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CN115398010A - 用于戈沙妥珠单抗疗法的生物标志物 - Google Patents

用于戈沙妥珠单抗疗法的生物标志物 Download PDF

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CN115398010A
CN115398010A CN202180022827.0A CN202180022827A CN115398010A CN 115398010 A CN115398010 A CN 115398010A CN 202180022827 A CN202180022827 A CN 202180022827A CN 115398010 A CN115398010 A CN 115398010A
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CN
China
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cancer
trop
patients
biomarkers
brca1
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Application number
CN202180022827.0A
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English (en)
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B.M.法尔塔斯
S.T.塔加瓦
O.埃莱门托
P.J.弗拉乔斯特吉奥斯
T.Rj.斯珀伯
T.M.卡迪洛
T.戈斯瓦米
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Immunomedics Inc
Original Assignee
Immunomedics Inc
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Abstract

本发明涉及用于用抗Trop‑2ADC治疗表达Trop‑2的癌症的生物标志物，该抗Trop‑2ADC包含抗Trop‑2抗体和与之偶联的拓扑异构酶I抑制剂，其中拓扑异构酶I抑制剂优选地为SN‑38或DxD。该抗Trop‑2ADC可以作为单一疗法或者作为与一种或多种抗癌剂(诸如DDR抑制剂)的组合疗法施用。单独使用ADC或者将ADC与其他抗癌剂组合使用的疗法可以减小实体瘤的尺寸、减少或消除转移，并且能够有效地治疗对标准疗法具有抗性的癌症。优选地，该组合疗法对抑制肿瘤生长具有累加作用。最优选地，该组合疗法对抑制肿瘤生长具有协同作用。在具体的实施方案中，该生物标志物可以涉及选自由以下项组成的组的基因：BRCA1、BRCA2、CHEK2、MSH2、MSH6、TP53、CDKN1A、BAG6、BRSK2、ERN1、FHIT、HIPK2、EGAES12、ZNF622、AEN、SART1、USP28、GADD45B、TGFB1、NDRG1、WEE1、PPP1R15A、MYBBP1A、SIRT1、ABE1、HRAS、ZNF385B、POER2K和DDB2。

Description

用于戈沙妥珠单抗疗法的生物标志物
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2020年3月20日提交的美国临时申请第62/992,728号的权益，该临时申请据此全文以引用方式并入本文用于所有目的。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式通过EFS-Web提交并且据此全文以引用方式并入。所述ASCII副本创建于2021年3月17日，名称为IMM376-WO-PCT-SL.txt，并且大小为1,667字节。
本专利申请包含很长的表格部分。这些表格的副本已经以ASCII格式通过电子方式提交并且据此以引用方式并入本文，其可以用于实施本文所提供的方法。所述ASCII表格创建于2019年12月3日，如下所示：(1)IMM376-WO-PCT Appendix 1.txt，10,198字节，(2)IMM376-WO-PCT Appendix 2-Part A.txt，3,491字节，(3)IMM376-WO-PCT Appendix 2-Part B.txt，96,588字节，以及(4)IMM376-WO-PCT Appendix 2-Part C.txt，1,169字节。
技术领域
本公开涉及抗Trop-2抗体-药物偶联物(ADC)(诸如戈沙妥珠单抗(IMMU-132))用于治疗表达Trop-2的癌症的用途。在某些实施方案中，ADC可以与一种或多种诊断测定法一起使用，所述诊断测定法例如：检测突变或遗传变异的基因组测定法，或者预测癌症对抗Trop-2 ADC的敏感性的功能测定法(诸如Trop-2表达水平)，其中ADC可以单独使用或者与一种或多种其他治疗剂(诸如DDR(DNA损伤反应)抑制剂)结合。在具体的实施方案中，单一遗传或生理标志物(统称为“生物标志物”)或者两种或更多种此类生物标志物的组合可以用于预测癌症对ADC和其他治疗剂的特定组合的敏感性。在优选的实施方案中，抗Trop-2抗体可以是如下所述的hRS7抗体。更优选地，抗Trop-2抗体可以使用可裂解接头(诸如CL2A接头)附接到化学治疗剂。最优选地，药物是SN-38，并且ADC是戈沙妥珠单抗(也称为IMMU-132或hRS7-CL2A-SN-38)。然而，可以利用其他已知的抗Trop-2 ADC，诸如DS-1062。本公开不限于用于癌症疗法的药剂组合的范围，而是还可以包括用ADC与任何其他已知的癌症疗法结合进行治疗，这些癌症疗法包括但不限于PARP抑制剂、ATM抑制剂、ATR抑制剂、CHK1抑制剂、CHK2抑制剂、Rad51抑制剂、WEE1抑制剂、CDK 4/6抑制剂，以及/或者基于铂的化学治疗剂。在某些实施方案中，该组合疗法可以包括抗Trop-2 ADC和上文列举的一种或多种抗癌剂。优选地，采用或不采用生物标志物分析的组合疗法能够有效地治疗对标准抗癌疗法不敏感或对ADC单一疗法表现出抗性的抗性/复发性癌症。普通技术人员将知道，主题生物标志物将用于多种目的，诸如提高诊断准确性、个体化患者治疗(精准医疗)、确定预后、预测治疗结果和复发率、监测疾病进展和/或识别癌症治疗的早期复发。在具体实施方案中，该生物标志物可以选自DDR或细胞凋亡基因中的遗传标志物，诸如BRCA1、BRCA2、CHEK2、MSH2、MSH6、TP53、CDKN1A、BAG6、BRSK2、ERN1、FHIT、HIPK2、LGALS12、ZNF622、AEN、SART1、USP28、GADD45B、TGFB1、NDRG1、WEE1、PPP1R15A、MYBBP1A、SIRT1、ABL1、HRAS、ZNF385B、POLR2K或DDB2。最优选地，所述生物标志物中的一种或多种可以用于区分对抗Trop-2 ADC(诸如戈沙妥珠单抗或D-1062)的反应者和非反应者。
背景技术
戈沙妥珠单抗是抗Trop-2抗体-药物偶联物(ADC)，已证明其对范围广泛的表达Trop-2的上皮癌有效，所述上皮癌包括但不限于：乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、HR+/HER2-转移性乳腺癌、尿路上皮癌、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠直肠癌、胃癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子宫癌、子宫内膜癌、前列腺癌、食道癌和头颈癌(Ocean等人，2017,Cancer 123:3843-54；Starodub等人，2015,Clin Cancer Res21:3870-78；Bardia等人，2018,J Clin Oncol 36(15_增刊):1004)。
与大多数其他目前的ADC不同，戈沙妥珠单抗(SG)不与超毒性药物或毒素偶联(Cardillo等人，2015,Bioconj Chem 26:919-31)。相反，SG包括经由CL2A接头(美国专利第7,999,083号)与拓扑异构酶I抑制剂伊立替康的活性代谢物(SN38)偶联的抗Trop-2hRS7抗体(例如，美国专利第7,238,785号、第8,574,575号)。也许由于使用了毒性较低的偶联药物以及抗Trop-2抗体的靶向作用，所以戈沙妥珠单抗仅表现出中度的全身毒性，主要是中性粒细胞减少症(Bardia等人，2019,N Engl J Med380:741-51)，并且具有高度有利的治疗窗(Ocean等人，2017,Cancer123:3843-54；Cardillo等人，2011,Clin Cancer Res 17:3157-69)。
戈沙妥珠单抗在多样化肿瘤的二线或更晚的治疗中是有效的，并且在标准化学治疗剂和/或检查点抑制剂治疗后复发/难治的患者中具有活性(Bardia等人，2019,N Engl JMed 380:741-51；Faltas等人，2016,Clin Genitourin Cancer 14:e75-9)。例如，在二线或更晚的环境中，用SG进行的I/II期临床试验已经报道了在转移性TNBC中，缓解率为33.3％，临床获益比率为45.5％，中位无进展生存期(PFS)为5.5个月，并且总生存期(OS)为13.0个月(Bardia等人，2019,N Engl J Med 380:741-51)。用SG治疗的患者先前用紫杉烷类、蒽环类和其他标准疗法(诸如检查点抑制剂抗体)治疗失败(Bardia等人，2019,N Engl J Med380:741-51)。
已经从II期开放标签研究中公布了戈沙妥珠单抗在患有转移性尿路上皮癌(mUC)的患者中的临时结果(Tagawa等人，2019,Ann Oncol 30(增刊_5):v851-934,mdz394)。在35例用10mg/kg戈沙妥珠单抗(SG)治疗的mUC患者中，客观缓解率(ORR)为29％，2例患者完全缓解(CR)、6例确认部分缓解(PR)，并且2例PR待确认。百分之七十四的治疗患者显示肿瘤尺寸缩小。肝转移患者的ORR为25％。SG耐受性良好，具有可管理、可预测和一致的安全特性，并且神经病变不大于或等于3级，无间质性肺病，并且无治疗相关死亡。这些数据建立在对戈沙妥珠单抗(IMMU-132-01)进行的首次人类药物试验中生成的早期数据上，其中在以推荐的2期剂量戈沙妥珠单抗治疗的45例尿路上皮癌患者中报道了31％的ORR。
在患有非小细胞肺癌(NSCLC)的患者中也已经获得了SG的临床结果(Heist等人，2017,J Clin Oncol 35:2790-97)。在47例用中位数为3种的既往疗法(包括检查点抑制剂)治疗且缓解可评估的患者中，ORR为19％，临床获益率为43％。中位PFS为5.2个月，中位OS为9.5个月。在转移性SCLC中获得了类似的结果(Gray等人，2017,Clin Cancer Res23:5711-19)。在接受SC的53例mSCLC患者中，ORR为14％，中位缓解持续时间为5.7个月，中位PFS为3.7个月，并且中位OS为7.5个月。百分之六十的患者显示肿瘤相对于基线缩小。基于上文论述的结果，我们得出结论，SG用于治疗各种各样的Trop-2+癌症是安全有效的。
尽管对使用抗Trop-2 ADC的疗法有这些有利的缓解，但是相当大百分比的患者将仍然无法缓解，或将对使用ADC的单一疗法产生抗性。需要一种诊断测定法或测定法的组合，其可以识别患有可能对用抗Trop-2 ADC(诸如戈沙妥珠单抗)治疗或者对使用ADC和一种或多种其他已知抗癌治疗的组合疗法更敏感的肿瘤的患者。还需要可以识别可能从使用单独的或与其他药剂组合的主题ADC的疗法受益的具有残留疾病和/或高复发风险的患者的生物标志物。
发明内容
在一个方面，本文提供了用抗Trop-2 ADC单独地或与至少一种其他已知抗癌治疗组合治疗患者中的表达Trop-2的癌症的方法。在一些实施方案中，本文所提供的方法涉及在向患有表达Trop-2的癌症的患者施用抗Trop2 ADC之前使用一种或多种生物标志物和测定法。在一些实施方案中，所述方法涉及使用一种或多种生物标志物来选择用抗Trop2 ADC治疗的患者。在某些实施方案中，本文所提供的方法涉及使用一种或多种诊断测定法来预测对用抗Trop-2 ADC单独地或与至少一种其他已知抗癌治疗组合治疗表达Trop-2的癌症的反应性，并且/或者指示需要用抗Trop-2 ADC单独地或与至少一种其他已知抗癌治疗组合治疗表达Trop-2的癌症。此类测定法可以检测DNA或RNA生物标志物的存在和/或不存在，所述生物标志物诸如突变、启动子甲基化、染色体重排、基因扩增和/或RNA剪接变体。替代性地，此类测定法可以检测关键基因(诸如Trop-2)的mRNA和/或蛋白质产物的过表达。作为生物标志物或用于诊断测定法的感兴趣基因可以包括但不限于53BP1、AKT1、AKT2、AKT3、APE1、ATM、ATR、BARD1、BAP1、BLM、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRIP1(FANCJ)、CCND1、CCNE1、CCDKN1、CDK12、CHEK1、CHEK2、CK-19、CSA、CSB、DCLRE1C、DNA2、DSS1、EEPD1、EFHD1、EpCAM、ERCC1、ESR1、EXO1、FAAP24、FANC1、FANCA、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCM、HER2、HMBS、HR23B、KRT19、KU70、KU80、hMAM、MAGEA1、MAGEA3、MAPK、MGP、MLH1、MRE11、MRN、MSH2、MSH3、MSH6、MUC16、NBM、NBS1、NER、NF-κB、P53、PALB2、PARP1、PARP2、PIK3CA、PMS2、PTEN、RAD23B、RAD50、RAD51、RAD51AP1、RAD51C、RAD51D、RAD52、RAD54、RAF、K-ras、H-ras、N-ras、RBBP8、c-myc、RIF1、RPA1、SCGB2A2、SLFN11、SLX1、SLX4、TMPRSS4、TP53、TROP-2、USP11、VEGF、WEE1、WRN、XAB2、XLF、XPA、XPC、XPD、XPF、XPG、XRCC4和XRCC7。(参见例如，Kwan等人，2018,CancerDiscov 8:1286-99；Vardakis等人，2010,Clin Cancer Res,17:165-73；Lianidou和Markou，2011,Clin Chem 57:1242-55；Xing等人，2019,Breast Cancer Res 21:78；Banno等人，2017,Int J Oncol 50:2049-58；Yaganeh等人，2017,Genes Cancer 8:784-98；Kitazano等人，Cancer Sci，2019年7月30日(刊载之前的电子版)；Allegra等人，2016,JClin Oncol 34:179-85；Shaw等人，2017,Clin Cancer Res 23:88-96；Jin等人，2017,Cancer Biol Ther 18:369-78；Williamson等人，2016,Nature Commun 7:13837；McCabe等人，2006,Cancer Res 66:8109-15；Srivastava和Raghavan，2015,Chem Biol 22:17-29)。在更具体的实施方案中，感兴趣基因可以选自：BRCA1、BRCA2、CHEK2、MSH2、MSH6、TP53、CDKN1A、BAG6、BRSK2、ERN1、FHIT、HIPK2、LGALS12、ZNF622、AEN、SART1、USP28、GADD45B、TGFB1、NDRG1、WEE1、PPP1R15A、MYBBP1A、SIRT1、ABL1、HRAS、ZNF385B、POLR2K和DDB2。
可以检测、纯化和/或分析不同形式的生物分子。在某些实施方案中，癌症生物标志物可以通过对疑似肿瘤直接取样(活检)来检测，例如使用免疫组织化学、蛋白质印迹、RT-PCR或其他已知技术。优选地，生物标志物可以在血液、淋巴、血清、血浆、尿液或其他流体(液体活检)中检测。液体活检样品中的生物标志物以多种形式出现，诸如蛋白质、cfDNA(无细胞DNA)、ctDNA(循环肿瘤DNA)和CTC(循环肿瘤细胞)，并且每种形式都可以使用下文详细论述的特定高级检测技术来检测。尽管本文所公开的方法和组合物一般用于癌症的检测、鉴定、表征和/或预后，但是在更具体的实施方案中，它们可以应用于表达特定肿瘤相关抗原(TAA)诸如Trop-2的肿瘤。在此类实施方案中，TAA(例如Trop-2)的表达水平或拷贝数可以具有独立于其他癌症生物标志物或与其他癌症生物标志物组合的预测值。此类预测性生物标志物可以用于预测对用ADC单一疗法或ADC与其他抗癌剂的组合疗法进行治疗的敏感性或抗性，或者前述治疗的毒性或对前述治疗的需求。此类生物标志物还可以用于确认特定肿瘤类型是否存在，或者用于预测表现出特定生物标志物或生物标志物组合的患者中的疾病过程。生物标志物的其他用途包括提高诊断准确性、个体化患者治疗(精准医疗)、监测疾病进展和/或检测癌症治疗的早期复发。
在某些实施方案中，循环肿瘤细胞(CTC)可以从血液、血清或血浆中分离。患者的血液、血浆或血清中存在CTC可以预测转移性癌症，或者指示早期抗癌治疗后的残余癌细胞。除了CTC本身存在的诊断价值之外，还可以测定分离的CTC是否存在一种或多种生物标志物(参见例如，Shaw等人，2017,Clin Cancer Res 23:88-96；Tellez-Gabriel等人，2019,Theranostics 9:4580-94；Kwan等人，2018,Cancer Discov 8:1286-99)。用于从血清或血浆中分离CTC的技术在下文更详细地论述，例如使用
Figure BDA0003854440460000061
系统。抗Trop-2、抗EpCAM或其他已知的抗体可以用作捕获抗体来分离Trop-2+或EpCAM+CTC。替代性地，在CTC检测或分离中使用的捕获抗体的组合是已知的，并且可以使用。
在优选的实施方案中，本发明涉及使用抗Trop-2 ADC与一种或多种已知抗癌剂的组合的组合疗法。此类药剂可以包括但不限于：PARP抑制剂、ATM抑制剂、ATR抑制剂、CHK1抑制剂、CHK2抑制剂、Rad51抑制剂、WEE1抑制剂、PI3K抑制剂、AKT抑制剂、CDK 4/6抑制剂，以及/或者基于铂的化学治疗剂。在组合疗法中使用的具体药剂在下文更详细地论述，但可以包括：奥拉帕尼、芦卡帕尼、他拉唑帕尼、维利帕尼、尼拉帕尼、阿卡替尼、替莫唑胺、阿替利珠单抗、帕博利珠单抗、纳武单抗、伊匹单抗、匹地珠单抗、度伐利尤单抗、BMS-936559、BMN-673、曲美木单抗、艾代拉里斯、伊马替尼、依鲁替尼、甲磺酸艾日布林、阿贝西利、帕博西尼、瑞博西利、曲拉西利、贝佐替尼、依帕曲替尼、阿普罗替尼、阿富塞替尼、曲西立滨、塞拉替尼、迪那西利、夫拉平度、罗斯科维汀、G1T38、SHR6390、库潘尼西、替西罗莫司、依维莫司、KU60019、KU55933、KU 59403、AZ20、AZD0156、AZD1390、AZD1775、AZD2281、AZD5363、AZD6738、AZD7762、AZD8055、AZD9150、BAY-937、BAY1895344、BEZ235、CCT241533、CCT244747、CGK733、CID44640177、CID1434724、CID46245505、CHIR-124、EPT46464、FTC、VE-821、VRX0466617、VX-970、LY294002、LY2603618、M1216、M3814、M4344、M6620、MK-2206、NSC19630、NSC109555、NSC130813、NSC205171、NU6027、NU7026、普瑞沙替尼(LY2606368)、PD0166285、PD407824、PV1019、SCH900776、SRA737、BMN 673、CYT-0851、mirin、Torin-2、氟喹啉2、烟曲霉毒素C、姜黄素、Kol43、GF120918、YHO-13351、YHO-13177、XL9844、渥曼青霉素、拉帕替尼、索拉非尼、舒尼替尼、尼罗替尼、吉西他滨、硼替佐米、曲古抑菌素A、紫杉醇、阿糖胞苷、顺铂、奥沙利铂和/或卡铂。
更优选地，该组合疗法比单独的ADC、单独的抗癌剂或者ADC和抗癌剂的作用的总和更有效。最优选地，该组合对治疗人类受试者的疾病(诸如癌症)表现出协同作用。在替代性实施方案中，ADC或组合疗法可以连同外科手术、放射疗法、化学疗法、免疫疗法、放射免疫疗法、免疫调节剂、疫苗和其他标准癌症治疗一起用作新辅助疗法或辅助疗法。
在利用抗Trop-2 ADC的实施方案中，抗Trop-2抗体部分优选地为hRS7抗体，其包含轻链CDR序列CDR1(KASQDVSIAVA，SEQ ID NO:1)、CDR2(SASYRYT，SEQ ID NO:2)和CDR3(QQHYITPLT，SEQ ID NO:3)，以及重链CDR序列CDR1(NYGMN，SEQ ID NO:4)、CDR2(WINTYTGEPTYTDDFKG，SEQ ID NO:5)和CDR3(GGFGSSYWYFDV，SEQ ID NO:6)。在更优选的实施方案中，抗Trop-2ADC是戈沙妥珠单抗(hRS7-CL2A-SN-38)。然而，在替代性的实施方案中，可以利用如下文所论述的其他已知的抗Trop-2 ADC。
在一个优选的实施方案中，与主题抗体偶联以形成ADC的药物部分是拓扑异构酶I抑制剂的以下活性代谢物：SN-38(Moon等人，2008,J Med Chem 51:6916-26)或DxD(Ogitani等人，2016Clin Cancer Res 22:5097-108；Ogitani等人，2016Bioorg Med ChemLett 26:5069-72)。然而，可以利用的其他药物部分包括：紫杉烷类(例如，巴卡亭III、紫杉醇)、奥瑞他汀(例如，MMAE)、卡奇霉素、埃博霉素、蒽环类药物(例如，多柔比星(DOX)、表柔比星、吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯啉基多柔比星)、拓扑替康、依托泊苷、顺铂、奥沙利铂或卡铂(参见例如，Priebe W(编辑)，1995，ACS会议论文集第574卷，American Chemical Society(Washington D.C.)出版(第332页)；Nagy等人，1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:2464-2469)。一般来讲，可以利用任何抗癌细胞毒性药物，更优选地导致DNA损伤的药物。优选地，所述抗体或其片段连接到至少一个化学治疗药物部分；优选地1个至5个药物部分；更优选地6个至12个药物部分、最优选地约6个至约8个药物部分。
各种实施方案可以涉及主题方法和组合物治疗癌症的用途，其中癌症包括但不限于口腔癌、食道癌、胃肠癌、肺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、宫颈癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、结缔组织癌、甲状腺癌、肝癌、胆囊癌、尿路上皮癌、肾癌、皮肤癌、中枢神经系统癌和睾丸癌。优选地，癌症可以是转移性三阴性乳腺癌(TNBC)、转移性HR+/HER2-乳腺癌、转移性非小细胞肺癌、转移性小细胞肺癌、转移性子宫内膜癌、转移性尿路上皮癌、转移性胰腺癌、转移性前列腺癌或转移性结肠直肠癌。将治疗的癌症可以是转移性或非转移性的，并且主题疗法可以在一线、二线、三线或晚期癌症中以及在新辅助或辅助的转移性环境或维持环境中使用。在一些实施方案中，癌症是尿路上皮癌。在一些实施方案中，癌症是转移性尿路上皮癌。在一些实施方案中，癌症是抗治疗性尿路上皮癌。在一些实施方案中，癌症对用基于铂和/或基于检查点抑制剂(CPI)(例如，抗PD1抗体或抗PD-L1抗体)的疗法进行治疗具有抗性。在一些实施方案中，癌症是转移性TNBC。
ADC的优选最佳给药剂量可以包括每周、每周两次、每隔一周或每三周给予的介于4mg/kg至16mg/kg之间、优选地介于6mg/kg至12mg/kg之间、更优选地介于8mg/kg至10mg/kg之间的剂量。最佳给药时间表可以包括下列治疗周期：连续治疗两周，随后休息一周、两周、三周或四周；或者，交替治疗和休息几周；或者，治疗一周，随后休息两周、三周或四周；或者，治疗三周，随后休息一周、两周、三周或四周；或者，治疗四周，随后休息一周、两周、三周或四周；或者，治疗五周，随后休息一周、两周、三周、四周或五周；或者，每两周施用一次、每三周施用一次或每月施用一次。治疗可以延长任意数量的周期。示例性的使用剂量可以包括1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg或18mg/kg。普通技术人员将认识到，在选择ADC的最佳剂量和时间表时可以考虑多种因素，诸如年龄、总体健康状况、特定器官功能或体重，以及既往疗法对特定器官系统(例如骨髓)的影响和治疗意图(治愈性或姑息性)，并且可以在治疗过程期间增加或减少施用的剂量和/或频率。根据需要可以重复施用该剂量，在仅仅4至8个剂量后观察到肿瘤缩小的迹象。使用组合疗法可以允许在此类组合中给予较低剂量的每种治疗剂，从而减少某些严重副作用，并且潜在地缩短所需的疗程。当没有重叠毒性或只有最小的重叠毒性时，也可以给予每种治疗剂的全剂量。
要求保护的方法使得实体瘤尺寸缩小15％或更多、优选地20％或更多、优选地30％或更多、更优选地40％或更多(根据RECIST或RECIST1.1，通过对目标病变的最长直径求和来测量)。普通技术人员将认识到，肿瘤尺寸可以通过多种不同的技术来测量，诸如肿瘤总体积、在任何维度上的最大肿瘤尺寸，或者在若干维度上的尺寸测量值的组合。这可以采用标准的放射学程序(诸如计算机断层摄影、磁共振成像、超声波检查和/或正电子发射断层摄影)来进行。测量尺寸的手段与观察用抗体或免疫偶联物治疗使得肿瘤尺寸减小(优选地导致肿瘤消除)的趋势的手段相比不那么重要。然而，为了遵守RECIST指南，优选的是使用造影剂连续地进行CT或MRI检查，并且应当重复该CT或MRI以确认测量值。对于恶性血液肿瘤，可以利用上述成像，以及癌症反应的其他标准量度，诸如不同细胞群的细胞计数、循环肿瘤细胞的检测和/或水平、免疫组织学、细胞学或荧光显微镜检查和类似的技术。
本文所公开的经优化的施用剂量和时间表，无论是与生物标志物分析结合使用，还是未与生物标志物分析结合使用，在人类受试者中均显示出乎意料的优异功效和降低的毒性，该发现无法从动物模型研究预测。令人惊讶的是，这种优异功效允许治疗先前被发现对一种或多种标准抗癌疗法具有抗性的肿瘤，包括先前用伊立替康(SN-38的母体化合物)治疗失败的一些肿瘤。
附图说明
图1A.用戈沙妥珠单抗治疗转移性尿路上皮癌患者的治疗缓解率。瀑布图示出了40例患者(排除5例未进行基线后评估的患者)中的目标病变的直径的总和*相对于基线的最佳变化百分比。缩写：CR，完全缓解；PR，部分缓解；SD，疾病稳定；PD，疾病进展。*目标病变的直径(对于非结节病变为最长轴，对于结节病变为短轴)的总和；
Figure BDA0003854440460000101
PD的变化为0％，且具有最佳总缓解率；
Figure BDA0003854440460000102
目标病变缩小>30％但未确认，因此被归类为SD；§CR基于淋巴结目标病变缩小到<10mm；**目标病变减小100％，但非目标病变持续稳定，因此被归类为PR。
图1B.用戈沙妥珠单抗治疗转移性尿路上皮癌患者的治疗缓解率。患者从治疗开始到出现进展达到客观缓解(n＝14)的泳道图。黑色方框指示开始缓解，箭头指示在数据截止处缓解持续存在。黑色圆圈指示其缓解持续时间由于缺少2次肿瘤评估或由于研究中断而被删截的患者。在分析时，3例患者仍在接受治疗，且缓解持续存在(>17个月、>19个月和>29个月)。
图2A.用戈沙妥珠单抗治疗转移性尿路上皮癌患者的中位无进展生存期(PFS)。
图2B.用戈沙妥珠单抗治疗转移性尿路上皮癌(mUC)患者的中位总生存期(OS)。
图3A.与对戈沙妥珠单抗的反应相关联的分子特征。Oncoprint展示了在用戈沙妥珠单抗治疗的14例mUC患者(反应者n＝6，非反应者n＝8)的GO:0097193信号传导通路中DNA损伤修复(DDR)基因和细胞凋亡基因中的突变频率。
图3B.mUC患者中与对戈沙妥珠单抗的反应相关联的分子特征。RNAseq热图示出了反应者对照非反应者的差异表达基因(伪发现率[FDR]<0.001；上调的基因：对数倍数变化[LFC]>2，n＝374；下调的基因：LFC<-2，n＝380)。
图3C.mUC患者中与对戈沙妥珠单抗的反应相关联的分子特征。单样品GSEA(ssGSEA)富集得分的差异显示反应者对照非反应者的细胞凋亡通路和P53通路的富集情况。报告Mann-Whitney检验的p值。
图4A.TNBC中的缓解和治疗分析。瀑布图示出了目标病变直径(对于非结节病变为最长轴，对于结节病变为短轴)的总和相对于基线的最佳变化百分比。星号表示其最佳变化百分比为百分之零的3例患者(2SD，1PD)。根据RECIST，在20％和-30％处的虚线分别指示疾病进展和部分缓解。
图4B.TNBC患者从治疗开始到疾病进展(通过局部评估确定)的客观缓解(根据RECIST，1.1版)情况的泳道图。在分析时，6例患者继续缓解。垂直虚线示出6个月和12个月时的缓解。
图5A.缓解可评估的mSCLC患者的抗肿瘤反应和持续时间的图示。根据RECIST 1.1标准，所选择目标病变的直径总和的最佳变化百分比，和最佳总缓解率描述符。根据戈沙妥珠单抗起始剂量以及患者对既往一线疗法敏感还是具有抗性来识别患者。在首次观察到客观缓解后4至6周，部分缓解未得到确认的患者在其接下来的CT评估中未能维持至少30％的肿瘤缩小。根据RECIST 1.0，这些患者的最佳总缓解情况是疾病稳定。
图5B.缓解可评估的mSCLC患者的抗肿瘤反应和持续时间的图示。达到部分或完全缓解的那些患者从开始治疗起的缓解持续时间。示出了实现的肿瘤缩小≥30％时的具体时间，以及戈沙妥珠单抗起始剂量和对一线疗法的敏感性。
图5C.mSCLC缓解可评估的患者的抗肿瘤反应和持续时间的图示。实现疾病稳定或更佳状态的患者的反应动态。继续治疗且部分缓解得到确认的两例患者用虚线示出
图6A.利用Kaplan-Meier方法推导的针对入选戈沙妥珠单抗试验的全部53例mSCLC患者的无进展生存期曲线。
图6B.利用Kaplan-Meier方法推导的针对入选戈沙妥珠单抗试验的全部53例mSCLC患者的总生存期曲线。
具体实施方式
定义
在以下描述中使用了许多术语，并且提供了以下定义以便于理解所要求保护的主题。本文未明确定义的术语根据其平常和普通的含义使用。
除非另外指明，否则一个或一种意指“一个或多个”或者“一种或多种”。
术语约在本文中用于表示某个值加或减百分之十(10％)。例如，“约100”是指介于90与110之间的任何数。
如本文所用，抗体是指全长(即，天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)。抗体在所要求保护主题的范围内可以是偶联的或以其他方式衍生化。此类抗体包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4(和IgG4亚型)，以及IgA同种型。如下文所用，缩写“MAb”可以互换使用，用于指代抗体、抗体片段、单克隆抗体或多特异性抗体。
抗体片段是抗体的一部分，诸如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、Fv、scFv(单链Fv)、单结构域抗体(DAB或VHH)等，包括IgG4的半分子(van der Neut Kolfschoten等人，Science,2007；317:1554-1557)。使用的抗体片段不管具有怎样的结构，均与被完整抗体识别的相同抗原结合。术语“抗体片段”还包括合成的或遗传工程化的蛋白质，其通过与特定抗原结合形成复合物而像抗体一样起作用。例如，抗体片段包括由可变区组成的分离的片段，诸如由重链的可变区和轻链的可变区组成的“Fv”片段，以及其中轻链可变区和重链可变区通过肽接头连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)。所述片段能够以不同的方式构建，以产生多价和/或多特异性结合形式。
治疗剂是可用于治疗疾病的原子、分子或化合物。治疗剂的示例包括但不限于：抗体、抗体片段、免疫偶联物、检查点抑制剂、药物、细胞毒性剂、促凋亡剂、毒素、核酸酶(包括DNA酶和RNA酶)、激素、免疫调节剂、螯合剂、光活性剂或染料、放射性核素、寡核苷酸、干扰RNA、siRNA、RNAi、抗血管生成剂、化学治疗剂、细胞因子、趋化因子、前药、酶、结合蛋白或肽，或者它们的组合。
