CN115429935B - 一种可注射性的交联硫酸软骨素水凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可注射性的交联硫酸软骨素水凝胶，它是将醛基化硫酸软骨素和氨基化硫酸软骨素分别溶解在超纯水或PBS缓冲液或生理盐水中，得到醛基化硫酸软骨素溶液和氨基化硫酸软骨素溶液，将醛基化硫酸软骨素溶液和氨基化硫酸软骨素溶液混合，胶凝化形成水凝胶。本发明醛基化硫酸软骨素和氨基化硫酸软骨素以亚胺键结合的方式形成水凝胶。本发明可注射性交联硫酸软骨素水凝胶的力学性能、微观结构、降解性能、溶胀性能等可灵活调控，网络骨架十分接近细胞外基质中支持细胞生长的蛋白质三维网络，且可以注射填充，可满足注射型细胞递送、组织工程、细胞三维培养和医美填充等生物医用领域对水凝胶性能的要求，具有广阔的应用前景。

Description

一种可注射性的交联硫酸软骨素水凝胶及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，具体属于水凝胶领域，涉及一种可注射性的交联硫酸软骨素水凝胶及其制备方法。

背景技术

研究者们对支架型生物材料进行了大量研究。水凝胶支架是一种重要的支架型生物材料，水凝胶是一类可以在水中溶胀但不能溶解的交联高分子，其水分含量高，在结构上类似于动物体的细胞外基质。根据操作方式不同，水凝胶可分为预制成形型水凝胶和可注射水凝胶。其中，可注射水凝胶是指在注射前为可流动的液体，注射后在原位通过特定的刺激发生凝胶化的一类水凝胶。可注射水凝胶的可注射性是其优点之一，通过注射的方式使用，对机体只产生微小的创伤，避免了复杂外科手术的干预。此外，可注射水凝胶的前驱体溶液在注射后可以填充于不规则的组织缺损，这是预制成形型水凝胶所不具备的优点。因此，将可注射水凝胶作为组织工程领域的支架材料极具可操作性。

近年来，为了获得一劳永逸的除皱效果，越来越多的消费者选择微整形、美容注射以及软组织填充等手段实现对美的追求。水凝胶材料是当下软组织填充的一个热门研究领域，理想的注射性填充材料必须具备以下条件：①组织相容性好；②无过敏反应，非致热源；③不致癌，不致畸；④与宿主有一定的结合能力；⑤不引起炎症或异物反应；⑥无微生物、病毒或其他病原体存在；⑦无抗原性、不导致免疫及组织相关性疾病；⑧效果持久、可靠。

硫酸软骨素作为一种天然来源的大分子多糖，是人体内最丰富的糖胺聚糖，广泛存在于皮肤、软骨、肌腱、心脏瓣膜和中枢神经系统等组织中，是软骨及细胞外基质的重要组成部分，发挥着重要的生理作用。由于硫酸软骨素无毒、可生物降解、生物相容性好，被认为是一种良好的软组织填充材料。硫酸软骨素参与软骨和骨的形成、调控生长因子如成纤维细胞生长因子-2和转化生长因子-β、促进伤口愈合、抗炎、抗凝血、抗氧化、抗肿瘤以及增强免疫反应等；正是基于这些生理活性，硫酸软骨素在临床上得到广泛应用，例如用于治疗视疲劳、神经痛、关节痛和抗炎等，另外还与氨基葡萄糖联用治疗骨关节炎。此外，硫酸软骨素具有优良的水溶性和带负电荷、结构中存在易于修饰改性的羧基和羟基，可用于构建多种生物材料，如用于肿瘤的诊断和治疗的纳米药物载体、组织工程支架材料等，尤其是基于硫酸软骨素的可注射水凝胶已成为近年来的研究热点。硫酸软骨素类水凝胶已被用于软骨修复、生物黏合剂、药物输送、基因递送和细胞治疗等医用领域。

