列和对应于多个连接产物的序列。
80.段落71-79中任何一个的方法，其中所述步骤在解除固定试剂的不存在下执行。
81.一种组合物，其包含来自段落1-70中任何一个的固定细胞和核。
实例
下述实例用于示出各个实施例并且不被解释为限制。
实例1.加工组织以获得单一细胞
从液氮贮存中取出具有玉米粒的近似大小的急速冷冻的人淋巴结组织样品，并且直接置于含有在冰上冷却的4％甲醛溶液的管内。在5分钟后，将组织样品切割成四个更小的区段，同时浸入甲醛溶液中。在另一个5分钟后，在浸入的同时将组织区段切割成更小的区段，并且在另一个5分钟后重复该过程。在浸入期间组织区段的周期性区段化促进了甲醛溶液灌注到组织区段内。在固定20分钟后，将组织区段从管中取出，并且置于具有10％ FBS的1X PBS的冷却溶液内，以使固定反应淬灭。
从淬灭介质中取出固定且淬灭淬灭的组织区段，并且置于解离酶混合物中，所述解离酶混合物含有在RPMI 1640中的0.1mg/ml释放酶(胶原酶I和II)、10mM DTT和0.2单位/μl的来自Thermo Fisher Scientific的核糖核酸酶抑制剂。使组织区段在解离酶混合物中在370C下温育10分钟，伴随间歇研磨，以使组织区段进一步解离。然后将固定的组织区段从解离酶混合物中取出，并且使用注射器柱塞的背面捣碎通过70μM Miltenyi MACs细胞滤器，并且在新管中收集所得到的组织颗粒。然后使用具有按重量计0.04％的BSA的1X PBS的冷却缓冲溶液洗涤滤器，并且在新管中收集流出物。
将组织颗粒和冷却的缓冲溶液流出物的混合物在40C下以500g的力离心5分钟。收集所得到的丸粒，并且重悬浮于具有按重量计0.04％的BSA的1X PBS的缓冲溶液中。使用40μM FlowMi过滤器过滤所得到的悬浮液，以产生固定、分离的组织细胞和细胞核的集合。
实例2.使用来自组织的单一细胞的RNA模板化连接
固定的、分离的组织细胞和细胞核的集合遵循下文所述的RNA模板化连接方案进行加工。目的是通过首先使靶向探针与细胞和核的模板RNA杂交，随后为连接，来产生用于靶向单一细胞RNA测序的可测序文库。连接的细胞然后通过GEM基因生成获取，随后为进一步加工，以产生用于测序(例如，在Illumina仪器上)的文库。
为了执行RNA模板连接，将900μl如表1中所示的杂交缓冲液加入100μl染色的、固定的PBMC中。这在45℃下温育2小时，伴随以500rpm的振荡。然后将混合物转移到15ml螺旋盖管中，并且将杂交后缓冲液(表2)加入到10ml，并且缓慢倒置5次。将管在室温下以500x g离心5分钟。去除上清液而不扰乱丸粒。使用宽口移液器吸头，将丸粒轻轻重悬浮于1ml杂交后缓冲液中。然后在37℃下用杂交后缓冲液使混合物达到10ml。将管再次离心，如上去除上清液，并且将丸粒轻轻重悬浮于1ml连接缓冲液中(表3)。然后在37℃下用连接缓冲液使混合物达到5ml。将管再次离心，如上去除上清液，并且在37℃下将丸粒重悬浮于200μL连接缓冲液中。添加以10μL的RNL2。使混合物在37℃下伴随振荡(500rpm)温育2小时。将管离心，如上去除上清液，并且将丸粒重悬浮于200μL细胞重悬缓冲液中(表4)。
在如上的杂交和连接之后，使用可从10X Genomics获得的Single Cell 3’Reagent Kit，版本3的修改，来操作固定的细胞和核。修改包括具有来自New EnglandBioLabs的Bst 2.0Warm
DNA聚合酶的下述GEM生成主混合物(表5)和下述GEM RT热循环仪温育(表6)。
在GEM生成后，遵循由10X Genomics公开的Single Cell 3′Reagent Kits v3User Guide完成进一步加工。在GEM-RT后提纯步骤中完成另一项修改。从每个样品中去除125μl回收剂/分隔油(粉红色)后，剩下60μL水相(透明)。将60μL拆分成两个等同的聚合酶链(PCR)反应，其中各30μL加入含有70μL下述主混合物的两个分开的管中，所述主混合物含有部分Illumina Nextera读数1引物序列和部分Illumina小RNA测序引物读数2(表7)。
100μl PCR反应具有表8中所示的热循环仪温育参数。
在第一次PCR反应后，遵循Single Cell 3′Reagent Kits v3 User Guide完成用固相反向固定珠(
)的cDNA提纯。代替0.6X SPRI提纯，完成1.8X SPRI提纯，其中将180μL
试剂加入每个样品中。另一个修改是缓冲液EB(洗脱缓冲液)的最终洗脱体积，其对于每个等同样品为25μl，然后合并为总共50μL洗脱的cDNA，而不是Single Cell 3′Reagent Kits v3 User Guide中的40μL。
然后将十μl扩增的RNA模板化连接的cDNA带入具有表9中所示的主混合物的样品索引PCR内，所述主混合物含有用于Illumina桥式扩增的P5-部分Nextera读数1和P7-小RNA样品索引引物。
关于100μl样品索引PCR的热循环仪参数显示于表10中。
在样品索引PCR反应后，遵循Single Cell 3′Reagent Kits v3 User Guide完成用
的cDNA提纯。代替0.6X SPRI提纯，完成1.2X SPRI提纯，其中将120μL