如本文所用，当提及特定基因的表达增加或减少时，该术语是指癌细胞与正常、良性和/或野生型细胞相比增加或减少。
抗体和抗体-药物偶联物(ADC)
某些实施方案涉及为未偶联形式或者作为与一种或多种治疗剂附接的免疫偶联物(例如ADC)的抗癌抗体的用途。优选地，偶联剂是诱导DNA链断裂(更优选地通过抑制拓扑异构酶I来诱导DNA链断裂)的作用剂。示例性的抑制拓扑异构酶I抑制剂包括SN-38和DxD。然而，其他拓扑异构酶I抑制剂也是本领域已知的，并且任何此类已知的拓扑异构酶I抑制剂均可以用于抗Trop-2 ADC中。示例性的拓扑异构酶I抑制剂包括喜树碱，诸如伊立替康、拓扑替康、SN-38、二氟替康、S39625、席拉替康(silatecan)、贝洛替康、那米替康、吉马替康、贝洛替康或喜树碱，以及非喜树碱，诸如吲哚并咔唑、菲啶、茚并异喹啉以及它们的衍生物，诸如NSC 314622、NSC 725776、NSC 724998、ARC-111、异吲哚并[2,1-a]喹喔啉、吲哚替康、因帝米替康(indimitecan)、CRLX101、蝴蝶霉素、伊朵替卡林(edotecarin)或贝卡替卡林(becatecarin)。[参见例如，Hevener等人，2018,Acta Pharm Sin B 8:844-61]
在替代性实施方案中，可以利用拓扑异构酶II抑制剂，诸如蒽环类药物、多柔比星、表柔比星、戊柔比星、柔红霉素、伊达比星、阿多柔比星、蒽二酮类、米托蒽醌、匹杉琼、安吖啶、右雷佐生、表鬼臼毒素、环丙沙星、沃沙罗辛(vosaroxin)、替尼泊苷或依托泊苷。[参见例如，Hevener等人，2018,Acta Pharm Sin B 8:844-61]
尽管拓扑异构酶抑制剂优选地用于抗体偶联，但是诱导DNA损伤和/或链断裂的其他作用剂也是已知的，并且可以用于替代性实施方案中。此类已知的抗癌剂包括但不限于：氮芥、叶酸类似物(诸如氨基蝶呤或甲氨蝶呤)、烷基化剂(诸如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、丝裂霉素C、链脲佐菌素或美法仑)、亚硝基脲类(诸如卡莫司汀、洛莫司汀或司莫司汀)、三氮烯类(诸如达卡巴嗪或替莫唑胺)，或者基于铂的抑制剂(诸如顺铂、卡铂、吡铂或奥沙利铂)。[参见例如，Ong等人，2013,Chem Biol 20:648-59]
在一个优选的实施方案中，抗体或包含抗Trop-2抗体(诸如hRS7抗体)的免疫偶联物可以用于治疗癌，诸如食道癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、膀胱癌、尿路上皮癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫癌、肾癌、头颈癌、脑癌和前列腺，如美国专利第7,238,785号、第7,999,083号、第8,758,752号、第9,028,833号、第9,745,380号和第9,770,517号中所公开的；这些专利各自的实施例部分以引用方式并入本文。hRS7抗体是人源化抗体，其包含轻链互补决定区(CDR)序列CDR1(KASQDVSIAVA，SEQ ID NO:1)、CDR2(SASYRYT，SEQ ID NO:2)和CDR3(QQHYITPLT，SEQ ID NO:3)，以及重链CDR序列CDR1(NYGMN，SEQ IDNO:4)、CDR2(WINTYTGEPTYTDDFKG，SEQ ID NO:5)和CDR3(GGFGSSYWYFDV，SEQ ID NO:6)。然而，在替代性的实施方案中，其他抗Trop-2抗体是已知的，并且可以用于抗Trop-2 ADC中。示例性的抗Trop-2抗体包括但不限于卡妥索单抗、VB4-845、IGN-101、阿德木单抗、ING-1、EMD 273 066或hTINA1(参见美国专利第9,850,312号)。抗Trop-2抗体可从许多来源商购获得，包括LS-C126418、LS-C178765、LS-C126416、LS-C126417(LifeSpan BioSciences,Inc.,Seattle,Wash.)；10428-MM01、10428-MM02、10428-R001、10428-R030(Sino BiologicalInc.，中国北京)；MR54(eBioscience,San Diego,Calif.)；sc-376181、sc-376746(SantaCruz Biotechnology,Santa Cruz,Calif.)；MM0588-49D6(Novus Biologicals,Littleton,Colo.)；ab79976和ab89928(ABCAM.RTM.,Cambridge,Mass.)。
其他抗Trop-2抗体已经公开于专利文献中。例如，美国专利公布第2013/0089872号公开了抗Trop-2抗体K5-70(登录号FERM BP-11251)、K5-107(登录号FERM BP-11252)、K5-116-2-1(登录号FERM BP-11253)、T6-16(登录号FERM BP-11346)和T5-86(登录号FERMBP-11254)，其保藏于日本筑波市的国际专利生物保藏中心。美国专利第5,840,854号公开了抗Trop-2单克隆抗体BR110(ATCC编号HB11698)。美国专利第7,420,040号公开了由以登录号141205-05保藏于IDAC(加拿大温尼伯市的加拿大国际保藏机构)的杂交瘤细胞系AR47A6.4.2产生的抗Trop-2抗体。美国专利第7,420,041号公开了由以登录号141205-03保藏于IDAC的杂交瘤细胞系AR52A301.5产生的抗Trop-2抗体。美国专利公布第2013/0122020号公开了抗Trop-2抗体3E9、6G11、7E6、15E2、18B1。编码代表性抗体的杂交瘤以登录号PTA-12871和PTA-12872保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。美国专利第8,715,662号公开了由以保藏号PD08019、PD 08020和PD 08021保藏于AID-ICLC(意大利热那亚市)的杂交瘤产生的抗Trop-2抗体。美国专利申请公布第20120237518号公开了抗Trop-2抗体77220、KM4097和KM4590。美国专利第8,309,094号(Wyeth)公开了通过序列表鉴定的抗体A1和A3。美国专利第9,850,312号公开了抗Trop-2抗体TINA1、cTINA1和hTINA1。本段落中以上引用的每件专利或专利申请的实施例部分以引用方式并入本文。非专利公布Lipinski等人(1981,Proc Natl.Acad Sci USA,78:5147-50)公开了抗Trop-2抗体162-25.3和162-46.2。
在一个优选的实施方案中，用于治疗人类疾病的抗体是抗体的人类或人源化(CDR移植)型式，不过也可以使用抗体的鼠类型式和嵌合型式。与递送剂相同物种的IgG分子对于使免疫反应降至最低是最优选的。此情形在考虑重复治疗时特别重要。对于人类来说，人类或人源化IgG抗体由患者生成抗IgG免疫反应的可能性较低。
ADC的制剂和施用
抗体或免疫偶联物(例如，ADC)可以根据已知方法配制，以制备药学上有用的组合物，由此抗体或免疫偶联物与药学上合适的赋形剂一起组合在混合物中。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上合适的赋形剂的一个示例。其他合适的赋形剂是本领域技术人员熟知的。参见例如，Ansel等人，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第5版(Lea和Febiger，1990)；以及Gennaro(编辑)，REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(Mack Publishing Company 1990)，及其修订版。
在一个优选的实施方案中，将抗体或免疫偶联物配制在古德氏缓冲液(pH 6-7)中，使用的缓冲液选自由以下项组成的组：N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(ADA)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、和哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)[PIPES]。更优选的缓冲液是MES或MOPS，优选地在20mM至100mM的浓度范围内，更优选地为约25mM。最优选的是25mM MES，pH6.5。该制剂还可以包含25mM海藻糖和0.01％v/v聚山梨醇酯80作为赋形剂，作为添加赋形剂的结果，最终的缓冲液浓度改变为22.25mM。优选的储存方法是作为偶联物的冻干制剂，储存在-20℃至2℃的温度范围内，最优选地储存在2℃至8℃。
所述抗体或免疫偶联物可以被配制用于经由例如快速浓注、缓慢输注或连续输注来静脉内施用。优选地，本发明的抗体在少于约4小时的时段内输注，并且更优选地，在少于约3小时的时段内输注。例如，最初的25mg至50mg可以在30分钟内，优选地甚至在15分钟内输注，剩余的剂量在接下来的2小时至3小时内输注。注射用制剂能够以单位剂型存在，例如在安瓿或多剂量容器中，其中添加防腐剂。所述组合物可以采取诸如在油性或水性溶媒中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。替代性地，活性成分可以是粉末形式，其在用合适的溶媒(例如无菌无热原水)溶解后使用。
一般来讲，施用于人类的抗体或免疫偶联物的剂量将根据诸如患者的年龄、体重、身高、性别、一般性医疗状况和既往病史等因素而变化。可能期望以单次静脉内输注向接受者提供约1mg/kg至24mg/kg范围内的免疫偶联物剂量，但是根据情况的需要，也可以施用较低或较高的剂量。根据需要可以重复施用该剂量，例如，每周一次持续4至10周、每周一次持续8周，或每周一次持续4周。根据维持治疗的需要，也可以按较低的频率施用该剂量，诸如每隔一周施用，持续几个月；或者每月或每季度施用，持续数月。优选的剂量可以包括但不限于：1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg和18mg/kg。该剂量优选地施用多次、每周施用一次或两次，或者以每3周或每4周一次的较低频率施用。可以使用4周、更优选地8周、更优选地16周或更长时间的最低剂量时间表。施用时间表可以包括每周施用一次或两次，施用周期选自由以下项组成的组：(i)每周；(ii)每隔一周；(iii)治疗一周，随后停用两周、三周或四周；(iv)治疗两周，随后停用一周、两周、三周或四周；(v)治疗三周，随后停用一周、两周、三周、四周或五周；(vi)治疗四周，随后停用一周、两周、三周、四周或五周；(vii)治疗五周，随后停用一周、两周、三周、四周或五周；(viii)每月和(ix)每3周。该周期可以重复2次、4次、6次、8次、10次、12次、16次或20次或者更多次。
替代性地，抗体或免疫偶联物可以每2周或每3周施用一个剂量，重复总共至少3个剂量。或者每周施用两次，持续4至6周。如果剂量降低至约200至300mg/m2(对于1.7m的患者，每剂340mg；或对于70kg的患者，4.9mg/kg)，则可以每周施用一次或甚至两次，持续4至10周。替代性地，可以将该剂量时间表减小，即每2周或每3周施用，持续2至3个月。然而，已经确定，对于重复的给药周期，甚至更高的剂量(诸如每周一次或每2至3周一次，每次12mg/kg)也可以通过缓慢静脉内输注来施用。该给药时间表可以任选地以其他间隔重复，并且剂量可以通过各种肠胃外途径给予，且对剂量和时间表进行适当调整。
DNA损伤和修复通路
使用具有靶向拓扑异构酶的药物部分的抗癌ADC可以导致癌细胞DNA中累积单链或双链断裂。对拓扑异构酶I抑制剂或其他损伤DNA的抗癌剂的抗癌作用的抗性或者在这些抗癌作用后复发，可能是由于存在DNA修复机制(诸如DNA损伤反应(DDR))所致。DDR是负责修复正常细胞和肿瘤细胞中的DNA损伤的一组复杂通路。可以将针对DDR通路的抑制剂与抗Trop-2 ADC组合使用，以在使用抗Trop-2 ADC的单一疗法后复发或对使用抗Trop-2 ADC的单一疗法具有抗性的肿瘤中提供增加的抗癌功效。替代性地，如果该组合显著优于单独使用ADC或其他治疗剂的单一疗法，则该组合疗法可以用于一线治疗中。此外，存在突变、其他遗传缺陷或编码DDR组分的基因的表达水平的变化可以预测抗Trop-2 ADC和/或使用抗Trop-2 ADC和一种或多种其他抗癌剂的组合疗法的功效。
在优选的实施方案中，主题ADC可以与一种或多种抑制DDR通路中的各种步骤的已知抗癌剂组合使用。有许多通路参与细胞DNA修复，且不同通路的蛋白质效应物部分重叠。拓扑异构酶抑制性ADC与针对DNA损伤修复通路中不同步骤的其他抑制剂组合使用可以表现出合成致死性，其中两种不同基因中的功能同时丧失导致细胞死亡，而仅一种基因中的功能丧失并不导致细胞死亡(例如，Cardillo等人，2017,Clin Cancer Res23:3405-15)。此概念也可以应用于癌症治疗中，其中在一种基因中携带突变的癌细胞被化学治疗剂靶向，该化学治疗剂抑制细胞用来克服第一种突变的第二种基因的功能(Cardillo等人，2017,Clin Cancer Res 23:3405-15)。此概念已经被应用于(例如)在具有BRCA基因突变的细胞中使用PARP抑制剂(Benafif和Hall，2015,Onco Targets Ther 8:519-28)。原则上，合成致死性可以在存在或不存在潜在癌细胞突变的情况下应用，例如通过单独使用组合疗法或将该组合疗法与DNA损伤诱导剂组合使用，其中该组合疗法采用了两种或更多种靶向DDR通路的不同方面的抑制剂。
双链DNA断裂(DSB)通过两条主要通路即同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)来修复。[参见例如，Srivastava和Raghavan，2015,Chem Biol 22:17-29]这些通路中的每一条都包括亚通路，即NHEJ通路的经典亚通路或替代性亚通路(分别为cNHEJ和aNHEJ)，以及HR通路的单链退火(SSA)。HR需要广泛的同源性来修复DSB，并且在细胞周期的S期和G2期最活跃，而NHEJ利用有限的同源性或不利用同源性来进行末端连接，并且能够在整个细胞周期中起作用。(Srivastava和Raghavan，2015,Chem Biol 22:17-29)。
通过DSB激活DDR通路包括经由ATM、ATR和DNA-PKcs介导的检查点阻滞(Nickoloff等人，2017,J Natl Cancer Inst 109:djx059)。ATM是HR修复DSB所必需的，并且通过刺激CtIP和MREll的核酸溶解活性以生成3’-ssDNA突出端，随后进行RPA加载与RAD51核丝形成来触发DSB末端切除(Bakr等人，2015,Nucleic Acids Res 43:3154)。ATR对更广谱的DNA损伤(包括DSB和ssDNA)有反应(Marechal等人，2013,Cold Spring Harb Perspect Biol 5:a012716)。然而，ATR和ATM的功能并不互相排斥，都是DSB诱导的检查点反应和DSB修复所必需的(Marechal等人，2013,Cold Spring Harb Perspect Biol 5:a012716)。ATR-ATRIP复合物定位到DNA损伤位点依赖于存在RPA包被的ssDNA的长拉伸物，这些长拉伸物可以通过如下文所论述的切除生成(Marechal等人，2013,Cold Spring Harb Perspect Biol 5:a012716)。DNA-PKcs是DNA-PK的催化亚基，并且主要参与NHEJ通路(Marechal等人，2013,Cold Spring Harb Perspect Biol 5:a012716)。
确定利用哪种DSB修复通路部分地由DSB处5’末端切除的量介导，该5’末端切除受53BP1/RIF1抑制并且由BRCA1/CtIP促进。切除增加有利于HR修复通路，而切除减少促进NHEJ通路(Nickoloff等人，2017,J Natl Cancer Inst 109:djx059)。在HR通路开始时，MRE11(MRN复合物的一部分连同RAD50和NBS1)启动有限的末端切除，随后是Exo1/EEPD1和Dna2，其用于广泛切除(Nickoloff等人，2017,J Natl Cancer Inst109:djx059)。在NHEJ通路中，53BP1/RIF1和KU70/80抑制切除并促进经典NHEJ，而PARP1与KU蛋白竞争并促进替代性NHEJ的有限末端切除(Nickoloff等人，2017,J Natl Cancer Inst 109:djx059)。Polθ也参与aNHEJ。
HR通路中的另外的步骤由RPA、BRCA2、RAD51、RAD52、RAD54和Polδ促进(Nickoloff等人，2017,J Natl Cancer Inst 109:djx059)。RAD52还连同ERCC1、ERCC2、ERCC3和ERCC4一起参与SSA(Nickoloff等人，2017,J Natl Cancer Inst 109:djx059)。参与HR的其他蛋白质包括RAD50、NBS1、BLM、XPF、FANCM、FAAP24、FANC1、FAND2、MSH3、SLX4、MUS81、EME1、SLX1、PALB2、BRIP1、BARD1、BAP1、PTEN、RAD51C、USP11、WRN和NER。[Nickoloff等人，2017,JNatl Cancer Inst 109:djx059；Srivastava和Raghavan，2015,Chem Biol 22:17-29]参与NHEJ的其他蛋白质包括Artemis、Polμ、Polλ、连接酶IV、XRCC4和XLF。[Nickoloff等人，2017,J Natl Cancer Inst109:djx059；Srivastava和Raghavan,2015,Chem Biol 22:17-29]关于这些各种DDR蛋白和抑制剂各自的作用的进一步细节在下文提供。
单链DNA病变的修复还可以经由多条通路即碱基切除修复(BER)、核苷酸切除修复(NER)和错配修复(MMR)来进行。BER通路由APE1、PARP1、Polβ、Lig III和XRCC1促进。NER由XPC、RAD23B、HR23B、XPF、ERCC1、XPG、XPA、RPA、XPD、CSA、CSB、XAB2和Polδ/κ/ε促进。MMR由MutSα/β、MLH1、PMS2、Exo1、PARP1、MSH2、MSH6和Polδ/ε促进(Nickoloff等人，2017,J NatlCancer Inst109:djx059)。MSH2中的突变使癌症倾向于对甲氨蝶呤和补骨脂素敏感(Nickoloff等人，2017,J Natl Cancer Inst 109:djx059)。NER中的缺陷(诸如ERCC1的表达降低)使癌症倾向于对交联剂诸如顺铂以及PARP1或ATR抑制剂敏感(Nickoloff等人，2017,J Natl Cancer Inst 109:djx059)。
如下文所论述的，各种这些DDR蛋白的抑制剂是已知的，并且任何此类已知抑制剂均可以与主题ADC组合使用。在更优选的实施方案中，BRCA1和/或BRCA2中存在突变可以预测ADC单一疗法或与ADC和DSB修复抑制剂的组合疗法的功效。
使用ADC和DNA损伤修复抑制剂的组合疗法
如上文所论述的，使用抗Trop-2 ADC连同一种或多种DDR通路抑制剂的组合疗法的关键目标是诱导人工(而不是遗传)合成致死性，其中产生DNA损伤的作用剂(例如拓扑异构酶I抑制剂)与抑制DDR损伤修复通路中的步骤的作用剂的组合能够有效地杀死对单独的任一类型的作用剂具有抗性的癌细胞。用于组合疗法的令人特别感兴趣的DDR抑制剂针对PARP、ATR、ATM、CHK1、CHK2、CDK12、RAD51、RAD52和WEE1。在替代性实施方案中，感兴趣的DDR抑制剂可以是既非PARP抑制剂也非RAD51抑制剂的DDR抑制剂。
PARP抑制剂
聚-(ADP-核糖)聚合酶(PARP)在DNA损伤反应中起关键作用，并且直接或间接地影响许多DDR通路，包括BER、HR、NER、NHEJ和MMR(Gavande等人，2016,Pharmacol Ther 160:65-83)。许多PARP抑制剂是本领域已知的，诸如奥拉帕尼、他拉唑帕尼(BMN-673)、芦卡帕尼、维利帕尼、尼拉帕尼、CEP 9722、MK 4827、BGB-290(帕米帕尼)、ABT-888、AG014699、BSI-201、CEP-8983、E7016和3-氨基苯甲酰胺(参见例如，Rouleau等人，2010,Nat Rev Cancer10:293-301；Bao等人，2015,Oncotarget[刊载之前的电子版，2015年9月22日])。已知PARP抑制剂表现出合成致死性，例如在BRCA1/2中具有突变的肿瘤中。奥拉帕尼已经获得FDA批准用于治疗在BRCA1或BRCA2中具有突变的卵巢癌患者。除奥拉帕尼之外，其他FDA批准的用于卵巢癌的PARP抑制剂包括尼拉帕尼和芦卡帕尼。他拉唑帕尼最近被批准用于治疗具有种系BRCA突变的乳腺癌，其正在进行恶性血液肿瘤和实体瘤的III期试验，并且已经报道了在SCLC、卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌中的功效(Bitler等人，2017,Gynecol Oncol 147:695-704)。维利帕尼正在进行进展期卵巢癌、TNBC和NSCLC的III期试验(参见维基百科“PARP_inhibitor”条目下的内容)。并非所有PARP抑制剂都依赖于BRCA突变状态，并且尼拉帕尼已被批准用于不依赖于BRCA状态的复发性铂敏感性卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌的维持治疗(Bitler等人，2017,Gynecol Oncol 147:695-704)。
任何此类已知的PARP抑制剂均可以与抗Trop-2 ADC组合使用，诸如戈沙妥珠单抗或DS-1062。戈沙妥珠单抗与奥拉帕尼、芦卡帕尼和他拉唑帕尼的组合已经在携带TNBC异种移植物的裸鼠中证明了对肿瘤生长的合成致死性和协同抑制(Cardillo等人，2017,ClinCancer Res 23:3405-15)。观察到组合疗法的有益效果与BRCA1/2突变状态无关(Cardillo等人，2017,Clin Cancer Res 23:3405-15)。
CDK12抑制剂
细胞周期蛋白依赖性激酶12(CDK12)是细胞周期调节剂，据报道其与PARP抑制剂共同起作用，并且观察到CDK12活性的敲低促进对奥拉帕尼的敏感性(Bitler等人，2017,Gynecol Oncol 147:695-704)。CDK12表现为至少部分地通过调节DDR基因的表达而起作用(Krajewska等人，2019,Nature Commun 10:1757)。CDK12的各种抑制剂是已知的，诸如迪那西利、夫拉平度、罗斯科维汀、THZ1或THZ531(Bitler等人，2017,Gynecol Oncol 147:695-704；Krajewska等人，2019,Nature Commun 10:1757；Paculova和Kohoutek，2017,Cell Div12:7)。使用PARP抑制剂和迪那西利的组合疗法逆转对PARP抑制剂的抗性(Bitler等人，2017,Gynecol Oncol 147:695-704)。在主题方法中，使用抗Trop-2 ADC与PARP抑制剂和CDK12抑制剂的组合的组合疗法可能是有用的。
RAD51抑制剂
BRCA1和BRCA2编码对于HR DNA修复通路至关重要的蛋白质，并且这些基因中的突变需要增加对NHEJ通路的依赖性才能使肿瘤存活。PARP是NHEJ介导的DNA修复的关键蛋白，并且在BRCA突变的肿瘤(例如，卵巢癌、TNBC)中使用PARP抑制剂(PARPi)提供合成致死性。然而，并非所有BRCA突变的肿瘤都对PARPi敏感，并且许多最初敏感的肿瘤将发展出抗性。
RAD51是HR通路中的另一种中心蛋白，其在癌细胞中频繁地过表达(参见维基百科“RAD51”条目下的内容)。RAD51表达增加可以部分地补偿BRCA突变并降低对PARP抑制剂的敏感性。已经证明，戈沙妥珠单抗(一种携带拓扑异构酶I抑制剂的抗Trop-2 ADC)可以至少部分地补偿RAD51过表达(参见美国专利申请序列号15/926,537)。因此，存在使用拓扑异构酶I抑制性ADC与RAD51抑制剂(有或没有PARP抑制剂)的组合疗法的基本原理。
使用ADC的组合疗法可以利用本领域已知的任何Rad51抑制剂，包括但不限于：B02((E)-3-苄基-2(2-(吡啶-3-基)乙烯基)喹唑啉-4(3H)-酮)(Huang和Mazin，2014,PLoS ONE9(6):e100993)、RI-1(3-氯-1-(3,4-二氯苯基)-4-(4-吗啉基)-1H-吡咯-2,5-二酮)(Budke等人，2012,Nucl Acids Res 40:7347-57)、DIDS(4,4'-二异硫氰基芪-2,2'-二磺酸)(Ishida等人，2009,Nucl Acids Res 37:3367-76)、哈里醌(halenaquinone)(Takaku等人，2011,Genes Cells 16:427-36)；CYT-0851(Cyteir Therapeutics,Inc.)、IBR2(Ferguson等人，2018,J Pharm Exp Ther 364:46-54)或伊马替尼(Choudhury等人，2009,Mol CancerTher 8:203-13)。这些物质中有许多可从商业来源获得(例如，B02，Calbiochem；RI-1，Calbiochem；DIDS，Tocris Bioscience；哈里醌，香港Angene International Ltd.；伊马替尼(
Figure BDA0003854440460000221
)，Novartis)。
如上文所论述的，与ADC以及RAD51抑制剂和PARP抑制剂两者的组合疗法可以用于治疗癌症。
ATM抑制剂
ATM和ATR是DDR的关键介体，它们的作用是诱导细胞周期停滞并且经由其下游靶标促进DNA修复(Weber和Ryan，2015,Pharmacol Ther149:124-38)。许多恶性肿瘤表现出DDR和细胞周期调节中涉及的关键蛋白(诸如p53、ATM、MRE11、BRCA1/2或SMC1)的功能丧失或功能失调(Weber和Ryan，2015,Pharmacol Ther 149:124-38)。如上文所论述的，某些DDR通路(诸如HRD)中的缺陷可以增加癌细胞对替代性DDR通路的依赖性，从而提供用于选择性抑制携带此类DDR突变的癌细胞的靶标(Weber和Ryan，2015,Pharmacol Ther 149:124-38)。除了BRCA1/2突变对易受PARP抑制剂影响这一性质的作用之外，DDR蛋白中可以增加对DNA损伤性抗癌治疗的敏感性的其他功能改变可以包括下列各项中的改变：DNA-PKcs(Zhao等人，2006,Cancer Res 66:5354-62)、ATM(Golding等人，2012,Cell Cycle 11:1167-73)、ATR(Fokas等人，2012,Cell Death Dis 3:e441)、CHK1和CHK2(Mathews等人，2007,CellCycle6:104-10；Riesterer等人，2011,Invest New Drugs 29:514-22)。原则上，此类敏化突变的作用可以通过使用针对相关DDR蛋白的抑制剂的组合疗法来再现。
ATM和ATR是磷脂酰肌醇2-激酶相关激酶(PIKK)家族的成员，该家族还包括DNA-PKcs/PRKDC、MTOR/FRAP和SMG1(Weber和Ryan，2015,Pharmacol Ther 149:124-38)。由于各种PIKK蛋白之间的高度序列同源性，在不同PIKK蛋白的抑制剂之间经常观察到交叉反应性，并且该交叉反应性可能导致不期望的毒性。与其他PIKK蛋白相比，优选使用对ATM或ATR具有高亲和力的抑制剂。
ATM通过与MRN复合物(MRE11-RAD50-NBS1)结合而附接到DSB位点(Weber和Ryan，2015,Pharmacol Ther 149:124-38)。与MRN结合将ATM激酶激活并促进其下游靶标p53、CHK2和Mdm2的磷酸化，这进而激活细胞周期检查点活性(Weber和Ryan，2015,PharmacolTher149:124-38)。ATM的其他下游效应物包括BRCA1、H2AX和p21(Ronco等人，2017,MedChem Commun 8:295-319)。ATM通路和ATR通路均抑制CDC25C和CDK1的活性(Ronco等人，2017,Med Chem Commun8:295-319)。
ATM的各种抑制剂是本领域已知的。咖啡因抑制ATM和ATR两者，并使细胞对电离辐射的作用敏感(Weber和Ryan，2015,Pharmacol Ther149:124-38)。渥曼青霉素是PIKK的相对非特异性抑制剂，其具有抗ATM、PI3K和DNA-PKcs的活性(Weber和Ryan，2015,PharmacolTher149:124-38)。CP-466722、KU-55933、KU-60019和KU-59403均对ATM具有相对选择性，据报道它们使细胞对电离辐射的作用敏感(Weber和Ryan，2015,Pharmacol Ther 149:124-38)。KU-59403还增加了依托泊苷和伊立替康的抗肿瘤功效，而KU-55933增加了癌症对多柔比星和依托泊苷的敏感性(Weber和Ryan，2015,Pharmacol Ther 149:124-38)。KU-60019的作用在p53突变癌细胞中显著增强，表明p53突变可能是使用ATM抑制剂的生物标志物。ATM抑制剂AZD0156已经与PARP抑制剂奥拉帕尼组合使用(Cruz等人，2018,Ann Oncol 29:1203-10)。AZD0156与WEE1抑制剂AZD1775组合在前列腺癌异种移植物中产生了协同抗肿瘤作用(Jin等人，Cancer Res Treat[刊载之前的电子版，2019年6月25日])。其他报道的ATM抑制剂包括CGK733、NVP-BEZ 235、Torin-2、氟喹啉2和SJ573017(Ronco等人，2017,MedChem Commun 8:295-319)。报道了使用氟喹啉2和伊立替康的组合疗法具有显著的抗肿瘤作用(Ronco等人，2017,Med Chem Commun 8:295-319)。
尽管都还没有获得FDA批准，但正在进行临床试验的ATM抑制剂包括：AZD1390(AstraZeneca)、Ku-60019(AstraZeneca)、AZD0156(AstraZeneca)。
ATR抑制剂
ATR是另一种参与DDR调节的中心激酶。与ATM相比之下，ATR被单链DNA结构(ssDNA)激活，其可以发生在切除的DSB或停滞的复制叉上(Weber和Ryan，2015,PharmacolTher 149:124-38)。ATR结合到ATRIP(ATR相互作用蛋白)，该ATRIP控制ATR定位到DNA损伤位点(Weber和Ryan，2015,Pharmacol Ther 149:124-38)。ssDNA结合到RPA，该RPA可以与ATR/ATRIP结合，也可以与RAD17/RFC2-5结合，RAD17/RFC2-5进而促进RAD9-HUS1-RAD1(9-1-1复合物)结合到DNA末端上(Weber和Ryan，2015,Pharmacol Ther 149:124-38)。9-1-1复合物募集TopBP1，该TopBP1激活ATR(Weber和Ryan，2015,Pharmacol Ther149:124-38)。然后ATR激活CHK1，后者促进DNA修复、稳定化和瞬时细胞周期停滞(Weber和Ryan，2015,Pharmacol Ther 149:124-38)。ATR功能的其他下游效应物包括Cdc25A、Cdc25C、WEE1、细胞周期蛋白B和cdc2(Ronco等人，2017,Med Chem Commun 8:295-319)。ATM通路和ATR通路部分重叠，并且对一条通路的抑制可以部分地由另一条通路的活性补偿。在某些实施方案中，可能优选的是使用ATM抑制剂和ATR抑制剂的组合疗法，或者使用对ATM和ATR都有活性的抑制剂。在其他实施方案中，ATR抑制剂可以被指示用于治疗其中突变或其他失活变化抑制癌细胞中的ATM功能的癌症。