将硫酸软骨素类多糖大分子化合物制备成具有三维网状结构的水凝胶，通常是由前体物经过物理交联、生物型交联和化学交联等方法获得。其中，物理交联即非共价交联，是由氢键、疏水作用、静电作用等弱相互作用将聚合物结合在一起，这类交联特别依赖于pH值、离子强度、溶剂的组成或温度等外部刺激，且存在交联不稳定、极易受环境影响而遭到破坏的缺点。生物型交联是一类酶参与反应的交联，因为有酶的参与，生物型交联对反应条件有一定的要求，操作起来具有一定的难度。而化学交联又称作共价交联，一般是先对前体聚合物进行一定的化学修饰，再经过化学反应生成新的化学键而形成交联结构，包括：点击化学反应、迈克尔加成反应、狄尔斯-阿尔德(DA)加成反应和席夫氏碱反应等，还可以通过形成二硫键、硼酸酯键和配位键等发生交联，这类交联反应具有操作简单、反应条件温和可控等优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可注射性的交联硫酸软骨素水凝胶及其制备方法，通过对硫酸软骨素进行化学修饰，得到两种可以通过席夫碱反应进行交联的改性硫酸软骨素，这两种经过修饰的硫酸软骨素只需要在水溶液中混合即可形成具有三维网状结构的水凝胶，水凝胶具有良好的力学性能和微观结构，可满足注射型细胞递送、组织工程和医美填充对水凝胶的要求。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：

一种可注射性的交联硫酸软骨素水凝胶，它是将带有多元醛基的醛基化硫酸软骨素和带有大量氨基侧链的氨基化硫酸软骨素分别溶解在超纯水或PBS缓冲液或生理盐水中，得到醛基化硫酸软骨素溶液和氨基化硫酸软骨素溶液，将醛基化硫酸软骨素溶液和氨基化硫酸软骨素溶液混合，胶凝化形成具有三维网状结构的水凝胶。

所述的醛基化硫酸软骨素溶液的浓度为40～60mg/mL；所述的氨基化硫酸软骨素溶液的浓度为40～60mg/mL。具体的，所述的醛基化硫酸软骨素溶液的浓度为和氨基化硫酸软骨素溶液的浓度相同。

所述的氨基化硫酸软骨素溶液和醛基化硫酸软骨素溶液的体积比为1:2～2:1。

所述的胶凝化的温度为4～60℃，优选为20～37℃。

所述的醛基化硫酸软骨素和氨基化硫酸软骨素以亚胺键结合的方式形成水凝胶。

所述的醛基化硫酸软骨素由以下方法制得的，包括：将硫酸软骨素加入超纯水中，充分搅拌溶解，得到硫酸软骨素溶液；往硫酸软骨素溶液中加入高碘酸钠溶液，常温下，避光反应1～2h；加入乙二醇，避光反应1～2h以消耗过量高碘酸钠；将反应液装入分子截留为3500Da的透析袋中，用超纯水进行透析，去除反应液中的含碘杂质和过量的乙二醇以及乙二醇的副产物，每隔12h换一次透析液，透析3天；经过透析的反应液在真空冷冻干燥得到醛基化硫酸软骨素。

所述的硫酸软骨素溶液中硫酸软骨素的浓度为20～50mg/mL。

所述的高碘酸钠与硫酸软骨素的质量比为0.25:1～1.1:1，优选为0.5:1～1.1:1，进一步优选为0.8:1～1.1:1。

所述的氨基化硫酸软骨素是由以下方法制得的，步骤如下：

步骤(1)、将硫酸软骨素和己二酸二酰肼(ADH)溶于超纯水中，搅拌溶解完全，采用盐酸调节pH至4.75～4.80；

步骤(2)、加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，采用盐酸维持反应体系pH在4.75～4.80，常温下搅拌反应4h；

步骤(3)、采用氢氧化钠溶液调节反应体系的pH至中性；

步骤(4)、将反应液装入分子截留为3500Da的透析袋中，先用浓度为100mmol/L的氯化钠水溶液透析24h，每12h换一次透析液，然后用25％(v/v)的乙醇溶液透析24h，最后用超纯水透析72h，每隔24h换一次透析液；

步骤(5)、经过透析的反应液真空冷冻干燥得到氨基化硫酸软骨素。

步骤(1)中，硫酸软骨素的浓度为6～10mg/mL；硫酸软骨素与己二酸二酰肼的质量比为1:5～1:15，优选为1:10～1:15。

步骤(2)中，硫酸软骨素与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的质量比为1:1～1:2.5。