试剂加入每个样品中。如Single Cell 3′ Reagent Kits v3 User Guide中所述，缓冲液EB(洗脱缓冲液)的最终洗脱体积为40μL。
实例3.分析
将来自实例2的所得到的最终可测序文库在缓冲液EN中1:10稀释，并且使用Agilent 2100Bioanalyzer进行分析。该生物分析仪提供了基于微流体的平台，用于DNA和RNA的大小分级、定量和质量控制。在将固定、分离的细胞和细胞核样品装载到所需芯片上之后，样品通过微通道移动，并且样品组分进行亲电分离。较小的组分比较大的组分迁移得更快。荧光染料分子嵌入DNA和RNA链内，其然后可以通过其荧光进行检测并且转变成凝胶状图像(条带)和电泳图(峰)。
代表本发明的图8是显示连接产物的生物分析仪图，所述连接产物得自根据本发明的方法制备的固定的、分离的细胞和细胞核的集合的RNA模板化连接。PL Minus Strand(SC3P 50bp R2)用于索引方案。代表1000、2000、3000和6000个细胞的四种不同细胞负荷的四种cDNA连接产物的四个大峰，出现在约230个碱基对(bp)处，其强度范围为2200个荧光单位(对于1000个细胞负荷)到6200个荧光单位(对于6000细胞负荷)。在大约230bp处出现的这些大峰指示了显著量的连接产物。
当该仪器用于分析得自根据本发明的方法制备的固定的、分离的细胞和细胞核的集合的RNA模板化连接的连接产物时，代表1000、2000、3000和6000个细胞的四种不同细胞负荷的四种cDNA连接产物的四个大峰，出现在约230个碱基对(bp)处，其强度范围为2200个荧光单位(对于1000个细胞负荷)到6200个荧光单位(对于6000细胞负荷)。在大约230bp处出现的这些大峰指示了显著量的连接产物。
图9是单独的3000细胞装载电泳图的重复，其中对于以230bp的连接产物突出显示了bp大小。35bp峰是下标，且10380bp峰是上标。所有其它峰代表引物二聚体和PCR伪影。
代表对照的图10是生物分析仪图，其显示了得自使用相同连接方案的RNA模板化连接的产物，其中使用常规技术制备急速冷冻的人淋巴结组织样品并进行粉碎。急速冷冻的组织样品首先用冷却的(4℃)基于NP40的裂解缓冲液进行处理，所述裂解缓冲液由在无核酸酶水中的10mM Tris-HCl、10mM NaCl、3mM MgCl2和0.1％ NonidetTM P40 Substitute构成。然后使用机械douncing将组织粉碎。将所得到的粉碎的组织颗粒进行离心，重悬浮并且使用具有1％ BSA和0.2单位/ul核糖核酸酶抑制剂的PBS进行洗涤。然后使用4％的甲醛固定洗涤的组织颗粒，与其中甲醛固定在进一步加工前完成的本发明不同。然后使用40μMFlowMi过滤器过滤所得到的悬浮液，然后使解离的组织核经受RNA模板化连接方案V1。
在另一个实验中，不使用此处公开的单一细胞制备方法，而是使用标准方法，使用常规技术制备急速冷冻的人淋巴结组织样品并进行粉碎。急速冷冻的组织样品首先用冷却的(4℃)基于NP40的裂解缓冲液进行处理，所述裂解缓冲液由在无核酸酶水中的10mMTris-HCl、10mM NaCl、3mM MgCl2和0.1％ NonidetTM P40 Substitute构成。然后使用机械douncing将组织粉碎。将所得到的粉碎的组织颗粒进行离心，重悬浮并且使用具有1％ BSA和0.2单位/ul核糖核酸酶抑制剂的PBS进行洗涤。然后使用4％的甲醛固定洗涤的组织颗粒，与其中甲醛固定在进一步加工前完成的本发明不同。然后使用40μM FlowMi过滤器过滤所得到的悬浮液，然后使解离的组织核经受RNA模板化连接方案。当使用Agilent2100Bioanalyzer分析连接产物时，并未检测到在～230bp处的产物。仅检测到在185bp处的小峰，其很可能代表引物二聚体或PCR伪影。
另外，来自本发明的方法的测序结果不仅确认了高数目的连接产物，而且确认了细胞中读数的高分数。细胞中读数的分数是测量背景并指示细胞健康的度量。细胞中读数的低分数指示细胞健康状况不佳，以及在GEM生成期间环境RNA含量的增加。细胞中读数的高分数指示高数目的读数，所述读数具有有效的条形码，UMI，对转录组的自信地映射，并且在细胞相关的分隔中。主要度量如表11中所示。
图11中所示的条形码等级图显示了条形码计数的分布以及哪些条形码推断为与细胞相关。y轴是映射到每个条形码的UMI计数数目，且x轴是低于该值的条形码数目。急剧下降指示了细胞相关的条形码以及与空分隔相关的条形码之间的良好分离。条形码等级图还显示了信号和噪声之间的良好分离。单独的‘膝盖(knee)’行为指示了在我们的目的细胞相关的条形码和非细胞相关的条形码的背景之间存在明确分离。
条形码等级图(映射到每个条形码的UMI计数数目相对于低于该值的条形码数目)显示了条形码计数的分布以及哪些条形码推断为与细胞相关。条形码等级图指示了细胞相关的条形码以及与空分隔相关的条形码之间的良好分离。条形码等级图还显示了信号和噪声之间的良好分离。该图显示了单独的“膝盖”，其指示了在目的细胞相关的条形码和非细胞相关的条形码的背景之间存在明确分离。一些数据显示于表12中。