已经开发了许多ATR选择性抑制剂。据称五味子乙素对ATR具有选择性(Nischida等人，2009,Nucleic Acids Res 73:5678-89)，然而仅有弱毒性。更有效的抑制剂(诸如NU6027、BEZ235、ETP46464和Torin 2)显示出与其他PIKK蛋白的交叉反应性(Weber和Ryan，2015,Pharmacol Ther149:124-38)。Vertex Pharmaceuticals已经开发了更有效和更具选择性的ATR抑制剂，诸如VE-821和VE-822(又名VX-970、M6620、贝佐替尼，Merck)。其他ATR抑制剂包括AZ20(AstraZeneca)、AZD6738(塞拉替尼)、M4344(Merck)(Weber和Ryan，2015,Pharmacol Ther 149:124-38)以及EPT-46464(Brandsma等人，2017,Expert OpinInvestig Drugs26:1341-55)。BAY1895344(Bayer)、BAY-937(Bayer)、AZD6738(AstraZeneca)、BEZ235(达克利司)、CGK 733和VX-970(M6620)正在进行癌症治疗的临床试验。据报道，AZD6738与p53缺陷和ATM缺陷具有合成致死性(Ronco等人，2017,Med ChemCommun 8:295-319)。
与VE-821的组合疗法显示在体内增强对顺铂和吉西他滨的敏感性，而AZD6738显著增加对卡铂的敏感性(Weber和Ryan，2015,Pharmacol Ther149:124-38)。VX970(M6620)增加对多种DNA损伤剂(诸如顺铂、奥沙利铂、吉西他滨、依托泊苷和SN-38)的敏感性(Weber和Ryan，2015,Pharmacol Ther 149:124-38)。在缺乏p53的癌细胞中，化学敏化更明显(Weber和Ryan，2015,Pharmacol Ther 149:124-38)。使用M6620和拓扑替康的组合疗法的I期研究在倾向于对单独的拓扑替康无反应的铂难治性SCLC中显示提高的功效(Thomas等人，2018,J Clin Oncol 36:1594-1602)。AZD6738增强了对卡铂的敏感性(Weber和Ryan，2015,Pharmacol Ther 149:124-38)。已报道各种癌症化学治疗剂与ATR抑制剂具有累加和/或协同作用。这些化学治疗剂包括但不限于吉西他滨、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、喜树碱、SN-38、顺铂、卡铂和奥沙利铂。[参见例如，Wagner和Kaufmann，2010,Pharmaceuticals 3:1311-34]此类药剂可以用于进一步增强与抗Trop-2 ADC和ATR抑制剂的组合疗法。
CHK1抑制剂
CHK1是ATR激酶的磷酸化靶标，并且是ATR活性的下游介体。由ATR将CHK1磷酸化激活CHK1活性，其进而将Cdc25A和Cdc25C磷酸化，从而介导ATR依赖性DNA修复机制(Wagner和Kaufmann，2010,Pharmaceuticals 3:1311-34)。
多种CHK1抑制剂是本领域已知的，包括目前正在进行癌症治疗的临床试验的一些。任何已知的CHK1抑制剂都可以与抗Trop-2 ADC组合使用，包括但不限于：XL9844(Exelixis,Inc.)、UCN-01、CHIR-124、AZD7762(AstraZeneca)、AZD1775(Astrazeneca)、XL844、LY2603618(Eli Lilly)、LY2606368(普瑞沙替尼，Eli Lilly)、GDC-0425(Genentech)、PD-321852、PF-477736(Pfizer)、CBP501、CCT-244747(Sareum)、CEP-3891(Cephalon)、SAR-020106(Sareum)、Arry-575(Array)、SRA737(Sareum)、V158411和SCH900776(又名MK-8776，Merck)。[参见Wagner和Kaufmann，2010,Pharmaceuticals 3:1311-34；Thompson和Eastman，2013,Br J Clin Pharmacol 76:3；Ronco等人，2017,Med ChemCommun 8:295-319]CHIR-124被报道在小鼠异种移植物中增强拓扑异构酶I抑制剂的活性(Ronco等人，2017,Med Chem Commun8:295-319)。CCT244747与吉西他滨和伊立替康组合使用显示出抗肿瘤活性(Ronco等人，2017,Med Chem Commun 8:295-319)。已经用LY2603618和SCH900776进行了临床试验(Ronco等人，2017,Med Chem Commun 8:295-319)。
CHK2抑制剂
几种CHK2抑制剂是已知的，并且可以与ADC和/或其他DDR抑制剂或抗癌剂组合使用。此类已知的CHK2抑制剂包括但不限于：NSC205171、PV1019、CI2、CI3(Gokare等人，2016,Oncotarget 7:29520-30)、2-芳基苯并咪唑(ABI，Johnson&Johnson)、NSC109555、VRX0466617和CCT241533(Ronco等人，2017,Med Chem Commun 8:295-319)。PV1019与拓扑替康或喜树碱组合显示增强的活性(Ronco等人，2017,Med Chem Commun 8:295-319)。然而，由于所需剂量太高，所以无法用于治疗用途(Ronco等人，2017,Med Chem Commun 8:295-319)。Ronco等人得出结论，迄今为止开发的CHK2抑制剂作为抗癌剂的活性显著低于CHK1、ATM或ATR抑制剂(Ronco等人，2017,Med Chem Commun 8:295-319)。
WEE1抑制剂
WEE1在许多形式的癌症中过表达，包括乳腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、鼻咽癌和耐药性癌症(Ronco等人，2017,Med Chem Commun8:295-319)。WEE1是ATR通路中的关键中间体，并且由CHK1激活(Ronco等人，2017,Med Chem Commun 8:295-319)。WEE1对细胞周期蛋白B/cdc2和CDK1发挥抑制作用，这进而调节细胞周期停滞(Ronco等人，2017,Med ChemCommun 8:295-319)。与DDR的其他组分相比，可用的WEE1抑制剂相对较少。
WEE1抑制剂AZD1775(MK1775)已经在临床试验中与DNA损伤疗法(诸如氟达拉滨、顺铂、卡铂、紫杉醇、吉西他滨、多西他赛、伊立替康或阿糖胞苷)组合使用(Matheson等人，2016,Trends Pharm Sci 37:P872-81；还可参见clinicaltrials.gov)。据报道，使用WEE1和CHK1/2的抑制剂的组合疗法在癌症异种移植物中产生协同作用(Ronco等人，2017,MedChem Commun 8:295-319)。因此，使用抗Trop-2 ADC、WEE1抑制剂和一种或多种CHK1/2抑制剂的组合疗法可能是有用的。其他已知的WEE1抑制剂包括PD0166285和PD407824。然而，这些抑制剂在临床上的有用性似乎比MK-1775低得多(Ronco等人，2017,Med Chem Commun 8:295-319)。
其他DDR抑制剂
除了上文论述的主要控制点之外，已经发现DDR通路中的其他蛋白质的各种抑制剂(Srivastava和Raghavan，2015,Chem Biol 22:17-29)。由于DDR中各种激酶之间的非特异性相互作用和高度同源性，这些抑制剂中的一些表现出与其他DDR蛋白的交叉反应性。
Mirin是靶向MRE11的HR抑制剂(Srivastava和Raghavan，2015,Chem Biol 22:17-29)。Ml216和NSC19630分别抑制RecQ解旋酶BLM和WRN(Srivastava和Raghavan，2015,ChemBiol 22:17-29)。NSC130813被开发为ERCC1抑制剂，其显示与顺铂和丝裂霉素C的协同活性(Srivastava和Raghavan，2015,Chem Biol 22:17-29)。在NHEJ蛋白中，DNA-PKcs受渥曼青霉素、LY294002、MSC2490484A(M3814)、VX-984(M9831)和NU7026抑制(Srivastava和Raghavan，2015,Chem Biol22:17-29；Brandsma等人，2017,Expert Opin Investig Drugs26:1341-55)。这些DDR抑制剂和其他已知的DDR抑制剂可以在主题方法和主题组合物中与抗Trop-2 ADC一起用于组合疗法中。
使用ADC和其他抗癌药物的组合疗法
PI3K/AKT抑制剂
磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT通路相比任何其他生长因子信号传导通路在更多的肿瘤类型中被遗传靶向，并且经常作为癌症驱动因子被激活(Guo等人，2015,J GenetGenomics 42:343-53)。PI3K与PI3K相关激酶(PIKK)ATM、ATR和DNA-PK之间存在相当大的序列同源性，并且不同激酶的抑制剂之间经常具有交叉反应性。人们正在积极地将PI3K、AKT和PIKK的抑制剂用于癌症治疗(Guo等人，2015,J Genet Genomics42:343-53)。
在某些实施方案中，PI3K和/或各种AKT同种型(AKT1、AKT2、AKT3)的抑制剂可以与单独的或与其他DDR抑制剂组合的抗Trop-2 ADC一起用于组合疗法中。多种PI3K抑制剂是已知的，诸如艾代拉里斯、渥曼青霉素、去甲氧绿胶霉素、哌立福辛、PX-866、IPI-145(杜韦利西布)、BAY 80-6946、BEZ235、RP6530、TGR1202、SF1126、INK1117、GDC-0941、GDC-0980、BKM120、XL147、XL765、Palomid 529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100-115、CAL263、PI-103、GNE477、CUDC-907、AEZS-136、NVP-BYL719、NVP-BEZ235、SAR260301、TGR1202或LY294002。据报道，pan-PI3K抑制剂BEZ235强有力地杀死B细胞淋巴瘤和携带IG-cMYC易位的人细胞系(Shortt等人，2013,Blood 121:2964-74)。
AKT是PI3K活性的下游介体。AKT由哺乳动物中的三种同种型AKT1、AKT2和AKT3组成(Guo等人，2015,J Genet Genomics 42:343-53)。不同的同种型具有不同的功能。AKT1表现为调节肿瘤起始，而AKT2主要促进肿瘤转移(Guo等人，2015,J Genet Genomics 42:343-53)。在被PI3K激活后，AKT将对细胞存活、生长、代谢、肿瘤发生和转移具有广泛影响的许多下游效应物磷酸化(Guo等人，2015,J Genet Genomics 42:343-53)。
AKT抑制剂包括MK2206、GDC0068(依帕曲替尼)、AZD5663、ARQ092、BAY1125976、TAS-117、AZD5363、GSK2141795(阿普罗替尼)、GSK690693、GSK2110183(阿富塞替尼)、CCT128930、A-674563、A-443654、AT867、AT13148、曲西立滨和MSC2363318A(Guo等人，2015,J Genet Genomics 42:343-53；Xing等人，2019,Breast Cancer Res 21:78；Nitulescu等人，2016,Int J Oncol 48:869-85)。任何此类已知的AKT抑制剂均可以与抗Trop-2 ADC和/或DDR抑制剂一起用于组合疗法中。MK-2206单一疗法在显示PIK3CA、AKT1或PTEN中的突变和/或PTEN丧失的进展期乳腺癌患者中表现出有限的临床活性(Xing等人，2019,BreastCancer Res 21:78)。MK-2206与紫杉醇组合治疗乳腺癌似乎更有效(Xing等人，2019,Breast Cancer Res 21:78)。
mTOR是AKT的关键下游靶标，对细胞代谢具有全局影响。已开发用于癌症疗法的mTOR抑制剂包括替西罗莫司、依维莫司、AZD8055、MLN0128和OSI-027(Guo等人，2015,JGenet Genomics 42:343-53)。此类mTOR抑制剂也可以与ADC和/或DRR抑制剂一起用于组合疗法中。
Guo等人(2015,J Genet Genomics 42:343-53)分析了PI3K/AKT通路的20种组分中的遗传改变，包括：GNB2LI、EGFR、PIK3CA、PIK3R1、PIK3R2、PTEN、PDPKI、AKT1、AKT2、AKT3、FOXO1、FOXO3、MTOR、RICTOR、TSC1、TSC2、RHEB、AKT1SI、RPTOR和MLST8。他们在不同癌细胞中观察到PI3K/AKT通路的每种组分的遗传改变。在所检查的每种形式的癌症中鉴定了遗传改变，范围从甲状腺癌中的6％至子宫内膜样癌中的95％(Guo等人，2015,J Genet Genomics42:343-53)。据发现，编码PI3K的p110α亚基的PIK3CA基因通常是癌症中最常改变的致癌基因(Guo等人，2015,J Genet Genomics 42:343-53)。PTEN中的突变也是常见的，RHEB的过表达也是如此(Guo等人，2015,J Genet Genomics42:343-53)。尽管AKT通常不发生突变，但经常在卵巢癌、子宫癌、乳腺癌、肝癌和膀胱癌中观察到该基因的扩增(Guo等人，2015,JGenet Genomics 42:343-53)。然而，据报道AKT3表达在高级浆液性卵巢癌中下调(Yeganeh等人，2017,Genes&Cancer 8:784-98)。
CDK4在由蛋白激酶C介导的通路中是PI3K的下游效应物。CDK4/6抑制剂干扰细胞周期进展，其包括阿贝西利、帕博西尼和瑞博西利(Schettini等人，2018,Front Oncol 12:608)。
其他抗癌剂
尽管本申请中的重点是抗Trop-2 ADC与DDR抑制剂的组合，但是主题方法和组合物也可以包括使用一种或多种其他已知抗癌剂。任何此类抗癌剂均可以与主题ADC一起使用，有或没有DDR抑制剂均可。各种抗癌治疗剂可以同时施用或按顺序施用。此类抗癌剂可以包括例如：药物、毒素、寡核苷酸、免疫调节剂、激素、激素拮抗剂、酶、酶抑制剂、放射性核素、血管生成抑制剂等。示例性抗癌剂包括但不限于：细胞毒性药物(诸如长春花生物碱)、蒽环类药物(诸如多柔比星)、吉西他滨、表鬼臼毒素、紫杉烷类、抗代谢物、烷基化剂、抗生素、SN-38、COX-2抑制剂、抗有丝分裂剂、抗血管生成剂和促凋亡剂、基于铂的药剂、紫杉醇、喜树碱、蛋白体抑制剂、mTOR抑制剂、HDAC抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂，等等。其他有用的抗癌细胞毒性药物包括氮芥、烷基磺酸盐、亚硝基脲类、三氮烯类、叶酸类似物、COX-2抑制剂、抗代谢物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、铂配位络合物、mTOR抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白体抑制剂、HDAC抑制剂、喜树碱、激素，等等。合适的细胞毒性剂描述于以下出版物中：REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第19版(Mack Publishing Co.1995)；GOODMANAND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS，第7版(MacMillanPublishing Co.1985)，以及这些出版物的修订版。
用于组合疗法的特定药物可以包括：5-氟尿嘧啶、阿法替尼、阿普利丁、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环类药物、阿西替尼、AVL-101、AVL-291、苯达莫司汀、博莱霉素、硼替佐米、博舒替尼、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、塞来考昔、苯丁酸氮芥、顺铂、COX-2抑制剂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、克里唑蒂尼、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、达沙替尼、迪那西利、多西他赛、更生霉素、柔红霉素、DM1、DM3、DM4、多柔比星、2-吡咯啉基多柔比星(2-PDox)、氰基-吗啉代多柔比星、多柔比星葡糖苷酸、内皮抑素、表柔比星葡糖苷酸、埃罗替尼、雌莫司汀、表鬼臼毒素、埃罗替尼、恩替诺特、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、依托泊苷葡糖苷酸、依托泊苷磷酸盐、依西美坦、芬戈莫德、氟尿苷(FUdR)、3',5'-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法呢基蛋白转移酶抑制剂、夫拉平度、福他替尼、加尼特皮(ganetespib)、GDC-0834、GS-1101、吉非替尼、吉西他滨、羟基脲、依鲁替尼、伊达比星、艾代拉里斯、异环磷酰胺、伊马替尼、拉帕替尼、来那度胺、亚叶酸、LFM-A13、罗氮芥、二氯甲基二乙胺、美法仑、巯嘌呤、6-巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光神霉素、丝裂霉素、米托坦、单甲基澳他汀F(MMAF)、单甲基澳他汀D(MMAD)、单甲基澳他汀E(MMAE)、诺维本、来那替尼、尼罗替尼、亚硝基脲、奥拉帕尼、普卡霉素、甲基苄肼、紫杉醇、PCI-32765、喷司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、SN-38、索拉非尼、链脲霉素、SU11248、舒尼替尼、它莫西芬、替莫唑胺、反铂、沙利度胺、硫鸟嘌呤、噻替哌、替尼泊苷、拓扑替康、乌拉莫司汀、瓦他拉尼、长春瑞滨、长春碱、长春新碱、长春花生物碱和ZD1839。
用于组合疗法中的示例性免疫调节剂包括：细胞因子、淋巴因子、单核因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、成血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、黄体生成素(LH)、肝细胞生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、转化生长因子(TGF)、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子(ILGF)、促红细胞生成素、促血小板生成素、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、穆勒氏抑制物、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、整合素、白介素(IL)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、干扰素-λ、S1因子、IL-1、IL-1cc、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21和IL-25、LIF、kit配体、FLT-3、血管抑素、血小板反应素、内皮抑素、淋巴毒素，等等。
这些抗癌剂和其他已知的抗癌剂可以与ADC和/或DDR抑制剂组合用于治疗癌症。
生物标志物检测
上文论述了与特定类别的DDR蛋白的抑制剂有关的各种生物标志物。例如，众所周知BRCA突变可用于预测对PARP抑制剂的易感性。这些和其他癌症生物标志物的使用将在下文更详细地论述。此类生物标志物可以用于检测或诊断各种形式的癌症，或者预测ADC单一疗法和/或使用ADC和一种或多种其他抗癌剂(诸如DDR抑制剂或替代性抗癌剂)的组合疗法的功效和/或毒性。
如本文所用，癌症生物标志物是与恶性细胞相关联的分子标志物。癌症的蛋白质生物标志物自从19世纪中期以来就已为人所知并被检测到。例如，1846年在多发性骨髓瘤患者的尿液中首次鉴定出Bence Jones蛋白，而早在1933年，在前列腺癌患者的血清中就检测到了前列腺酸性磷酸酶(Virji等人，1988,CA Cancer J Clin 38:104-26)。已经在各种形式的癌症中检测到许多其他肿瘤相关抗原(TAA)，包括但不限于：碳酸酐酶IX、CCL19、CCL21、CSAp、HER-2/neu、CD1、CD1a、CD5、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CEACAM5、CEACAM6、甲胎蛋白(AFP)、VEGF、ED-B纤连蛋白、EGP-1(Trop-2)、EGP-2、EGF受体(ErbB1)、ErbB2、ErbB3、因子H、Flt-3、HMGB-1、低氧诱导因子(HIF)、胰岛素样生长因子(ILGF)、IL-13R、IL-2、IL-6、IL-8、IL-17、IL-18、IP-10、IGF-1R、HCG、HLA-DR、CD66a-d、MAGE、MCP-1、MIP-1A、MUC5ac、PSA(前列腺特异性抗原)、PSMA、NCA-95、Ep-CAM、Le(y)、间皮素、腱生蛋白、Tn抗原、Thomas-Friedenreich抗原、TNF-α、TRAIL受体R1、TRAIL受体R2、VEGFR、RANTES和各种致癌基因蛋白。
此类蛋白质生物标志物在历史上已经在实体瘤的活检样品中或者在生物流体诸如血液或尿液(液体活检)中检测到。许多用于蛋白质检测的技术是本领域熟知的，并且可以用于检测蛋白质生物标志物，诸如ELISA、蛋白质印迹、免疫组织化学、HPLC、质谱、蛋白质微阵列、荧光显微镜检查和类似技术。许多基于蛋白质的测定依赖于特异性蛋白质/抗体相互作用来进行检测。虽然此类测定在临床癌症诊断中具有标准用途，并且可以用于主题方法和组合物中，但是下面的论述进一步把重点放在检测癌症的核酸生物标志物上。优选地，在来自患者的液体样品(血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、脑脊液等)中检测此类核酸生物标志物。这是一个快速发展的领域，并且用于检测核酸生物标志物的高度灵敏和特异性的测试仍在开发中。一般来讲，以下对液体活检核酸生物标志物的论述将把重点放在分析无细胞DNA(cfDNA)、循环肿瘤DNA(ctDNA)或循环肿瘤细胞(CTC)上。
cfDNA分析
cfDNA(无细胞DNA)是指在血液或其他体液中出现的细胞外DNA。cfDNA主要以约150bp至180bp长度的短核酸片段的形式存在，其通过细胞凋亡和坏死从正常细胞或肿瘤细胞释放，或者通过形成外来体或微泡而从细胞脱落(Huang等人，2019,Cancers 11:E805；Kubiritova等人，2019,Int J Mol Sci 20:3662)。还可以存在具有更长片段长度的cfDNA，其在癌症患者中可以达到10,000bp大小(Bronkhorst等人，2019,Biomol Detect Quantif18:100087)。cfDNA水平在癌症患者中通常是升高的(Pos等人，2018,J Immunol 26:937-45)，并且癌症患者血浆中的cfDNA的一小部分来源于癌细胞(Stroun等人，1989,Oncology46:318-22)。
已经提出，cfDNA在癌症管理中可能具有广泛的用途，包括分期和预后、肿瘤定位、初始治疗分层、监测治疗反应、监测残留疾病和复发，以及鉴定获得性耐药性的机制(Bronkhorst等人，2019,Biomol Detect Quantif18:100087)。cfDNA在临床实践中的效用已通过FDA批准以下测试得到证实：
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EGFR突变测试v2，该测试被设计为识别适合用埃罗替尼或奥希替尼治疗的肺癌患者；和Epi
Figure BDA0003854440460000332
其为基于SEPT9启动子的甲基化状态的结肠直肠癌筛选测试(Bronkhorst等人，2019,Biomol Detect Quantif 18:100087)。
分析来自液体样品的cfDNA可以涉及分析前分离、浓缩和纯化。虽然这些操作可以手动进行，但是可获得几种用于从液体样品中提取cfDNA的自动化系统或试剂盒，并且可以优选地利用这些自动化系统或试剂盒。这些自动化系统或试剂盒包括
Figure BDA0003854440460000333
DNA血浆试剂盒(Takara)、与KINGFISHERTM仪器(ThermoFisher)一起使用的MAGMAXTM无细胞DNA分离试剂盒、与Hamilton
Figure BDA0003854440460000334
STARTM平台一起使用的Omega Bio-tek自动化系统、
Figure BDA0003854440460000335
RSC(MR)cfDNA血浆试剂盒，和许多其他自动化系统或试剂盒。用于从液体样品中分离cfDNA的此类方法和设备是本领域熟知的，并且任何此类已知的方法或设备可以用于实践主题方法。
cfDNA一旦分离，就可以分析其中生物标志物的存在。传统方法已经用于检测DNA突变、插入、缺失、重组或其他生物标志物，诸如Sanger二脱氧测序(手动或通过AppliedBiosystems工作站)、RT-PCR、荧光显微镜检查、SNP杂交、
Figure BDA0003854440460000336
和其他已知技术。在特异性突变“热点”是已知的并且被充分表征的情况下，基于PCR的分析可以用于生物标志物检测。例如，Qiagen销售的PI3K突变检测试剂盒使用
Figure BDA0003854440460000337
和
Figure BDA0003854440460000338
技术来检测PI3K致癌基因的外显子9和20中的4个突变(H1047R、E542K、E545D、E545K)。在野生型基因组DNA的背景中检测1％的突变序列是可能的。
Figure BDA0003854440460000341
(Myriad)是用于检测BRCA1或BRCA2中的突变的另一种基于PCR的测试。被设计用于检测特定基因或基因集合中的生物标志物的其他检测可商购获得。
虽然这些检测足以检测有限数量的被充分表征并且已知与特定类型的癌症相关联的核酸生物标志物，但是用于检测可能在多个位置出现或者是异质生物标志物或表征不良的一整套生物标志物的更全面的方法需要使用更先进的DNA分析技术，诸如下文所论述的下一代测序(Kubiritova等人，2019,Int J Mol Sci 20:3662)。已经对使用液体活检样品的NGS技术进行了综述(例如，Chen和Zhao，2019,Human Genomics 13:34)。
下一代测序(NGS)可以针对DNA的编码区(全外显子组测序)，或者针对编码区和非编码区两者(全基因组测序)。对癌症生物标志物的分析通常更关心编码区变异和调控序列，诸如启动子。特定靶标基因集合也可以被优化以便进行NGS(Johnson等人，2013,Blood122:3268-75)。使用中的NGS技术和设备存在许多变化。以下论述内容是NGS的一些共同特征的一般化论述。
在获得(例如cfDNA)样品后，NGS中的最初步骤是将基因组DNA或cDNA切割成具有几百个碱基对(这是cfDNA的平均大小)的短片段。如果存在较长的DNA序列，它们可能需要被片段化为合适的大小。可以将短寡核苷酸接头(衔接子)添加到这些DNA片段中。如果要同时分析多个样品，可以用独特的荧光探针或其他可检测探针(分子条形码)对这些接头进行标记，以允许将序列分配给不同的个体或不同的基因。如果来源DNA对于信号检测太有限，则接头也允许PCR扩增。如下文所论述的，条形码技术也可以用于针对许多其他核酸种类的背景鉴定特异性核酸序列。
短DNA片段被转变为单链DNA，并且与位于显微镜载片或另一种类型的微流体芯片设备上的通道中的互补寡核苷酸杂交，不过也可以使用其他类型的固体表面。杂交片段的位置可以例如通过荧光显微镜检查来检测(Johnson等人，2013,Blood 122:3268-75)。由于互补寡核苷酸的位置和序列是已知的，因此可以鉴定杂交DNA片段的相应序列。在各种实施方案中，互补寡核苷酸可以作为引物通过DNA聚合酶活性进一步延伸，以生成另外的序列数据。
在Illumina NGS系统中，与流动池表面上的引物附接的互补DNA被复制，以形成用于信号扩增的相同DNA序列的小簇。添加未标记的dNTP和DNA聚合酶以延长和接合附接的DNA链，从而在流动池上的引物之间形成dsDNA的“桥”。然后将dsDNA分解成ssDNA。添加对这四种核苷酸中的每一种都具有特异性的引物和荧光标记的终止子。一旦核苷酸掺入正在生长的链中，进一步的链延长就被阻断，直到除去终止子。荧光显微镜检查用于鉴定在流动池的每个位置掺入了哪个核苷酸。除去终止子，进行下一轮聚合。可以将各单独的短(约150bp)序列汇编成较大的外显子或非编码基因组序列。
Illumina平台仅仅是示例性的，也可使用许多其他NGS系统，其中每个系统都用到了用于获得核酸序列的技术、化学品和方案中的一些变化(参见例如，Besser等人，2018,Clin Microbiol Infect.24:335-41)。其他常见的检测平台可以涉及焦磷酸测序(基于焦磷酸盐释放)(参见例如，Jouini等人，2019,Heliyon 19:e01330)或ION TORRENTTMNGS(基于掺入DNTP时氢离子的释放)(参见例如，Fan等人，2019,Oncol Rep 42:1580-88)。
ctDNA分析
ctDNA是来源于肿瘤细胞的无细胞DNA。通常，在患有早期癌症的个体中，只占cfDNA的一小部分，即ctDNA可以是cfDNA的0.1％或更少(Huang等人，2019,Cancers 11:E805)，但是已报道了ctDNA频率高达cfDNA的90％的估计值(Volik等人，2016,Mol CancerRes 14:898-908)。由于ctDNA的大小范围略有不同，因此可以从cfDNA部分地富集ctDNA，方式为利用聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后切除并洗脱适当的大小范围(Huang等人，2019,Cancers 11:E805)。然而，尽管此类技术可以富集ctDNA，但是至少在早期癌症中的大部分cfDNA将仍来自正常细胞，从而导致高信噪比背景。对ctDNA的分析也由于肿瘤异质性而复杂化。已经开发了用于处理ctDNA低发生率的技术，包括液滴数字PCR(ddPCR)和基于分子索引的下一代测序(Volik等人，2016,Mol Cancer Res 14:898-908；Wood-Bouwens等人，2017,J Mol Diagn 19:697-710)。
对ctDNA的初步研究依赖实时等位基因特异性PCR来检测感兴趣突变(Yi等人，2017,Int J Cancer 140:2642-47)。该技术被设计用于检测仅存在于癌细胞中的突变。然而，该技术的灵敏度和特异性将其应用主要限于具有高肿瘤负荷的个体。数字PCR通过有限稀释DNA样品增加了灵敏度和特异性，使得各单独的DNA分子存在于水-油乳状液滴或室中(Yi等人，2017,Int J Cancer 140:2642-47)。被设计用于区分特定基因的突变等位基因和正常等位基因的引物和探针可以用于扩增以及对突变等位基因频率进行定量。然而，此类技术需要待检测的核酸生物标志物的现有知识。
下一代测序(特别是大规模平行测序)已经应用于ctDNA以及cfDNA。这些方法和系统在前一节中详细论述过。如上文所论述的，由于正常细胞的cfDNA与ctDNA之间存在大小重叠，所以从浓度高得多的cfDNA中分离ctDNA在技术上很困难。因此，对ctDNA的分析已经频繁地尝试使用上文论述的相同的分析技术，针对cfDNA的高背景检测肿瘤特异性核酸生物标志物。
该方法的一个有趣的变化是利用基于捕获的下一代测序来检测NSCLC中的ALK(间变性淋巴瘤激酶)重排(Wang等人，2016,Oncotarget7:65208-17)。使用了基于捕获的测序组套(Burning Rock Biotech Ltd，中国广州)，其靶向168个基因并跨越160kb的人基因组DNA序列。将cfDNA与捕获探针杂交，通过磁珠结合进行分离，然后PCR扩增。在NextSeq 500系统(Illumina)上对扩增的样品进行测序。考虑到基于大小的分离技术存在困难，使用捕获技术对于从cfDNA中分离ctDNA可能具有优势。然而，这需要对特定的基因集进行靶向分析，或者肿瘤细胞中存在的核酸序列变体的现有知识。