盐酸的浓度为0.5～3mol/L。用于调节pH的氢氧化钠水溶液的浓度为0.5～3mol/L。

所述的真空冷冻干燥的温度为-5～-20℃，优选为-20℃；所述的真空冷冻干燥的时间为48h。

本发明的另一个目的是提供一种所述的可注射性的交联硫酸软骨素水凝胶的制备方法，包括：将醛基化硫酸软骨素和氨基化硫酸软骨素分别溶解在超纯水或PBS缓冲液或生理盐水中，得到醛基化硫酸软骨素溶液和氨基化硫酸软骨素溶液，将醛基化硫酸软骨素溶液和氨基化硫酸软骨素溶液混合，胶凝化形成水凝胶。

本发明的另一个目的是提供所述的可注射性的交联硫酸软骨素水凝胶在制备注射型细胞递送材料、组织工程材料、细胞三维培养材料和医疗美容填充材料中的应用。

本发明所述的常温为25℃±5℃。

本发明的有益效果：

本发明以生物相容性优异且低毒环保的己二酸二酰肼作为交联剂，使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺活化硫酸软骨素上的羧基，使己二酸二酰肼与羧基高效结合，得到带有大量叠氮氨基的氨基化硫酸软骨素；本发明使用高碘酸钠在避光条件下将硫酸软骨素的邻位羟基氧化成醛基，得到醛基化硫酸软骨素；本发明将两种硫酸软骨素的水溶液混合，分子间通过形成动态亚胺键连接成交联紧密的网状结构，就可得到可注射性的硫酸软骨素水凝胶(图1)。且动态亚胺键连接可使破裂的水凝胶在短时间内重新结合在一起，具有自我修复的功能。

本发明水凝胶以pH敏感的席夫碱(带有亚氨基结构的物质)结合而成，在碱性条件下容易发生降解/解离，而在接近中性pH的生理条件下或是偏酸性条件下，该水凝胶具有良好的力学性能和结构稳定性，且降解缓慢，具有良好的注射依从性。通过静电作用或氢键获得的物理交联水凝胶，极易受pH、温度、盐溶液等环境变化而发生降解。相比之下，本发明水凝胶以化学交联的方式形成交联网络，为永久性交联，对于环境变化更具有耐受性，也具有更好的力学性能和微观结构均匀性，并且具有可控的交联密度和力学性能。相较于反应条件较为复杂的酶交联相比，化学交联的反应条件更为温和可控，操作简单。

本发明可注射性硫酸软骨素水凝胶具有原料易得、反应条件温和、反应时间短(数分钟内完成，较优技术方案下2～6min即可成胶)、工艺简单等优点。原料是天然来源的大分子多糖，不仅具有多种有益的生理功能，还具有优异的生物相容性、可降解性和吸水性能，且安全无毒，其降解产物也可以被人体代谢分解。

本发明可注射性硫酸软骨素水凝胶的力学性能、微观结构、降解性能、溶胀性能等可灵活调控，网络骨架十分接近细胞外基质中支持细胞生长的蛋白质三维网络，且可以注射填充，可满足注射型细胞递送、组织工程、细胞三维培养和医美填充等生物医用领域对水凝胶性能的要求，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为硫酸软骨素分子修饰及席夫碱键形成水凝胶的机理图。