相比之下，由于细胞中读数的较低分数、以及由于中值UMI计数的较低数目/细胞的较低灵敏度，关于解除固定的核的无偏基因表达模式在文库的清洁度方面没有那么好。使用常规方法，使用如上所述的上述基于NP40的裂解缓冲液，来分离解除固定的核。通过使用可从BD Sciences-US获得的BD FACSMelodyTM Cell Sorter的分选来清洁核。使用可从10X Genomics获得的Single Cell 3’版本3.1Reagent Kit操作分选的核。图12中显示的所得到的条形码等级图不那么干净，并且显示了更多的噪声。不存在急剧下降，并且该图含有多重“膝盖”，指示了在目的细胞相关的条形码和背景之间不存在明确分离。尽管使用～2000基因靶实验对象组的本发明的方法相对于来自解除固定核的无偏基因表达的完全转录组方法，但与本发明的方法相比，核也具有在细胞中低得多的读数分数、以及更低的中值UMI计数/细胞。一些数据显示于表13中。
为了进一步比较无偏基因表达方法与本发明中描述的靶向探针方法(～2000基因靶实验对象组)，来自解除固定的核的无偏基因表达数据在计算上是从来自所使用的靶向探针实验对象组的全基因组到相同的～2000基因靶实验对象组的子集。虽然与本公开内容中描述的方法相比，靶向读数/细胞在该子集基因表达样品中更低，但通过检测299个基因和1,346个UMI(表11)，通过本方法实现的复杂性明显更高。对相同靶基因集的子集基因表达产生了187个基因和448个UMI。本文所述的固定方法具有超过使用Single Cell 3'Kit分离解除固定的核且加工的明确的样品处理益处。
本文描述的本发明的实施例是示例性的，并且可以制备各种修改和改善，而不脱离本发明的精神和范围。本发明的范围由所附权利要求限定，并且落入等价物的含义和范围内的所有变化都预期包含在其中。
Claims (45)
1.一种用于组织样品的核酸分析的方法，其包括：
a)使组织样品与固定试剂接触；
b)在固定试剂的存在下，将组织样品分成组织区段，以允许固定试剂灌注到组织区段内；
c)使组织区段解离，以提供多个生物颗粒，其中所述生物颗粒包含多个样品核酸分子；以及
d)使用所述多个样品核酸分子和多个核酸条形码分子生成多个加条形码的核酸分子。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤d)之前，所述方法还包括使多个核酸探针与所述多个生物颗粒的多个样品核酸分子杂交。
3.根据权利要求2所述的方法，其中第一探针和第二探针与生物颗粒的样品核酸分子杂交，以形成包含第一探针、第二探针和样品核酸分子的核酸复合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述核酸复合物包含条形码序列。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一探针或所述第二探针包含条形码序列。
6.根据权利要求4所述的方法，其中生成步骤d)包括将所述多个生物颗粒分隔到多个分隔内。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述多个分隔是多个液滴或多个孔。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织样品是固体组织样品。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织样品是新鲜的组织样品。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织样品是冷冻的组织样品。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述冷冻的组织样品是急速冷冻或闪速冷冻的组织样品。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个生物颗粒包含多个单一细胞。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个生物颗粒包含多个单一核。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个生物颗粒包含多个单一细胞和多个单一核。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个样品核酸分子包括核糖核酸(RNA)分子。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述RNA分子包含信使RNA分子。
17.根据权利要求3所述的方法，其中所述生物颗粒包含所述核酸复合物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述生物颗粒还包含标记试剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述标记试剂配置为与所述生物颗粒的特征联接。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述特征选自受体、抗原、表面蛋白质、跨膜蛋白质、分化蛋白簇、蛋白质通道、蛋白质泵、载体蛋白质、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞-细胞相互作用蛋白质复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化的T细胞受体、T细胞受体、B细胞受体、嵌合抗原受体、间隙连接和粘着连接。