越来越多的研究已经基于ctDNA分析检查了癌症生物标志物。Angus等人(MolOncol 2019 13:2361-74)通过NGS分析了转移性结肠直肠癌(mCRC)患者的ctDNA的RAS和BRAF中的突变。具有RAS或BRAF突变的mCRC患者不对抗EGFR抗体(诸如西妥昔单抗和帕尼单抗)作出反应(Angus等人，2019 13:2361-74)。尽管基于RAS突变选择患者进行抗EGFR治疗，但只有不到50％的野生型mCRC患者显示临床益处(Angus等人，2019 13:2361-74)。对血浆样品的ctDNA分析证明了通过肿瘤活检被鉴定为野生型RAS的患者中的RAS突变和BRAF突变的异质性。相对于无突变的患者，具有RAS/BRAF突变的那些患者具有较短的无进展生存期(1.8个月对4.9个月)和总生存期(3.1个月对9.4个月)(Angus等人，2019 13:2361-74)。得出结论，cfDNA/ctDNA中的RAS突变和BRAF突变预示西妥昔单抗单一疗法的结果(Angus等人，2019 13:2361-74)。
Galbiati等人(2019,Cells 8:769)使用微阵列探针杂交与液滴数字PCR(ddPCR)的组合来检测KRAS、NRAS和BRAF中的特异性突变，并且确定mCRC患者的ctDNA中的突变等位基因的丰度分数。这些微阵列捕获探针对于以下各项具有特异性：KRAS(G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13D、Q61H(A>C)、Q61H(A>T)、Q61K、Q61L、Q61R、A146T)，NRAS(G12A、G12C、G12D、G12S、G12V、G13D、G13V)，和BRAF(V600E)，以及野生型序列(Galbiati等人，2019,Cells 8:769)。在等位基因特异性杂交后，使用ssPCR-报告基因杂交体进行检测。在微阵列分析后，用QX100TMDROPLET DIGITALTMPCR系统(Bio-Rad)进行ddPCR。微阵列结果与组织活检分析的比较显示总体一致性为95％，且观察到组织活检中未发现的两个额外的KRAS突变(Galbiati等人，2019,Cells 8:769)。得出结论，ctDNA分析可以用于非侵入性的生物标志物检测，以指导mCRC中的抗EGFR抗体疗法(Galbiati等人，2019,Cells 8:769)。
关于cfDNA或ctDNA分析的这些和许多其他报道的研究证实了循环核酸用于检测、预后、监测对疾病的反应以及预测对特定抗癌剂和/或组合疗法的反应性的效用。应当指出的是，一般来讲，对ctDNA的研究没有从正常细胞cfDNA中分离出肿瘤来源的核酸，相反，对ctDNA的分析基于对肿瘤特异性或肿瘤选择性标志物的检测。因此，在癌症诊断中cfDNA分析与ctDNA分析之间在语义本质上存在一些区别，在前一节中关于cfDNA所述的所有技术、方法和设备也可以用于分析ctDNA。
循环肿瘤细胞(CTC)的分析
已经提出，在肿瘤进展的早期，癌细胞可能以低浓度存在于循环中(参见例如，Krishnamurthy等人，2013,Cancer Medicine 2:226-33；Alix-Panabieres和Pantel，2013,Clin Chem 50:110-18；Wang等人，2015,Int JClin Oncol,20:878-90)。由于血液样品采集的相对非侵入性，一直以来人们对CTC的分离和检测都有很大的兴趣，其用于促进疾病早期的癌症诊断，并且作为肿瘤进展、疾病预后和/或对药物治疗的反应性的预测指标(参见例如，Alix-Panabieres和Pantel，2013,Clin Chem 50:110-18；Winer-Jones等人，2014,PLoSOne 9:e86717；美国专利申请公开第2014/0357659号)。
已经开发了各种技术和设备来分离和/或检测循环肿瘤细胞。最近已经发表了该领域的几篇综述论文(参见例如，Alix-Panabieres和Pantel，2013,Clin Chem 50:110-18；Joosse等人，2014,EMBO Mol Med 7:1-11；Truini等人，2014,Fron Oncol 4:242)。这些技术涉及富集和/或分离CTC(通常使用针对肿瘤细胞上表达的抗原的捕获抗体)，以及使用磁性纳米颗粒、微流体装置、过滤、磁性分离、离心、流式细胞术和/或细胞分选装置来进行分离(例如，Krishnamurthy等人，2013,Cancer Medicine 2:226-33；Alix-Panabieres和Pantel，2013,Clin Chem 50:110-18；Joosse等人，2014,EMBO Mol Med 7:1-11；Truini等人，2014,Fron Oncol 4:242；Powell等人，2012,PLoS ONE 7:e33788；Winer-Jones等人，2014,PLoS One 9:e86717；Gupta等人，2012,Biomicrofluidics 6:24133；Saucedo-Zeni等人，2012,Int J Oncol41:1241-50；Harb等人，2013,Transl Oncol 6:528-38)。然后可以使用多种已知方法来分析富集或分离的CTC，如下文进一步论述的。
已经用于CTC分离和检测的系统或设备包括
Figure BDA0003854440460000381
系统(例如，Truini等人，2014,Front Oncol 4:242)、MagSweeper装置(例如，Powell等人，2012,PLoS ONE 7:e33788)、
Figure BDA0003854440460000382
系统(Winer-Jones等人，2014,PLoS One 9:e86717)、
Figure BDA0003854440460000383
系统(例如，Gupta等人，2012,Biomicrofluidics 6:24133)、GILUPICELLCOLLECTORTM(例如，Saucedo-Zeni等人，2012,Int J Oncol 41:1241-50)，以及ISOFLUXTM系统(Harb等人，2013,Transl Oncol 6:528-38)。
迄今为止，由FDA批准的用于CTC检测的唯一技术涉及
Figure BDA0003854440460000384
平台(Veridex LLC,Raritan,NJ)，其利用附接到磁性纳米颗粒的抗EpCAM抗体来捕获CTC。对结合细胞的检测用荧光标记的抗细胞角蛋白(CK)和CD45的抗体进行。使用强磁场分离出与磁性颗粒结合的荧光标记细胞，然后通过数字荧光显微镜检查来计数。
Figure BDA0003854440460000385
系统已获得FDA批准，用于检测转移性乳腺癌、前列腺癌和结肠直肠癌。
大多数CTC检测系统已经把重点放在使用抗EpCAM捕获抗体(参见例如，Truini等人，2014,Front Oncol 4:242；Powell等人，2012,PLoS ONE7:e33788；Alix-Panabieres和Pantel，2013,Clin Chem 50:110-18；Lin等人，2013,Biosens Bioelectron 40:63-67；Magbanua等人，2015,Clin Cancer Res 21:1098-105；Harb等人，2013,Transl Oncol 6:528-38)。然而，并非所有转移性肿瘤都表达EpCAM(参见例如，Mikolajcyzyk等人，2011,JOncol 2011:252361；Pecot等人，2011,Cancer Discovery 1:580-86；Gupta等人，2012,Biomicrofluidics 6:24133)。已经尝试利用分离和检测EpCAM阴性CTC的替代性方案，诸如使用抗TAA的抗体组合。已经利用抗多达10种不同TAA的抗体来试图增加转移性循环肿瘤细胞的回收率(例如，Mikolajcyzyk等人，2011,J Oncol 2011:252361；Pecot等人，2011,Cancer Discovery 1:580-86；Krishnamurthy等人，2013,Cancer Medicine 2:226-33；Winer-Jones等人，2014,PLoS One 9:e86717)。
本发明的CTC分析方法可以与基于亲和力的富集步骤一起使用，或者不与富集步骤一起使用，诸如
Figure BDA0003854440460000391
(Pachmann等人，2005,Breast Cancer Res,7:R975)。使用磁性装置进行基于亲和力的富集的方法包括
Figure BDA0003854440460000392
系统(Veridex)、
Figure BDA0003854440460000393
平台(Cynvenio Biosystems)和MagSweeper装置(Talasaz等人，PNAS,2009,106:3970)。不使用磁性装置进行基于亲和力的富集的方法包括多种制造的微流体装置，诸如CTC芯片(Stott等人，2010,Sci Transl Med,2:25ra23)、HB芯片(Stott等人，2010,PNAS,107:18392)、NanoVelcro芯片(Lu等人，2013,Methods,64:144)、GEDI微装置(Kirby等人，2012,PLoS ONE,7:e35976)，以及Biocept的OncoCEETM技术(Pecot等人，2011,CancerDiscov,1:580)。
Truini等人(2014,Front Oncol 4:242)论述了FDA批准的
Figure BDA0003854440460000394
系统用于非小细胞肺癌患者和小细胞肺癌患者的CTC检测的用途。将7.5ml外周血样品与包被有抗EpCAM抗体的磁性铁纳米颗粒混合。使用强磁场将EpCAM阳性细胞与EpCAM阴性细胞分离。使用荧光标记的抗CK抗体和抗CD45抗体连同细胞核的DAPI(4’,6’-二脒基-2-苯基吲哚)荧光标记一起对结合的CTC进行检测。通过荧光检测将CTC鉴定为CK阳性、CD45阴性和DAPI阳性。
VerIFASTTM系统用于对非小细胞肺癌(NSCLC)中的循环肿瘤细胞(CTC)进行诊断和药效动力学分析(Casavant等人，2013,Lab Chip13:391-6；2014,Lab Chip 14:99-105)。VerIFASTTM平台利用微观尺度中表面张力对重力的相对优势来并排加载不混溶相。这拴住了相邻室中的水性场和油性场，从而在两个水性孔之间形成虚拟过滤器(Casavant等人，2013,Lab Chip 13:391-6)。使用顺磁性颗粒(PMP)和附接的抗体或其他靶向部分，可以通过油栅的简单往复移动从复合物背景靶向和分离特定的细胞群。在该NSCLC示例中，链霉亲和素偶联至
Figure BDA0003854440460000401
FLOWCOMPTMPMP(Life Technologies,USA)，并且使用生物素化抗EpCAM抗体捕集细胞。使用手持式磁体在水性室之间转移结合到PMP的CTC。使用PMP释放缓冲液(
Figure BDA0003854440460000402
)释放所收集的CTC，并且对EpCAM、EGFR或转录终止因子(TTF-1)染色。VerIFASTTM平台将微孔膜整合到水性室中，以在不需要细胞转移或离心的情况下允许多流体转移。由于物理特征标度赋予相对于宏观尺度技术的高精度，所以此类微流体技术非常适于在样品损失最小的情况下捕集和评估CTC。VerIFASTTM平台从NSCLC患者的血液有效地捕集CTC(Casavant等人，2013,Lab Chip13:391-6；2014,Lab Chip 14:99-105)。
GILUPI CELLCOLLECTORTM(Saucedo-Zeni等人，2012,Int J Oncol41:1241-50)基于包被有嵌合抗EpCAM抗体的功能化医疗Seldinger导丝(FSMW)。该导丝使用聚羧酸酯水凝胶层功能化，该水凝胶层使用EDC和NHS活化，从而允许抗体的共价结合。通过标准静脉套管将包被有抗体的FSMW插入乳腺癌或NSCLC肺癌患者的肘静脉，保持30分钟。在细胞结合到导丝之后，通过EpCAM和/或细胞角蛋白的免疫细胞化学染色和细胞核染色来鉴定CTC。使用Axio Imager.A1m显微镜(Zeiss,Jena,Germany)来分析荧光标记。FSMW系统能够从24例检测患者中的22例富集EpCAM阳性CTC，包括那些其中未诊断到癌细胞远端转移的早期癌症患者。健康志愿者中未检测到CTC。FSMW系统的优点在于不受离体血液样品体积的限制，这些离体血液样品可以使用替代性方法来处理。估计在30分钟暴露期间接触FSMW的血液体积为1.5升至3升。
用于CTC分离的这些方法和其他方法可以用于获得用于生物标志物分析的样品。尽管EpCAM是捕获抗体最常用的靶标，但是也可以将各种装置与不同的捕获抗体(诸如抗Trop-2抗体)一起使用。由于本文所公开的ADC组合疗法靶向的癌症类型通常会具有Trop-2的高表达，所以此类抗体可以更有效地捕获患有此类癌症的患者中的CTC。不排除相同的抗体(例如hRS7)可能以拓扑异构酶I抑制剂偶联的ADC的形式用于CTC的捕获和表征以及用于治疗潜在肿瘤。
一旦从循环中分离出CTC，就可以使用本文别处所公开的标准方法(例如通过PCR、RT-PCR、荧光显微镜检查、ELISA、蛋白质印迹、免疫组织化学、微流体芯片技术、SNP杂交、分子条形码分析或下一代测序)来分析它们中生物标志物的存在。Kwan等人(2018,CancerDiscov 8:1286-99)对来自乳腺癌中的CTC的RNA进行了数字分析。治疗4周后，化学疗法抗性与ESR1突变(L536R、Y537C、Y537N、Y537S、D538G)、CTC评分升高和持续的CTC信号相关联(Kwan等人，2018,Cancer Discov8:1286-99)。快速肿瘤进展与PIP、SERPINA3、AGR2、SCGB2A1、EFHD1和WFDC2的生物标志物相关联。
Shaw等人(2017,Clin Cancer Res 23:88-96)对转移性乳腺癌患者中的cfDNA和单一CTC进行了分析。使用抗EpCAM抗体，用
Figure BDA0003854440460000411
设备获得CTC。通过50个癌症基因中大约2200个突变的下一代测序进行分析。在PIK3CA、TP53、ESR1和KRAS中观察到个体CTC之间的突变异质性(Shaw等人，2017,Clin Cancer Res 23:88-96)。cfDNA图谱与从CTC获得的那些图谱相关(Shaw等人，2017,Clin Cancer Res 23:88-96)。在原发性肿瘤样品中没有观察到在CTC中看到的ESR1突变和KRAS突变，提示这些突变代表细胞的亚克隆群体或者是随着疾病进展而获得的(Shaw等人，2017,Clin Cancer Res 23:88-96)。
用于生物标志物检测的其他技术
核酸生物标志物的检测不限于任何特定的技术或者分子或细胞的类型。在其他实施方案中，生物标志物可以是例如RNA的形式。尽管由于内源性核糖核酸酶活性，RNA样品通常以非常低的浓度存在，但是它们仍然可以从循环中获得。替代性地，可以使用标准技术从固体活检样品中提取mRNA(参见例如，Singh等人，2018,J Biol Methods 5:e95)。
用于检测RNA生物标志物的自动化系统可商购获得。一种这样的系统是NanoString
Figure BDA0003854440460000412
技术。如果样品中存在足够的RNA，则用捕获探针和荧光条形码标记的报告基因探针进行mRNA的溶液相杂交。报告基因探针的序列被设计成与感兴趣的特定核酸生物标志物杂交。在除去未杂交的材料后，杂交的探针被固定并排列在样品盒的表面上。然后通过荧光检测定位的条形码来鉴定条形码标记的mRNA。
Figure BDA0003854440460000421
系统允许同时检测多达800个所选择的核酸靶标。尽管直接检测循环RNA或固体活检RNA是优选的，但如果样品量不足，可以增加RT-PCT步骤。由于可能出现的扩增偏倚或其他误差，这固有地降低了技术的准确度。在需要可靠定量的情况下，直接检测是优选的，诸如确定各种生物标志物基因的基因表达水平。还可以使用NanoString技术来分析cfDNA或ctDNA样品。
Souza等人(2019,J Oncol 8393769)使用NanoString
Figure BDA0003854440460000422
人v3miRNA表达组套来分析乳腺癌患者的血清中的循环无细胞微RNA。在分析的800个微RNA探针中，42个显示在乳腺癌患者中存在显著差异表达的循环微RNA，并且进一步显示在乳腺癌的不同亚型中的差异表达(Souza等人，2019,J Oncol 8393769)。生物标志物miR-2503p显示与TNBC的最高相关性。得出结论，循环微RNA的液体活检可能适用于乳腺癌的早期检测(Souza等人，2019,J Oncol 8393769)。
用于检测核酸生物标志物的另一个平台是Affymetrix
Figure BDA0003854440460000423
该系统可以与预装载用于RNA或DNA分析的杂交探针的多种
Figure BDA0003854440460000424
微阵列一起使用。这些探针组可以是定制设计的，或者可以选自用于SNP检测的标准芯片，并且每个芯片可以包含多达一百万个探针(Dalma-Weiszhausz等人，2006,Methods Enzymol 410:3-28)。已经设计了不同的芯片用于基因组SNP检测、全基因组表达谱分析、全基因组测序、差异剪接变异和许多其他应用。例如，Affymetrix全基因组人SNP阵列6.0含有180万个遗传标志物，包括906,600个SNP和超过946,000个用于检测拷贝数变异的探针。Agilent人miRNA微阵列12.0版可以测定866个miRNA种类的存在。Affymetrix
Figure BDA0003854440460000425
人类基因组U133Plus 2.0阵列可以分析超过47,000种转录物(包括38,500个充分表征的基因)的表达。
可以使用标准技术和设备来测定DNA甲基化。例如，可以使用癌症基因组图谱(TCGA)的
Figure BDA0003854440460000426
HumanMethylation450数据集获得关于全基因组DNA甲基化的信息。可以使用
Figure BDA0003854440460000427
甲基化Epic Beadchip试剂盒(Illumina)或
Figure BDA0003854440460000428
450K甲基化阵列(Illumina)来检测甲基化。替代性地，可以使用
Figure BDA0003854440460000429
甲基化测定和BEADARRAYTM技术来检测甲基化。Illumina
Figure BDA00038544404600004210
HD Beadchip可以测定近120万个基因组基因座，用于基因型分型和确定拷贝数变异。这些和许多其他标准平台或系统在本领域中是熟知的，用于检测和鉴定癌症生物标志物。
用于指示抗癌功效和/或毒性的生物标志物
上文已经列出了许多癌症生物标志物，诸如在NRAS、KRAS、BRCA1、BRCA2、p53、ATM、MRE11、SMC1、DNA-PKcs、PI3K或BRAF中的突变。用于生物标志物分析的感兴趣基因(或其编码的蛋白质)包括但不限于53BP1、AKT1、AKT2、AKT3、APE1、ATM、ATR、BARD1、BAP1、BLM、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRIP1(FANCJ)、CCND1、CCNE1、CDKN1、CDK12、CHEK1、CHEK2、CK-19、CSA、CSB、DCLRE1C、DNA2、DSS1、EEPD1、EFHD1、EpCAM、ERCC1、ESR1、EXO1、FAAP24、FANC1、FANCA、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCM、HER2、HMBS、HR23B、KRT19、KU70、KU80、hMAM、MAGEA1、MAGEA3、MAPK、MGP、MLH1、MRE11、MRN、MSH2、MSH3、MSH6、MUC16、NBM、NBS1、NER、NF-κB、P53、PALB2、PARP1、PARP2、PIK3CA、PMS2、PTEN、RAD23B、RAD50、RAD51、RAD51AP1、RAD51C、RAD51D、RAD52、RAD54、RAF、K-ras、H-ras、N-ras、RBBP8、c-myc、RIF1、RPA1、SCGB2A2、SLFN11、SLX1、SLX4、TMPRSS4、TP53、TROP-2、USP11、VEGF、WEE1、WRN、XAB2、XLF、XPA、XPC、XPD、XPF、XPG、XRCC4和XRCC7。如以下实施例1中所论述的，在某些实施方案中，用于生物标志物检测的感兴趣基因可以包括BRCA1、BRCA2、CHEK2、MSH2、MSH6、TP53、CDKN1A、BAG6、BRSK2、ERN1、FHIT、HIPK2、LGALS12、ZNF622、AEN、SART1、USP28、GADD45B、TGFB1、NDRG1、WEE1、PPP1R15A、MYBBP1A、SIRT1、ABL1、HRAS、ZNF385B、POLR2K或DDB2。
在一些实施方案中，用于生物标志物检测的感兴趣基因包括：BRCA1、BRCA2、CHEK2、MSH2、MSH6、TP53、CDKN1A、BAG6、BRSK2、ERN1、FHIT、HIPK2、LGALS12、ZNF622、AEN、SART1、USP28、GADD45B、TGFB1、NDRG1、WEE1、PPP1R15A、MYBBP1A、SIRT1、ABL1、HRAS、ZNF385B、POLR2K和DDB2。
在一些实施方案中，用于生物标志物检测的感兴趣基因由以下项组成：BRCA1、BRCA2、CHEK2、MSH2、MSH6、TP53、CDKN1A、BAG6、BRSK2、ERN1、FHIT、HIPK2、LGALS12、ZNF622、AEN、SART1、USP28、GADD45B、TGFB1、NDRG1、WEE1、PPP1R15A、MYBBP1A、SIRT1、ABL1、HRAS、ZNF385B、POLR2K和DDB2。
在一些实施方案中，用于生物标志物检测的感兴趣基因包括：AEN、MSH2、MYBBP1A、SART1、SIRT1、USP28、CDKN1A、ABL1、TP53、BAG6、BRCA1、BRCA2、BRSK2、CHEK2、ERN1、FHIT、HIPK2、HRAS、LGALS12、MSH6、ZNF385B和ZNF622。
在一些实施方案中，用于生物标志物检测的感兴趣基因由以下项组成：AEN、MSH2、MYBBP1A、SART1、SIRT1、USP28、CDKN1A、ABL1、TP53、BAG6、BRCA1、BRCA2、BRSK2、CHEK2、ERN1、FHIT、HIPK2、HRAS、LGALS12、MSH6、ZNF385B和ZNF622。
在一些实施方案中，用于生物标志物检测的感兴趣基因包括：BRCA1、BRCA2、CHEK2、MSH2、MSH6、TP53、CDKN1A、BAG6、BRSK2、ERN1、FHIT、HIPK2、LGALS12、ZNF622、AEN、SART1和USP28。
在一些实施方案中，用于生物标志物检测的感兴趣基因由以下项组成：BRCA1、BRCA2、CHEK2、MSH2、MSH6、TP53、CDKN1A、BAG6、BRSK2、ERN1、FHIT、HIPK2、LGALS12、ZNF622、AEN、SART1和USP28。
在一些实施方案中，用于生物标志物检测的感兴趣基因包括：POLR2K、DDB2、GADD45B、WEE1、TGFB1、NDRG1和PPP1R15A。
在一些实施方案中，用于生物标志物检测的感兴趣基因由以下项组成：POLR2K、DDB2、GADD45B、WEE1、TGFB1、NDRG1和PPP1R15A。
在一些实施方案中，用于生物标志物检测的感兴趣基因包括：BRCA1、BRCA2、CHEK2、MSH2、MSH6、TP53、CDKN1A、BAG6、BRSK2、ERN1、FHIT、HIPK2、LGALS12、ZNF622、AEN、SART1、USP28、GADD45B、TGFB1、NRG1、WEE1和PPP1R15A。
在一些实施方案中，用于生物标志物检测的感兴趣基因由以下项组成：BRCA1、BRCA2、CHEK2、MSH2、MSH6、TP53、CDKN1A、BAG6、BRSK2、ERN1、FHIT、HIPK2、LGALS12、ZNF622、AEN、SART1、USP28、GADD45B、TGFB1、NRG1、WEE1和PPP1R15A。
在一些实施方案中，该生物标志物是引起下列取代的多种单核苷酸多态性，这些取代包括：ABL1中的E155K、ABL1中的G706S、AEN中的V172L、BAG6中的R279Q、BRCA1中的P1020Q、BRCA1中的E255K、BRCA2中的L2518V、BRSK2中的T656A、CDKN1A中的M1V、CHECK2中的A377D、ERN1中的G771S、FHIT中的R46S、HIPK2中的E457Q、HRAS中的G12V、LGALS12中的A278V、MSH2中的N127S、MSH6中的S625F、MYBBP1A中的H680Y、SART1中的R373Q、SIRT1中的E113Q、TP53中的*394S、TP53中的R282G、TP53中的T377P、TP53中的E271K、TP53中的Y220C、TP53中的E180*、USP28中的I987L、ZNF385B中的R370Q、以及ZNF622中的A437E。
在一些实施方案中，该生物标志物是引起下列取代的多种单核苷酸多态性，这些取代由以下项组成：ABL1中的E155K、ABL1中的G706S、AEN中的V172L、BAG6中的R279Q、BRCA1中的P1020Q、BRCA1中的E255K、BRCA2中的L2518V、BRSK2中的T656A、CDKN1A中的M1V、CHECK2中的A377D、ERN1中的G771S、FHIT中的R46S、HIPK2中的E457Q、HRAS中的G12V、LGALS12中的A278V、MSH2中的N127S、MSH6中的S625F、MYBBP1A中的H680Y、SART1中的R373Q、SIRT1中的E113Q、TP53中的*394S、TP53中的R282G、TP53中的T377P、TP53中的E271K、TP53中的Y220C、TP53中的E180*、USP28中的I987L、ZNF385B中的R370Q、以及ZNF622中的A437E。
在一些实施方案中，该生物标志物是引起下列取代的多种单核苷酸多态性，这些取代包括：AEN中的V172L、BAG6中的R279Q、BRCA1中的P1020Q、BRCA1中的E255K、BRCA2中的L2518V、BRSK2中的T656A、CDKN1A中的M1V、CHECK2中的A377D、ERN1中的G771S、FHIT中的R46S、HIPK2中的E457Q、MSH2中的N127S、MSH6中的S625F、SART1中的R373Q、TP53中的*394S、TP53中的R282G、TP53中的T377P、TP53中的E271K、TP53中的Y220C、TP53中的E180*、以及USP28中的I987L。
在一些实施方案中，该生物标志物是引起下列取代的多种单核苷酸多态性，这些取代由以下项组成：AEN中的V172L、BAG6中的R279Q、BRCA1中的P1020Q、BRCA1中的E255K、BRCA2中的L2518V、BRSK2中的T656A、CDKN1A中的M1V、CHECK2中的A377D、ERN1中的G771S、FHIT中的R46S、HIPK2中的E457Q、MSH2中的N127S、MSH6中的S625F、SART1中的R373Q、TP53中的*394S、TP53中的R282G、TP53中的T377P、TP53中的E271K、TP53中的Y220C、TP53中的E180*、以及USP28中的I987L。
在一些实施方案中，该生物标志物是选自由以下项组成的组的移码突变：BAG6中的K1110fs、CDKN1A中的R32fs、CDKN1A中的DC33fs、以及CDKN1A中的EG60fs。
在一些实施方案中，该生物标志物是包括以下项的多种移码突变：BAG6中的K1110fs、CDKN1A中的R32fs、CDKN1A中的DC33fs、以及CDKN1A中的EG60fs。
在一些实施方案中，该生物标志物是由以下项组成的多种移码突变：BAG6中的K1110fs、CDKN1A中的R32fs、CDKN1A中的DC33fs、以及CDKN1A中的EG60fs。
在一些实施方案中，该生物标志物是与相应的正常组织相比，癌症中的基因表达增加或减少，该基因选自由以下项组成的组：POLR2K、DDB2、GADD45B、WEE1、TGFB1、NDRG1和PPP1R15A。
在一些实施方案中，该生物标志物是与相应的正常组织相比，癌症中的基因表达的多个增加或减少，该基因包括：POLR2K、DDB2、GADD45B、WEE1、TGFB1、NDRG1和PPP1R15A。
在一些实施方案中，该生物标志物是与相应的正常组织相比，癌症中的基因表达的多个增加或减少，该基因由以下项组成：POLR2K、DDB2、GADD45B、WEE1、TGFB1、NDRG1和PPP1R15A。
在一些实施方案中，该基因选自由以下项组成的组：BRCA1、BRCA2、PTEN、ERCC1和ATM。
在一些实施方案中，所述一种或多种生物标志物包括以下项或由以下项组成：BRCA1、BRCA2、PTEN、ERCC1和ATM。
使用的生物标志物能够以多种形式出现，诸如突变、插入、缺失、基因扩增、复制或重排、启动子甲基化、RNA剪接变体、SNP、特定mRNA或蛋白质水平的增加或降低，以及任何其他形式的生物分子变异。在文献中已经鉴定了许多癌症生物标志物，其中一些具有用于确定哪种单一疗法或组合疗法可能在给定癌症中有效的预测价值。任何此类已知的生物标志物可以用于主题方法中。下文总结了已被鉴定为用于癌症诊断的各种生物标志物。然而，主题方法不限于本文所公开的特定生物标志物，而是可以包括本领域已知的任何生物标志物。
用于拓扑异构酶I抑制剂的生物标志物
癌细胞对拓扑异构酶I抑制剂的敏感性或拓扑异构酶I抑制剂的毒性的生物标志物可能与对拓扑异构酶I抑制性ADC(诸如戈沙妥珠单抗或DS-1062)的敏感性或拓扑异构酶I抑制性ADC的毒性相关联。Cecchin等人(2009,J Clin Oncol 27:2457-65)检查了用伊立替康(SN-38的母体化合物)治疗的转移性结肠直肠癌(mCRC)患者中UGT1A1、UGT1A7和UGT1A9的单倍型的预测价值。对250例mCRC患者中的UGT1A1*28、UGT1A1*60、UGT1A1*93、UGT1A7*3和UGT1A9*22进行基因型分型(Cecchin等人，2009,J Clin Oncol 27:2457-65)。UGT1A7*3单倍型是第一治疗周期后的严重血液毒性和胃肠毒性的唯一生物标志物，并且与SN-38的葡萄糖醛酸化相关联，而UGT1A1*28是与进展时间相关联的唯一生物标志物(Cecchin等人，2009,J Clin Oncol 27:2457-65)。其他研究已得出结论，UGT1A1*6和UGT1A1*28与伊立替康诱导的毒性显著相关(Yang等人，2018,Asia Pac J Clin Oncol,14:e479-89)。然而，这些生物标志物的结果是不一致的(Yang等人，2018,Asia Pac J ClinOncol,14:e479-89)。UGT1A编码UDP葡糖醛酸基转移酶，其通过葡萄糖醛酸化使SN-38失活。由于与戈沙妥珠单抗偶联的SN-38被保护免于葡萄糖醛酸化(Sharkey等人，2015,ClinCancer Res 21:5131-8)，所以UGT1A1生物标志物可能与这些ADC的毒性无关。Ocean等人(2017,Cancer 123:3843-54)在用戈沙妥珠单抗(SG)治疗各种不同上皮癌的研究中发现，UGT1A1基因型(具体为UGT1A1*28/UGT1A1*28)与SG的毒性之间仅有轻微的表观相关性。UGT1A1*28/UGT1A1*28在本研究中未指示戈沙妥珠单抗的剂量限制性毒性。
P38是DNA损伤传感器系统的下游效应物激酶，起始于ATM、ATR和DNA-PK的活化(Paillas等人，2011,Cancer Res 71:1041-9)。活化(磷酸化)MAPK p38水平升高与对SN-38的抗性相关联，并且用p38抑制剂SB202190处理SN-38抗性细胞增强SN-38的细胞毒性作用(Paillas等人，2011,Cancer Res 71:1041-9)。对伊立替康敏感的患者的原发性结肠癌显示磷酸化p38的水平降低(Paillas等人，2011,Cancer Res 71:1041-9)。磷酸化p38的水平可以是用于抗Trop-2 ADC的生物标志物，磷酸化p38的水平低指示对ADC的敏感性，而其水平高指示抗性(Paillas等人，2011,Cancer Res 71:1041-9)。另外，p38抑制剂可以在抗性肿瘤中与拓扑异构酶I抑制性ADC一起用于组合疗法。