图2为硫酸软骨素水凝胶的微观结构照片。

图3为硫酸软骨素水凝胶自愈合行为测试结果图。

图4为硫酸软骨素水凝胶细胞毒性检测结果图。

具体实施方式

下面通过实例进一步描述本发明，但不限于这些实例。

下述实施例使用的硫酸软骨素为牛源硫酸软骨素(购自嘉兴恒杰生物制药股份有限公司，浙江，中国)，外观：粉末。

实施例1

氨基化硫酸软骨素(CS-ADH)的制备：

首先，将0.5g硫酸软骨素(CS)粉末溶解在50mL超纯水中，得到浓度为10mg/mL的硫酸软骨素溶液；将2.5g己二酸二酰肼(ADH)粉末加入硫酸软骨素溶液中，待全部固体溶解后，常温搅拌30分钟；随后，使用浓度为1mol/L的盐酸将混合物的pH调节至4.75，加入0.5g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)粉末，待固体溶解后，搅拌反应4小时，在搅拌过程中监测pH，采用浓度为1mol/L的盐酸将混合物的pH维持在4.75～4.8；然后加入浓度为1mol/L的NaOH溶液调节pH至7.0以终止反应；将反应混合物倒入用超纯水洗过的透析袋(截留分子量为3500Da)中，先用大量的100mmol/L的NaCl水溶液透析24小时，每12小时换一次透析液，然后用V(乙醇):V(H₂O)＝1:3的乙醇溶液透析24小时，最后用超纯水透析72小时，每24小时换一次透析液；经过透析的溶液在-20℃下真空冷冻干燥48小时，得到氨基化硫酸软骨素(CS-ADH)。

醛基化硫酸软骨素(CS-CHO)的制备：

将1g硫酸软骨素溶解在32mL超纯水中，在避光条件下，逐滴加入2.5mL浓度为0.5mol/L的高碘酸钠溶液，混合物在常温避光条件下继续搅拌2小时；加入0.5mL乙二醇终止反应，并继续避光搅拌1小时；将反应液装入用超纯水洗过的透析膜(截留分子量为3500Da)，在超纯水中透析72小时，经过透析的溶液在-20℃下真空冷冻干燥48小时，得到醛基化硫酸软骨素(CS-CHO)。

硫酸软骨素水凝胶的制备：

分别取CS-CHO和CS-ADH各0.06g，溶解在0.05M的PBS缓冲液(pH7.2～7.4)中，得到浓度为60mg/mL的CS-CHO溶液、浓度为60mg/mL的CS-ADH溶液；在常温下，将CS-ADH溶液和CS-CHO溶液分别按照体积比2:4、3:3和4:2混和，体积比为4:2混合的样品不能形成固体凝胶，为浓稠流体，体积比2:4、3:3均可得到固体水凝胶，然后将形成的水凝胶常温放置约30min，再用大量的超纯水浸泡，取出，真空冷冻干燥得到CS水凝胶样品。

实施例2

氨基化硫酸软骨素(CS-ADH)的制备：

首先，将0.5g硫酸软骨素粉末溶解在50mL超纯水中，得到浓度为10mg/mL的硫酸软骨素溶液；将3.75g己二酸二酰肼粉末加入硫酸软骨素溶液中，待全部固体溶解后，常温搅拌30分钟，随后使用浓度为1mol/L的盐酸将混合物的pH调节至4.75，加入0.75g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺粉末，待固体溶解后，继续搅拌，在搅拌过程中监测pH，采用浓度为1mol/L的盐酸将混合物的pH维持在4.75～4.8，反应4小时后，加入浓度为1mol/L的NaOH溶液使pH升至7.0以终止反应；将反应混合物倒入预洗过的透析袋(截留分子量为3500Da)中，先用大量的浓度为100mmol/L的NaCl水溶液进行透析24小时，每12小时换一次透析液，然后用V(乙醇):V(H₂O)＝1:3的乙醇溶液透析24小时，最后用超纯水透析72小时，每24小时换一次透析液；经过透析的溶液在-20℃下真空冷冻干燥48小时，得到氨基化硫酸软骨素。

醛基化硫酸软骨素(CS-CHO)的制备：

将1g硫酸软骨素溶解在25mL超纯水中，逐滴加入5mL浓度为0.5mol/L的高碘酸钠溶液，混合物在常温避光条件下搅拌2小时，加入1mL乙二醇以终止反应，并继续避光搅拌1小时；将反应液装入预洗过的透析袋(截留分子量为3500Da)，在超纯水中透析72小时；经过透析的溶液-20℃下真空冷冻干燥48小时，得到醛基化硫酸软骨素。

硫酸软骨素水凝胶的制备：

分别取CS-CHO和CS-ADH各0.05g，溶解在0.05M的PBS缓冲液(pH7.2～7.4)中，得到浓度为50mg/mL的CS-CHO溶液、浓度为50mg/mL的CS-ADH溶液，将CS-ADH溶液和CS-CHO溶液按照体积比2:4、3:3和4:2混和，均可得到水凝胶，然后将形成的水凝胶常温放置约30min，用大量的超纯水浸泡，取出，真空冷冻干燥得到CS水凝胶样品。