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述标记试剂选自蛋白质、肽、抗体、亲脂性部分、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性T细胞衔接子、T细胞受体衔接子、B细胞受体衔接子、前抗体、适体、单体、affimer、Darpin和蛋白质支架。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述标记试剂包含报道寡核苷酸。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述报道寡核苷酸包含报道序列。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述报道序列鉴定所述特征。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述固定试剂是有机固定试剂。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述有机固定试剂选自醇、酮、醛、交联剂、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、辛二亚氨酸二甲基酯(DMS)、福尔马林、己二亚氨酸二甲基酯(DMA)、二硫代-双(-丙酸琥珀酰亚胺酯)(DSP)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、乙二醇双(琥珀酸琥珀酰亚胺酯)(EGS)和双咪唑羧酸酯化合物。
27.一种从生物组织中提取且分离固定的细胞和/或核的方法，其包括：
获得固定的组织样品；以及
使所述固定的组织样品解离，以获得细胞和/或核。
28.根据权利要求27所述的方法，其中使新鲜组织与有机固定试剂接触，并且随后与淬灭介质或淬灭溶液接触，以获得固定的组织样品。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述有机固定试剂选自醇、酮、醛、交联剂、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、辛二亚氨酸二甲基酯(DMS)、福尔马林、己二亚氨酸二甲基酯(DMA)、二硫代-双(-丙酸琥珀酰亚胺酯)(DSP)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、乙二醇双(琥珀酸琥珀酰亚胺酯)(EGS)、双咪唑羧酸酯化合物及其组合。
30.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述有机固定试剂包含福尔马林，并且包括按重量计约2％至约6％的甲醛水溶液。
31.根据权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所述新鲜组织在与有机固定试剂接触之前进行急速冷冻。
32.根据权利要求28-31中任一项所述的方法，其中所述新鲜组织在与有机固定试剂接触之前或期间被分离成组织区段。
33.根据权利要求28-32中任一项所述的方法，其中所述新鲜组织在与有机固定试剂接触之前与解离酶接触。
34.根据权利要求27-33中任一项所述的方法，其中获得细胞和/或核的解离步骤包括化学、酶促或机械解离。
35.根据权利要求27-34中任一项所述的方法，其中获得细胞和/或核的解离步骤包括使用胶原酶、胰凝乳蛋白酶、分散酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、胰酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或其组合的酶促解离。
36.根据权利要求27-35中任一项所述的方法，其另外包括：
形成细胞和/或核的悬浮液并过滤所述悬浮液。
37.根据权利要求27-36中任一项所述的方法，其另外包括：
使用所述细胞和/或核执行单一细胞测定。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述单一细胞测定包括RNA模板化的DNA连接或抗体染色测定。
39.根据权利要求27-38中任一项所述的方法，其中不使用解交联剂或可逆固定试剂。
40.一种细胞和/或核的组合物，其通过权利要求27-39中任一项获得。
41.一种在生物组织样品中的核糖核酸(RNA)分析的方法，其包括
a)使生物组织样品与有机固定试剂接触；
b)在有机固定试剂的存在下，将生物组织样品分成组织区段，以允许有机固定试剂灌注到组织区段内；
c)使组织区段解离，以提供多个单一细胞和/或单一核；以及
d)对多个单一细胞和/或单一核执行RNA分析。
42.根据权利要求41所述的方法，其中步骤(a)的生物组织是冷冻的或新鲜的生物组织。
43.根据权利要求41或42中的一项所述的方法，其中执行RNA分析包括RNA模板化连接以及检测所述多个单一细胞和/或单一核中的连接产物。
44.根据权利要求41-43中任一项所述的方法，其中执行RNA分析包括将所述多个单一细胞和/或单一核分隔到多个液滴内。
45.根据权利要求41-44中任一项所述的方法，其中所述步骤在不存在解除固定剂下执行。
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