据报道与拓扑异构酶I抑制剂敏感性或抗性相关联的其他DDR基因包括PARP、TDP1、XPF、APTX、MSH2、MLH1和ERCC1(Gilbert等人，2012,Br J Cancer 106:18-24)。相同的生物标志物可以用于预测对拓扑异构酶I抑制性ADC的敏感性或抗性。此外，针对相应表达的蛋白质的抑制剂可以与拓扑异构酶I抑制性ADC一起用于组合疗法。
Hoskins等人(2008,Clin Cancer Res 14:1788-96)检查了CDC45L、NFKB1、PARP1、TDP1、XRCC1和TOP1中的遗传变异对伊立替康细胞毒性的影响。基于不同种族受试者的单倍型组成鉴定SNP标志物。使用单倍型标签SNP(htSNP)对伊立替康治疗的进展期结肠直肠癌患者进行基因型分型(Hoskins等人，2008,Clin Cancer Res 14:1788-96)。TOP1基因中的htSNP与3/4级中性粒细胞减少症相关联，而TDP1基因中的htSNP与对伊立替康的反应相关联(Hoskins等人，2008,Clin Cancer Res 14:1788-96)。TOP1 htSNP位于IVS4+61。TDP1SNP位于IVS12+79(Hoskins等人，2008,Clin Cancer Res 14:1788-96)。在TOP1 IVS4+61处，G/G基因型显示8％的3/4级中性粒细胞减少症发生率，而A/A基因型显示50％的发生率(在小样品量中)。在TDP1 IVS12+79处，G/G基因型显示64％的对伊立替康的反应率，而T/T基因型显示25％的反应率(Hoskins等人，2008,Clin Cancer Res 14:1788-96)。在XRCC1c.1196G>A处的基因型与临床反应之间观察到非显著关联。
最近，Schlafen 11(SLFN11)基因的表达已被鉴定为对DNA损伤修复抑制剂(包括拓扑异构酶I抑制剂)具有敏感性的生物标志物(Thomas和Pommier，2019年6月21日，ClinCancer Res[刊载之前的电子版]；Ballestrero等人，2017,J Transl Med 15:199)。SLFN11是一种推定的DNA/RNA解旋酶，其与对拓扑异构酶I和II抑制剂、铂化合物和其他DNA损伤剂的抗性以及抗病毒反应性相关联(Ballestrero等人，2017,J Transl Med 15:199)。SLFN11高甲基化(导致表达降低)与卵巢癌的预后不良以及肺癌对铂化合物的抗性相关联，而SLFN11的高表达与乳腺癌化学疗法后的生存期改善相关(Ballestrero等人，2017,JTransl Med 15:199)。因此，癌细胞中的SLFN11表达水平和/或甲基化状态可以预测对单独的或与一种或多种DDR抑制剂组合的拓扑异构酶抑制性ADC的敏感性。
拓扑异构酶I序列中丝氨酸残基506处的新型磷酸化位点已被鉴定为在癌症中广泛表达，而在正常组织中不表达，并且与对喜树碱类拓扑异构酶I抑制剂的敏感性增加相关联(Zhao和Gjerset,2015,PLoS One10:e0134929)。
c-Met的表达增加与乳腺癌中的不良临床结果和对拓扑异构酶II抑制剂的抗性相关联(Jia等人，2018,Med Sci Monit 24:8239-49)。还报道了APTX的表达增加与对喜树碱的抗性相关联(Gilbert等人，2012,Br J Cancer 106:18-24)。
这些生物标志物和其他生物标志物可以预测拓扑异构酶I抑制性ADC的毒性和/或功效。
用于指示对PARP抑制剂的敏感性的生物标志物
在本领域中熟知的是，BRCA1/2突变指示对PARP抑制剂的易感性，事实上，PARP抑制剂(诸如奥拉帕尼)在卵巢癌中的FDA批准的临床用途涉及治疗具有种系BRCA突变的患者。BRCA突变的诊断用途和预测用途不限于卵巢癌，而是也可以适用于其他癌症类型，诸如TNBC(参见例如，Cardillo等人，2017,Clin Cancer Res 23:3405-15)。已经提出，类似的突变指示“BRCAness”，诸如CHEK2、NBN、PTEN和ATM基因中的突变(Cardillo等人，2017,ClinCancer Res 23:3405-15；Turner等人，2004,Nat Rev Cancer 4:814-19；Lips等人，2011,Ann Oncol 22:870-76)。容易诱发PARP1敏感性的其他基因中的突变包括PARB2、BRIP1、BARD1、CDK12、RAD51和p53(Bitler等人，2017,Gynecol Oncol 147:695-704；Lui等人，JClin Pathol 71:957-62；Weber和Ryan，2015,Pharmacol Ther149:124-38)。BRCA甲基化导致的表观遗传沉默也被认为容易诱发PARP抑制剂敏感性(参见例如，Bitler等人，2017,Gynecol Oncol 147:695-704)。BRCA 1/2突变和沉默发生在约30％的高级浆液性卵巢癌中，并且经常导致HR通路活性降低(Bitler等人，2017,Gynecol Oncol 147:695-704)。PARPi抗性的其他生物标志物包括FANCD2的过表达、PARP1的丧失、CHD4的丧失、SLFN11的失活，或者53BP1、REV7/MAD2L2、PAXIPI/PTIP或Artemis的丧失(Cruz等人，2018,Ann Oncol29:1203-10)。此外，继发突变可以恢复BRCA1/2的功能，从而克服对PARP的抑制(Cruz等人，2018,Ann Oncol 29:1203-10)。
已经在BRCA突变的乳腺癌中检查了RAD51功能的变化对PARP抗性的影响(Cruz等人，2018,Ann Oncol 29:1203-10)。RAD51经常在癌症中过表达(参见例如，维基百科“Rad51”条目下的内容)。作为HR通路中的关键蛋白，RAD51在gBRCA1/2突变体中的过表达可以部分地补偿HR功能的丧失并降低对PARPi的易感性(Cruz等人，2018,Ann Oncol29:1203-10)。Cruz等人使用DDR蛋白的外显子组测序和免疫染色研究了BRCA突变型乳腺癌中PARPi抗性的机制。RAD51核病灶(HR功能的替代标志物)是在PARPi抗性肿瘤中观察到的唯一共同特征，而低RAD51表达与对PARPi的反应性增加相关联(Cruz等人，2018,Ann Oncol 29:1203-10)。这些结果表明，PARP抑制剂(PARPi)可能由于存在RAD51病灶而禁忌使用，而RAD51的低表达可能是对PARPi具有易感性的阳性生物标志物。另外，RAD51抑制剂可以与PARP抑制剂组合使用。在RAD51病灶与对基于铂的化学治疗剂的敏感性之间没有观察到相关性(Cruz等人，2018,Ann Oncol 29:1203-10)。
以上论述涉及对PARP抑制剂(诸如奥拉帕尼)具有敏感性的生物标志物。因此，它们可能与使用抗Trop-2 ADC和PARP抑制剂的组合疗法有关。另外，由于生物标志物指示DDR通路的状态，该状态可能进而与对DNA损伤剂如拓扑异构酶I抑制剂和相应的ADC的敏感性有关，因此任何此类生物标志物可以用于预测对携带拓扑异构酶I抑制剂(如SN-38或DxD)的ADC的敏感性。
用于指示对抗癌剂的敏感性的其他生物标志物
已经表明，癌症中常见的p53突变可以使癌细胞易受靶向ATM激酶和/或ATR激酶的抑制剂的影响(Weber和Ryan，2015,Pharmacol Ther149:124-38)，以及易受使用ATM抑制剂和PARP抑制剂的组合疗法的影响(Brandsma等人，2017,Expert Opin Investig Drugs 26:1341-55)。
与ATM功能完整的肿瘤相比，在ATM不足的异种移植物中对ATR抑制剂AZD6738的敏感性增强，表明可以通过阻断ATM和ATR这两条通路的突变或抑制剂来实现合成致死性(Weber和Ryan，2015,Pharmacol Ther 149:124-38)。ATM和p53均不足的NSCLC肿瘤显示对ATR抑制的特定敏感性(Weber和Ryan，2015,Pharmacol Ther 149:124-38)。已经观察到ATM或ATR通路与DDR的多种组分之间的合成致死性，这些组分包括范可尼贫血通路、APE1抑制剂，XRCC1、ERCC1、ERCC4(XPF)或MRE11A的功能丧失(Weber和Ryan，2015,Pharmacol Ther149:124-38；Brandsma等人，2017,Expert Opin Investig Drugs 26:1341-55)。增加对ATM抑制剂和/或ATR抑制剂的敏感性的其他缺陷包括FANCD2、RAD50、BRCA1和ATM。这些结果涉及使用DNA损伤性ADC和ATM抑制剂和/或ATR抑制剂的组合疗法。当ATM调节通路和ATR调节通路均有活性时，可以指示将抗Trop-2 ADC与ATM和ATR抑制剂组合使用。当ATM调节的DNA修复通路中存在突变时，可以指示使用ADC和ATR抑制剂的组合疗法。类似地，ATR调节通路中的突变可以指示将ADC与ATM抑制剂组合使用。普通技术人员知道，ATM和ATR催化通路中的初始步骤、含有上文详细论述的多种下游效应物，并且使用ATM或ATR抑制剂可以被相同DDR通路中的下游效应物的抑制剂替代。
基于RNAi实验，已经提出将ATR的合成致死性用于沉默ATRIP、RAD17、RAD9A、RAD1、HUS1、POLD1、ARID1A和TOPBP1，并且这些沉默也使细胞对VE821敏感(Brandsma等人，2017,Expert Opin Investig Drugs 26:1341-55)。CDC25A功能的丧失被认为与ATR抑制剂抗性相关联(Brandsma等人，2017,Expert Opin Investig Drugs 26:1341-55)。
DNA-PK抑制剂敏感性的生物标志物包括AKT1、CDK4、CDK9、CHK1、IGFR1、mTOR、VHL、RRM2、MYC、MSH3、BRCA1、BRCA2、ATM和其他HR相关基因中的缺陷(Brandsma等人，2017,Expert Opin Investig Drugs 26:1341-55)。
已经提出，p53中的突变指示对WEE1抑制剂或者对使用CHK1抑制剂和DNA损伤剂的组合疗法的易感性增加(Ronco等人，2017,Med Chem Commun 8:295-319)。WEE1抑制剂在PKMYT1的表达较低并且具有FANCC、FANCG和BRCA2中的突变的细胞中也更有效(Brandsma等人，2017,Expert Opin Investig Drugs 26:1341-55)。
Nadaraja等人(2019年9月3日，Acta Oncol,[刊载之前的电子版])检查了接受一线基于铂的疗法的高级浆液性癌(HGSC)患者的转录组学图谱的改变。使用基因表达阵列来检测mRNA的变化，而通过IHC来检查所选择生物标志物的蛋白表达(Nadaraja等人，2019年9月3日,Acta Oncol[刊载之前的电子版])。ARAP1(锚蛋白重复序列和PH结构域1)的表达在早期进展者中相比晚期进展者中明显较低。ARAP1表达鉴定出64.7％的早期进展者，灵敏度为78.6％(Nadaraja等人，2019年9月3日,Acta Oncol[刊载之前的电子版])。这些结果表明，ARAP1表达指示对基于铂的抗癌剂的敏感性，并且可以用于预测对其他DNA损伤剂(诸如拓扑异构酶I抑制性ADC)的敏感性。
Ilelis等人进行了类似的研究(2018,Pathol Res Pract 214:187-94)，其使用ICH来检查用基于铂的化学疗法治疗的HGSC患者中的GRIM-19、NF-κB和IKK2的表达。得出结论，IKK2和NF-κB的高表达与生存率低和对基于铂的药剂的抗性相关联，而GRIM-19的高表达则预示较高的无疾病生存率，并且与复发率负相关。GRIM-19的表达可以是对基于铂的疗法和潜在的其他DNA损伤治疗(诸如拓扑异构酶I抑制性ADC)具有敏感性的有用生物标志物。
Miao等人(2019,Cell Mol biol 65:64-72)使用定量PCR测定了乳腺癌患者中与良性和正常样品相比的cfDNA水平。还确定了血浆的CEA、CA125和CA15-3。乳腺癌患者的cfDNA浓度和完整性显著高于对照组，并且接受化学疗法后两种生物标志物均明显减少(Miao等人，2019,Cell Mol biol 65:64-72)。cfDNA分析的灵敏度和特异性显著高于传统肿瘤生物标志物的灵敏度和特异性(Miao等人，2019,Cell Mol biol 65:64-72)。因此，除了检查cfDNA中的特异性生物标志物之外，血清中的总cfDNA水平也可以用作指示癌症存在和抗癌疗法的功效的生物标志物。
Faltas等人(2016Nat Genet 48:1490-99)报道，L1CAM(L1细胞粘附分子)中的突变与转移性尿路上皮癌中的化学疗法抗性(例如顺铂抗性)相关联。这些突变中的大部分是错义突变。使用全外显子组测序进行分析，分析了21,522个基因，包括250个靶向的癌症基因。
这些生物标志物和其他已知的生物标志物可以用于预测单独地或与其他抗癌剂组合用于癌症治疗的ADC的敏感性、抗性或毒性。普通技术人员将知道，此类癌症生物标志物可以具有其他用途，诸如提高诊断准确性、个体化患者治疗(精准医疗)、确定预后、预测治疗结果和复发率、监测疾病进展和/或识别癌症治疗的早期复发。
试剂盒
各种实施方案可以涉及套件，这些套件包含适用于治疗患者的患病组织的组分。示例性试剂盒可以包含至少一种如本文所述的抗体或ADC。试剂盒还可以包括药物，诸如DDR抑制剂或其他已知的抗癌治疗剂。如果含有用于施用的组分的组合物没有被配制用于经由消化道递送(诸如通过口服递送)，则可以包括能够通过另一些途径递送试剂盒组分的装置。用于诸如肠胃外递送等应用的一种类型的装置是用于将组合物注射到受试者体内的注射器。还可以使用吸入装置。
这些试剂盒组分可以包装在一起，或者分到两个或更多个容器中。在一些实施方案中，这些容器可以是容纳组合物的适用于复溶的无菌冻干制剂的小瓶。试剂盒还可以包含一种或多种适用于复溶和/或稀释其他试剂的缓冲液。可以使用的其他容器包括但不限于小袋、托盘、盒子、管等。试剂盒组分可以以无菌方式包装和保持在这些容器内。可以包括的另一种组分是供使用试剂盒的人阅读以了解其用途的说明书。
附加的示例性实施方案
在一个方面，本文提供了一种治疗表达Trop-2的癌症的方法，包括：a)测定来自患有表达Trop-2的癌症的人类受试者的样品中一种或多种癌症生物标志物的存在；b)检测与对抗Trop-2抗体-药物偶联物(ADC)的敏感性相关联的一种或多种生物标志物；以及c)用包含与拓扑异构酶I抑制剂偶联的抗Trop-2抗体的抗Trop-2 ADC治疗所述受试者。在一些实施方案中，该方法还包括：d)检测与对使用抗Trop-2 ADC和DDR抑制剂的组合疗法的敏感性相关联的一种或多种生物标志物；以及e)用抗Trop-2ADC和DDR(DNA损伤修复)抑制剂的组合治疗所述受试者。
在另一个方面，本文提供了一种选择将用抗Trop-2抗体-药物偶联物(ADC)治疗的患者的方法，包括：a)分析来自人类癌症患者的样品中一种或多种癌症生物标志物的存在；b)检测与对抗Trop-2 ADC的敏感性或者抗Trop-2 ADC的毒性相关联的一种或多种生物标志物；c)基于所述一种或多种生物标志物的存在，选择将用抗Trop-2 ADC治疗的患者；以及d)用抗Trop-2 ADC治疗所选择的患者。在一些实施方案中，该方法还包括：e)基于所述一种或多种生物标志物的存在，选择将用组合疗法治疗的患者；以及f)用抗Trop-2 ADC和DDR抑制剂的组合治疗所述患者。
在一些实施方案中，先将抗Trop-2 ADC作为新辅助疗法施用于患者，再施用至少另外一种抗癌疗法。
在一些实施方案中，该方法还包括：e)监测所述患者中一种或多种生物标志物的存在；以及f)确定癌症对所述治疗的响应。
在一些实施方案中，该方法还包括基于生物标志物分析监测患者的残留疾病或复发。
在一些实施方案中，该方法还包括基于生物标志物分析确定疾病结果或进展的预后。
在一些实施方案中，该方法还包括基于生物标志物分析为患者选择优化的个体治疗。
在一些实施方案中，该方法还包括基于生物标志物分析对癌症进行分期。
在一些实施方案中，该方法还包括基于生物标志物分析对初始治疗的患者群体进行分层。
在一些实施方案中，该方法还包括基于生物标志物分析推荐支持性疗法以改善ADC治疗的副作用。
在一些实施方案中，样品是来自实体瘤的活检样品。
在一些实施方案中，样品是液体活检样品。
在一些实施方案中，样品包括cfDNA、ctDNA或循环肿瘤细胞(CTC)。
在一些实施方案中，样品包含CTC，并且分析这些CTC中一种或多种癌症生物标志物的存在。
在一些实施方案中，生物标志物是DNA损伤修复(DDR)基因或细胞凋亡基因中的遗传标志物。
在一些实施方案中，该基因选自由以下项组成的组：BRCA1、BRCA2、CHEK2、MSH2、MSH6、TP53、CDKN1A、BAG6、BRSK2、ERN1、FHIT、HIPK2、LGALS12、ZNF622、AEN、SART1、USP28、GADD45B、TGFB1、NDRG1、WEE1、PPP1R15A、MYBBP1A、SIRT1、ABL1、HRAS、ZNF385B、POLR2K和DDB2。
在一些实施方案中，所述生物标志物包括以下项或由以下项组成：BRCA1、BRCA2、CHEK2、MSH2、MSH6、TP53、CDKN1A、BAG6、BRSK2、ERN1、FHIT、HIPK2、LGALS12、ZNF622、AEN、SART1、USP28、GADD45B、TGFB1、NDRG1、WEE1、PPP1R15A、MYBBP1A、SIRT1、ABL1、HRAS、ZNF385B、POLR2K和DDB2。
在一些实施方案中，所述生物标志物包括以下项或由以下项组成：AEN、MSH2、MYBBP1A、SART1、SIRT1、USP28、CDKN1A、ABL1、TP53、BAG6、BRCA1、BRCA2、BRSK2、CHEK2、ERN1、FHIT、HIPK2、HRAS、LGALS12、MSH6、ZNF385B和ZNF622。
在一些实施方案中，所述生物标志物包括以下项或由以下项组成：BRCA1、BRCA2、CHEK2、MSH2、MSH6、TP53、CDKN1A、BAG6、BRSK2、ERN1、FHIT、HIPK2、LGALS12、ZNF622、AEN、SART1和USP28。
在一些实施方案中，所述生物标志物包括以下项或由以下项组成：POLR2K、DDB2、GADD45B、WEE1、TGFB1、NDRG1和PPP1R15A。
在一些实施方案中，所述生物标志物包括以下项或由以下项组成：GADD45B、TGFB1、NRG1、WEE1和PPP1R15A。
在一些实施方案中，所述生物标志物包括以下项或由以下项组成：BRCA1、BRCA2、CHEK2、MSH2、MSH6、TP53、CDKN1A、BAG6、BRSK2、ERN1、FHIT、HIPK2、LGALS12、ZNF622、AEN、SART1、USP28、GADD45B、TGFB1、NRG1、WEE1和PPP1R15A。
在一些实施方案中，该基因选自由以下项组成的组：BRCA1、BRCA2、PTEN、ERCC1和ATM。
在一些实施方案中，所述生物标志物包括以下项或由以下项组成：BRCA1、BRCA2、PTEN、ERCC1和ATM。
在一些实施方案中，该生物标志物是引起下列取代突变的单核苷酸多态性，所述取代突变选自由以下项组成的组：ABL1中的E155K、ABL1中的G706S、AEN中的V172L、BAG6中的R279Q、BRCA1中的P1020Q、BRCA1中的E255K、BRCA2中的L2518V、BRSK2中的T656A、CDKN1A中的M1V、CHECK2中的A377D、ERN1中的G771S、FHIT中的R46S、HIPK2中的E457Q、HRAS中的G12V、LGALS12中的A278V、MSH2中的N127S、MSH6中的S625F、MYBBP1A中的H680Y、SART1中的R373Q、SIRT1中的E113Q、TP53中的*394S、TP53中的R282G、TP53中的T377P、TP53中的E271K、TP53中的Y220C、TP53中的E180*、USP28中的I987L、ZNF385B中的R370Q、以及ZNF622中的A437E。
在一些实施方案中，所述生物标志物是引起下列取代的多种单核苷酸多态性，这些取代包括以下项或由以下项组成：ABL1中的E155K、ABL1中的G706S、AEN中的V172L、BAG6中的R279Q、BRCA1中的P1020Q、BRCA1中的E255K、BRCA2中的L2518V、BRSK2中的T656A、CDKN1A中的M1V、CHECK2中的A377D、ERN1中的G771S、FHIT中的R46S、HIPK2中的E457Q、HRAS中的G12V、LGALS12中的A278V、MSH2中的N127S、MSH6中的S625F、MYBBP1A中的H680Y、SART1中的R373Q、SIRT1中的E113Q、TP53中的*394S、TP53中的R282G、TP53中的T377P、TP53中的E271K、TP53中的Y220C、TP53中的E180*、USP28中的I987L、ZNF385B中的R370Q、以及ZNF622中的A437E。
在一些实施方案中，所述生物标志物是引起下列取代的多种单核苷酸多态性，这些取代包括以下项或由以下项组成：AEN中的V172L、BAG6中的R279Q、BRCA1中的P1020Q、BRCA1中的E255K、BRCA2中的L2518V、BRSK2中的T656A、CDKN1A中的M1V、CHECK2中的A377D、ERN1中的G771S、FHIT中的R46S、HIPK2中的E457Q、MSH2中的N127S、MSH6中的S625F、SART1中的R373Q、TP53中的*394S、TP53中的R282G、TP53中的T377P、TP53中的E271K、TP53中的Y220C、TP53中的E180*、以及USP28中的I987L。
在一些实施方案中，该生物标志物是选自由以下项组成的组的移码突变：BAG6中的K1110fs、CDKN1A中的R32fs、CDKN1A中的DC33fs、以及CDKN1A中的EG60fs。
在一些实施方案中，所述生物标志物是包括以下项或由以下项组成的多种移码突变：BAG6中的K1110fs、CDKN1A中的R32fs、CDKN1A中的DC33fs、以及CDKN1A中的EG60fs。
在一些实施方案中，该生物标志物是与相应的正常组织相比，癌症中的基因表达增加或减少，该基因选自由以下项组成的组：POLR2K、DDB2、GADD45B、WEE1、TGFB1、NDRG1和PPP1R15A。
在一些实施方案中，所述生物标志物是与相应的正常组织相比，癌症中的基因表达的多个增加或减少，该基因包括以下项或由以下项组成：POLR2K、DDB2、GADD45B、WEE1、TGFB1、NDRG1和PPP1R15A。
在一些实施方案中，该基因选自由以下项组成的组：BRCA1、BRCA2、PTEN、ERCC1和ATM。
在一些实施方案中，所述生物标志物包括以下项或由以下项组成：BRCA1、BRCA2、PTEN、ERCC1和ATM。
在一些实施方案中，该生物标志物选自由以下项组成的组：突变、插入、缺失、染色体重排、SNP(单核苷酸多态性)、DNA甲基化、基因扩增、RNA剪接变体、miRNA、基因表达增加、基因表达减少、蛋白质磷酸化和蛋白质去磷酸化。
在一些实施方案中，样品测定法包括DNA或RNA的下一代测序。
在一些实施方案中，拓扑异构酶I抑制剂是SN-38或DxD。
在一些实施方案中，抗Trop-2 ADC选自由以下项组成的组：戈沙妥珠单抗和DS-1062。
在一些实施方案中，DDR抑制剂是以下物质的抑制剂：53BP1、APE1、Artemis、ATM、ATR、ATRIP、BAP1、BARD1、BLM、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDC2、CDC25A、CDC25C、CDK1、CDK12、CHK1、CHK2、CSA、CSB、CtIP、细胞周期蛋白B、Dna2、DNA-PK、EEPD1、EME1、ERCC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、Exo1、FAAP24、FANC1、FANCM、FAND2、HR23B、HUS1、KU70、KU80、Lig III、连接酶IV、Mdm2、MLH1、MRE11、MSH2、MSH3、MSH6、MUS81、MutSα、MutSβ、NBS1、NER、p21、p53、PALB2、PARP、PMS2、Polμ、Polβ、Polδ、Polε、Polκ、Polλ、PTEN、RAD1、RAD17、RAD23B、RAD50、RAD51、RAD51C、RAD52、RAD54、RAD9、RFC2、RFC3、RFC4、RFC5、RIF1、RPA、SLX1、SLX4、TopBP1、USP11、WEE1、WRN、XAB2、XLF、XPA、XPC、XPD、XPF、XPG、XRCC1或XRCC4。
在一些实施方案中，DDR抑制剂是以下物质的抑制剂：PARP、CDK12、ATR、ATM、CHK1、CHK2、CDK12、RAD51、RAD52或WEE1。
在一些实施方案中，PARP抑制剂选自由以下项组成的组：奥拉帕尼、他拉唑帕尼(BMN-673)、芦卡帕尼、维利帕尼、尼拉帕尼、CEP9722、MK 4827、BGB-290(帕米帕尼)、ABT-888、AG014699、BSI-201、CEP-8983、E7016和3-氨基苯甲酰胺。
在一些实施方案中，CDK12抑制剂选自由以下项组成的组：迪那昔布、夫拉平度、罗斯科维汀、THZ1和THZ531。
在一些实施方案中，RAD51抑制剂选自由以下项组成的组：B02((E)-3-苄基-2(2-(吡啶-3-基)乙烯基)喹唑啉-4(3H)-酮)、RI-1(3-氯-1-(3,4-二氯苯基)-4-(4-吗啉基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、DIDS(4,4'-二异硫氰基芪-2,2'-二磺酸)、哈里醌、CYT-0851、IBR2和伊马替尼。
在一些实施方案中，ATM抑制剂选自由以下项组成的组：渥曼青霉素、CP-466722、KU-55933、KU-60019、KU-59403、AZD0156、AZD1390、CGK733、NVP-BEZ 235、Torin-2、氟喹啉2和SJ573017。
在一些实施方案中，ATR抑制剂选自由以下项组成的组：五味子乙素、NU6027、BEZ235、ETP46464、Torin 2、VE-821、VE-822、AZ20、AZD6738(塞拉色替)、M4344、BAY1895344、BAY-937、AZD6738、BEZ235(达克利司)、CGK 733和VX-970。
在一些实施方案中，CHK1抑制剂选自由以下项组成的组：XL9844、UCN-01、CHIR-124、AZD7762、AZD1775、XL844、LY2603618、LY2606368(普瑞沙替尼)、GDC-0425、PD-321852、PF-477736、CBP501、CCT-244747、CEP-3891、SAR-020106、Arry-575、SRA737、V158411和SCH900776(MK-8776)。
在一些实施方案中，CHK2抑制剂选自由以下项组成的组：NSC205171、PV1019、CI2、CI3、2-芳基苯并咪唑、NSC109555、VRX0466617和CCT241533。
在一些实施方案中，WEE1抑制剂选自由以下项组成的组：AZD1775(MK1775)、PD0166285和PD407824。
在一些实施方案中，DDR抑制剂选自由以下项组成的组：mirin、M1216、NSC19630、NSC130813、LY294002和NU7026。
在一些实施方案中，DDR抑制剂不是PARP或RAD51的抑制剂。
在一些实施方案中，抗Trop-2 ADC包括hRS7抗体，其包含轻链CDR序列CDR1(KASQDVSIAVA，SEQ ID NO:1)、CDR2(SASYRYT，SEQ ID NO:2)和CDR3(QQHYITPLT，SEQ IDNO:3)，以及重链CDR序列CDR1(NYGMN，SEQ ID NO:4)、CDR2(WINTYTGEPTYTDDFKG，SEQ IDNO:5)和CDR3(GGFGSSYWYFDV，SEQ ID NO:6)。
在一些实施方案中，该方法还包括用抗癌剂治疗受试者，该抗癌剂选自由以下项组成的组：奥拉帕尼、芦卡帕尼、他拉唑帕尼、维利帕尼、尼拉帕尼、阿卡替尼、替莫唑胺、阿替利珠单抗、帕博利珠单抗、纳武单抗、伊匹单抗、匹地珠单抗、度伐利尤单抗、BMS-936559、BMN-673、曲美木单抗、艾代拉里斯、伊马替尼、依鲁替尼、甲磺酸艾日布林、阿贝西利、帕博西尼、瑞博西利、曲拉西利、贝佐替尼、依帕曲替尼、阿普罗替尼、阿富塞替尼、曲西立滨、塞拉替尼、迪那西利、夫拉平度、罗斯科维汀、G1T38、SHR6390、库潘尼西、替西罗莫司、依维莫司、KU 60019、KU 55933、KU 59403、AZ20、AZD0156、AZD1390、AZD1775、AZD2281、AZD5363、AZD6738、AZD7762、AZD8055、AZD9150、BAY-937、BAY1895344、BEZ235、CCT241533、CCT244747、CGK 733、CID44640177、CID1434724、CID46245505、CHIR-124、EPT46464、FTC、VE-821、VRX0466617、VX-970、LY294002、LY2603618、M1216、M3814、M4344、M6620、MK-2206、NSC19630、NSC109555、NSC130813、NSC205171、NU6027、NU7026、普瑞沙替尼(LY2606368)、PD0166285、PD407824、PV1019、SCH900776、SRA737、BMN 673、CYT-0851、mirin、Torin-2、氟喹啉2、烟曲霉毒素C、姜黄素、Kol43、GF120918、YHO-13351、YHO-13177、XL9844、渥曼青霉素、拉帕替尼、索拉非尼、舒尼替尼、尼罗替尼、吉西他滨、硼替佐米、曲古抑菌素A、紫杉醇、阿糖胞苷、顺铂、奥沙利铂和卡铂。
在一些实施方案中，癌症选自由以下项组成的组：乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、HR+/HER2-转移性乳腺癌、尿路上皮癌、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠直肠癌、胃癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子宫癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌、食道癌、胰腺癌、脑癌、肝癌和头颈癌。在一些实施方案中，癌症是尿路上皮癌。在一些实施方案中，癌症是转移性尿路上皮癌。在一些实施方案中，癌症是抗治疗性尿路上皮癌。在一些实施方案中，癌症对用基于铂和基于检查点抑制剂(CPI)(例如，抗PD1抗体或抗PD-L1抗体)的疗法进行治疗具有抗性。在一些实施方案中，癌症是转移性TNBC。
在另一个方面，本文提供了一种预测患有表达Trop-2的癌症的受试者在用抗Trop-2 ADC治疗后的临床结果的方法，包括测定来自患有表达Trop-2的癌症的人类受试者的样品中一种或多种癌症生物标志物的存在，其中存在或不存在一种或多种癌症生物标志物预示该受试者中的临床结果。
在一些实施方案中，存在或不存在一种或多种癌症生物标志物预示用抗Trop-2ADC进行治疗的功效，其中ADC包括拓扑异构酶I的抑制剂。
在一些实施方案中，存在或不存在一种或多种癌症生物标志物预示用抗Trop-2ADC和DDR抑制剂的组合进行治疗的功效或安全性。
在一些实施方案中，存在或不存在一种或多种癌症生物标志物预示用抗Trop-2ADC和标准抗癌疗法的组合进行治疗的功效或安全性。
在一些实施方案中，该方法还包括预测在用抗Trop-2 ADC治疗后的无复发间隔、总生存期、无疾病生存期或远端无复发间隔。
实施例
通过以下实施例说明本发明的各种实施方案，但这些实施例并不限制本发明的范围。
实施例1.戈沙妥珠单抗用于抗治疗性转移性尿路上皮癌(mUC)以及用于指示敏感 性的生物标志物
概述
在基于铂的疗法和检查点抑制剂(CPI)疗法后出现进展的转移性尿路上皮癌(mUC)患者的治疗选择有限。戈沙妥珠单抗是包含与细胞毒性剂SN-38偶联的人源化单克隆抗Trop-2抗体的抗体-药物偶联物(ADC)。I/II期单臂多中心试验(NCT01631552)评价了戈沙妥珠单抗在≥1次既往全身治疗后出现发展的预先治疗过的mUC中的安全性和活性。