实施例3

氨基化硫酸软骨素(CS-ADH)的制备：

首先，将0.5g硫酸软骨素粉末溶解在50mL超纯水中，得到浓度为10mg/mL的硫酸软骨素溶液；再将5g己二酸二酰肼粉末加入溶液中，待全部固体溶解后，常温搅拌30分钟；随后使用1mol/L的盐酸将反应混合物的pH调节至4.75，加入1g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺粉末，待固体溶解后，继续搅拌，在搅拌过程中监测pH，用浓度为1mol/L的盐酸将反应混合物的pH维持在4.75-4.8，反应4小时后，加入浓度为1mol/L的NaOH溶液使pH升至7.0以终止反应；将反应混合物倒入预洗过的透析袋(截留分子量为3500Da)中，先用大量浓度为100mmol/L的NaCl水溶液透析24小时，每12小时换一次透析液，然后用V(乙醇)：V(H₂O)＝1:3的乙醇溶液透析24小时，最后用超纯水透析72小时，每24小时换一次透析液；将透析后的溶液在-20℃下真空冷冻干燥48小时，得到氨基化硫酸软骨素。

醛基化硫酸软骨素(CS-CHO)的制备：

将1g硫酸软骨素溶解在50mL超纯水中，逐滴加入7.5mL浓度为0.5mol/L的高碘酸钠溶液，混合物在常温避光条件下搅拌2小时，加入1.5mL乙二醇以终止反应，并继续避光搅拌1小时；将反应液装入预洗过的透析袋(截留分子量为3500Da)，在超纯水中透析72小时，经过透析的溶液-20℃下真空冷冻干燥48小时，得到醛基化硫酸软骨素。

硫酸软骨素水凝胶的制备：

分别取CS-CHO和CS-ADH各0.04g，溶解在0.05M的PBS缓冲液(pH7.2～7.4)中，得到浓度为40mg/mL的CS-CHO溶液、浓度为40mg/mL的CS-ADH溶液，将CS-ADH溶液和CS-CHO溶液按照体积比2:4、3:3和4:2混和，均可得到水凝胶，然后将形成的水凝胶常温放置约30min，用大量的超纯水浸泡，取出，真空冷冻干燥得到CS水凝胶样品。

图2为硫酸软骨素水凝胶(CS-ADH溶液和CS-CHO溶液体积比4:2)的微观结构照片，表明水凝胶具有三维网状结构。

实施例4

氨基化硫酸软骨素(CS-ADH)的制备：

首先，将0.5g硫酸软骨素粉末溶解在50mL超纯水中，得到浓度为10mg/mL的硫酸软骨素溶液，再将7.5g己二酸二酰肼粉末加入硫酸软骨素溶液中，待全部固体溶解后，常温搅拌30分钟；使用浓度为1mol/L的盐酸将混合物的pH调节至4.75，加入1.25g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺粉末，待固体溶解后，继续搅拌，在搅拌过程中监测pH，用浓度为1mol/L的盐酸将混合物的pH维持在4.75-4.8，反应4小时后，加入浓度为1mol/L的NaOH溶液使pH升至7.0以终止反应；将反应混合物倒入预洗过的透析袋(截留分子量为3500Da)中，先用大量浓度为100mmol/L的NaCl水溶液透析24小时，每12小时换一次透析液，然后用V(乙醇):V(H₂O)＝1:3的乙醇溶液透析24小时，最后用超纯水透析72小时，每24小时换一次透析液；经过透析的溶液在-20℃真空冷冻干燥48小时，得到氨基化硫酸软骨素。

醛基化硫酸软骨素(CS-CHO)的制备：

将1g硫酸软骨素溶解在50ml超纯水中，逐滴加入10mL浓度为0.5mol/L的高碘酸钠溶液，混合物在常温避光条件下搅拌2小时，加入2mL乙二醇以终止反应，并继续避光搅拌1小时；将反应液装入预洗过的透析袋(截留分子量为3500Da)，在超纯水中透析72小时；经过透析的溶液-20℃下真空冷冻干燥48小时，得到醛基化硫酸软骨素。

硫酸软骨素水凝胶的制备：

分别取CS-CHO和CS-ADH各0.04g，溶解在0.05M的PBS缓冲液(pH7.2～7.4)中，得到浓度为0.04g/ml的CS-CHO溶液、浓度为0.04g/ml的CS-ADH溶液，将CS-ADH溶液和CS-CHO溶液按照体积比2:4、3:3和4:2混和，均可得到水凝胶，然后将形成的水凝胶常温放置约30min，用大量的超纯水浸泡，取出，真空冷冻干燥得到CS水凝胶样品。

实施例5

氨基化硫酸软骨素(CS-ADH)的制备：

精密称取3g硫酸软骨素溶于450mL超纯水中得到硫酸软骨素溶液，再加入30g己二酸二酰肼，在常温下搅拌溶解，用浓度为3mol/L的盐酸调节pH至4.75～4.80，称取3g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺加入到溶液中，一边搅拌一边测pH，用浓度为3mol/L的盐酸将pH维持在4.75～4.8，反应4h后，用浓度为3mol/L的NaOH溶液将pH调节到7.0终止反应；将反应液装进透析袋(截留分子量为3500Da)中，先用0.1mol/L的NaCl溶液透析24h，隔12h换一次透析液；然后用25％(v/v)的乙醇透析24h；最后用超纯水进行充分透析，透析约3天，每24h换一次透析液；经过透析的溶液在-20℃下真空冷冻干燥，得到CS-ADH样品。

醛基化硫酸软骨素(CS-CHO)的制备：

将3g硫酸软骨素搅拌溶解于100mL超纯水中，缓慢加入22.5mL浓度为0.5mol/L的高碘酸钠，常温避光搅拌反应2h，加入4.5mL乙二醇避光反应1h以消耗未反应的高碘酸钠，将反应液装入透析袋(截留分子量为3500Da)，在大量的超纯水中透析3天，每24h换一次透析液，经过透析的溶液在-20℃下真空冷冻干燥，得到CS-CHO样品。

硫酸软骨素水凝胶的制备：

分别取CS-CHO和CS-ADH各0.04g，溶解在0.05M PBS缓冲液中，得到浓度为40mg/mL的CS-CHO溶液和浓度40mg/mL的CS-ADH溶液，将CS-ADH溶液和CS-CHO溶液按照体积比2:4、3:3和4:2混和，均可得到水凝胶，然后将形成的水凝胶常温放置约30min，用大量的超纯水浸泡，取出，真空冷冻干燥得到CS水凝胶样品。

实施例6

将实施例1-实施例4的制备的氨基化硫酸软骨素溶于0.05M PBS缓冲液(pH7.2～7.4)中，配制得到浓度为60mg/mL的氨基化硫酸软骨素溶液，分别标记为A1、A2、A3、A4，将实施例1-实施例4的制备的醛基化硫酸软骨素溶于0.05M PBS缓冲液(pH7.2～7.4)中，配制得到浓度为60mg/mL的醛基化硫酸软骨素溶液，分别标记为C1、C2、C3、C4，待溶解完全后，将各组溶液置于37℃水浴30min，然后按照氨基化硫酸软骨素溶液和醛基化硫酸软骨素溶液体积比为2:1、1:1和1:2在37℃水浴的48孔板里混合，每组做3个重复组，分别记录凝胶化时间，凝胶化时间以平板倒置法进行判断，即从氨基化硫酸软骨素溶液与醛基化硫酸软骨素溶液混合开始至平板倒置而溶液不能从平板里倒出的这一段时间。

四组凝胶化时间结果如下：

A1:C1＝2:1V/V不能形成固体凝胶，为浓稠流体，无法获得凝胶化时间，A1:C1＝1:1V/V凝胶化时间为28±1min，A1:C1＝1:2V/V凝胶化时间为8±1min；