患者在21天周期的第1天和第8天接受静脉内戈沙妥珠单抗(10mg/kg)，直到出现进展或不可接受的毒性。终点包括安全性、研究者评价的客观缓解率(ORR，依据RECIST1.1)、临床获益率、缓解持续时间(DOR)、无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)。在来自反应者和非反应者的肿瘤子组中进行差异突变和表达的基因和通路的测序分析。
以推荐的2期剂量治疗的四十五例患者入选(中位年龄为67岁[范围：49岁至90岁]；91％男性；既往疗法中位数为2[范围：1至6]种；69％的ECOG PS评分为1；73％存在内脏转移[33％存在肝转移])，接受≥1个戈沙妥珠单抗剂量。ORR为31％(14/45；2例完全缓解，12例部分缓解)。中位DOR为12.9个月，PFS为7.3个月，OS为16.3个月。肝转移患者的ORR为33％(5/15)，既往用CPI治疗过的患者(既往治疗线中位数为3条)的ORR为24％(4/17)，并且既往用CPI和铂治疗过的患者的ORR为27％(4/15)。最常见的≥3级不良事件为中性粒细胞减少症(38％)、贫血(13％)、低磷血症(11％)、腹泻(9％)、疲劳(9％)和发热性中性粒细胞减少症(7％)。对来自反应者的肿瘤的测序显示，在DNA修复通路和细胞凋亡通路中存在分子改变富集现象。
基于本文报道的研究结果，我们得出结论，戈沙妥珠单抗在抗性mUC中表现出显著的临床活性，且毒性可管理。
简介
在基于铂的化学疗法和免疫检查点抑制剂(CPI)疗法后出现进展的转移性尿路上皮癌(mUC)患者的结局较差，且治疗选择有限(Di Lorenzo等人，2015,Medicine(Baltimore)94:e2297；Vlachostergios等人，2018,Bladder Cancer 4:247-59)。最近，有几种针对化学疗法抗性mUC的CPI(检查点抑制剂)获批，使mUC的治疗前景得以扩大。然而，仅约15％至21％的患者对这些药剂有反应(Vlachostergios等人，2018,Bladder Cancer4:247-59；Bellmunt等人，2017,N Eng J Med 37:1015-26；Patel等人，2018,Lancet Oncol19:51-64；Powles等人，2017,JAMA Oncol 3:e172411；Rosenberg等人，2016,Lancet 387:1909-20)。关于CPI出现疾病进展的患者目前没有获得批准的治疗选择(Di Lorenzo等人，2015,Medicine(Baltimore)94:e2297；Bellmunt等人，2017,N Eng J Med 37:1015-26)。由于治疗需求未获满足，所以仍然迫切地需要为这些患者开发有效的治疗方案。
戈沙妥珠单抗是一种靶向滋养层细胞表面抗原2(Trop-2)的新型抗体-药物偶联物(ADC)(Goldenberg等人，2015,Oncotarget 6:22496-512)。Trop-2是在大多数上皮癌中高度表达的跨膜钙信号转导蛋白(Trerotola等人，2013,Oncogene 32:222-33；Avellini等人，2017,Oncotarget 8:58642-53；Shvartsur和Bonavida，2015,Genes Cancer 6:84-105；Stepan等人，2011,J Histochem Cytochem 59:701-10；Goldenberg等人，2018,Oncotarget9:28989-29006)。Trop-2表达升高与预后不良相关联，并且在细胞转化和增殖中起关键作用，且在转移性疾病中观察到相比早期疾病更高的表达(Trerotola等人，2013,Oncogene 32:222-33；Avellini等人，2017,Oncotarget 8:58642-53；Shvartsur和Bonavida，2015,Genes Cancer 6:84-105；Stepan等人，2011,J Histochem Cytochem 59:701-10；Goldenberg等人，2018,Oncotarget 9:28989-29006)。
戈沙妥珠单抗由抗Trop-2人源化单克隆抗体hRS7 IgG1κ和与之偶联的SN-38(拓扑异构酶1抑制剂伊立替康的活性代谢物)组成(Goldenberg等人，2018,Oncotarget 9:28989-29006)。这种偶联使用独特的可水解CL2A接头实现(Goldenberg等人，2015,Oncotarget 6:22496-512；Goldenberg等人，2018,Oncotarget 9:28989-29006；Cardillo等人，2011,Clin Cancer Res 17:3157-69；Cardillo等人，2015,Bioconjug Chem 26:919-31；Starodub等人，2015,Clin Cancer Res 21:3870-78)。戈沙妥珠单抗是一种新型ADC，具有比其他ADC高得多的药物-抗体比率(每个抗体多达8个SN-38分子)，而其他ADC通常具有2:1至4:1的比率(Goldenberg等人，2018,Oncotarget 9:28989-29006；Challita等人，2016,Cancer Res76:3003-13)。hRS7(游离形式或偶联形式)在与Trop-2结合后被内化，从而将SN-38递送到肿瘤细胞内(Cardillo等人，2011,Clin Cancer Res17:3157-69)。戈沙妥珠单抗的独特的可水解接头还使得SN-38能够释放到肿瘤微环境中，使得结合戈沙妥珠单抗的肿瘤细胞由于SN-38的细胞内摄取而被杀死，相邻的肿瘤细胞则被释放到细胞外的SN-38杀死，其中SN-38容易穿过紧密相邻细胞的细胞表面膜(Goldenberg等人，2018,Oncotarget 9:28989-29006；Cardillo等人，2015,Bioconjug Chem 26:919-31；Starodub等人，2015,Clin Cancer Res 21:3870-78)。
最初在I/II期篮式设计的开放标签单臂多中心试验(IMMU-132-01；NCT01631552)中，针对接受过至少一种用于转移性疾病的既往疗法的进展期上皮癌患者评估了戈沙妥珠单抗的安全性和功效(Starodub等人，2015,Clin Cancer Res 21:3870-78；Ocean等人，2017,Cancer 123:3843-54)。根据该研究，在以下四种癌症类型中报道了令人鼓舞的临床活性：三阴性和激素受体阳性/HER2阴性乳腺癌(Bardia等人，2017,J Clin Oncol35:2141-48；Bardia等人，2019,N Engl J Med 380:741-51；Bardia等人，2018,J Clin Oncol 36(增刊):1004)、预先治疗过的小细胞肺癌(Gray等人，2017,Clin Cancer Res 23:5711-19)，以及非小细胞肺癌(Heits等人，2017,J Clin Oncol 35:2790-97)。此外，Faltas及其同事报道了来自mUC患者研究的I期部分的早期结果(Faltas等人，2016,Clin GenitourinCancer14:e75-9)。在本文中，我们报道了有关戈沙妥珠单抗在预先治疗过的mUC患者中的安全性和功效的发现。
材料和方法
患者-符合以下条件的患者入选：18岁以上，患有经组织学确认的mUC，已经在至少一种既往的标准治疗方案后复发或者是至少一种既往的标准治疗方案难治的。所有患者在入选时均患有可通过1.1版(RECIST1.1)实体瘤反应评价标准测量的转移性疾病。要求患者的东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态为0至1，预期生存期≥6个月，且具有适当的肝功能、肾功能和血液功能。患者必须处于先前的治疗线(包括抗癌治疗或高剂量全身皮质类固醇，或者大手术)之后≥2周，并且必须从所有急性毒性中恢复至1级或更低等级(除脱发外)。具有稳定脑转移的患者只有处于高剂量类固醇治疗之后≥2周，才可以被纳入。不需要基于肿瘤表达Trop-2对患者进行预选择。
研究设计-基于来自该研究的先前报道的I期部分的数据和来自该研究的II期部分的早期安全性数据，将戈沙妥珠单抗的10mg/kg剂量确定为最大耐受剂量(Starodub等人，2015,Clin Cancer Res 21:3870-8；Ocean等人，2017,Cancer 123:3843-54)。在3周治疗周期的每21天，在第1天和第8天静脉内施用戈沙妥珠单抗，无需术前给药，直到出现不可接受的毒性或疾病进展。由研究者自行决定允许输注造血生长因子或输血，但不在第一次给药之前输注。根据医学需要，允许给予其他支持性护理(止吐药、止泻药或骨稳定剂)。
该研究的I期部分和II期部分的主要目标分别是限定最大耐受剂量，以及评价戈沙妥珠单抗的安全性和功效。附加的次要目标包括评估药代动力学和免疫原性，这之前由Ocean及其同事报道过(Ocean等人，2017,Cancer 123:3843-54)。安全性评价包括不良事件(AE)、严重不良事件(SAE)、实验室安全性评价、生命体征、体格检查和12导联心电图(ECG；在基线处、每个偶数治疗周期的第1天输注完成后、治疗结束时以及研究结束时进行)。AE根据国家癌症研究所常用术语不良事件标准(National Cancer Institute CommonTerminology Criteria for Adverse Events)4.0版进行分级。
在基线处和从治疗开始直到出现需要中断治疗的进展以8周为间隔获得CT/磁共振成像(MRI)分期扫描结果。在初始部分缓解(PR)或完全缓解(CR)后不早于4周获得验证性CT/MRI扫描结果。在验证性扫描后以8周为间隔进行后续扫描。准许具有临床获益证据的患者在疾病进展后接受治疗。研究者使用RECIST 1.1版来评估反应。功效终点包括客观缓解率(ORR)、至缓解的时间、缓解持续时间(DOR)、临床获益率(CBR；被定义为CR、PR或疾病稳定≥6个月)、无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)。
生物标志物分析-为了深刻理解对戈沙妥珠单抗作出反应的潜在生物学原理，我们根据独立的机构审查委员会批准的方案，在获得书面知情同意的情况下，对来自反应者和非反应者的可用肿瘤进行了全外显子组测序(WES)和RNA测序(RNAseq)。分析了反应者和非反应者之间差异突变和表达的基因和通路，重点在于介导SN-38的细胞毒性作用所涉及的通路中的分子改变，其中SN-38是戈沙妥珠单抗的活性部分。为了确定介导对戈沙妥珠单抗的反应的细胞过程，对每个肿瘤进行了单样品基因集富集分析(GSEA)。
从14例在WCM-NYP被诊断为尿路上皮癌并且入选该试验的患者的存档原发性标本(TURBT，膀胱切除术)和转移性标本(核芯活检)的库存过量组织回顾性地收集了新鲜冷冻和福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品。所有肿瘤样品均由常规UC组成。所有病理标本均由WCM/NYP病理科获委员会认证的泌尿生殖病理学家审查和报告。
DNA提取和全外显子组测序-先前已经描述过本研究中所使用的全外显子组测序(WES)方案(Di Lorenzo等人，2015,Medicine(Baltimore)94:e2297；Vlachostergios等人，2018,Bladder Cancer 4:247-59)。在对目标病变进行宏观解剖后，使用Promega
Figure BDA0003854440460000651
16MDx(Promega,Madison,WI,USA)从FFPE或带芯OCT冷冻保存的肿瘤中提取肿瘤DNA。使用相同的方法从与肿瘤相邻的正常组织提取种系DNA。由其中一名WCM/NYP病理学家进行的病理学审查证实了诊断结果并确定了肿瘤含量。最少取200ng DNA用于WES。DNA质量通过TapeStation仪器(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)测定，并且在测序前通过实时PCR确认。使用Illumina HiSeq 2500(2×100bp)进行测序。使用Agilent HaloPlexExome(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)共分析了21,522个基因，平均覆盖度为85×。
全外显子组测序数据处理流水线-所有样品数据均通过纽约长老会医院威尔康奈尔医学院精准医疗研究所的计算分析流水线(IPM-Exome-pipeline)进行了处理(Vlachostergios等人，2018,Bladder Cancer 4:247-59)。用FASTQC评估原始读段质量，并且将其与GRCh37人类参考基因组进行比对(Vlachostergios等人，2018,Bladder Cancer4:247-59)。流水线输出包括片段DNA拷贝数数据、体细胞拷贝数畸变(CNA)和推定的体细胞单核苷酸变体(SNV)。
单核苷酸变异-我们开发了共识的体细胞SNV检出流水线来提高这些检出的准确性。使用MuTect2、Strelka、VarScan和SomaticSniper在成对的肿瘤-正常样品中鉴定SNV，并且只保留了由至少2种突变检出工具所鉴定的SNV。使用Strelka和VarScan鉴定插入缺失(插入或缺失)，并且只保留了由两种工具所鉴定的那些。使用以下标准进一步过滤所鉴定的体细胞改变：(a)肿瘤样品和匹配的正常样品的读段深度≥10个读段，(b)肿瘤样品中的变体等位基因频率(VAF)≥5％并且超过3个读段具有突变的等位基因，(c)匹配的正常样品的VAF≤1％或仅有一个读段具有突变的等位基因。使用Oncotator(1.9版)对这些变体进行注释；突变检出之中的dbSNP除非也在COSMIC数据库中找到，否则被过滤掉。对于IPM样品，混杂突变检出(以前在内部被鉴定为Haloplex的人工产物)也从最终的突变列表中排除。将Fischer精确检验应用于给定通路的反应者和非反应者中的突变表型和野生型表型的基因计数矩阵，以鉴定该通路是否在这两个患者反应组中的任一组中富集。使用“ComplexHeatmap”Bioconductor R软件包为所选择的突变创建Oncoprint。
RNA提取、RNA测序和数据分析-使用Promega
Figure BDA0003854440460000661
16MDx仪器(
Figure BDA0003854440460000662
16LEV simplyRNA组织试剂盒)从冷冻材料中提取RNA用于RNA测序(RNA-seq)。使用TruSeqRNA文库制备试剂盒v2或
Figure BDA0003854440460000663
制备标本用于RNA测序。使用Agilent生物分析仪2100(Agilent Technologies)验证RNA完整性。使用
Figure BDA0003854440460000664
III(Invitrogen)由总RNA合成cDNA。然后在GAII、HiSeq 2000或HiSeq 2500上进行测序。将所有读段独立地与STAR_2.4.0fl(Bellmunt等人，2017,N Eng J Med37:1015-26)比对，用于对照人类基因组序列构建体GRCh37进行序列比对；然后经由UCSC基因组浏览器SAMTOOLS v0.1.19(Patel等人，2018,Lancet Oncol 19:51-64)下载，以便对读段进行排序和加索引。使用HTSeq-count软件将映射到每个转录物的读段数定量为计数。使用Cufflinks(2.0.2)(Powles等人，2017,JAMA Oncol 3:e172411)，连同用于注释的GENCODE v23(Rosenberg等人，2016,Lancet387:1909-20)GTF文件，将归一化的转录本丰度定量为每百万个映射片段中每千碱基外显子的片段数(FPKM)。将Rstudio(1.0.136)与R(v3.3.2)和ggplot2(2.2.1)一起用于统计分析和生成图形。
RNAseq数据定量、整合与表达分析-将17个UC肿瘤的mRNA基因表达定量为每百万个片段中每千碱基转录本的片段数(FPKM)。对FPKM值进行对数变换，以便进一步分析。使用Bioconductor软件包DESeq2对计数数据进行来自反应者和非反应者的肿瘤之间的差异基因表达(DGE)分析。差异调节基因的选择阈值对于上调基因被确定为倍数变化>2，对于下调基因被确定为倍数变化<-2，并且在调整后的p值为0.05时认为结果是显著的(Benjamini-Hochberg校正)。
基因集富集分析-使用Bioconductor R软件包DESeq对RNAseq计数进行差异基因表达(DGE)分析。鉴定反应者患者组与非反应者患者组之间的差异表达基因(反应者中上调：log倍数变化(LFC)>2，反应者中下调：LFC<-2，调整后的p值<0.001)，并且使用“pheatmap”R软件包将这些基因在热图中可视化。将预先排序的基因集富集分析(GSEA)应用于所有基因的排序列表，其中这些基因按照从DGE分析获得的其LFC值排列。将通过分子特征数据库(Goldenberg等人，2015,Oncotarget 6:22496-512)中的基因本体生物通路集合可获得的基因集用于GSEA分析。进一步分析了来自GSEA分析的两条重要通路，即HALLMARK_P53_PATHWAY和HALLMARK_APOPTOSIS(FDR<0.10)，以使用单样品GSEA(ssGSEA)获得每个样品的单独通路富集得分，其中ssGSEA是使用“gsva”R软件包关于RNAseq FPKM实施的。P值是从在反应者患者组与非反应者患者组之间应用的Mann-Whitney统计检验获得的。
统计分析-本文报告的功效分析和安全性分析包括的所有患者均以10mg/kg剂量水平接受至少一剂戈沙妥珠单抗，无论其入选的是本研究的I期部分还是II期部分，其中本研究包括从2014年9月至2017年6月入选的45例患者。此分析的数据截止日期为2018年9月1日。ORR和CBR是以由Clopper-Pearson方法(Clopper和Pearson，1934,Biometrika 26:404-13)估计的95％置信区间计算的。用Kaplan-Meier方法分析PFS、OS和到事件终点的时间，其中通过Brookmeyer和Crowley方法用log-log变换确定中位数和对应的95％置信区间。使用描述性统计结果来表征AE。将Fischer精确检验应用于反应者与非反应者之间的突变表型和野生型表型的通路相关基因计数矩阵，以鉴定在这两个反应组中的任一组中富集的通路。从Mann-Whitney统计检验获得反应者患者组与非反应者患者组之间的单样品GSEA(ssGSEA)富集得分差异的P值。
结果
四十五例患者(中位年龄：67岁；范围：49岁至90岁)以10mg/kg剂量水平接受至少一剂戈沙妥珠单抗，并且被包括在本分析中。其中17例患者接受过既往CPI治疗，并且其中15例患者接受过既往CPI治疗和基于铂的治疗。患者的人口统计学特征和基线特征示于表1中。患者接受的既往治疗线的中位数为2(范围：1至6)条，包括既往基于铂的化学疗法(93.3％)和既往CPI治疗(37.8％)。大多数患者(45例中有33例，[73％])存在内脏受累，主要是肝转移(n＝15)和肺转移(n＝27)。百分之四十四的患者具有2至3个Bellmunt风险因素(表1)。
表1.患者的人口统计学特征和基线特征
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Figure BDA0003854440460000691
*类别不是相互排斥的。
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卡介苗免疫疗法不被认为是既往疗法。
Figure BDA0003854440460000694
风险因素是ECOG PS>0，存在肝转移，以及血红蛋白<10g/dL。
中位随访持续时间为15.7个月(范围：1个月至39.6个月)。患者接受中位数为8个周期的戈沙妥珠单抗(16剂；范围：1剂至90剂)，且中位治疗持续时间为5.2个月(范围：0.03个月至32.3个月)。
剂量减少出现在40％(18/45)的患者中(这18例患者中的12例仅有一次剂量减少)。9例患者接受治疗超过12个月。39例(87％)患者中断治疗，主要是由于疾病进展(表2)。5例患者在2018年9月的数据截止日期继续接受治疗(3例反应者，1例患者疾病稳定[SD]，另外1例患者在先前记录的CR后的休药期与后续进展之后继续治疗)。到数据截止日期为止，已经报告了28例死亡(在随访期期间有17例)，其中26例是由于疾病进展，1例是由于研究结束后的心肌梗塞，还有1例是由于未知原因所致。
表2.治疗中断原因汇总
Figure BDA0003854440460000692
*29例患者中有2例由于与研究药物无关且与疾病进展相关的AE而中断治疗。
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另外两例患者由于与研究药物无关且与疾病进展相关的AE而中断治疗。
戈沙妥珠单抗的耐受性-最常见的AE为腹泻、恶心、疲劳和中性粒细胞减少症；在≥5％的患者中观察到的≥3级AE还包括低磷血症和发热性中性粒细胞减少症(表3)。将生长因子载体施用于24.4％(11/45)的患者。没有报告周围神经病变或心血管AE为3级或更高级别的病例。11％(5/45)的患者由于被研究者认为可能与药物相关的AE(包括3级腹泻、2级贮袋炎、2级瘙痒/发痒、3级斑状丘疹/瘙痒和3级高血压)而中断治疗。45例患者中有21例(46.7％)发生了一个或多个SAE；在多于一例患者中发生的那些SAE包括发热性中性粒细胞减少症、腹泻和中性粒细胞计数减少(各有2例患者)。未报告导致死亡或治疗相关死亡的AE。
表3.在≥20％的患者中观察到的不良事件，不考虑因果关系(N＝45)
Figure BDA0003854440460000701
*包括中性粒细胞减少症和中性粒细胞计数减少。
戈沙妥珠单抗的整体临床活性以及在患者子组中的临床活性-总体而言，31.1％(14/45)的患者实现了客观缓解(95％CI，18.2％至46.6％；表4)。反应包括2例CR(4.4％)和12例PR(26.7％)。在35.6％(16/45)的患者中观察到SD，22.2％(10/45)的患者出现疾病进展。CBR(包括CR、PR和SD≥6个月)为46.7％(45例患者中有21例)。至客观缓解的中位时间为1.9个月(范围：1.7个月至7.4个月)，并且中位DOR(缓解持续时间)为12.9个月(表4)。
表4.治疗功效汇总(总mUC队列)
Figure BDA0003854440460000711
ORR的子组分析显示，肝转移患者中的缓解率为33.3％(15例患者中有5例)，而存在任何内脏受累的患者中的缓解率为27.3％(33例患者中有9例)(表4)。既往用CPI治疗过的患者(45例患者中有17例)和既往用CPI和铂这两种疗法治疗过的患者(45例患者中有15例)的ORR分别为患者的23.5％(4/17)和26.7％(4/15)。
77.5％的患者实现了目标病变减小(40例患者中有31例进行了至少一次基线后肿瘤评估；图1A)。50％的反应者(7/14)具有持续超过12个月的缓解。在该分析时，3例持续缓解的患者仍在治疗(图1B)，并且在数据截止时5例患者仍在治疗。中位PFS和中位OS分别为7.3个月(95％CI，5.0个月至10.7个月)和16.3个月(95％CI，9.0个月至31.0个月)(图2)。
基因组评估-WES分析和RNAseq分析的结果显示，包括DNA损伤修复基因和细胞凋亡基因在内的内在细胞凋亡信号传导通路(GO:0097193)中的突变在反应者中相比在非反应者中富集(未调整的p＝0.02)。该通路中的几种DNA损伤反应和修复基因(BRCA1、BRCA2、CHEK2、MSH2、MSH6、TP53、CDKN1A)和细胞凋亡基因(BAG6、BRSK2、ERN1、FHIT、HIPK2、LGALS12、ZNF622、AEN、SART1、USP28)在这两个组之间差异突变(图3A)。RNAseq数据分析鉴定了对戈沙妥珠单抗的反应者与对戈沙妥珠单抗的非反应者之间的前几个差异调节基因中的GADD45B、TGFB1、NRG1、WEE1和PPP1R15A基因(图3B)。这些基因在功能上与对伊立替康或其代谢物SN-38的反应相关(Miettinen等人，2009,Anticancer Drugs 20:589-600；Bauer等人，2012,PLoS One 7:e39381；Yang等人，2017,Oncotarget 8:47709-24；Yin等人，2018,Mol Med Rep17:3344-49；Roh等人，2016,J Cancer Res Clin Oncol 142:1705-14)。单样品GSEA分析的结果显示，在对戈沙妥珠单抗的反应者中，细胞凋亡通路(p＝0.04)和p53通路(p＝0.006)中存在差异变化富集(图3C)，这与p53信号传导在介导SN-38的下游细胞毒性作用中所起的作用是一致的(Poele和Joele，1999,Br J Cancer 81:1285-93)。
附录1和附录2中公开了关于基因组生物标志物、等位基因频率和特定突变或其他遗传变异的具体数据。附录1标识了在mUC患者样品中鉴定的特定基因组生物标志物。第1栏列出了其中出现生物标志物的基因、染色体数目、遗传变体的起始位置和结束位置、变体的类型、适当时(例如，SNP)的参考等位基因和肿瘤等位基因、所引起的密码子序列和蛋白质序列的改变，以及肿瘤VAF(变体等位基因频率)。
附录2的A部分将反应者和非反应者有关每个突变基因的突变频率分开，其中基因在第1栏中标识，随后是反应者突变频率、非反应者突变频率，以及在来自每个患者的样品中是存在还是不存在。还指出了遗传变异的具体类型(SNP或插入/缺失)。附录2的B部分列出了检查的各个基因，以及在反应者对非反应者中观察到的生物标志物。附录2的C部分汇总了被分类为对戈沙妥珠单抗的反应者或非反应者的每个样品的P53通路和细胞凋亡通路的GSEA得分。
讨论
在化学疗法和CPI后出现疾病进展的mUC患者的结局较差，且没有获批的治疗选择(Di Lorenzo等人，2015,Medicine(Baltimore)94:e2297；Vlachostergios等人，2018,Bladder Cancer 4:247-59)。为这些患者开发安全有效的治疗方案至关重要，其中ADC代表有前景的治疗形式(Vlachostergios等人，2018,Bladder Cancer 4:247-59；Starodub等人，2015,Clin Cancer Res 21:3870-8；Rosenberg等人，2019,J Clin Oncol 37(增刊7S):377)。我们的研究显示，戈沙妥珠单抗在该过度预治疗的抗性/难治性mUC患者群体中具有显著的临床活性，从而实现31％的客观缓解率，包括在肝转移患者中的33％缓解率。尽管既往CPI暴露的患者体能状态较差且治疗线较多，但是其中23.5％仍实现了客观缓解。总体而言，患者获得持久的临床益处，中位DOR为12.9个月，且50％反应者的缓解持续时间超过12个月，在数据截止时的最长持续缓解时间为29.4个月。尽管接受的既往治疗线的中位数为2条，但是使用戈沙妥珠单抗观察到的中位PFS和OS分别为7.3个月和16.3个月，在数据截止时5例患者继续接受治疗。戈沙妥珠单抗用于mUC的这些早期结果报道的中位OS比在用于mUC患者的类似二线环境中使用其他护理标准治疗或研究性治疗观察到的中位OS(范围：4.3个月至13.8个月)更长(Bellmunt等人，2017,N Eng J Med37:1015-26；Patel等人，2018,Lancet Oncol 19:51-64；Rosenberg等人，2016,Lancet 387:1909-20；Rosenberg等人，2019,J Clin Oncol 37(增刊7S):377；Bellmunt等人，J Clin Oncol 27:4454-61；Bellmunt等人，2013,Ann Oncol 24:1466-72；Siefker-Radtke等人，2018,J Clin Oncol36:4503)。综上所述，这些发现表明戈沙妥珠单抗在抗性/难治性mUC患者中是有效的。
与戈沙妥珠单抗相关联的AE是可预测且可管理的，从而得到低中断率。安全特性与戈沙妥珠单抗在其他癌症中所报道的一致(Starodub等人，2015,Clin Cancer Res 21:3870-8；Ocean等人，2017,Cancer 123:3843-54；Bardia等人，2019,N Engl J Med 380:741-51；Gray等人，2017,Clin Cancer Res 23:5711-19；Heist等人，2017,J Clin Oncol35:2790-97)。严重腹泻是使用伊立替康治疗的重大问题(Rothenberg,1997,Ann Oncol 8:837-55；Beer等人，2008,Clin Genitourin Cancer 6:36-9；Camptosar[药品说明书]NewYork,NY,Pharmacia&Upjohn,2016)，其中伊立替康作为单药疗法施用时报道的≥3级延迟性腹泻事件发生率为31％，并且≥3级早期腹泻事件发生率为8％(Camptosar[药品说明书]New York,NY,Pharmacia&Upjohn,2016)。值得注意的是，本研究中使用戈沙妥珠单抗观察到的3级腹泻发生率较低(9％)，无4级或更高级别的腹泻病例，仅1例因腹泻而中断治疗。尽管Trop-2在正常组织中表达(Trerotola等人，2013,Oncogene32:222-33；Goldenberg等人，2018,Oncotarget 9:28989-29006)，但是戈沙妥珠单抗毒性(包括频繁的骨髓抑制)能够利用给药时间表修改和支持性护理来管理，从而确保相对剂量强度>90％，并且由于AE所导致的治疗中断率较低。事实上，在我们的研究中，并没有由于中性粒细胞减少症导致治疗中断，尽管40％的患者出现剂量减少，却报道了高缓解率。与用戈沙妥珠单抗治疗的其他群体中报道过的结果一致(Bardia等人，2017,J Clin Oncol 35:2141-48；Bardia等人，2019,NEngl J Med 380:741-51；Bardia等人，2018,J Clin Oncol 36(增刊)：1004；Gray等人，2017,Clin Cancer Res 23:5711-19；Heist等人，2017,J Clin Oncol 35:2790-97)，没有3级或更高级别的神经病变或心血管AE的病例。重要的是，我们的研究中未报道治疗相关的死亡事件。
在本研究中，患者子组中的整合基因组和转录组分析显示了对戈沙妥珠单抗的反应者与对戈沙妥珠单抗的非反应者之间DNA损伤反应通路和细胞凋亡通路中的差异体细胞突变和基因表达的独特模式。这与SN-38在诱导DNA损伤和激活p53介导的细胞凋亡中的生物效应一致(Candeil等人，2004,Int J Cancer 109:848-54；Tomicic等人，2013,BiochimBiophys Acta 1835:11-27)。值得注意的是，戈沙妥珠单抗和聚-ADP-核糖聚合酶(PARP)抑制剂的组合在三阴性乳腺癌细胞系和小鼠异种移植物模型中不依赖于BRCA1/2突变状态而导致增强的抗肿瘤活性(Cardillo等人，2017,Clin Cancer Res 23:3405-15)。综上所述，我们的发现为更深入地理解戈沙妥珠单抗的生物效应奠定了基础，并且如果按预期得到验证，还可能对选择最可能受益于治疗的患者具有重要意义。
这项研究的主要优势为，该群体中至少38％的成员作为四线治疗或更晚的治疗线接受戈沙妥珠单抗，包括在CPI治疗后出现进展之后，从而允许评估戈沙妥珠单抗在过度预治疗的患者中的活性。此外，在临床实践中更具代表性的群体中对该群体进行了评价。尽管某些临床子组中的少数患者限制了对来自子组分析的数据的解读，但总体功效数据支持使用戈沙妥珠单抗来治疗转移性尿路上皮癌(mUC)。
总而言之，戈沙妥珠单抗在预先治疗过的治疗抗性/难治性mUC患者(包括过度预治疗的患者)中展示了临床上有意义的活性，包括高缓解率、长缓解持续时间和生存益处，以及可管理的安全特性。正在进行一项国际多中心开放标签II期研究(TROPHY-U-01，NCT03547973)，以进一步评价戈沙妥珠单抗在基于铂的化学疗法方案或基于抗PD-1/PD-L1的免疫疗法失败后在mUC患者中的功效和安全性。
实施例2.用抗Trop-2 ADC戈沙妥珠单抗治疗转移性三阴性乳腺癌