A2:C2＝2:1、1:1、1:2V/V凝胶化时间分别为31±1min，3min±20s，2min±10s；

A3:C3＝2:1、1:1、1:2V/V凝胶化时间分别为6min±20s，2min±20s，90s±6s；

A4:C4＝2:1、1:1、1:2V/V凝胶化时间分别为6min±30s，3min±10s，2min±10s。

根据上述凝胶化时间以及实验试剂用量和注射的可操作性，发明人选择实施例3的水凝胶作为后续实验的样品凝胶。

实施例7

考察硫酸软骨素水凝胶的自愈合行为

取实施例3制得的氨基化硫酸软骨素(CS-ADH)和醛基化硫酸软骨素(CS-CHO)，采用0.05M PBS缓冲液(pH7.2～7.4)中，分别配制得到浓度为60mg/mL的氨基化硫酸软骨素溶液、浓度为60mg/mL的醛基化硫酸软骨素溶液，将溶液置于37℃水浴30min，然后按照氨基化硫酸软骨素溶液和醛基化硫酸软骨素溶液体积比为4:2在圆模具中混合，在37℃水浴下形成水凝胶。共制得两组水凝胶(水凝胶制备后进行冻干)，为了便于比较观察，其中一组水凝胶用考马斯亮蓝染色。然后将两组水凝胶拼接在一起，放置在盛有水的常温容器中(图3a，左侧水凝胶染色，右侧水凝胶未染色)，不进行任何其他干预，放置约2小时，即可完全愈合(图3b)，然后用镊子夹取水凝胶拉伸(图3c-图3f)，表明其具有自愈合能力。将愈合的水凝胶冻干，用扫描电镜测定愈合水凝胶的形态(见图3g、3h)，可以明显看出水凝胶之间紧密连接，证明了水凝胶是可以完全自愈合的。

上述结果表明两组水凝胶自愈合并成一种具有更强连接点的水凝胶，该水凝胶不会应拉伸而断裂。说明水凝胶是通过CS-CHO上的醛基和CS-ADH上的氨基之间的动态亚胺键形成的，且亚胺键的断裂和形成一直在水凝胶中持续发生着。因此，水凝胶可以在没有额外刺激的情况下自动愈合。此外，由于氢键作用和分子链的物理缠结，也增强了亚胺键形成的交联网络。

实施例8

参考GB/T16886.5-2017/ISO 10993-5：2009体外细胞毒性实验标准，采用人包皮成纤维细胞(HFF-1细胞)对硫酸软骨素水凝胶进行毒性评价。

取实施例3制得的氨基化硫酸软骨素(CS-ADH)和醛基化硫酸软骨素(CS-CHO)，采用0.05M PBS缓冲液(pH7.2～7.4)中，分别配制得到浓度为60mg/mL的氨基化硫酸软骨素溶液、浓度为60mg/mL的醛基化硫酸软骨素溶液，将溶液置于37℃水浴30min，然后按照氨基化硫酸软骨素溶液和醛基化硫酸软骨素溶液体积比为2::4、3:3、4:2混合，制备成水凝胶，将形成的水凝胶常温放置约30min，用大量的超纯水浸泡，取出，真空冷冻干燥得到CS水凝胶样品，分别记为A2/C4、A3/C3、A4/C2。

取A2/C4、A3/C3、A4/C2和高密度聚乙稀各0.2g，放入六孔板中，按照0.1g/mL加入含15％胎牛血清的DMEM培养基，放入含5％CO₂的37℃细胞培养箱中浸提24h，浸提液用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。实验分为：空白对照组(含15％血清的DMEM培养基)、实验组(A2/C4、A3/C3、A4/C2凝胶的浸提液)、阴性对照组(高密度聚乙稀浸提液)、阳性对照(含5％DMSO的DMEM培养基，DMSO对细胞有毒性)。

将HFF-1细胞以1×10⁵/mL接种在96孔板中，每孔100μL，每组5个复孔，待细胞贴壁24h后，除空白对照组外，吸除其余各组的原培养液，实验组分别取A2/C4、A3/C3和A4/C2浸提液100μL加入到培养板中继续培养，阴性对照组加入100μL高密度聚乙稀浸提液，阳性对照组加入100μL含5％DMSO的DMEM培养基。当HFF-1细胞与浸提液作用24h后，每孔加入20μLMTT(5mg/L)，继续培育4h，吸去原液，每孔加入150μLDMSO，在微量振荡器上振荡10min，待紫色结晶完全溶解后，用酶标仪测量570nm处的吸光度值(见图4)，根据以下公式计算实验组细胞的相对增殖率RGR。