三阴性乳腺癌(TNBC)的特征在于不存在雌激素受体、孕酮受体和HER2表达。TNBC占乳腺癌的大约20％，显示出侵袭性更强的临床病程，以及更高的复发风险和死亡风险。由于不存在激素受体靶标，所以缺乏针对TNBC的适当靶向疗法(Jin等人，2017,Cancer BiolTher 18:369-78)，不过阿替利珠单抗与白蛋白结合型紫杉醇化学疗法的组合最近已被批准用于TNBC的一线疗法。迄今为止，TNBC的主要全身性治疗一直是基于铂的化学疗法，主要使用顺铂和卡铂(Jin等人，2017,Cancer Biol Ther18:369-78)。然而，对这些药剂的抗性或在使用这些药剂后复发很常见。超过75％的BRCA1/2突变乳腺癌显示TNBC表型，已经提出使用由于突变或甲基化导致的BRCA功能丧失所引起的同源重组缺陷(HRD)来预测铂的功效(Jin等人，2017,Cancer Biol Ther 18:369-78)。本研究报告了转移性TNBC患者的I/II期临床试验(NCT01631552)的结果，这些患者既往用至少一种标准的抗癌疗法治疗失败。以下报告的结果证明了戈沙妥珠单抗(一种抗Trop-2 ADC)在过度预治疗的转移性复发/难治性TNBC群体中的安全性和功效。
方法和材料
先前用至少一条既往治疗线治疗失败的复发/难治性TNBC患者入选于单臂多中心试验中(Bardia等人，2019,N Engl J Med 380:741-51)。本研究报告了关于108例已经用至少2条既往治疗线(既往疗法的中位数为3种)治疗失败的患者的信息(Bardia等人，2019,NEngl J Med 380:741-51)。患者在21天周期的第1天和第8天接受10mg/kg起始剂量，重复该给药计划，直到出现疾病进展或不可接受的不良事件。对于严重的治疗相关不良事件，在第一次发生后允许剂量减少25％，在第二次发生后允许剂量减少50％，并且在第三次发生后中断治疗。在这108例患者中，107例是女性，1例是男性，中位年龄为55岁。既往疗法包括用以下药物治疗：紫杉烷类(98％)、蒽环类药物(86％)、铂剂(69％)、吉西他滨(55％)、艾日布林(45％)和检查点抑制剂(17％)。通过基线处的计算机断层摄影(CT)和MRI进行肿瘤分期，从治疗开始直到疾病进展，以8周为间隔随访。
结果
最常见的不良事件包括恶心(67％的患者，6％达到3级)、腹泻(62％，8％达到3级)、呕吐(49％，6％达到3级)、疲劳(55％，8％达到3级)、中性粒细胞减少症(64％，26％达到3级)和贫血(50％，11％达到3级)。观察到仅有的一些4级不良事件是中性粒细胞减少症(16％)、高血糖(1％)和白细胞计数减少(3％)。四例患者在研究过程中死亡。这四例死亡中的每一例都被研究者归因于疾病进展，而非戈沙妥珠单抗的毒性(Bardia等人，2019,NEngl J Med 380:741-51)。三例患者由于不良事件而中断治疗。在数据截止时，这108例患者中的中位随访持续时间为9.7个月。8例患者继续接受治疗，100例已中断治疗，其中86例由于疾病进展而中断治疗。实验室安全值的短暂变化包括血细胞计数减少和生化值的改变，其通常在治疗结束时恢复。
图4A示出的瀑布图展示了根据本地评估的反应的宽度和深度。缓解率(CR+PR)为33.3％，包括2.8％的完全缓解(CR)。临床获益比率(包括疾病稳定至少6个月)为45.5％。
图4B示出了表现出客观缓解的36例患者的缓解开始时间和持续时间的泳道图。至缓解的中位时间为2.0个月，并且中位缓解持续时间为7.7个月。估计患者在6个月时将表现出缓解的概率为59.7％，在12个月时为27.0％。到数据截止日期为止，6例患者的长期缓解时间超过12个月。没有随患者年龄、转移性疾病发作、既往治疗的次数或者内脏转移存在与否的变化观察到对戈沙妥珠单抗的反应的显著差异。在既往用检查点抑制剂疗法治疗失败的患者中，缓解率为44％。中位无进展生存期为5.5个月，并且中位总生存期为13.0个月。
讨论
大多数TNBC患者会在接受一线疗法后进展，并且标准的治疗选择仅限于化学疗法。化学疗法与既往用标准化学疗法治疗失败的转移性TNBC患者的低缓解率(10％至15％)和短PFS(2个月至3个月)相关联。由于缺少正常乳腺组织受体，所以目前还没有TNBC靶向疗法的治疗选择。
戈沙妥珠单抗(SG)是一种抗Trop-2 ADC，其中人源化RS7抗体经由CL2A接头偶联至拓扑异构酶I抑制剂SN-38(伊立替康的代谢物)。据报道，Trop-2在超过85％的乳腺癌肿瘤中表达(Bardia等人，2019,N Engl J Med 380:741-51)。
本研究显示，在过度预治疗的转移性抗性/难治性TNBC群体中，用10mg/kg SG的优化剂量治疗引起33.3％的缓解率，中位持续时间为7.7个月，中位PFS为5.5个月，且中位OS为13.0个月。这些数字明显优于针对TNBC患者的处于二线或更晚治疗线中的当前护理标准，后者仅限于全身性化学疗法。进一步单独地使用或者与一种或多种其他治疗方式组合使用靶向抗Trop-2 ADC，并且使用或不使用诊断测定法来预测哪些患者更可能受益于单一疗法或组合疗法，将进一步提高该治疗方法对这种高度难治性和致死性形式的癌症的功效。
实施例3.用抗Trop-2 ADC治疗mSCLC患者
拓扑替康(一种拓扑异构酶I抑制剂)被批准为对一线含铂方案敏感的患者的二线疗法，但仅有少数新治疗剂已被批准用于治疗转移性小细胞肺癌(mSCLC)(Gray等人，2016,Clin Cancer Res 23:5711-9)。在该实施例中，研究了新型的抗Trop-2 ADC，即戈沙妥珠单抗。既往疗法中位数为2(范围：1至7)种的患者在21天周期的第1天和第8天接受ADC，给予剂量的中位数为10(范围：1至63)剂。≥3级的主要毒性为可管理的中性粒细胞减少症、疲劳和腹泻。尽管施用多达63个重复剂量，但是ADC未引发免疫反应。
43例可评估患者中有49％的患者的肿瘤尺寸相对于基线缩小；客观缓解率(部分缓解)为16％，并且在49％的患者中实现了疾病稳定。基于意向性治疗(N＝53)分析，中位无进展生存期和中位总生存期分别为3.6个月和7.0个月。该ADC在对一线化学疗法具有化学敏感性或化学抗性的患者中具有活性，并且在二线拓扑替康疗法治疗失败的患者中也具有活性(Gray等人，2016,Clin Cancer Res 23:5711-9)。这些数据支持使用戈沙妥珠单抗作为进展期mSCLC的新治疗剂。
方法
符合以下条件的mSCLC患者入选：年龄≥18岁，已经在用于IV期转移性疾病的至少一条既往标准治疗线之后复发或者是用于IV期转移性疾病的至少一条既往标准治疗线难治的，并且具有可通过CT测量的肿瘤。要求他们具有0至1的东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态，并且具有适当的骨髓功能、肝功能和肾功能，以及I期试验中描述的其他资格(Starodub等人，2015,Clin Cancer Res 21:3870-8)。既往治疗必须至少在入选前4周完成。
针对各种不同癌症进行的篮式试验的这一部分的总体目标(ClinicalTrials.gov,NCT01631552)是评价戈沙妥珠单抗在mSCLC患者中的安全性和抗肿瘤活性。在21天周期的第1天和第8天给予8mg/kg或10mg/kg的剂量，可能有偶然事件导致延迟(最多2周)。毒性通过用于血细胞减少、剂量延迟和/或方案中规定的修改(例如，既往剂量的25％)的支持性造血细胞生长因子疗法或者通过标准医疗实践来管理。继续治疗，直到疾病进展、开始替代性抗癌治疗、出现不可接受的毒性，或者撤回知情同意书。
53例mSCLC患者入选(30例女性、23例男性，中位年龄：63岁(范围：44岁至82岁)。从初次诊断到使用戈沙妥珠单抗治疗的中位时间为9.5个月(范围：3个月至53个月)。大多数患者被过度预治疗，既往治疗线的中位数为2(范围：1至7)条。每个人都接受过顺铂或卡铂加上依托泊苷。22例患者(41％)接受了1条既往治疗线，而14例(26％)和17例(32％)分别被给予2种和≥3种既往化学疗法方案。此外，18例(33％)接受拓扑替康和/或伊立替康，9例(16％)接受紫杉烷，5例(9％)接受免疫检查点抑制剂疗法，包括纳武单抗(N＝4)或阿替利珠单抗(N＝1)。
基于对含铂一线治疗的反应持续时间长于或短于3个月，分别有27例(51％)化学敏感性患者和26例(49％)化学抗性患者。大多数患者患有广泛期疾病，转移到多个器官，包括肺(66％)、肝(59％)、淋巴结(76％)、胸(34％)、肾上腺(25％)、骨(23％)和胸膜(6％)。其他疾病部位包括胰腺(N＝4)、脑(N＝2)、皮肤(N＝2)，以及食道壁、卵巢和窦(各1个)。
主要终点是被确认客观缓解的患者的比例，该比例由每个机构的放射学小组或合同规定的本地放射学服务大约每8周评估一次，直到疾病进展。客观缓解通过实体瘤反应评价标准1.1版(RECIST 1.1)评估(Eisenhauer等人，2009,Eur J Cancer 45:228-47)。部分缓解(PR)或完全缓解(CR)需要在初始缓解后的4周至6周内确认。临床获益率(CBR)被定义为客观缓解加上疾病稳定(SD)≥4个月的那些患者。每3个月监测一次生存率，直到死亡或撤回知情同意书。
安全性评价在按时间表的访视期间进行，或者如有必要，更频繁地进行。在施用戈沙妥珠单抗之前和临床指示时，常规检查血细胞计数和血清化学物质。
统计分析-分析中包括的数据来源于2013年11月至2016年6月入选的患者，随访至2017年1月31日。不良事件(AE)的频率和严重程度由MedDRA优选术语和系统器官分类(SOC)10版定义，且严重程度由NCI-CTCAE v4.03评估。评价了接受戈沙妥珠单抗的所有患者的毒性。
方案规定，针对接受≥2剂(1个周期)并且进行了最初8周的CT评估的患者确定客观缓解率(ORR)。根据RECIST 1.1标准定义缓解持续时间，其中具有客观缓解的那些患者的标记时段为从首次缓解证据的时间起直到疾病进展，而疾病稳定持续时间的标记时段为从治疗开始起直到疾病进展。PFS和OS根据从治疗开始起直到确定客观评估进展(PFS)或死亡(OS)的时段来定义。使用MedCalc统计软件16.4.3版(Ostend,Belgium)，通过Kaplan-Meier方法，以95％置信区间(CI)估计缓解持续时间、PFS和OS。
戈沙妥珠单抗及组分的肿瘤Trop-2免疫组织化学和免疫原性-通过IHC对Trop-2的存档肿瘤标本进行染色，并按照之前报告的信息进行解释(Starodub等人，2015,ClinCancer Res 21:3870-8)。阳性需要至少10％的肿瘤细胞被染色，强度评分为1+(弱)、2+(中等)和3+(强)。在基线处然后在每个偶数编号的周期之前采集的血清样品中通过由申办者进行的酶联免疫吸附测定监测对戈沙妥珠单抗、IgG抗体和SN-38的抗体反应(Starodub等人，2015,Clin Cancer Res 21:3870-8)。对于ADC和IgG，测定灵敏度为50ng/mL；对于抗SN-38抗体，测定灵敏度为170ng/mL。
结果
患者-从2013年11月至2016年6月，53例mSCLC患者入选(30例女性、23例男性，中位年龄：63岁(范围：44岁至82岁)。从初次诊断到使用戈沙妥珠单抗治疗的中位时间为9.5个月(范围：3个月至53个月)。大多数患者被过度预治疗，既往治疗线的中位数为2(范围：1至7)条。每个人都接受过顺铂或卡铂加上依托泊苷。22例患者(41％)接受了1条既往治疗线，而14例(26％)和17例(32％)分别被给予2种和≥3种既往化学疗法方案。此外，18例(33％)接受拓扑替康和/或伊立替康，9例(16％)接受紫杉烷，5例(9％)接受免疫检查点抑制剂疗法，包括纳武单抗(N＝4)或阿替利珠单抗(N＝1)。大多数患者患有广泛期疾病，转移到多个器官，包括肺(66％)、肝(59％)、淋巴结(76％)、胸(34％)、肾上腺(25％)、骨(23％)和胸膜(6％)。其他疾病部位包括胰腺(N＝4)、脑(N＝2)、皮肤(N＝2)，以及食道壁、卵巢和窦(各1个)。
治疗暴露、安全性和耐受性-在入选的53例患者中，2016年5月首次治疗的2例在截止日期2017年1月31日继续接受戈沙妥珠单抗治疗。所有其他患者均已中断治疗，并且监测其生存情况。已经施用了超过590剂(在295个周期内)，每例患者的中位数为10(范围：1至63)剂。没有报道输注相关反应。
15例患者的初始剂量以8mg/kg的起始剂量给予；10mg/kg是接下来的38例患者的起始剂量。在这2个剂量组之间，25例患者接受了≥10个剂量(≥5个周期)，2例患者接受了62个剂量和63个剂量(>30个周期)。中位治疗持续时间为2.5个月(范围：1个月至23个月)。中性粒细胞减少症(≥2级)是剂量减少的唯一指征，并且在10mg/kg的剂量水平下，在中位数为2.5(范围：1至9)剂的剂量后在29％(11/38)的患者中报告。以8mg/kg治疗的15例患者中有2例(13％)剂量减少，1例是在2剂后减少，另1例是在41剂(20个周期)后减少。一旦减少，就很少再出现减少。未观察到治疗相关的死亡事件。
在该试验中，10例患者在第一次缓解评估之前脱落；4例接受了1剂，5例接受了2剂，另1例在4剂之后脱落。3例患者在接受1剂或2剂后没有资格进行缓解评价，因为其中1例出现了SCLC和NSCLC的组织学混合，而另外2例在接受第1剂戈沙妥珠单抗后被诊断为试验前脑和/或脊髓转移。根据方案指南，2例在1剂之后报告CTCAE 3级不良事件(中性粒细胞减少症和疲劳)并且未及时恢复而不能施用第2剂的患者中断治疗。4例患者在2剂后退出该研究，2例撤回知情同意书，2例由于2级疲劳而退出。还有1例患者在4次治疗后由于并发多种合并症而离开研究，并且在第一次缓解评估之前突然死亡。
在接受至少一剂戈沙妥珠单抗的53例患者中最频繁报告的AE是恶心、腹泻、疲劳、脱发、中性粒细胞减少症、呕吐和贫血(数据未示出)。34％(18/53)的患者发生了3级或4级中性粒细胞减少症，且只有1例患者患上了发热性中性粒细胞减少症。其他3级或4级不良事件很少，包括疲劳(13％)、腹泻(9％)、贫血(8％)、碱性磷酸酶升高(8％)和低钠血症(8％)。虽然在8mg/kg剂量组中需要剂量减少的患者较少(13％对10mg/kg时的28％)，但10mg/kg的剂量水平同样耐受良好，且在少数患者中具有剂量改变和/或生长因子支持。
功效-如所描述的，在入选的53例mNSCLC患者中，10例在其首次CT缓解评估之前中断治疗，剩下43例患者在接受至少两剂戈沙妥珠单抗和至少一次随访扫描后，进行方案要求的客观缓解评估。图5提供了一系列缓解的图示，包括43例患者的目标病变的直径总和的最佳百分比变化的瀑布图(图5A)、显示达到PR或SD状态的那些患者的缓解持续时间的图(图5B)，以及跟踪PR患者和SD患者随时间推移的缓解变化的图线(图5C)。
43例CT可评估的患者中有21例(49％)经历了肿瘤尺寸相对于基线缩小(图5A)。7例患者确认发生了部分缓解(缩小≥30％)，得到16％的ORR(表5)。这些患者至缓解的中位时间为2.0个月(范围：1.8个月至3.6个月)，且Kaplan-Meier方法估计的中位缓解持续时间为5.7个月(95％CI：3.6，19.9)。7例反应者中有2例在最后一次随访时持续存在缓解(即，患者存活，无疾病进展，并且未开始另选的抗癌治疗)，其中1例从治疗开始起持续缓解7.2+个月，另1例从治疗开始起持续缓解8.7+个月。
表5.SCLC患者对戈沙妥珠单抗(SG)的反应汇总
Figure BDA0003854440460000821
在21例患者(49％)中确定了疾病稳定(SD)，其中6例(14％)最初出现>30％的肿瘤缩小，但在随后的验证性CT中没有维持(PR未确认，或PRu)，其中3例出现≥20％的肿瘤缩小。值得注意的是，10例患者SD≥4个月(由Kaplan-Meier方法推导的中位数＝5.6个月，95％CI：5.2，9.7)，与确认PR组的中位PFS(7.9个月，95％CI：7.6，21.9；P＝0.1620)无显著差异，并且临床获益率(CBR：PR+SD≥4个月)为40％(17/43)。实际上，甚至这10例SD患者的OS与7例确认PR的患者也无显著差异(分别为8.3个月，95％CI：7.5，22.4；对9.2个月，95％CI：6.2，20.9；P＝0.5599)。这表明SD维持适当的持续时间(≥4个月)应当是感兴趣的终点。基于意向性治疗(ITT)(N＝53)，中位PFS为3.6个月(95％CI：2.0，4.3)(图6A)，而中位OS为7.0个月(95％CI：5.5，8.3)，其中17例患者存活，5例失访(1例在1.8个月后，1例在5个月后，还有3例在11.4个月至12.8个月后)(图6B)。
进行了客观缓解评估的43例患者中有13例以8mg/kg的剂量治疗，其中1例PR得到确认(8％)、1例PR未确认，还有3例SD。在10mg/kg组(N＝30)中，6例患者PR得到确认(20％)，还有12例SD，其中5例在一次CT中显示肿瘤缩小>30％(PRu)。CBR为47％(14/30)，表明10mg/kg起始剂量提供了更好的总缓解率。
进行了缓解评估的24例患者被分类为对一线基于铂的化学疗法具有敏感性。4例(17％)实现了确认的PR，9例SD，其中4例的单次扫描显示肿瘤缩小>30％(PRu)。19例患者具有抗性，其中3例(16％)PR得到确认，6例SD(包括2例PRu)。化学敏感性组和化学抗性组的中位PFS分别为3.8个月(95％CI：2.8，6.0)和3.6个月(95％CI：1.8，3.8)，而中位OS分别为8.3个月(95％CI：7.0，13.2)和6.2个月(95％CI：4.0，10.5)(表5)。在化学敏感性组和化学抗性组之间未发现PFS或OS存在显著差异(P值分别为：P＝0.3981和P＝0.3100)。
43例患者中有19例在二线环境中接受了戈沙妥珠单抗，3/19(16％)实现了PR并且7例实现了SD作为最佳缓解状态(后者中有2例在一次CT中发现肿瘤缩小>30％)。在这些患者中观察到的缓解与针对被给予戈沙妥珠单抗作为其三线治疗或更晚的治疗线的患者(N＝24)发现的缓解相同，有4例PR得到确认(16％)和8例SD，其中4例SD患者在一次CT中发现肿瘤缩小>30％。未发现PFS或OS的持续时间存在显著差异(相应地，P＝0.9538，P＝0.6853)。缓解分析汇总于表5中。
在接受使用免疫检查点抑制剂(CPI)的既往治疗的5例患者中，1例经历了未确认的PR(第一次评估时缩小54％，撤回知情同意书，且未进行额外的治疗或评估)；2例实现SD，其中1例肿瘤缩小17％且持续8.7个月，另1例肿瘤尺寸无变化，持续3.7个月；1例出现疾病进展；而第5例患者在接受1个周期的戈沙妥珠单抗后撤回了知情同意书。所有用CPI治疗过的患者在接受戈沙妥珠单抗之前要么无法对CPI作出反应，要么疾病进展，表明这些患者在接受CPI治疗后可以对戈沙妥珠单抗作出反应。
在接受戈沙妥珠单抗作为三线治疗或更晚的治疗线的24例患者中，15例既往已接受过拓扑替康和/或伊立替康，而另外9例从未接受过这些药剂。这两个组的客观缓解相似，且PFS无显著差异(3.8个月对3.7个月；P＝0.7341)。然而，既往接受过拓扑替康治疗且用戈沙妥珠单抗治疗的那些患者的OS显著长于未接受过拓扑替康治疗且用戈沙妥珠单抗治疗的患者(8.8个月，95％CI：6.2，20.9；对5.5个月，95％CI：3.2，8.3；P＝0.0357)。该组中更长的OS可以反映拓扑替康在对铂敏感的患者中的已知活性，因此可以具有更好的长期结果。
肿瘤标本的免疫组织化学(IHC)染色-从29例患者获得存档肿瘤标本，但其中4个标本不适合审查，剩下25个可评估肿瘤，其中92％为阳性，2个(8％)为强(3+)染色，13个(52％)为中等(2+)染色。这些患者中的23例进行了客观缓解评估。该组有5例PR得到确认，2例PR未确认；5例为2+染色，而另外2例为1+(未示出)，表明更高的表达提供更好的缓解。然而，相对于IHC评分评估PFS值和OS值显示无明显趋势(未示出)，并且用Kaplan-Meier方法针对IHC评分为0和1+的组合的患者(N＝10)相比IHC评分为2+和3+的组合的患者(N＝13)得到的PFS和OS估计值指示基于IHC评分无显著差异(PFS，P＝0.2661；OS，P＝0.7186)。
ADC、SN-38或hRS7抗体的免疫原性-在维持治疗甚至长达22个月的患者中没有检测到戈沙妥珠单抗、hRS7抗体或SN-38的中和性抗体。
讨论
SCLC在一线化学疗法后的复发继续被分为两类：抗性复发，其发生在第一次基于铂的疗法的三个月内；和敏感性复发，其发生在治疗后至少3个月后(O'Brien等人，2006,JClin Oncol 24:5441-7；Perez-Soler等人，1996,J Clin Oncol 14:2785-90)。尽管关于复发性SCLC的最佳管理手段仍存在一些不确定性，但拓扑替康(一种与在本文所研究的ADC中使用的SN-38类似的拓扑异构酶-I抑制剂)是被批准用于化学敏感性复发的唯一产品，这是众多试验所支持的(O'Brien等人，2006,J Clin Oncol 24:5441-7；Horita等人，2015,SciRep 5:15437)。然而，如在14篇文章中报道的对超过1000例患者的荟萃分析所证明的那样，拓扑替康的功效和不良事件在先前的研究中有相当大的变化，拓扑替康在化学抗性一线患者中的客观缓解率为5％，而在化学敏感性患者中的客观缓解率为17％(Horita等人，2015,Sci Rep 5:15437)。≥3级的中性粒细胞减少症、血小板减少症和贫血分别在69％、1％和24％的患者中出现，并且大约2％的患者死于该化学疗法(Horita等人，2015,Sci Rep 5:15437)。因此，拓扑替康在对基于铂的化学疗法显示出敏感性之后复发的患者的该二线环境中表现出一定的前景，但其血液毒性相当大。然而，即使这个结论最近也受到了Lara等人(2015,J Thorac Oncol 10:110-5)的质疑，Lara等人断言铂敏感性与用拓扑替康治疗后的PFS和OS改善没有很强的相关性，而铂敏感性是目前批准的拓扑替康适应症。
正是在这种环境中，在中位数为2(范围：1至7)种的既往疗法之后，此处在广泛性进展期疾病患者(IV期)中用戈沙妥珠单抗报告的结果带来了希望。根据RECIST 1.1，49％的患者显示肿瘤测量值相对于基线减小，ORR为16％，且中位缓解持续时间为5.7个月(95％CI：3.6，19.9)。在35％的患者中发现疾病稳定，其中这些SD患者中的14％出现肿瘤缩小>30％作为最佳缓解状态，不过该状态在第二次扫描中没有维持。≥4个月时的临床获益率为40％。中位PFS和OS分别是3.6个月和7.0个月。有趣的是，10例SD患者的中位OS为8.3个月(95％CI：7.5，22.4)，PR患者的中位OS为9.2个月(95％CI：6.2，20.9)，两者并无统计学差异(P＝0.5599)。在接受10mg/kg作为起始剂量的组中(N＝30)，6例患者(20％)中确认客观缓解，另外5例患者在单次CT中显示肿瘤缩小≥30％(PRu)。而且，在10mg/kg的剂量下，该组的临床获益率为47％。这支持采用10mg/kg作为优选剂量。还值得注意的是，在需要对患者进行选择时，缺少基于肿瘤Trop-2的免疫组织化学染色选择患者的手段，尽管建议是更强的染色与更好的缓解相关联，但在IHC评分方面并未发现PFS或OS的显著差异。
如上文所提到的，在SD>4个月或PR的患者之间，PFS和OS没有显著差异。在大多数ORR评估中通常不考虑PR未确认(即，在一次CT中肿瘤缩小>30％)或存在SD的患者。然而，此处的结果表明，确认PR或SD持续超过4个月的患者之间的缓解持续时间没有差异。实际上，对个体患者有关PR或SD的缓解情况(特别是当SD持续≥4个月时，这是确认PR的类似时间范围)的动态跟踪表明，这两组的临床益处是保持低于基线肿瘤尺寸数月的时间。尽管确认PR的患者的PFS有趋势比SD持续≥4个月的患者组更长(P＝0.1620)，但是这两组的OS却无显著差异(P＝0.5599)。因此，虽然在该初始分析中患者的数量相对较少，但是数据表明，应当更多地考虑疾病稳定，当达到适当的持续时间时作为临床活性的重要指标，类似于针对接受免疫检查点抑制剂的患者的随访。
基于先前的化学敏感性(N＝24)或化学抗性(N＝19)来评价患者，结果表明，在使用戈沙妥珠单抗治疗时无缓解差异(表5)。在一线治疗中具有化学敏感性的患者的PFS和OS结果为3.8个月和8.3个月，与之相比，化学抗性组的PFS和OS分别为3.6个月和6.2个月。由于没有统计学差异，所以看起来戈沙妥珠单抗能够在二线疗法或更晚的治疗线中施用于患者，而不管这些患者对一线化学疗法是具有化学敏感性还是化学抗性。这与拓扑替康不同，仅指出将拓扑替康用于对一线顺铂和依托泊苷化学疗法的反应持续时间≥3个月的那些SCLC患者(O'Brien等人，2006,J Clin Oncol 24:5441-7；Perez-Soler等人，1996,J ClinOncol 14:2785-90)。在Perez-Solar等人(1996,J Clin Oncol 14:2785-90)所研究的28例患者中，11％存在PR，中位生存期为5个月，并且一年生存率为3.5％。
尽管拓扑替康和SN-38都是DNA拓扑异构酶I的抑制剂，当通过稳定DNA复合物来合成DNA时，DNA拓扑异构酶I是造成超螺旋DNA螺旋松弛的原因，从而导致单链DNA断裂的累积(Takimoto和Arbuck，1966,Camptothecins.载于Chabner和Long(编辑)，CancerChemotherapy and Biotherapy.第二版中，Philadelphia:Lippincott-Raven；第463至第484页)，但是戈沙妥珠单抗在拓扑替康治疗后复发的患者中显示活性。因此，拓扑替康抗性或复发可能不是施用戈沙妥珠单抗的禁忌症，并且由于戈沙妥珠单抗在对顺铂和依托泊苷具有化学抗性的患者中具有类似的活性，所以在转移性SCLC患者(不考虑化学敏感性状态)中作为二线治疗剂可能有特别的价值。
自从批准拓扑替康用于二线环境以来的二十年中，一直没有新的药剂获得许可用于转移性SCLC的二线治疗或更晚的治疗。然而，最近关于T细胞检查点受体程序性细胞死亡蛋白(PD-1)和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)的抑制剂出现了一些进展(Antonia等人，2016,Lancet Oncol 17:883-95)。这些作者在复发性SCLC患者中进行了纳武单抗与CTLA-4抗体伊匹单抗结合或不与之结合的I-II期试验。单独的纳武单抗获得了10％的缓解率，而该组合的缓解率为19％至23％，且疾病控制率为32％(Antonia等人，2016,LancetOncol 17:883-95)。然而，最近一项在SCLC中将伊匹单抗与化学疗法结合或不与化学疗法结合的研究未能证实这些结果(Reck等人，2016,J Clin Oncol 34:3740-48)。由于我们观察到戈沙妥珠单抗可能在用免疫检查点抑制剂治疗失败的患者中具有活性，所以我们对这一点进一步作出了研究，尤其是因为在其他癌症类型的患者中，在用免疫检查点抑制剂治疗后有证据显示这类缓解(Bardia等人，2017,J Clin Oncol 35:2141-48；Faltas等人，2016,Clin Genitourin Cancer 14:e75-9；Gray等人，2017,Clin Cancer Res 23:5711-19；Heist等人，2017,J Clin Oncol35:2790-97；Tagawa等人，2017,J Clin Oncol 35:abstract 327；Han等人，2018,Gynecol Oncol Rep 25:37-40)。
尽管最近在免疫疗法中取得了进展并且鉴定了其他新型的SCLC靶标(Rudin等人，2017,Lancet Oncol 18:42-51)，但SCLC仍然是一种致死性疾病，特别是在对一线疗法具有化学抗性的群体中。戈沙妥珠单抗在过度预治疗的进展期复发IV期SCLC患者中的当前结果表明，这种抗Trop-2ADC可以在拓扑替康之前或之后用于针对化学敏感性和化学抗性这两类SCLC患者的疗法中。
实施例4.在多种上皮癌中用戈沙妥珠单抗进行临床试验
本实施例报道了来自I期临床试验和进行中的II期扩展的结果，其中II期扩展使用戈沙妥珠单抗，这是内化、人源化的hRS7抗Trop-2抗体通过pH敏感性接头与SN-38偶联所得的ADC(平均药物-抗体比＝7.6)。Trop-2是以高密度(约1×105)、高频率和高特异性由许多人类癌症表达而在正常组织中表达有限的I型跨膜钙转导蛋白质。在携带Capan-1人胰腺肿瘤异种移植物的裸鼠中的临床前研究已经揭示，戈沙妥珠单抗能够向肿瘤递送是来源于最大耐受剂量的伊立替康疗法的120倍之多的SN-38。
本实施例报道了已经用多种既往疗法(一些包括拓扑异构酶-I/II抑制药物)治疗失败的25例患者(pt)的初始I期试验，并且进行中的II期扩展现在报道了关于患有以下癌症的69例pt的信息：包括结肠直肠癌(CRC)、小细胞肺癌和非小细胞肺癌(分别是SCLC、NSCLC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、胰腺癌(PDC)、食道癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、头/颈癌和肝细胞癌。在转移性癌症的标准治疗方案后，患者是难治的或复发。
如下文详细论述的，Trop-2在血清中未检测到，但在大多数存档肿瘤中强烈表达(≥2+)。在3+3试验设计中，戈沙妥珠单抗在重复的21天周期中的第1天和第8天给予，从8mg/kg/剂开始，然后在剂量限制性中性粒细胞减少症出现之前以12mg/kg和18mg/kg给予。为了优化累积治疗且将延迟降至最低，II期试验把重点放在8mg/kg和10mg/kg(n分别等于30和14)。此时，在49例报告相关AE的患者中，≥G3的中性粒细胞减少症发生在28％的患者中(4％G4)。这些患者最初最常见的非血液毒性是疲劳(55％；≥G3＝9％)、恶心(53％；≥G3＝0％)、腹泻(47％；≥G3＝9％)、脱发(40％)和呕吐(32％；≥G3＝2％)。在6例患者中发现了纯合UGT1A1*28/*28，其中2例具有更严重的血液毒性和GI毒性。在I期和延展期，目前有48例pt(不包括PDC)可通过RECIST/CT评估最佳缓解状态。7例(15％)患者出现部分缓解(PR)，包括CRC患者(N＝1)、TNBC患者(N＝2)、SCLC患者(N＝2)、NSCLC患者(N＝1)和食道癌患者(N＝1)；另外27例患者(56％)疾病稳定(SD)，共计38例患者(79％)出现疾病缓解；13例CT可评估的PDC患者中有8例(62％)出现SD，中位进展时间(TTP)为12.7周，与之相比，其最后一次既往治疗的TTP为8.0周。剩余48例pt的TTP为12.6+周(范围：6.0周至51.4周)。血浆CEA和CA19-9与缓解相关。尽管给药数月，却未检测到抗hRS7抗体或抗SN-38抗体。3天内偶联物从血清中清除，这与体内动物研究的结果一致，其中每天释放50％的SN-38，血清中>95％的SN-38与非葡萄糖醛酸化形式的IgG结合，并且浓度是被给予伊立替康的患者中报道的SN-38的100倍之多。这些结果表明，抗Trop-2 ADC在许多转移性实体癌中具有治疗活性，且腹泻和中性粒细胞减少症可管理。
药代动力学
使用两种ELISA方法来测量IgG(用抗hRS7独特型抗体捕获)和完整偶联物(用抗SN-38IgG捕获/用具有抗hRS7独特型抗体的探针捕获)的清除。通过HPLC测量了SN-38。总戈沙妥珠单抗级分(完整偶联物)比IgG(未示出)清除得更快，反映了SN-38从偶联物中已知的逐渐释放。SN-38(未结合的和总计)的HPLC测定显示，血清中>95％的SN-38与IgG结合。低浓度的SN-38G表明，与IgG结合的SN-38被保护免于葡萄糖醛酸化。将偶联物的ELISA与SN-38的HPLC进行比较，结果揭示两者重叠，表明ELISA是监测SN-38清除的替代手段。
临床试验状态
共报告了69例患有各种不同转移性癌症且既往疗法的中位数为3种的患者(包括I期的25例患者)。8例患者出现临床进展，在CT评估前退出研究。单独报告了13例CT可评估的胰腺癌患者。PDC患者的中位TTP(进展时间)为11.9周(范围：2周至21.4周)，与之相比，最后一次既往治疗的中位TTP为8周。
共48例患有各种不同癌症的患者至少进行了1次CT评估，从中确定最佳缓解状态和进展时间(TTP)。为了汇总最佳缓解状态数据，在8例可评估的TNBC(三阴性乳腺癌)患者中，有2例PR(部分缓解)、4例SD(疾病稳定)和2例PD(疾病进展)，总缓解率[PR+SD]为6/8(75％)。对于SCLC(小细胞肺癌)，在4例可评估患者中，有2例PR、0例SD和2例PD，总缓解率为2/4(50％)。对于CRC(结肠直肠癌)，在18例可评估患者中，有1例PR、11例SD和6例PD，总缓解率为12/18(67％)。对于食道癌，在4例可评估患者中，有1例PR、2例SD和1例PD，总缓解率为3/4(75％)。对于NSCLC(非小细胞肺癌)，在5例可评估患者中，有1例PR、3例SD和1例PD，总缓解率为4/5(80％)。在所有经治疗的患者中，对于48例可评估患者，有7例PR、27例SD和14例PD，总缓解率为34/48(71％)。这些结果证明，抗TROP-2ADC(hRS7-SN-38)在人类患者中显示了针对范围广泛的实体瘤的显著临床功效。
报告的治疗副作用(不良事件)汇总于表6中。从表6的数据可以明显看出，在显示可接受的低水平不良副作用的ADC剂量下实现了戈沙妥珠单抗的治疗功效。
表6.