RGR(％)＝(实验组吸光度均值/阴性对照组吸光度均值)×100％

毒性评价：按照表1，把RGR值转换成五级反应以评定材料的毒性程度，结果见表2。

表1.细胞毒性反应分级

级别	相对增殖率
		0	≥100
1	80-99
		2	50-79
3	30-49
		4	0-29

其中，0或1级反应为合格；2级需要结合细胞形态分析并综合评价，细胞活性下降大于30％认为有细胞毒性反应；3-4级反应为不合格。

表2.硫酸软骨素水凝胶浸提液的相对增殖率及等级

分组	阳性对照组	A2/C4	A3/C3	A4/C2
					相对增殖率RGR(％)	66.1	103.9	103.5	86.9
等级	2	0	0	1

Claims (7)

1.一种可注射性的交联硫酸软骨素水凝胶，其特征在于：它是将醛基化硫酸软骨素和氨基化硫酸软骨素分别溶解在超纯水或PBS缓冲液或生理盐水中，得到醛基化硫酸软骨素溶液和氨基化硫酸软骨素溶液，将醛基化硫酸软骨素溶液和氨基化硫酸软骨素溶液混合，胶凝化形成水凝胶；

所述的醛基化硫酸软骨素溶液的浓度为40～60mg/mL；所述的氨基化硫酸软骨素溶液的浓度为40～60mg/mL；

所述的氨基化硫酸软骨素溶液和醛基化硫酸软骨素溶液的体积比为1:2～2:1；

所述的醛基化硫酸软骨素由以下方法制得的，包括：将硫酸软骨素加入超纯水中，搅拌溶解，得到硫酸软骨素溶液；往硫酸软骨素溶液中加入高碘酸钠溶液，常温下，避光反应1～2h；加入乙二醇，避光反应1～2h；将反应液装入分子截留为3500Da的透析袋中，用超纯水进行透析，每隔12h更换一次透析液，透析3天；经过透析的反应液真空冷冻干燥得到醛基化硫酸软骨素；所述的高碘酸钠与硫酸软骨素的质量比为0.8:1～1.1:1；

所述的氨基化硫酸软骨素是由以下方法制得的，步骤如下：

步骤(1)、将硫酸软骨素和己二酸二酰肼溶于超纯水中，硫酸软骨素与己二酸二酰肼的质量比为1:10～1:15，搅拌溶解，采用盐酸调节pH至4.75～4.80；

步骤(2)、加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，采用盐酸维持反应体系pH在4.75～4.80，常温下搅拌反应4h；

步骤(3)、采用氢氧化钠溶液调节反应体系的pH至中性；

步骤(4)、将反应液装入分子截留为3500Da的透析袋中，先用浓度为100mmol/L的氯化钠水溶液透析24h，每12h换一次透析液，然后用25%(v/v)的乙醇溶液透析24h，最后用超纯水透析72h，每隔24h换一次透析液；

步骤(5)、经过透析的反应液真空冷冻干燥得到氨基化硫酸软骨素。

2.根据权利要求1所述的可注射性的交联硫酸软骨素水凝胶，其特征在于：所述的胶凝化温度为4～60℃。

3.根据权利要求2所述的可注射性的交联硫酸软骨素水凝胶，其特征在于：所述的胶凝化温度为20～37℃。

4.根据权利要求1所述的可注射性的交联硫酸软骨素水凝胶，其特征在于：所述的硫酸软骨素溶液中硫酸软骨素的浓度为20～50mg/mL。

5.根据权利要求1所述的可注射性的交联硫酸软骨素水凝胶，其特征在于：步骤(1)中，硫酸软骨素的浓度为6～10mg/mL；

步骤(2)中，硫酸软骨素与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的质量比为1:1～1:2.5。

6.一种权利要求1所述的可注射性的交联硫酸软骨素水凝胶的制备方法，其特征在于：包括：将醛基化硫酸软骨素和氨基化硫酸软骨素分别溶解在超纯水或PBS缓冲液或生理盐水中，得到醛基化硫酸软骨素溶液和氨基化硫酸软骨素溶液，将醛基化硫酸软骨素溶液和氨基化硫酸软骨素溶液混合，胶凝化形成水凝胶。

7.权利要求1所述的可注射性的交联硫酸软骨素水凝胶在制备注射型细胞递送材料、组织工程材料、细胞三维培养材料、医疗美容填充材料中的应用。