Figure BDA0003854440460000901
通过CT数据(未示出)确认了对抗Trop-2 ADC的示例性部分缓解。作为CRC的示例性PR，一例首次诊断为CRC的62岁女性接受了初次半结肠切除术。四个月后，该患者因肝转移接受了肝切除术，并接受了7个月的FOLFOX治疗和1个月的5FU治疗。该患者主要在肝脏中呈现多处病变(通过免疫组织学确定存在3+Trop-2)，在初始诊断后约1年以8mg/kg的起始剂量加入戈沙妥珠单抗试验。在第一次CT评估时，实现了PR，目标病变减少37％(未示出)。患者继续治疗，在治疗10个月后实现了目标病变的最大减少，即减少65％(未显示)，CEA从781ng/mL减少到26.5ng/mL，3个月后疾病进展。
一例诊断为IIIB期NSCLC(鳞状细胞癌)的65岁男性作为NSCLC的PR示例性示例。卡铂/依托泊苷(3个月)与7000cGy XRT共同起作用的初始治疗导致持续10个月的缓解。然后，该患者开始接受埃罗替尼维持治疗，继续该治疗，直到在除接受腰椎椎板切除术之外，还考虑进行戈沙妥珠单抗试验。该患者在用埃罗替尼治疗5个月后接受了第一剂戈沙妥珠单抗，此时在右肺中出现5.6cm病变，伴有大量胸腔积液。两个月后，当第一次CT显示原发目标病变缩小至3.2cm(未示出)时，他刚接受完第6剂。
一例诊断为低分化SCLC的65岁女性作为SCLC患者的PR示例性示例。在接受卡铂/依托泊苷(Topo-II抑制剂)2个月后结束治疗，未缓解，随后接受拓扑替康(Topo-I抑制剂)，2个月后结束治疗，也未缓解，于是该患者接受了局部XRT(3000cGy)，1个月后结束治疗。然而，到下个月时，疾病继续进展。该患者在接下来的一个月内开始用戈沙妥珠单抗治疗(12mg/kg；减少至6.8mg/kg；Trop-2表达3+)，在使用戈沙妥珠单抗两个月后，目标病变减小38％，包括出现的主要肺部病变显著减小(未示出)。患者在接受12剂后的3个月后出现疾病进展。
这些结果有重大意义，因为它们证明抗Trop-2 ADC是有效的，甚至在多次既往疗法后治疗失败或出现进展的患者中也是如此。
综上所述，在所使用的剂量下，主要毒性是可管理的中性粒细胞减少症，毒性很少达到3级。戈沙妥珠单抗在三阴性乳腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、结肠直肠癌和食道癌的复发/难治性患者(包括具有拓扑异构酶-I抑制剂疗法的既往复发史的患者)中显示出活性证据(PR和持久SD)。这些结果示出了抗Trop-2 ADC在对现有疗法具有抗性的范围广泛的癌症中的功效。
实施例5.循环肿瘤细胞(CTC)和cfDNA的收集和分析
从转移性TNBC患者的血液中收集CTC细胞。将7.5ml全血样品收集到CELLSAVETM保存管中，以便用
Figure BDA0003854440460000911
CTC系统(Janssen Diagnostics)捕获CTC。将20ml全血样品收集到EDTA管中，然后加工成血浆用于获得cfDNA，如Page等人(2013,PLoS One 8:e77963)中所公开的那样。根据制造商的说明书，使用
Figure BDA0003854440460000921
循环核酸试剂盒(Qiagen)从3ml血浆中分离出cfDNA。使用DEPARRAYTM系统分离单CTC，并且对CTC核酸进行AMPLI1TM全基因组扩增。
定制AMPLISEQTM检测组套(Fisher)被设计成筛选以下基因中的突变：53BP1、AKT1、AKT2、AKT3、APE1、ATM、ATR、BARD1、BAP1、BLM、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRIP1(FANCJ)、CCND1、CCNE1、CEACAM5、CDKN1、CDK12、CHEK1、CHEK2、CK-19、CSA、CSB、DCLRE1C、DNA2、DSS1、EEPD1、EFHD1、EpCAM、ERCC1、ESR1、EXO1、FAAP24、FANC1、FANCA、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCM、HER2、HMBS、HR23B、KRT19、KU70、KU80、hMAM、MAGEA1、MAGEA3、MAPK、MGP、MLH1、MRE11、MRN、MSH2、MSH3、MSH6、MUC16、NBM、NBS1、NER、NF-κB、P53、PALB2、PARP1、PARP2、PIK3CA、PMS2、PTEN、RAD23B、RAD50、RAD51、RAD51AP1、RAD51C、RAD51D、RAD52、RAD54、RAF、K-ras、H-ras、N-ras、RBBP8、c-myc、RIF1、RPA1、SCGB2A2、SLFN11、SLX1、SLX4、TMPRSS4、TP53、TROP-2、USP11、VEGF、WEE1、WRN、XAB2、XLF、XPA、XPC、XPD、XPF、XPG、XRCC4和XRCC7。使用10ngWGA DNA或8ng cfDNA建立AMPLISEQTM反应。使用ION PERSONAL GENOME
Figure BDA0003854440460000922
(ThermoFisher)在Ion 316TM芯片(ThermoFisher)上进行下一代测序，如Guttery等人(2015,Clin Chem61:974-82)中所述。使用Bio-Rad QX200TM液滴数字PCR系统，通过液滴数字PCR验证所选择的突变，如Hindson等人(2011,Anal Chem 83:8604-10)中所述。使用RS7抗Trop-2抗体，通过ELISA测定CTC中的Trop-2表达水平。
用奥拉帕尼(每天两次，每次200mg至300mg，具体取决于患者的计算的肌酸酐清除率)和戈沙妥珠单抗(在每个21天周期的第1天和第8天以10mg/kg静脉内施用)的组合疗法治疗患者21天。
将患者分为对该组合疗法的反应者(CR+PR+SD>6个月)或对该组合疗法的非反应者。对该组合疗法的敏感性与来自CTC和cfDNA的生物标志物数据以及Trop-2表达的相关性表明，对使用奥拉帕尼和SG的组合疗法的敏感性与Trop-2表达以及与BRCA1、BRCA2、PTEN、ERCC1和ATM中的突变正相关。这些生物标志物用作未来使用PARP抑制剂和戈沙妥珠单抗的组合进行治疗的正向指标。
实施例6.用戈沙妥珠单抗加上普瑞沙替尼(LY2606368)(一种CHK1抑制剂)治疗复 发转移性卵巢癌
一例66岁BRCA1突变阳性的FIGO IV期卵巢癌女性接受了初次手术，并在术后接受了紫杉醇和卡铂(TC)。在20个月无铂间期后，CT确认腹膜中CA125水平升高并且复发。用TC再治疗后，对卡铂发生超敏反应，于是将卡铂更换为奈达铂。通过CT确认完全缓解。8个月PFI后，确认血清CA125水平升高，并且腹膜和肝脏中复发。
然后给予该患者抗Trop-2 ADC(戈沙妥珠单抗)加上普瑞沙替尼(一种CHK1抑制剂)的组合疗法。在28天周期的第1天和第8天以10mg/kg施用戈沙妥珠单抗，而在该28天周期的每14天以105mg/m2静脉内施用普瑞沙替尼。除了短暂的2级中性粒细胞减少症和初期一定程度的腹泻外，该患者对此疗法耐受良好，在休息2个月后重复该疗法，再进行一个疗程的治疗。放射学检查表明，根据RECIST标准该患者出现部分缓解，因为指数病变的直径总和减小了45％。该患者的一般状况也得到改善，恢复到与生病之前几乎相同的活动水平。
实施例7.Trop-2在正常组织对癌组织中的细胞表面表达
通过免疫组织化学(IHC)在一系列正常组织样品和相应的癌组织中测定了Trop-2的表达和定位。与相应的癌组织相比，Trop-2通常在较小比例的正常组织样品中以较弱的IHC染色强度表达(表7)。在肿瘤细胞中，Trop-2过表达几乎完全是膜性的。然而，在相关的正常组织中，膜性Trop-2表达通常较弱，或者未观察到。
表7.正常组织对癌组织中的Trop-2表达
Figure BDA0003854440460000931
Figure BDA0003854440460000941
1.Bignotti E等人，Eur J Cancer.2010；46:944-953.2.Ohmachi T等人，ClinCancer Res.2006；12:3057-3063.3.Mühlmann G等人，J Clin Pathol.2009；62:152-158.4.Fong D等人，Mod Pathol.2008；21:186-191.5.Fong D等人，Br J Cancer.2008；99:1290-1295.
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根据前面的描述，本领域技术人员可以容易地确定本发明的本质特征，并且在不背离本发明的实质和范围的情况下，可以对本发明作出各种变化和修改，以使本发明适应各种用途和条件，而无需过度实验。本文引用的所有专利、专利申请和出版物均以引用方式并入本文。
WCM ID、Hugo符号、Chr、起始位置、结束位置、变体分类、变体类型、参考等位基因、肿瘤等位基因、密码子改变、蛋白质改变、样品号(肿瘤VAF)
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Figure BDA0003854440460000961
Figure BDA0003854440460000971
突变基因，反应者突变频率，非反应者突变频率，WCM1053、WCM1298、WCM386、WCM499、WCM561、WCM761、WCM784、WCM88、WCM1384、WCM1399、WCM1533、WCM175、WCM748、WCM923
Figure BDA0003854440460000981
缓解，反应者，反应者，非反应者，反应者，反应者，反应者，反应者，反应者，反应者，非反应者，非反应者，非反应者，非反应者，非反应者，非反应者，非反应者，反应者位置，原发，转移，转移，转移，转移，转移，转移，转移，转移，原发，转移，转移，转移，原发，转移，转移，转移
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Figure BDA0003854440460001231
Figure BDA0003854440460001241
Figure BDA0003854440460001251
Figure BDA0003854440460001261
Figure BDA0003854440460001271
Figure BDA0003854440460001281
Figure BDA0003854440460001291
Figure BDA0003854440460001301
Figure BDA0003854440460001311
Figure BDA0003854440460001321
Figure BDA0003854440460001331
Figure BDA0003854440460001341
Figure BDA0003854440460001351
Figure BDA0003854440460001361
Figure BDA0003854440460001371
Figure BDA0003854440460001381
Figure BDA0003854440460001391
Figure BDA0003854440460001401
Figure BDA0003854440460001411
Figure BDA0003854440460001421
序列表
<110> 免疫医疗公司
<120> 用于戈沙妥珠单抗疗法的生物标志物
<130> IMM376-WO-PCT
<140>
<141>
<150> 62/992,728
<151> 2020-03-20
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成的肽
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<223> 人工序列描述: 合成的肽
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<223> 人工序列描述：合成的肽
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Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10

Claims (90)

1.一种治疗表达Trop-2的癌症的方法，包括：
a)测定来自患有表达Trop-2的癌症的人类受试者的样品中一种或多种癌症生物标志物的存在；
b)检测与对抗Trop-2抗体-药物偶联物(ADC)的敏感性相关联的一种或多种生物标志物；以及
c)用包含与拓扑异构酶I抑制剂偶联的抗Trop-2抗体的抗Trop-2ADC治疗所述受试者。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括：
d)检测与对使用抗Trop-2 ADC和DDR抑制剂的组合疗法的敏感性相关联的一种或多种生物标志物；以及
e)用抗Trop-2 ADC和DDR(DNA损伤修复)抑制剂的组合治疗所述受试者。
3.一种选择将用抗Trop-2抗体-药物偶联物(ADC)治疗的患者的方法，包括：
a)分析来自人类癌症患者的样品中一种或多种癌症生物标志物的存在；
b)检测与对抗Trop-2 ADC的敏感性或者所述抗Trop-2 ADC的毒性相关联的一种或多种生物标志物；
c)基于所述一种或多种生物标志物的存在，选择将用抗Trop-2ADC治疗的患者；以及
d)用抗Trop-2 ADC治疗所选择的患者。
4.根据权利要求3所述的方法，还包括：
e)基于所述一种或多种生物标志物的存在，选择将用组合疗法治疗的患者；以及
f)用抗Trop-2 ADC和DDR抑制剂的组合治疗所述患者。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中先将抗Trop-2 ADC作为新辅助疗法施用于所述患者，再施用至少另外一种抗癌疗法。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，还包括：
e)监测所述患者中一种或多种生物标志物的存在；以及
f)确定所述癌症对所述治疗的响应。
7.根据权利要求6所述的方法，还包括基于生物标志物分析监测所述患者的残留疾病或复发。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的方法，还包括基于生物标志物分析确定疾病结果或进展的预后。
9.根据权利要求3至8中任一项所述的方法，还包括基于生物标志物分析为所述患者选择优化的个体治疗。
10.根据权利要求3至9中任一项所述的方法，还包括基于生物标志物分析对所述癌症进行分期。
11.根据权利要求3至10中任一项所述的方法，还包括基于所述生物标志物分析对初始治疗的患者群体进行分层。
12.根据权利要求3至11中任一项所述的方法，还包括基于生物标志物分析推荐支持性疗法以改善ADC治疗的副作用。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述样品是来自实体瘤的活检样品。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述样品是液体活检样品。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述样品包括cfDNA、ctDNA或循环肿瘤细胞(CTC)。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述样品包含CTC，并且分析所述CTC中一种或多种癌症生物标志物的存在。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述生物标志物是DNA损伤修复(DDR)基因或细胞凋亡基因中的遗传标志物。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述基因选自由以下项组成的组：BRCA1、BRCA2、CHEK2、MSH2、MSH6、TP53、CDKN1A、BAG6、BRSK2、ERN1、FHIT、HIPK2、LGALS12、ZNF622、AEN、SART1、USP28、GADD45B、TGFB1、NDRG1、WEE1、PPP1R15A、MYBBP1A、SIRT1、ABL1、HRAS、ZNF385B、POLR2K和DDB2。
19.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述生物标志物包括以下项或由以下项组成：BRCA1、BRCA2、CHEK2、MSH2、MSH6、TP53、CDKN1A、BAG6、BRSK2、ERN1、FHIT、HIPK2、LGALS12、ZNF622、AEN、SART1、USP28、GADD45B、TGFB1、NDRG1、WEE1、PPP1R15A、MYBBP1A、SIRT1、ABL1、HRAS、ZNF385B、POLR2K和DDB2。
20.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述生物标志物包括以下项或由以下项组成：AEN、MSH2、MYBBP1A、SART1、SIRT1、USP28、CDKN1A、ABL1、TP53、BAG6、BRCA1、BRCA2、BRSK2、CHEK2、ERN1、FHIT、HIPK2、HRAS、LGALS12、MSH6、ZNF385B和ZNF622。
21.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述生物标志物包括以下项或由以下项组成：BRCA1、BRCA2、CHEK2、MSH2、MSH6、TP53、CDKN1A、BAG6、BRSK2、ERN1、FHIT、HIPK2、LGALS12、ZNF622、AEN、SART1和USP28。
22.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述生物标志物包括以下项或由以下项组成：POLR2K、DDB2、GADD45B、WEE1、TGFB1、NDRG1和PPP1R15A。
23.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述生物标志物包括以下项或由以下项组成：GADD45B、TGFB1、NRG1、WEE1和PPP1R15A。
24.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述生物标志物包括以下项或由以下项组成：BRCA1、BRCA2、CHEK2、MSH2、MSH6、TP53、CDKN1A、BAG6、BRSK2、ERN1、FHIT、HIPK2、LGALS12、ZNF622、AEN、SART1、USP28、GADD45B、TGFB1、NRG1、WEE1和PPP1R15A。
25.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述基因选自由以下项组成的组：BRCA1、BRCA2、PTEN、ERCC1和ATM。
26.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述生物标志物包括以下项或由以下项组成：BRCA1、BRCA2、PTEN、ERCC1和ATM。
27.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述生物标志物是引起下列取代突变的单核苷酸多态性，所述取代突变选自由以下项组成的组：ABL1中的E155K、ABL1中的G706S、AEN中的V172L、BAG6中的R279Q、BRCA1中的P1020Q、BRCA1中的E255K、BRCA2中的L2518V、BRSK2中的T656A、CDKN1A中的M1V、CHECK2中的A377D、ERN1中的G771S、FHIT中的R46S、HIPK2中的E457Q、HRAS中的G12V、LGALS12中的A278V、MSH2中的N127S、MSH6中的S625F、MYBBP1A中的H680Y、SART1中的R373Q、SIRT1中的E113Q、TP53中的*394S、TP53中的R282G、TP53中的T377P、TP53中的E271K、TP53中的Y220C、TP53中的E180*、USP28中的I987L、ZNF385B中的R370Q、以及ZNF622中的A437E。
28.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述生物标志物是引起下列取代的多种单核苷酸多态性，所述取代包括以下项或由以下项组成：ABL1中的E155K、ABL1中的G706S、AEN中的V172L、BAG6中的R279Q、BRCA1中的P1020Q、BRCA1中的E255K、BRCA2中的L2518V、BRSK2中的T656A、CDKN1A中的M1V、CHECK2中的A377D、ERN1中的G771S、FHIT中的R46S、HIPK2中的E457Q、HRAS中的G12V、LGALS12中的A278V、MSH2中的N127S、MSH6中的S625F、MYBBP1A中的H680Y、SART1中的R373Q、SIRT1中的E113Q、TP53中的*394S、TP53中的R282G、TP53中的T377P、TP53中的E271K、TP53中的Y220C、TP53中的E180*、USP28中的I987L、ZNF385B中的R370Q、以及ZNF622中的A437E。
29.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述生物标志物是引起下列取代的多种单核苷酸多态性，所述取代包括以下项或由以下项组成：AEN中的V172L、BAG6中的R279Q、BRCA1中的P1020Q、BRCA1中的E255K、BRCA2中的L2518V、BRSK2中的T656A、CDKN1A中的M1V、CHECK2中的A377D、ERN1中的G771S、FHIT中的R46S、HIPK2中的E457Q、MSH2中的N127S、MSH6中的S625F、SART1中的R373Q、TP53中的*394S、TP53中的R282G、TP53中的T377P、TP53中的E271K、TP53中的Y220C、TP53中的E180*、以及USP28中的I987L。
30.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述生物标志物是选自由以下项组成的组的移码突变：BAG6中的K1110fs、CDKN1A中的R32fs、CDKN1A中的DC33fs、以及CDKN1A中的EG60fs。
31.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述生物标志物是包括以下项或由以下项组成的多种移码突变：BAG6中的K1110fs、CDKN1A中的R32fs、CDKN1A中的DC33fs、以及CDKN1A中的EG60fs。
32.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述生物标志物是与相应的正常组织相比，所述癌症中的基因表达增加或减少，所述基因选自由以下项组成的组：POLR2K、DDB2、GADD45B、WEE1、TGFB1、NDRG1和PPP1R15A。
33.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述生物标志物是与相应的正常组织相比，所述癌症中的基因表达的多个增加或减少，所述基因包括以下项或由以下项组成：POLR2K、DDB2、GADD45B、WEE1、TGFB1、NDRG1和PPP1R15A。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述生物标志物选自由以下项组成的组：突变、插入、缺失、染色体重排、SNP(单核苷酸多态性)、DNA甲基化、基因扩增、RNA剪接变体、miRNA、基因表达增加、基因表达减少、蛋白质磷酸化和蛋白质去磷酸化。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述样品测定法包括DNA或RNA的下一代测序。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述拓扑异构酶I抑制剂是SN-38或DxD。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中所述抗Trop-2 ADC选自由以下项组成的组：戈沙妥珠单抗和DS-1062。
38.根据权利要求2至37中任一项所述的方法，其中所述DDR抑制剂是以下物质的抑制剂：53BP1、APE1、Artemis、ATM、ATR、ATRIP、BAP1、BARD1、BLM、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDC2、CDC25A、CDC25C、CDK1、CDK12、CHK1、CHK2、CSA、CSB、CtIP、细胞周期蛋白B、Dna2、DNA-PK、EEPD1、EME1、ERCC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、Exo1、FAAP24、FANC1、FANCM、FAND2、HR23B、HUS1、KU70、KU80、Lig III、连接酶IV、Mdm2、MLH1、MRE11、MSH2、MSH3、MSH6、MUS81、MutSα、MutSβ、NBS1、NER、p21、p53、PALB2、PARP、PMS2、Polμ、Polβ、Polδ、Polε、Polκ、Polλ、PTEN、RAD1、RAD17、RAD23B、RAD50、RAD51、RAD51C、RAD52、RAD54、RAD9、RFC2、RFC3、RFC4、RFC5、RIF1、RPA、SLX1、SLX4、TopBP1、USP11、WEE1、WRN、XAB2、XLF、XPA、XPC、XPD、XPF、XPG、XRCC1或XRCC4。
39.根据权利要求2至38中任一项所述的方法，其中所述DDR抑制剂是以下物质的抑制剂：PARP、CDK12、ATR、ATM、CHK1、CHK2、CDK12、RAD51、RAD52或WEE1。
40.根据权利要求33所述的方法，其中所述PARP抑制剂选自由以下项组成的组：奥拉帕尼、他拉唑帕尼(BMN-673)、芦卡帕尼、维利帕尼、尼拉帕尼、CEP 9722、MK 4827、BGB-290(帕米帕尼)、ABT-888、AG014699、BSI-201、CEP-8983、E7016和3-氨基苯甲酰胺。
41.根据权利要求33所述的方法，其中所述CDK12抑制剂选自由以下项组成的组：迪那昔布、夫拉平度、罗斯科维汀、THZ1和THZ531。
42.根据权利要求33所述的方法，其中所述RAD51抑制剂选自由以下项组成的组：B02((E)-3-苄基-2(2-(吡啶-3-基)乙烯基)喹唑啉-4(3H)-酮)、RI-1(3-氯-1-(3,4-二氯苯基)-4-(4-吗啉基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、DIDS(4,4'-二异硫氰基芪-2,2'-二磺酸)、哈里醌、CYT-0851、IBR2和伊马替尼。
43.根据权利要求33所述的方法，其中所述ATM抑制剂选自由以下项组成的组：渥曼青霉素、CP-466722、KU-55933、KU-60019、KU-59403、AZD0156、AZD1390、CGK733、NVP-BEZ 235、Torin-2、氟喹啉2和SJ573017。
44.根据权利要求33所述的方法，其中所述ATR抑制剂选自由以下项组成的组：五味子乙素、NU6027、BEZ235、ETP46464、Torin 2、VE-821、VE-822、AZ20、AZD6738(塞拉色替)、M4344、BAY1895344、BAY-937、AZD6738、BEZ235(达克利司)、CGK733和VX-970。
45.根据权利要求33所述的方法，其中所述CHK1抑制剂选自由以下项组成的组：XL9844、UCN-01、CHIR-124、AZD7762、AZD1775、XL844、LY2603618、LY2606368(普瑞沙替尼)、GDC-0425、PD-321852、PF-477736、CBP501、CCT-244747、CEP-3891、SAR-020106、Arry-575、SRA737、V158411和SCH 900776(MK-8776)。
46.根据权利要求33所述的方法，其中所述CHK2抑制剂选自由以下项组成的组：NSC205171、PV1019、CI2、CI3、2-芳基苯并咪唑、NSC109555、VRX0466617和CCT241533。
47.根据权利要求33所述的方法，其中所述WEE1抑制剂选自由以下项组成的组：AZD1775(MK1775)、PD0166285和PD407824。
48.根据权利要求2至47中任一项所述的方法，其中所述DDR抑制剂选自由以下项组成的组：mirin、M1216、NSC19630、NSC130813、LY294002和NU7026。
49.根据权利要求2至48中任一项所述的方法，其中所述DDR抑制剂不是PARP或RAD51的抑制剂。
50.根据权利要求1至49中任一项所述的方法，其中所述抗Trop-2 ADC包括hRS7抗体，其包含轻链CDR序列CDR1(KASQDVSIAVA，SEQ ID NO:1)、CDR2(SASYRYT，SEQ ID NO:2)和CDR3(QQHYITPLT，SEQ ID NO:3)，以及重链CDR序列CDR1(NYGMN，SEQ ID NO:4)、CDR2(WINTYTGEPTYTDDFKG，SEQ ID NO:5)和CDR3(GGFGSSYWYFDV，SEQ ID NO:6)。
51.根据权利要求1至50中任一项所述的方法，还包括用抗癌剂治疗所述受试者，所述抗癌剂选自由以下项组成的组：奥拉帕尼、芦卡帕尼、他拉唑帕尼、维利帕尼、尼拉帕尼、阿卡替尼、替莫唑胺、阿替利珠单抗、帕博利珠单抗、纳武单抗、伊匹单抗、匹地珠单抗、度伐利尤单抗、BMS-936559、BMN-673、曲美木单抗、艾代拉里斯、伊马替尼、依鲁替尼、甲磺酸艾日布林、阿贝西利、帕博西尼、瑞博西利、曲拉西利、贝佐替尼、依帕曲替尼、阿普罗替尼、阿富塞替尼、曲西立滨、塞拉替尼、迪那西利、夫拉平度、罗斯科维汀、G1T38、SHR6390、库潘尼西、替西罗莫司、依维莫司、KU60019、KU 55933、KU 59403、AZ20、AZD0156、AZD1390、AZD1775、AZD2281、AZD5363、AZD6738、AZD7762、AZD8055、AZD9150、BAY-937、BAY1895344、BEZ235、CCT241533、CCT244747、CGK 733、CID44640177、CID1434724、CID46245505、CHIR-124、EPT46464、FTC、VE-821、VRX0466617、VX-970、LY294002、LY2603618、M1216、M3814、M4344、M6620、MK-2206、NSC19630、NSC109555、NSC130813、NSC205171、NU6027、NU7026、普瑞沙替尼(LY2606368)、PD0166285、PD407824、PV1019、SCH900776、SRA737、BMN 673、CYT-0851、mirin、Torin-2、氟喹啉2、烟曲霉毒素C、姜黄素、Kol43、GF120918、YHO-13351、YHO-13177、XL9844、渥曼青霉素、拉帕替尼、索拉非尼、舒尼替尼、尼罗替尼、吉西他滨、硼替佐米、曲古抑菌素A、紫杉醇、阿糖胞苷、顺铂、奥沙利铂和卡铂。
52.根据权利要求1至51中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由以下项组成的组：乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、HR+/HER2-转移性乳腺癌、尿路上皮癌、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠直肠癌、胃癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子宫癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌、食道癌、胰腺癌、脑癌、肝癌和头颈癌。
53.根据权利要求1至52中任一项所述的方法，其中所述癌症是尿路上皮癌。
54.根据权利要求1至53中任一项所述的方法，其中所述癌症是转移性尿路上皮癌。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的方法，其中所述癌症是抗治疗性尿路上皮癌。
56.根据权利要求1至55中任一项所述的方法，其中所述癌症对用基于铂和/或基于检查点抑制剂(CPI)(例如，抗PD1抗体或抗PD-L1抗体)的疗法进行治疗具有抗性。
57.根据权利要求1至52中任一项所述的方法，其中所述癌症是转移性TNBC。
58.一种预测患有表达Trop-2的癌症的受试者在用抗Trop-2 ADC治疗后的临床结果的方法，包括测定来自患有表达Trop-2的癌症的人类受试者的样品中一种或多种癌症生物标志物的存在，其中存在或不存在一种或多种癌症生物标志物预示所述受试者中的临床结果。
59.根据权利要求58所述的方法，其中存在或不存在一种或多种癌症生物标志物预示用抗Trop-2 ADC进行治疗的功效，其中所述ADC包括拓扑异构酶I的抑制剂。
60.根据权利要求58或59所述的方法，其中存在或不存在一种或多种癌症生物标志物预示用抗Trop-2 ADC和DDR抑制剂的组合进行治疗的功效或安全性。
61.根据权利要求58至60中任一项所述的方法，其中存在或不存在一种或多种癌症生物标志物预示用抗Trop-2 ADC和标准抗癌疗法的组合进行治疗的功效或安全性。
62.根据权利要求58至61中任一项所述的方法，其中所述生物标志物选自由以下项组成的组：突变、插入、缺失、染色体重排、SNP(单核苷酸多态性)、DNA甲基化、基因扩增、RNA剪接变体、miRNA、基因表达增加、基因表达减少、蛋白质磷酸化和蛋白质去磷酸化。
63.根据权利要求58至62中任一项所述的方法，其中所述生物标志物是DNA损伤修复(DDR)基因或细胞凋亡基因中的遗传标志物。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述基因选自由以下项组成的组：BRCA1、BRCA2、CHEK2、MSH2、MSH6、TP53、CDKN1A、BAG6、BRSK2、ERN1、FHIT、HIPK2、LGALS12、ZNF622、AEN、SART1、USP28、GADD45B、TGFB1、NDRG1、WEE1、PPP1R15A、MYBBP1A、SIRT1、ABL1、HRAS、ZNF385B、POLR2K和DDB2。
65.根据权利要求58至63中任一项所述的方法，其中所述生物标志物包括以下项或由以下项组成：BRCA1、BRCA2、CHEK2、MSH2、MSH6、TP53、CDKN1A、BAG6、BRSK2、ERN1、FHIT、HIPK2、LGALS12、ZNF622、AEN、SART1、USP28、GADD45B、TGFB1、NDRG1、WEE1、PPP1R15A、MYBBP1A、SIRT1、ABL1、HRAS、ZNF385B、POLR2K和DDB2。
66.根据权利要求58至63中任一项所述的方法，其中所述生物标志物包括以下项或由以下项组成：AEN、MSH2、MYBBP1A、SART1、SIRT1、USP28、CDKN1A、ABL1、TP53、BAG6、BRCA1、BRCA2、BRSK2、CHEK2、ERN1、FHIT、HIPK2、HRAS、LGALS12、MSH6、ZNF385B和ZNF622。
67.根据权利要求58至63中任一项所述的方法，其中所述生物标志物包括以下项或由以下项组成：BRCA1、BRCA2、CHEK2、MSH2、MSH6、TP53、CDKN1A、BAG6、BRSK2、ERN1、FHIT、HIPK2、LGALS12、ZNF622、AEN、SART1和USP28。
68.根据权利要求58至63中任一项所述的方法，其中所述生物标志物包括以下项或由以下项组成：POLR2K、DDB2、GADD45B、WEE1、TGFB1、NDRG1和PPP1R15A。
69.根据权利要求58至63中任一项所述的方法，其中所述生物标志物包括以下项或由以下项组成：GADD45B、TGFB1、NRG1、WEE1和PPP1R15A。
70.根据权利要求58至63中任一项所述的方法，其中所述生物标志物包括以下项或由以下项组成：BRCA1、BRCA2、CHEK2、MSH2、MSH6、TP53、CDKN1A、BAG6、BRSK2、ERN1、FHIT、HIPK2、LGALS12、ZNF622、AEN、SART1、USP28、GADD45B、TGFB1、NRG1、WEE1和PPP1R15A。
71.根据权利要求58至63中任一项所述的方法，其中所述基因选自由以下项组成的组：BRCA1、BRCA2、PTEN、ERCC1和ATM。
72.根据权利要求58至63中任一项所述的方法，其中所述生物标志物包括以下项或由以下项组成：BRCA1、BRCA2、PTEN、ERCC1和ATM。
73.根据权利要求58至63中任一项所述的方法，其中所述生物标志物是引起下列取代突变的单核苷酸多态性，所述取代突变选自由以下项组成的组：ABL1中的E155K、ABL1中的G706S、AEN中的V172L、BAG6中的R279Q、BRCA1中的P1020Q、BRCA1中的E255K、BRCA2中的L2518V、BRSK2中的T656A、CDKN1A中的M1V、CHECK2中的A377D、ERN1中的G771S、FHIT中的R46S、HIPK2中的E457Q、HRAS中的G12V、LGALS12中的A278V、MSH2中的N127S、MSH6中的S625F、MYBBP1A中的H680Y、SART1中的R373Q、SIRT1中的E113Q、TP53中的*394S、TP53中的R282G、TP53中的T377P、TP53中的E271K、TP53中的Y220C、TP53中的E180*、USP28中的I987L、ZNF385B中的R370Q、以及ZNF622中的A437E。
74.根据权利要求58至63中任一项所述的方法，其中所述生物标志物是引起下列取代的多种单核苷酸多态性，所述取代包括以下项或由以下项组成：ABL1中的E155K、ABL1中的G706S、AEN中的V172L、BAG6中的R279Q、BRCA1中的P1020Q、BRCA1中的E255K、BRCA2中的L2518V、BRSK2中的T656A、CDKN1A中的M1V、CHECK2中的A377D、ERN1中的G771S、FHIT中的R46S、HIPK2中的E457Q、HRAS中的G12V、LGALS12中的A278V、MSH2中的N127S、MSH6中的S625F、MYBBP1A中的H680Y、SART1中的R373Q、SIRT1中的E113Q、TP53中的*394S、TP53中的R282G、TP53中的T377P、TP53中的E271K、TP53中的Y220C、TP53中的E180*、USP28中的I987L、ZNF385B中的R370Q、以及ZNF622中的A437E。
75.根据权利要求58至63中任一项所述的方法，其中所述生物标志物是引起下列取代的多种单核苷酸多态性，所述取代包括以下项或由以下项组成：AEN中的V172L、BAG6中的R279Q、BRCA1中的P1020Q、BRCA1中的E255K、BRCA2中的L2518V、BRSK2中的T656A、CDKN1A中的M1V、CHECK2中的A377D、ERN1中的G771S、FHIT中的R46S、HIPK2中的E457Q、MSH2中的N127S、MSH6中的S625F、SART1中的R373Q、TP53中的*394S、TP53中的R282G、TP53中的T377P、TP53中的E271K、TP53中的Y220C、TP53中的E180*、以及USP28中的I987L。
76.根据权利要求58至63中任一项所述的方法，其中所述生物标志物是选自由以下项组成的组的移码突变：BAG6中的K1110fs、CDKN1A中的R32fs、CDKN1A中的DC33fs、以及CDKN1A中的EG60fs。
77.根据权利要求58至63中任一项所述的方法，其中所述生物标志物是包括以下项或由以下项组成的多种移码突变：BAG6中的K1110fs、CDKN1A中的R32fs、CDKN1A中的DC33fs、以及CDKN1A中的EG60fs。
78.根据权利要求58至63中任一项所述的方法，其中所述生物标志物是与相应的正常组织相比，所述癌症中的基因表达增加或减少，所述基因选自由以下项组成的组：POLR2K、DDB2、GADD45B、WEE1、TGFB1、NDRG1和PPP1R15A。
79.根据权利要求58至63中任一项所述的方法，其中所述生物标志物是与相应的正常组织相比，所述癌症中的基因表达的多个增加或减少，所述基因包括以下项或由以下项组成：POLR2K、DDB2、GADD45B、WEE1、TGFB1、NDRG1和PPP1R15A。
80.根据权利要求58至79中任一项所述的方法，还包括测量所述癌症中两个或更多个基因的基因表达的增加或减少。
81.根据权利要求58至80中任一项所述的方法，其中所述抗Trop-2ADC选自由以下项组成的组：戈沙妥珠单抗和DS-1062。
82.根据权利要求58至81中任一项所述的方法，其中存在或不存在一种或多种癌症生物标志物用于确定所述癌症的阶段。
83.根据权利要求58至82中任一项所述的方法，其中存在或不存在一种或多种癌症生物标志物用于量化所述癌症在抗癌治疗后的复发风险。
84.根据权利要求58至83中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由以下项组成的组：乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、HR+/HER2-转移性乳腺癌、尿路上皮癌、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠直肠癌、胃癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子宫癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌、食道癌、胰腺癌、脑癌、肝癌和头颈癌。
85.根据权利要求58至84中任一项所述的方法，其中所述癌症是尿路上皮癌。
86.根据权利要求58至85中任一项所述的方法，其中所述癌症是转移性尿路上皮癌。
87.根据权利要求58至86中任一项所述的方法，其中所述癌症是抗治疗性尿路上皮癌。
88.根据权利要求58至87中任一项所述的方法，其中所述癌症对用基于铂和/或基于检查点抑制剂(CPI)(例如，抗PD1抗体或抗PD-L1抗体)的疗法进行治疗具有抗性。
89.根据权利要求58至88中任一项所述的方法，其中所述癌症是转移性TNBC。
90.根据权利要求58至89中任一项所述的方法，还包括预测在用抗Trop-2 ADC治疗后的无复发间隔、总生存期、无疾病生存期或远端无复发间隔。
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